CN115486537A - 包含永生化干细胞的富含外泌体的培养液及肉毒杆菌毒素的功能性组合物 - Google Patents
包含永生化干细胞的富含外泌体的培养液及肉毒杆菌毒素的功能性组合物 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及包含永生化干细胞的富含外泌体的培养液及肉毒杆菌毒素的功能性组合物。具体地，根据本发明的功能性组合物在抑制胶原蛋白及弹性蛋白的分解的同时还能促进其合成，且能改善皱纹，促进细胞再生，从而可用于皮肤再生、改善皱纹、改善皮肤弹性、抑制皮肤老化及抑制皱纹产生的功能性材料或创伤治疗用途。
Description
技术领域
本发明涉及包含永生化干细胞的富含外泌体的培养液(exosome-richconditioned medium)及肉毒杆菌毒素的功能性组合物。
背景技术
皮肤作为对人体进行保护或防御的主要器官的同时，还是全面覆盖身体表面的最宽的器官，其由表皮、真皮及皮下组织构成。其中，位于表皮最外层的角质层由角质和脂质构成，其能抑制有害物质的渗透或水分蒸发，保护人体免受细菌感染或外界刺激。角质层以两周为周期脱落而形成新的角质层。
皮肤经常受到压力或紫外线等刺激的损伤，由于这些诱发皮肤损伤的因素导致角质层和脂质层受到破坏，经皮水分流失迅速增加。不仅如此，还可能会发生由于皮肤干燥、皱纹生成、瘙痒症和细菌感染引起的炎症。人角质形成细胞可以因外界刺激而产生和释放由IL-1α开始的IL-6、IL-8、TNF-α等多种细胞因子，这些细胞因子诱导皮肤刺激或介导局部炎症反应。
尤其，如果紫外线等外部刺激反复对角质层造成损伤，或者正常角质层的恢复延迟，皮肤老化可能会加速，且可能会发展成皮肤疾病。因外界损伤引起的角质层的快速修复可以缓解皮肤干燥、皮肤老化和瘙痒等，并且，这些可以通过促进用于诱导人角质形成细胞正常分化和增殖的皮肤再生来预防。皮肤再生的愈合期根据组织损伤的大小或程度而不同。愈合是止血、炎症、增殖和重塑四个发展过程依次通过调控而发生的过程，其需要各种细胞相互作用、生长因子和细胞因子。
在这方面，韩国授权专利第10-2214378号涉及一种用于皮肤再生、改善皱纹、抗炎或皮肤美白用组合物，其公开了如下内容：即沙苑子苷A(complanatoside A)增加皮肤成纤维细胞中的胶原蛋白总量，抑制胶原酶活性，提高皮肤再生或皱纹改善效果，抑制一氧化氮产生以显示抗炎效果，减少黑色素总量以显示美白作用，从而可用作药物组合物、皮肤外用剂、化妆料组合物或保健功能食品。
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的在于，提供包含永生化干细胞的富含外泌体的培养液及肉毒杆菌毒素的功能性组合物。
本发明的另一目的在于，提供永生化干细胞的富含外泌体的培养液及肉毒杆菌毒素的用途。
用于解决问题的手段
为了实现所述目的，本发明提供一种功能性组合物，其包含永生化干细胞的富含外泌体的培养液(exosome-rich conditioned medium，ERCM)及肉毒杆菌毒素。
此外，本发明提供用于预防或治疗创伤的药物组合物，其包含永生化干细胞的富含外泌体的培养液及肉毒杆菌毒素作为有效成分。
此外，本发明提供用于预防或治疗创伤的试剂盒，其包括：包含永生化干细胞的富含外泌体的培养液作为有效成分的第一组合物，以及包含肉毒杆菌毒素作为有效成分的第二组合物。
此外，本发明提供皮肤改善方法，其包括向个体施用永生化干细胞的富含外泌体的培养液及肉毒杆菌毒素的步骤。
此外，本发明提供永生化干细胞的富含外泌体的培养液及肉毒杆菌毒素在制备改善皮肤的组合物中的用途。
此外，本发明提供用于预防、改善或治疗创伤的方法，其包括向个体施用永生化干细胞的富含外泌体的培养液及肉毒杆菌毒素的步骤。
进一步地，本发明提供永生化干细胞的富含外泌体的培养液及肉毒杆菌毒素在制备预防、改善或治疗创伤的药物中的用途。
发明的效果
根据本发明的功能性组合物在抑制胶原蛋白及弹性蛋白的分解的同时还能促进其合成，能改善皱纹，促进细胞再生，从而可用于改善皱纹、皮肤再生、改善皮肤弹性、抑制皮肤老化及抑制皱纹产生的功能性材料或创伤治疗用途。
附图说明
图1是确认本发明一实施例中制备的富含外泌体的培养液中存在的外泌体标志物CD9的结果的图。
图2是确认本发明一实施例中制备的富含外泌体的培养液中存在的生长因子及神经营养因子的含量的结果的曲线图(*标记表示与正常培养液相比有显著差异)。
图3是确认基于本发明一实施例中制备的富含外泌体的培养液及A型肉毒杆菌毒素的胶原蛋白分解酶MMP-1的活性抑制效果的结果的曲线图(*标记表示与正常活性相比有显著差异)。
图4是确认基于本发明一实施例中制备的富含外泌体的培养液及A型肉毒杆菌毒素的弹性蛋白分解酶MMP-12的活性抑制效果的结果的曲线图(*标记表示与正常活性相比有显著差异)。
图5是确认基于本发明一实施例中制备的富含外泌体的培养液及A型肉毒杆菌毒素的胶原蛋白合成促进效果的结果的曲线图(*标记表示与正常培养条件相比有显著差异)。
图6是确认基于本发明一实施例中制备的富含外泌体的培养液及A型肉毒杆菌毒素的弹性蛋白合成促进效果的结果的曲线图(*标记表示与正常培养条件相比有显著差异)。
