KR102261434B1

KR102261434B1 - 장미 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 미백용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102261434B1
Application number: KR1020200152457A
Authority: KR
Inventors: 조병성
Original assignee: 주식회사 엑소코바이오
Priority date: 2020-11-16
Filing date: 2020-11-16
Publication date: 2021-06-07
Also published as: JP2023550238A; US20230248639A1; CN116472018A; EP4201396A1; WO2022102913A1

Abstract

본 발명은 장미 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 미백용 화장료 조성물을 제공한다. 본 발명의 미백용 화장료 조성물은 피부 미백, 피부 미용 등의 효과가 우수하다.

Description

장미 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 미백용 화장료 조성물 {A whitening cosmetic composition comprising an exosome derived from Rosa stem cell as an active ingredient}

본 발명은 장미 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 미백용 화장료 조성물에 관한 것이다.

사람의 피부색은 피부 내부의 멜라닌 농도와 분포에 따라 결정된다. 멜라닌은 티로시나아제에 의해 티로신으로부터 도파(DOPA), 도파퀴논으로 전환된 후 비효소적인 산화 반응을 거쳐 합성된다. 멜라닌이 과량 생성되면 색소 침착이 일어나고 얼굴, 목, 팔 등에 기미, 점, 주근깨 등이 생겨 외관상 보기 좋지 않다. 기미, 주근깨, 어두운 피부톤을 개선하기 위한 피부 미백제가 개발되고 있으나, 미백 효과가 우수하면서도 부작용이 없는 피부 미백제의 개발은 어려운 것이 현실이다. 예를 들어, 멜라닌을 생성하는 멜라노사이트를 선택적으로 공격하는 피부 미백제는 미백 효과는 탁월하지만 피부 독성의 부작용이 있다.

최근 세포 분비물(secretome)에 세포의 행동(behavior)을 조절하는 다양한 생체활성인자가 포함되어 있다는 연구가 보고되고 있으며, 특히 세포 분비물 내에는 세포 간 신호전달 기능을 갖는 '엑소좀(exosome)' 또는 '세포외 소포체(extracellular vesicle)'가 포함되어 있어 그 성분과 기능에 대한 연구가 활발히 진행 중에 있다.

세포는 세포외 환경에 다양한 막(membrane) 유형의 소포체를 방출하는데, 통상 이러한 방출 소포체들을 세포외 소포체(Extracellular vesicles, EVs)라고 부르고 있다. 세포외 소포체는 세포막 유래 소포체, 엑토좀(ectosomes), 쉐딩 소포체(shedding vesicles), 마이크로파티클(microparticles), 엑소좀 등으로 불려지기도 하며, 경우에 따라서는 엑소좀과는 구별되어 사용되기도 한다.

엑소좀은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터 크기의 소포체로서 내부에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, 핵산(mRNA, miRNA 등) 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다. 엑소좀은 유래된 세포의 성질 및 상태에 따라 특이적인 유전물질과 생체활성 인자들이 포함되어 있다. 증식하는 줄기세포 유래 엑소좀의 경우 세포의 이동, 증식 및 분화와 같은 세포 행동을 조절하고, 조직 재생과 관련된 줄기세포의 특성이 반영되어 있다(Nature Review Immunology 2002 (2) 569-579).

즉, 세포의 아바타라고 불리는 엑소좀은 세포와 유사하게 성장인자와 같은 생체활성 인자들이 포함되어 있는데, 생체활성 인자들을 세포와 세포 간에 실어 나르는 전달체 역할, 즉, 세포와 세포 간의 교신 역할을 한다. 엑소좀은 줄기세포, 면역세포, 섬유아세포 및 암세포 등의 동물세포로부터 방출될 뿐만 아니라 식물, 세균(bacteria), 균류(fungi), 조류(algae) 등 다양한 생물의 세포로부터도 방출되는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 엑소좀은 암세포, 면역세포, 중간엽 줄기세포 등의 배양액 외에도 식물줄기세포 배양액으로부터도 분리될 수 있다.

그러나 식물줄기세포로부터 유래된 엑소좀의 분리·정제 및 특성분석에 대한 연구는 아직 미진한 상태이다. 따라서 식물줄기세포로부터 유래된 엑소좀에 대한 보다 면밀한 특성분석 및 기능에 대한 연구가 필요하다.

장미는 북반구의 한대, 아한대, 온대, 및 아열대 등 넓은 지역에서 다양한 품종이 재배되고 있고, 그 추출물은 향수나 화장품 등에 사용되고 있다. 그러나 현재까지의 기술은 장미의 꽃잎을 건조하여 열수 추출하거나 용매 추출하여 얻은 추출물을 향수, 방향제 등에 사용하고 있는 수준이다. 또한, 장미 캘러스 배양물에는 생장조절물질이나 캘러스 유도물질이 포함되어 있어 천연물질의 화장품 원료라고 하기 어렵고 배양물 내에 포함된 생장조절물질 등이 피부 트러블 등의 부작용을 일으킬 우려가 있다. 장미 추출물 역시 열수 추출이나 용매 추출 과정에서 불순물이 포함되어 민감한 피부를 갖는 사람에게는 피부 트러블이나 알러지를 유발하는 경우가 빈발하다.