图7是拍摄基于本发明一实施例中制备的富含外泌体的培养液及A型肉毒杆菌毒素的皮肤皱纹改善效果的结果图。
图8是定量示出基于本发明一实施例中制备的富含外泌体的培养液及A型肉毒杆菌毒素的皮肤皱纹改善效果的结果曲线图(*标记表示与由UVB引起的皮肤皱纹相比有显著差异)。
图9是拍摄基于本发明一实施例中制备的富含外泌体的培养液及A型肉毒杆菌毒素的皮肤再生效果的结果图。
具体实施方式
以下，详细说明本发明。
本发明提供包含永生化干细胞的富含外泌体的培养液(exosome-richconditioned medium，ERCM)及肉毒杆菌毒素的功能性组合物。
本说明书中使用的术语“干细胞(stem cell)”作为发育相对较少的未分化细胞，是指具有可以分化为特定组织细胞的能力的细胞。干细胞可以根据分化能力分为全能干细胞(pluripotent stem cell)，多能干细胞(multipotent stem cell)或单能干细胞(unipotent stem cell)。此外，所述干细胞可根据来源细胞分为胚胎干细胞(embryonicstem cell)、成体干细胞(adult stem cell)或由人体体细胞制备的诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)。具体地，根据本发明的干细胞可以是成体干细胞。所述术语中，成体干细胞是指存在于成体的组织或器官，可以分化为所需细胞且可以自我复制(self-renew)的未分化细胞。作为一例，根据本发明的干细胞可以是羊水来源成体干细胞。
本说明书中使用的术语“永生化(immortalization)”是指在细胞继代培养过程中可持续增殖而不会经历正常的细胞老化和破裂的过程的细胞。通常，细胞在继代培养过程中，增殖能力下降，培养液中有效成分的含量下降，而永生化细胞可以使增殖能力以及培养液中有效成分的含量维持恒定。根据本发明的永生化干细胞可以根据本领域公知的方法制备。此外，本领域普通技术人员可以适当地修改制备方法以使所需的永生化干细胞的特性最大化。作为一例，本发明的永生化干细胞可以是永生化的人羊水来源干细胞，具体地，对永生化干细胞于2014年7月25日进行了保藏，保藏编号为KCTC12634BP，生物物质分类名称为CBNU-AFSC，保藏机构韩国典型菌种保藏中心位于，韩国全罗北道井邑市立新街181号，邮政编码305-806(181，Ipsin-gi，Jeongeup-s，Jeollabuk-do，Kore)。
本说明书中使用的术语“富含外泌体的培养液(exosome-rich conditionedmedium，ERCM)”是指通过培养具有如上所述的特征的永生化干细胞来获得的培养液。通过永生化干细胞来获得外泌体的含量增加的培养液的方法是本领域已公知的。所述术语“外泌体(exosome)”是指从多种细胞分泌的膜结构的细胞外囊泡(extracellular vesicle，EV)。所述外泌体与其他细胞或组织结合并执行如传递膜构成要素、蛋白质、RNA等多种功能，并且通常可具有约50nm至200nm的平均直径。所述外泌体可以使用包含在其中的标记蛋白来确认。所述标记蛋白可以包括本领域已知的所有类型的标记蛋白，具体地，所述标记蛋白可以是CD9。
作为一例，根据本发明的富含外泌体的培养液可以是通过在包含TNF-α的培养基中培养永生化干细胞而获得的培养液。此时，所述TNF-α的浓度可以是3ng/ml至100ng/ml、3ng/ml至90ng/ml、3ng/ml至80ng/ml、3ng/ml至60ng/ml、10ng/ml至100ng/ml、10ng/ml至90ng/ml、10ng/ml至80ng/ml、10ng/ml至70ng/ml、10ng/ml至60ng/ml、20ng/ml至100ng/ml、20ng/ml至90ng/ml、20ng/ml至80ng/ml、20ng/ml至70ng/ml、20ng/ml至60ng/ml、30ng/ml至100ng/ml、30ng/ml至90ng/ml、30ng/ml至80ng/ml、30ng/ml至70ng/ml、30ng/ml至60ng/ml、40ng/ml至100ng/ml、40ng/ml至90ng/ml、40ng/ml至80ng/ml、40ng/ml至70ng/ml或40ng/ml至60ng/ml。
此外，所述富含外泌体的培养液可以是通过在低氧浓度下培养永生化干细胞而获得。所述低氧浓度可以是约20％的浓度，所述约20％的浓度是通常大气条件下的平均氧浓度。具体地，所述低氧浓度可以是10％以下、0.1％至10％、0.1％至8％、0.1％至5％、0.1％至3％、0.5％至10％、0.5％至8％、0.5％至5％、0.5％至3％、1％至10％、1％至8％、1％至5％或1％至3％。此外，所述培养可以进行1小时至80小时、1小时至70小时、1小时至60小时、1小时至50小时、10小时至80小时、10小时至70小时、10小时至60小时、10小时至50小时、20小时至80小时、20小时至70小时、20小时至60小时、20小时至50小时、30小时至80小时、30小时至70小时、30小时至60小时、30小时至50小时、40小时至80小时、40小时至70小时、40小时至60小时或40小时至50小时。
可以根据需要过滤或浓缩本发明的富含外泌体的培养液，以去除杂质。
所述富含外泌体的培养液可包含生长因子及神经营养因子。作为一例，所述生长因子及神经营养因子可以包括本领域已知的所有种类的因子，具体地，所述生长因子及神经营养因子可以是选自由碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、延伸因子G(elongation factor G，EFG)、胰岛素样生长因子(insulin-like growthfactor，IGF)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、血小板原性生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)及转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)组成的组中的一种以上。更具体地，所述生长因子及神经营养因子可包括bFGF、EFG、IGF、VEGF、PDGF及TGF-β。
本说明书中使用的术语“肉毒杆菌毒素(botulinum toxin)”是指由称为肉毒梭状芽孢杆菌(Clostridium botulinum)的革兰氏阳性厌氧细菌生成分子量为约150kDa的毒素蛋白。所述肉毒杆菌毒素包括A型、B型、C型、D型、E型、F型及G型的共7种血清型(serotype)，根据各血清型的不同对神经的作用部位可能也有所不同。具体地，所述肉毒杆菌毒素可以是选自由A型、B型、C型、D型、E型、F型及G型的肉毒杆菌毒素组成的组中的一种以上，更具体地，可以是A型肉毒杆菌毒素。
所述A型肉毒杆菌毒素可以阻止乙酰胆碱(acetyl choline)从分布在皮肤的胆碱能神经系统(cholinergic nervous system)的神经末梢分泌到肌肉神经接头(neuromuscular junction)。
所述肉毒杆菌毒素可以包括分离的肉毒杆菌毒素、提取的肉毒杆菌毒素或市售的肉毒杆菌毒素，还可以包括肉毒杆菌毒素的变异体或融合蛋白。只要具有肉毒杆菌毒素的活性，所述肉毒杆菌毒素的变异体可包括其中一部分。此外，所述变异体可以是对肉毒杆菌毒素的一个以上氨基酸残基进行化学或功能修饰的。作为一例，所述修饰可以是一个或一个以上的氨基酸残基被取代、缺失或修饰的。
本发明的组合物可以以1至200个单位、1至150个单位、1至100个单位、1至50个单位、1至30个单位、1至10个单位、3至200个单位、3至150个单位、3至100个单位、3至50个单位、3至30个单位或3至10个单位的量包含肉毒杆菌毒素。
本发明的组合物将肉毒杆菌毒素与永生化干细胞的富含外泌体的培养液混合或联合使用，因此即使使用少量也可以确认显著的效果，并且可以消除过量的肉毒杆菌毒素导致的皮肤下垂、局部麻痹、肌肉功能丧失等的副作用。具体地，所述混合可以意味着使本发明的永生化干细胞的富含外泌体的培养液及肉毒杆菌毒素形成一种组合物。另外，所述联合使用可以意味着将永生化干细胞的富含外泌体的培养液及肉毒杆菌毒素分别制成组合物，同时、依次或倒序给药。
本发明的组合物可以是皮肤改善用组合物。具体地，所述皮肤改善可以是改善因紫外线、老化、压力等的各种刺激因素而损伤的皮肤。作为一例，所述皮肤改善可以是通过选自由皮肤再生、改善皱纹、改善皮肤弹性、抑制皮肤老化及抑制皱纹产生的功能组成的组中的一种以上的功能来改善皮肤。此外，所述组合物可以是保健功能食品、化妆料组合物或皮肤外用剂。
即本发明的组合物可以是皮肤改善用保健功能食品、化妆料组合物或皮肤外用剂。
所述保健功能食品可以将作为其有效成分的本发明的组合物直接添加到食品中，或可以与其他食品或食品成分一起使用。此时，所添加的有效成分的含量可以根据目的而定，通常可以是整体食品重量的0.01至90重量份。
所述保健功能食品的形式及种类没有特别限制。具体地，所述保健功能食品可以是片剂、胶囊、粉末、颗粒、液相和丸的形式。作为附加成分，所述保健功能食品可包含多种香味剂、甜味剂或天然碳水化合物。所述甜味剂可以是天然或合成甜味剂，天然甜味剂的实例包括索马甜、甜菊提取物等。另外，合成甜味剂的实例包括糖精、阿斯巴甜等。此外，所述天然碳水化合物可以是单糖、双糖、多糖、寡糖及糖醇等。
除了上述附加成分以外，本发明的保健功能食品还可以包括营养剂、维生素、电解质、调味剂、着色剂、果胶及其盐、海藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇等。这种成分可以单独使用或组合使用。相对于每100重量份的本发明的组合物，所述添加剂的比例可以选自0.01重量份至0.1重量份的范围。
此外，所述化妆料组合物可包含0.1重量百分比至50重量百分比的本发明的组合物作为其有效成分，具体地，可包含1重量百分比至10重量百分比作为其有效成分。所述化妆料组合物可以以改善皮肤为目的而直接涂敷至皮肤。