본 발명자들은 장미 줄기세포의 분리·정제 및 특성분석에 대해 예의 연구를 거듭한 결과, 장미 줄기세포로부터 유래된 엑소좀이 피부 미백 효능이 있는 것을 확인하고, 장미 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 미백용 화장료 조성물을 개발하였다.

한편, 상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 본 발명의 "선행 기술"로서 이용될 수 있다는 승인으로서 인용한 것은 아님을 이해하여야 한다.

대한민국 공개특허공보 제10-2015-0000977호 (2015.01.06) 대한민국 등록특허공보 제10-1503420호 (2015.03.17)

본 발명의 목적은 장미 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 미백용 화장료 조성물을 제공하는데 있다.

그러나, 전술한 바와 같은 본 발명의 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명은 장미 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 미백용 화장료 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 용어, "장미(Rosa spp.)"는 쌍떡잎 식물군, 장미목, 장미과 및 장미속에 속하는 식물을 총칭하며, 야생종과 개량을 가한 원예종을 모두 포함한다.

본 명세서에서 용어, "엑소좀(exosomes)"은 식물세포로부터 세포외 공간으로 분비 또는 방출된 막 구조를 갖는 나노 사이즈의 소낭을 의미하며, 엑소좀-유사 베지클 또는 엑소좀-유사 파티클로도 정의된다.

본 명세서에서 사용되는 용어인 "미백"은 멜라닌 등의 색소의 과다로 인하여 명도가 감소한 피부의 명도를 증가시키거나, 또는 피부의 명도를 일정 수준으로 유지하는 것을 포함한다.

본 발명의 일 구체예의 미백용 화장료 조성물에 있어서, 상기 장미 줄기세포는 장미의 배(胚) 또는 잎 유래 캘러스를 유도한 후 세포 배양하여 얻은 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예의 미백용 화장료 조성물은 예를 들어, 크림 또는 로션일 수 있다.

한편, 본 발명의 일 구체예의 화장료 조성물은 본 발명의 효과를 손상하지 않는 범위내에서 통상 화장품에 이용되는 성분, 예를 들면 보습제, 산화방지제, 유성성분, 자외선 흡수제, 유화제, 계면활성제, 증점제, 알콜류, 분말성분, 색재, 수성성분, 물, 각종 피부영양제 등을 필요에 따라 적절히 배합할 수 있다.

또한, 본 발명의 일 구체예의 화장료 조성물은 장미 줄기세포 유래의 엑소좀 이외에, 그 작용(피부 미백, 피부 미용 등)을 손상시키지 않는 한도에서 종래부터 사용된 피부 미백제, 피부 개선제 및/또는 보습제를 함께 혼합하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 장미 줄기세포 유래의 엑소좀은 하이드로겔, 히알루론산, 히알루론산 염(예를 들어 히알루론산 나트륨 등), 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종에 담지되거나 혼합될 수 있다. 본 발명의 일 구체예의 화장료 조성물에서, 상기 하이드로겔의 종류는 제한되지 않으나, 바람직하게는 겔화 고분자를 다가 알코올에 분산시켜 얻은 하이드로겔일 수 있다. 상기 겔화 고분자는 플루로닉, 정제한천, 아가로오스, 젤란검, 알긴산, 카라기난, 카시아검, 잔탄검, 갈락토만난, 글루코만난, 펙틴, 셀룰로오스, 구아검 및 로커스트빈검으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종일 수 있고, 상기 다가 알코올은 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 이소부틸렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 소르비톨, 자일리톨 및 글리세린으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종일 수 있다.

본 발명의 일 구체예의 화장료 조성물은 예를 들면, 패취, 마스크팩, 마스크시트, 크림, 토닉, 연고, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 로션, 젤, 오일, 팩, 스프레이, 에어졸, 미스트, 파운데이션, 파우더, 기름 종이 등의 다양한 형태에 적용할 수 있다. 예를 들어, 상기 화장료 조성물은 패취, 마스크팩 또는 마스크시트의 적어도 일면(一面)에 도포되거나 침적될 수 있다.

본 발명의 일 구체예의 화장료 조성물은 피부 미백, 피부 미용 등을 목적으로 사용되며, 화장품 제형은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다. 예를 들어 패취, 마스크팩, 마스크시트, 유연화장수, 영양화장수, 수렴화장수, 영양크림, 마사지크림, 아이크림, 클렌징크림, 에센스, 아이에센스, 클렌징로션, 클렌징폼, 클렌징워터, 선스크린, 립스틱, 비누, 샴푸, 계면활성제-함유 클렌징, 입욕제, 바디로션, 바디크림, 바디오일, 바디에센스, 바디세정제, 염모제, 헤어토닉 등으로 제형화할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예의 화장료 조성물은 화장품에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 그리고 담체를 포함할 수 있다. 또한, 화장료 조성물에 대한 각각의 제형에 있어서, 다른 성분들은 화장료 조성물의 종류 또는 사용목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다.