所述化妆料组合物可以被制剂化为常规制备的化妆料剂型。所述化妆料组合物可以被制剂化为溶液、混悬液、乳状液、糊剂、凝胶、乳液、霜剂、粉剂、肥皂、含表面活性剂的清洁剂、油、粉底、乳状液粉底、蜡状粉底和喷雾剂等。具体地，可以是柔润化妆水、营养化妆水、营养霜、按摩霜、精华液、眼霜、洁面霜、洁面泡沫、洁肤水、面膜、喷雾或粉末。
在本发明的化妆料组合物的剂型为糊剂、霜剂或凝胶的情况下，作为载体可以包括动物油、植物油、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、有机硅(silicone)、膨润土、二氧化硅、滑石、氧化锌或它们的混合物。此外，在所述化妆料组合物的剂型为粉末或喷雾的情况下，可以包括乳糖、滑石、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙、聚酰胺粉末或它们的混合物。尤其，在喷雾的情况下，还可以包括氯氟烃、丙烷/丁烷或二甲醚等。
在本发明的化妆料组合物的剂型为溶液或乳状液的情况下，作为载体可以包括溶剂、溶剂化剂、乳化剂或它们的混合物。作为其例，包括水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁基乙二醇油、甘油脂肪族酯、聚乙二醇、失水山梨醇脂肪酸酯等。
在本发明的化妆料组合物的剂型为混悬液的情况下，作为载体可以包括如水、乙醇或丙二醇等的液状稀释剂；如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇酯(polyoxyethylene sorbitol ester)和聚氧乙烯失水山梨醇酯(polyoxyethylenesorbitan ester)等的混悬剂；微晶纤维素；偏氢氧化铝；膨润土；琼脂；黄蓍胶或它们的混合物。此外，在所述化妆料组合物的剂型为含表面活性剂的清洁剂的情况下，作为载体可以包括使用脂肪醇硫酸盐、脂肪族醇醚硫酸盐、磺基琥珀酸单酯、羟乙基磺酸盐、咪唑啉衍生物、甲基牛磺酸盐、肌氨酸盐(sarcosinate)、脂肪酸酰胺醚硫酸盐、烷基酰胺基甜菜碱、脂肪醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物油、羊毛脂衍生物、乙氧基化甘油脂肪酸酯或它们的混合物。
除了载体成分以外，本发明的化妆料组合物作为辅助剂可以包括抗氧化剂、稳定剂、增溶剂、保湿剂、颜料、香料、紫外线阻隔剂、显色剂、表面活性剂或它们的混合物。只要是通常用于制备化妆料组合物的物质均可用作所述辅助剂。
此外，所述皮肤外用剂可以包括药学上可接受的载体及赋形剂。所述载体及赋形剂可以包括防腐剂、稳定剂、水合剂、乳化促进剂和缓冲剂等。具体地，所述赋形剂可以是乳糖、糊精、淀粉、甘露醇、山梨糖醇、葡萄糖、蔗糖、微晶纤维素、明胶、聚乙烯吡咯烷酮或它们的混合物。所述皮肤外用剂可以根据本领域公知的方法适当地制备。所述皮肤外用剂可以制成粉末、凝胶、软膏、霜剂、液体及气雾剂的形式。
此外，本发明提供用于预防或治疗创伤的药物组合物，其包含永生化干细胞的富含外泌体的培养液及肉毒杆菌毒素作为有效成分。
作为有效成分包含在本发明的药物组合物中的永生化干细胞的富含外泌体的培养液及肉毒杆菌毒素可以具有如上所述的特征。作为一例，所述干细胞可以是人羊水来源干细胞，具体地，所述永生化干细胞可以是以保藏编号KCTC12634BP进行保藏的干细胞。此外，所述富含外泌体的培养液可以是通过在包含TNF-α的培养基中培养永生化干细胞而获得的。此外，所述富含外泌体的培养液可以是在低氧浓度下培养的。
另外，所述肉毒杆菌毒素可以是选自由A型、B型、C型、D型、E型、F型及G型的肉毒杆菌毒素组成的组中的一种以上，具体地，可以是A型肉毒杆菌毒素。
本说明书中使用的术语“创伤(wound)”是指生物体损伤的状态，可包括所有构成生物体内部或外部表面的组织(如皮肤、肌肉、神经组织、骨骼、软组织、内部器官或血管组织)被切割或破坏的病理状态。具体地，所述创伤可以包括擦伤、裂伤、刺伤、割伤、撕脱伤、褥疮、卧疮、辐射对组织的破坏、穿透伤、枪伤、烧伤、冻伤、手术伤口、整形手术后的缝合部位、化学创伤等。
就所述永生化干细胞的富含外泌体的培养液及肉毒杆菌毒素而言，可包括根据各个成分分别进行剂型化的情况，或对其进行混合后进行剂型化的情况。
此外，相对于组合物的整体重量，本发明的药物组合物可包含0.1至95重量百分比的永生化干细胞的富含外泌体的培养液及肉毒杆菌毒素作为有效成分。此外，除了所述有效成分以外，本发明的药物组合物还可以包括一种以上表现出相同或类似功能的有效成分。
本发明的药物组合物可包括生物制剂中通常使用的载体、稀释剂、赋形剂或它们的混合物。只要是能适用于将组合物递送到生物体内，则可以使用任何药学上可接受的载体。具体地，所述载体是记载于如下文件中的化合物、盐水、无菌水、林格氏溶液、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇或它们的混合物，其中，该文件为：Merck Index，13th ed.，Merck&Co.Inc.。此外，可以根据需要添加抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂等常规添加剂。
在将所述组合物制剂化的情况下，可以添加通常使用的填充剂、增量剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂等的稀释剂或赋形剂。
本发明的组合物可以剂型化为口服制剂或非口服制剂。口服制剂可包括固体制剂及液体制剂。所述固体制剂可以是片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂或锭剂，这种固体制剂可以通过向所述组合物添加至少一种赋形剂来制备。所述赋形剂可以是淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖、明胶或它们的混合物。此外，所述固体制剂可包括润滑剂，作为其例，包括硬脂酸镁、滑石等。另外，液体制剂可以是混悬剂、内服液剂、乳剂或糖浆。此时，所述液体制剂可以包括润湿剂、甜味剂、芳香剂、保存剂等赋形剂。
所述非口服制剂可包括注射剂、栓剂、呼吸器吸入用粉末、喷雾用气雾剂、粉剂和霜剂等。所述注射剂可包括无菌水溶液、非水性溶液、悬浮剂、乳剂等。此时，作为非水性溶剂或悬浮剂，可以使用丙二醇、聚乙二醇、橄榄油等的植物油、或油酸乙酯等可注射的酯。
此外，本发明提供用于预防或治疗创伤的试剂盒，其包含：含有永生化干细胞的富含外泌体的培养液作为有效成分的第一组合物，以及含有肉毒杆菌毒素作为有效成分的第二组合物。
作为有效成分包含在本发明的治疗用试剂盒的永生化干细胞的富含外泌体的培养液及肉毒杆菌毒素可以具有如上所述的特征。作为一例，所述干细胞可以是人羊水来源干细胞，具体地，所述永生化干细胞可以是以保藏编号KCTC12634BP进行保藏的干细胞。此外，所述富含外泌体的培养液可以是通过在包含TNF-α的培养基中培养永生化干细胞而获得的。此外，所述富含外泌体的培养液可以是在低氧浓度下培养的。
另外，所述肉毒杆菌毒素可以是选自由A型、B型、C型、D型、E型、F型及G型的肉毒杆菌毒素组成的组中的一种以上，具体地，可以是A型肉毒杆菌毒素。
此外，所述创伤可以具有如上所述的特征。
所述第一组合物及第二组合物可以具有如上所述的药物组合物的特征。此外，它们可以以同时、依次或倒序的方式联合给药。具体地，可以同时施用永生化干细胞的富含外泌体的培养液及肉毒杆菌毒素。此外，可以在施用所述永生化干细胞的富含外泌体的培养液之后，再施用所述肉毒杆菌毒素。并且，也可以在施用所述肉毒杆菌毒素之后，再施用所述永生化干细胞的富含外泌体的培养液。此时，在以同时、依次或倒序的方式施用永生化干细胞的富含外泌体的培养液及肉毒杆菌毒素的情况下，给药间隔可以由本领域普通技术人员适当调整。
此外，本发明提供皮肤改善方法，其包括向个体施用永生化干细胞的富含外泌体的培养液及肉毒杆菌毒素的步骤。
作为有效成分用于本发明的皮肤改善方法的永生化干细胞的富含外泌体的培养液及肉毒杆菌毒素可以具有如上所述的特征。作为一例，所述干细胞可以是人羊水来源干细胞，具体地，所述永生化干细胞可以是以保藏编号KCTC12634BP进行保藏的干细胞。此外，所述富含外泌体的培养液可以是通过在包含TNF-α的培养基中培养永生化干细胞而获得的。此外，所述富含外泌体的培养液可以是在低氧浓度下培养的。
另外，所述肉毒杆菌毒素可以是选自由A型、B型、C型、D型、E型、F型及G型的肉毒杆菌毒素组成的组中的一种以上，具体地，可以是A型肉毒杆菌毒素。
所述个体可以是哺乳动物，具体可以是人。
根据目的，给药可以是口服或非经胃肠道给药。非经胃肠道给药可包括腹膜内、直肠内、皮下、静脉内、肌肉内或胸腔内注射方式。此外，所述非经胃肠道给药可以是皮肤涂敷。
此外，本发明提供用于制备皮肤改善用组合物的永生化干细胞的富含外泌体的培养液及肉毒杆菌毒素的用途。
本发明的用于制备皮肤改善用组合物的永生化干细胞的富含外泌体的培养液及肉毒杆菌毒素可以具有如上所述的特征。作为一例，所述干细胞可以是人羊水来源干细胞，具体地，所述永生化干细胞可以是以保藏编号KCTC12634BP进行保藏的干细胞。此外，所述富含外泌体的培养液可以是通过在包含TNF-α的培养基中培养永生化干细胞而获得的。此外，所述富含外泌体的培养液可以是在低氧浓度下培养的。
另外，所述肉毒杆菌毒素可以是选自由A型、B型、C型、D型、E型、F型及G型的肉毒杆菌毒素组成的组中的一种以上，具体地，可以是A型肉毒杆菌毒素。
此外，本发明提供用于预防、改善或治疗创伤的方法，其包括向个体给药永生化干细胞的富含外泌体的培养液及肉毒杆菌毒素的步骤。
本发明的用于预防、改善或治疗创伤的方法的永生化干细胞的富含外泌体的培养液及肉毒杆菌毒素可以具有如上所述的特征。作为一例，所述干细胞可以是人羊水来源干细胞，具体地，所述永生化干细胞可以是以保藏编号KCTC12634BP进行保藏的干细胞。此外，所述富含外泌体的培养液可以是通过在包含TNF-α的培养基中培养永生化干细胞而获得的。此外，所述富含外泌体的培养液可以是在低氧浓度下培养的。
另外，所述肉毒杆菌毒素可以是选自由A型、B型、C型、D型、E型、F型及G型的肉毒杆菌毒素组成的组中的一种以上，具体地，可以是A型肉毒杆菌毒素。
所述个体可以是哺乳动物，具体可以是人。
根据目的，给药可以是口服或非经胃肠道给药。非经胃肠道给药可包括腹膜内、直肠内、皮下、静脉内、肌肉内或胸腔内注射方式。此外，所述非经胃肠道给药可以是皮肤涂敷。所述给药可以以药学上的有效剂量来进行给药。这可能根据疾病的类型、严重程度、药物活性、患者对药物的敏感性、给药时间、给药途径、治疗周期、同时使用的药物等而不同。然而，为了获得优选效果，本发明的有效成分可以以0.0001至1000mg/kg剂量给药，具体以0.001至500mg/kg的剂量给药，所述给药可以是一天一次或数次。
此外，所述给药可以单独给药或与其他治疗剂联合给药。联合给药时，给药可以是依次给药或同时给药。
进一步地，本发明提供用于制备预防、改善或治疗创伤的药物的永生化干细胞的富含外泌体的培养液及肉毒杆菌毒素的用途。
本发明的用于制备预防、改善或治疗创伤的药物的永生化干细胞的富含外泌体的培养液及肉毒杆菌毒素可以具有如上所述的特征。作为一例，所述干细胞可以是人羊水来源干细胞，具体地，所述永生化干细胞可以是以保藏编号KCTC12634BP进行保藏的干细胞。此外，所述富含外泌体的培养液可以是通过在包含TNF-α的培养基中培养永生化干细胞而获得的。此外，所述富含外泌体的培养液可以是在低氧浓度下培养的。
另外，所述肉毒杆菌毒素可以是选自由A型、B型、C型、D型、E型、F型及G型的肉毒杆菌毒素组成的组中的一种以上，具体地，可以是A型肉毒杆菌毒素。
具体实施例
以下，通过以下实施例详细说明本发明。然而，以下实施例仅用于例示本发明，本发明并不限于此。具有与本发明的权利要求书中记载的技术思想实质上相同的结构并达到相同作用效果的任何内容均包含在本发明的技术范围内。
实施例1.永生化干细胞富含外泌体的培养液的制备
通过如下方法培养永生化干细胞以获得富含外泌体的培养液(exosome-richconditioned medium，ERCM)。
首先，使用DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)培养基，在5％CO2及37℃的条件培养1×106cells/ml的永生化羊水干细胞(保藏编号KCTC12634BP)。24小时后，在培养基中添加50ng/ml的TNF-α，并将氧浓度降至2％，继续培养48小时。完成培养后，取培养液，用过滤器进行过滤来去除细胞等的杂质，并在低温下浓缩30倍，获得永生化干细胞的富含外泌体的培养液(以下称为“富含外泌体的培养液”或“ERCM”)。
比较例1.永生化干细胞培养液的制备
使用DMEM培养基，在5％CO2及37℃的条件培养永生化羊水干细胞(保藏编号KCTC12634BP)，之后，取培养液，用过滤器进行过滤来去除细胞等的杂质，并在低温下浓缩30倍，获得永生化干细胞培养液(以下称为“正常培养液”或“CM”)。
实验例1.外泌体含量分析
通过确认作为外泌体的标志物的CD9的表达来分析存在于以上述方式获得的富含外泌体的培养液中的外泌体含量。
具体地，使用总外泌体分离试剂盒(total exosome isolation kit，Invitrogen)从6ml的富含外泌体的培养液收集外泌体后，以常规方式进行对CD9的蛋白质免疫印迹(Western Blot)，将其结果示于图1。此时，作为对照组使用了比较例1的正常培养液。
如图1所示，与正常培养液相比，富含外泌体的培养液中的CD9表达水平显著增高约50倍以上。
实验例2.生长因子及神经营养因子分析
分析存在于以上述方式获得的富含外泌体的培养液中的生长因子及神经营养因子，具体如下。实验是通过常规ELISA方法进行，具体地，确认了bFGF(basic fibroblastgrowth factor)、EFG(elongation factor G)、IGF(insulin-like growth factor)、VEGF(vascular endothelial growth factor)、PDGF(platelet-derived growth factor)及TGF-β(transforming growth factor-β)蛋白的表达水平。此时，作为对照组使用了正常培养液，确认的生长因子及神经营养因子的表达水平示于图2。
如图2所示，与正常培养液相比，存在于富含外泌体的培养液中的生长因子及神经营养因子的表达水平显著增高。具体地，bGFG、EFG、IGF、VEGF及PDFG蛋白约增加了10倍以上，尤其，TGF-β蛋白的表达水平增加了约17倍以上。
实验例3.对胶原蛋白降解酶抑制的确认
通过基质金属蛋白酶-1(matrix metalloproteinase-1，MMP-1)蛋白的活性抑制来确认了获得的富含外泌体的培养液的胶原蛋白降解酶抑制效果。
具体地，将100μl/ml的富含外泌体的培养液及5个单位(units)的A型肉毒杆菌毒素(美迪妥适(medytox)株式会社，韩国)添加到包含底物(MCA-Lys-Pro-Leu-Gly-Leu-DPA-Ala-Arg-NH2)和重组人MMP-1蛋白(Cat.#M9195，Sigma-Aldrich)的反应液。将其在320nm的激发波长(excitation)和405nm的发射波长下测定吸光度，测定时间为5分钟。此时，作为对照组，使用未进行任何处理的正常对照组，仅用肉毒杆菌毒素处理的肉毒杆菌毒素处理组、以及用肉毒杆菌毒素和正常培养液处理的肉毒杆菌毒素及正常培养液处理组。对于其结果，将MMP-1蛋白的活性基于正常对照组的活性来计算成百分比，并示于图3。
如图3所示，在仅用肉毒杆菌毒素处理的情况下，未能抑制MMP-1蛋白的活性，然而，与分别用富含外泌体的培养液和肉毒杆菌毒素处理的情况相比，当用富含外泌体的培养液和肉毒杆菌毒素一起处理的情况下，MMP-1蛋白的活性显著减少。尤其，这种效果也显著高于一起使用肉毒杆菌毒素和正常培养液进行处理的情况。
实验例4.对弹性蛋白分解酶的抑制的确认
通过MMP-12(matrix metalloproteinase-12)蛋白的活性抑制来确认了获得的富含外泌体的培养液的弹性蛋白分解酶抑制效果。
具体地，将100μl/ml的富含外泌体的培养液及5个单位的A型肉毒杆菌毒素添加到包含底物(N-succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide)及人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(elastase，Cat.#MAK246，Sigma-Aldrich)的反应液。使用酶联免疫检测仪(ELISA reader)在410nm条件下测定吸光度。此时，作为对照组，使用未进行任何处理的正常对照组，仅用肉毒杆菌毒素处理的肉毒杆菌毒素处理组、以及用肉毒杆菌毒素和正常培养液处理的肉毒杆菌毒素及正常培养液处理组。对于其结果，将MMP-12蛋白的活性基于正常对照组的活性来计算成百分比，并示于图4。
如图4所示，在仅用肉毒杆菌毒素处理的情况下，未能抑制MMP-12蛋白的活性，然而与分别用富含外泌体的培养液和肉毒杆菌毒素处理的情况相比，当用富含外泌体的培养液和肉毒杆菌毒素一起处理的情况下，MMP-12蛋白的活性显著减少。尤其，这种效果也显著高于一起使用肉毒杆菌毒素和正常培养液进行处理的情况。
实验例5.对胶原蛋白合成促进的确认
以如下方式，确认了所获得的富含外泌体的培养液的胶原蛋白合成促进效果。
首先，使用培养基106(medium 106)以常规方法培养了作为人真皮成纤维细胞株的CCD986SK(Thermo Fisher Scientific)细胞株。将制备的细胞接种到6孔板，每孔5×104，并向其添加100μl/ml的富含外泌体的培养液及5个单位的A型肉毒杆菌毒素。培养72小时后，用马松三色(Masson's Trichrome)对培养的细胞的胶原蛋白纤维进行染色，并用显微镜进行观察。并且，取细胞培养液，使用羊抗1型胶原蛋白-UNLB抗体(Southern Biotech)进行ELISA，并在450nm下测定吸光度，从而确认1型胶原蛋白的含量。此时，作为对照组，使用未进行任何处理的正常对照组，仅用肉毒杆菌毒素处理的肉毒杆菌毒素处理组、以及用肉毒杆菌毒素和正常培养液处理的肉毒杆菌毒素及正常培养液处理组。至于其结果，即将显微镜观察结果以及ELISA分析的结果示于图5。
如图5所示，在仅用肉毒杆菌毒素处理的情况下，未能促进胶原蛋白的合成，然而，在用富含外泌体的培养液和肉毒杆菌毒素一起处理的情况下，胶原蛋白的合成显著增加。尤其，这种效果也显著高于使用肉毒杆菌毒素和正常培养液一起进行处理的情况。
实验例6.对弹性蛋白合成促进的确认
以如下方式，确认了所获得的富含外泌体的培养液的弹性蛋白合成促进效果。
具体地，以与实验例3相同的条件及方法培养用富含外泌体的培养液及A型肉毒杆菌毒素处理的细胞，培养时间为7天。对培养的细胞的弹性蛋白纤维以如下方式进行确认：即用兔抗-人α-弹性蛋白抗体(Bio-Rad)进行染色，并用常规的方法进行免疫染色，之后用显微镜进行观察。并且，取细胞培养液，使用相同抗体进行ELISA，并在450nm下测定吸光度，从而确认了弹性蛋白的含量。此时，作为对照组，使用未进行任何处理的正常对照组，仅用肉毒杆菌毒素处理的肉毒杆菌毒素处理组、以及用肉毒杆菌毒素和正常培养液处理的肉毒杆菌毒素及正常培养液处理组。至于其结果，即将显微镜观察结果及ELISA分析的结果示于图6。
如图6所示，在仅用肉毒杆菌毒素处理的情况下，不仅未能促进弹性蛋白的合成，相反还表现出了抑制弹性蛋白的倾向，然而，在用富含外泌体的培养液和肉毒杆菌毒素一起处理的情况下，弹性蛋白的合成显著增加。尤其，这种效果也显著高于使用肉毒杆菌毒素和正常培养液一起进行处理的情况。
实验例7.对皮肤皱纹改善的确认
以如下方式，确认了所获得的富含外泌体的培养液的皮肤皱纹改善效果。
首先，用UVB灯(沃德公司)向7周龄雄性无毛(hairless)小鼠(SKH-1)的背部皮肤照射紫外线(UVB)。具体地，第一周是以1最小红斑量(minimun erythema dose，MED)照射UVB，第二周以2MED进行照射，第三周以3MED进行照射，第四周至第十周以4MED进行照射，从而诱发皮肤皱纹。混合50μl的富含外泌体的培养液和5个单位的A型肉毒杆菌毒素并皮下注射到诱发皮肤皱纹的小鼠。此时，注射是以1cm为间隔共分在构成圆形的5个位置进行注射，注射后第一天、第二周及第四周观察了皱纹。此时，作为对照组，使用未进行任何处理的正常皮肤组、仅用UVB处理的UVB处理组、仅用肉毒杆菌毒素处理的肉毒杆菌毒素处理组、以及用肉毒杆菌毒素和正常培养液处理的肉毒杆菌毒素和正常培养液处理组。之后，使用有机硅聚合物(
Impression Material)复制皱纹，并以将光的入射角固定在20度的状态用相机拍摄了皱纹的明暗图像。使用图像分析程序(Skin Visiometer SV600software)从拍摄的照片分析了粗糙度(roughness)。至于其结果，将所拍摄的图片示于图7，通过分析皮肤的粗糙程度来确认的皱纹评分(score)结果示于图8。
如图7及图8所示，UVB照射形成的皱纹在观察四周后仍维持11.7分。另外，在仅用肉毒杆菌毒素处理的情况下，处理一天后虽然改善至5.6分，然而第二周、第四周分别为7.5分、10.3分，即再次形成皱纹。然而，在用肉毒杆菌毒素和富含外泌体的培养液或正常培养液一起处理的情况下，皱纹的再形成明显受阻，尤其在用富含外泌体的培养液和肉毒杆菌毒素一起处理的情况下，四周后评分为6.4分，完全阻断了皱纹的再形成，维持了皱纹改善效果。
因此，由上述内容可知，与单独用肉毒杆菌毒素处理、或用肉毒杆菌毒素处理和正常培养液一起处理的情况相比，在用富含外泌体的培养液和肉毒杆菌毒素一起处理的情况下，皱纹生成抑制效果显著增加，并且可以长时间维持这种效果。
实验例8.皮肤再生效果的确认
通过划痕试验(wound scratch assay)方法确认了获得的富含外泌体的培养液的皮肤再生效果。
首先，使用EpiLife(Gibco)培养基以常规方法培养了作为人表皮角质细胞株的NHEK细胞株(Guangdong BioCell Biotechnology Co.，Ltd.)。将制备的细胞接种至6孔板，每孔3×105，并用100μl的移液管尖端诱导刮痕(scratch)创伤。之后，向其添加100μl/ml的富含外泌体的培养液和5个单位的A型肉毒杆菌毒素，培养24小时并进行观察。此时，作为对照组，使用未进行任何处理的正常对照组，仅用肉毒杆菌毒素处理的肉毒杆菌毒素处理组、以及用肉毒杆菌毒素和正常培养液处理的肉毒杆菌毒素及正常培养液处理组。使用相差显微镜(phase-contrast microscope)进行拍摄，从而定量评价了细胞的再生程度。
如图9所示，确认了正常对照组细胞再生约20％、肉毒杆菌毒素处理组细胞再生约35％。相反，在用肉毒杆菌毒素和富含外泌体的培养液或正常培养液一起处理的情况下，细胞再生显著增加，尤其，在用富含外泌体的培养液和肉毒杆菌毒素一起处理的情况下，约85至90％的细胞再生。
因此，由上述内容可知，在用富含外泌体的培养液和肉毒杆菌毒素一起处理的情况下，细胞再生效果显著增加。
Claims (16)
1.一种功能性组合物，其中，
包含永生化干细胞的富含外泌体的培养液及肉毒杆菌毒素。
2.根据权利要求1所述的功能性组合物，其中，
所述干细胞是人羊水来源干细胞。
3.根据权利要求1所述的功能性组合物，其中，
保藏所述永生化干细胞的保藏编号为KCTC12634BP。
4.根据权利要求1所述的功能性组合物，其中，
所述富含外泌体的培养液是通过在包含TNF-α的培养基中培养永生化干细胞而获得。
5.根据权利要求4所述的功能性组合物，其中，
所述TNF-α的浓度为3ng/ml至100ng/ml。
6.根据权利要求4所述的功能性组合物，其中，
所述富含外泌体的培养液是通过在10％以下的氧浓度条件下培养永生化干细胞而获得。
7.根据权利要求6所述的功能性组合物，其中，
所述富含外泌体的培养液是通过在1％至5％的氧浓度条件下培养永生化干细胞而获得。
8.根据权利要求1所述的功能性组合物，其中，
所述肉毒杆菌毒素为选自由A型、B型、C型、D型、E型、F型及G型的肉毒杆菌毒素组成的组中的一种以上。
9.根据权利要求8所述的功能性组合物，其中，
所述肉毒杆菌毒素为A型肉毒杆菌毒素。
10.根据权利要求1所述的功能性组合物，其中，
所述组合物是皮肤改善用组合物。
11.根据权利要求10所述的功能性组合物，其中，
通过选自由皮肤再生、改善皱纹、改善皮肤弹性、抑制皮肤老化及抑制产生皱纹的功能组成的组中的一种以上的功能来改善皮肤。
12.根据权利要求1所述的功能性组合物，其中，
所述组合物为保健功能食品、化妆料组合物或皮肤外用剂。
13.一种永生化干细胞的富含外泌体的培养液及肉毒杆菌毒素在制备预防、改善或治疗创伤的药物中的用途。
14.一种用于预防或治疗创伤的试剂盒，其中，
包括：
包含永生化干细胞的富含外泌体作为有效成分的培养液的第一组合物，以及
包含肉毒杆菌毒素作为有效成分的第二组合物。
15.根据权利要求14所述的用于预防或治疗创伤的试剂盒，其中，
所述永生化干细胞的富含外泌体的培养液及肉毒杆菌毒素以同时、依次或倒序的方式联合给药。
16.一种永生化干细胞的富含外泌体的培养液及肉毒杆菌毒素在制备用于改善皮肤的组合物中的用途。
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