본 발명의 다른 구체예는 상기 화장료 조성물을 이용한, 피부 미백방법을 제공한다.

본 발명의 일 구체예의 피부 미백방법은, (a) 상기 화장료 조성물을 포유동물의 피부에 직접 도포하는 것, (b) 상기 화장료 조성물이 도포되거나 침적된 패취, 마스크팩 또는 마스크시트를 포유동물의 피부에 접촉 또는 부착하는 것, 또는 상기 (a) 및 (b)를 순차적으로 진행하는 것을 포함한다. 상기 (a) 단계에서는 화장료 조성물로서 로션이나 크림이 사용될 수 있다.

대안으로, 본 발명의 일 구체예의 피부 미백방법은, (c) 상기 (b) 단계 이후에 상기 패취, 마스크팩 또는 마스크시트를 상기 포유동물의 피부로부터 제거하고, 상기 화장료 조성물을 포유동물의 피부에 도포하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 (c) 단계에서는 화장료 조성물로서 로션이나 크림이 사용될 수 있다.

본 발명의 일 구체예의 피부 미백방법에 있어서, 상기 포유동물은 인간, 개, 고양이, 설치류, 말, 소, 원숭이, 또는 돼지일 수 있다.

본 발명의 장미 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 미백용 화장료 조성물은 종래의 장미 여과물, 단순 추출물, 캘러스 배양액에 비해 생장조절인자와 같은 불순물 함유 가능성이 낮으며, 장미 줄기세포 배양액 여과물 및 장미 추출물 등에 비해 세포 독성이 적은 장점이 있다. 본 발명의 미백용 화장료 조성물은 피부 미백, 피부 미용 등의 효과가 우수하다.

한편, 전술한 바와 같은 효과들에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

도 1A는 실시예 3에 따라 수득된 장미 줄기세포 유래 엑소좀(100 kDa 엑소좀)에 대한 NTA 분석 결과를 도시한 그래프이고, 도 1B는 실시예 3에 따라 수득된 장미 줄기세포 유래 엑소좀(500 kDa 엑소좀)에 대한 NTA 분석 결과를 도시한 그래프이며, 도 1C는 실시예 3에서 TFF를 수행하기 전에 여과된 배양액(CM)에 대한 NTA 분석 결과를 도시한 그래프이다.
도 2는 본 발명의 장미 줄기세포 유래 엑소좀을 멜라닌 생성 세포에 처리한 경우 장미 줄기세포 배양액 여과물을 멜라닌 생성 세포에 처리한 경우 보다 멜라닌 생성량을 현저히 감소시키는 것을 나타내는 그래프이다.
도 3은 멜라닌 생성 세포를 본 발명의 장미 줄기세포 유래 엑소좀으로 처리하고 배양한 경우의 세포생존율이 멜라닌 생성 세포를 장미 줄기세포 배양액 여과물로 처리하고 배양한 경우의 세포생존율 보다 높고 세포 독성이 적은 것을 나타내는 그래프이다.

이하 본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌들은 본 발명에 참고로서 통합된다.

명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

실시예

실시예 1: 세포의 배양

마우스 멜라노마세포(mus musculus melanoma)인 B16F10 세포는 ATCC에서 구입하여, 10% 우태아 혈청 (fetal bovine serum: ThermoFisher Scientific에서 구입), 1% 항생제-항진균제 (antibiotics-antimycotics: ThermoFisher Scientific에서 구입), L-글루타민 (ThermoFisher Scientific에서 구입) 및 소듐 피루베이트 (sodium pyruvate; ThermoFisher Scientific에서 구입)가 함유된 DMEM, 무페놀레드 (ThermoFisher Scientific에서 구입) 배지에 5% CO₂, 37℃ 조건에서 계대 배양하였다.

실시예 2: 장미 줄기세포의 제조

당업계에 알려진 식물 줄기세포 제조 및 배양 방법에 따라, 장미의 배(胚) 및/또는 잎 유래 캘러스를 유도하고, 유도된 장미 캘러스를 세포 배양한다. 그리고, 성장상태가 좋은 캘러스를 선택하고 대량으로 배양하여 장미 줄기세포 배양액을 준비한다.

실시예 3: 장미 줄기세포 유래의 엑소좀의 제조

실시예 2와 같은 방식으로 제조된 장미 줄기세포 배양액을 (주)바이오에프디엔씨(대한민국 인천광역시에 소재하는 Damask Rose 줄기세포 배양액 공급업체)에서 입수하였다. 장미 줄기세포 배양액을 0.22 ㎛ 필터로 여과하여 세포 잔해물, 노폐물 및 거대 입자 등의 불순물을 제거해 주었다. 여과된 배양액으로부터, 접선흐름여과장치(Tangential Flow Filtration; TFF)를 이용하여 장미 줄기세포 유래의 엑소좀을 분리하였다. 접선흐름여과장치를 이용한 장미 줄기세포 유래의 엑소좀의 분리를 위해 MWCO 100 kDa TFF 필터 또는 500 kDa TFF 필터를 사용하였다. 이하, 100 kDa TFF 필터를 사용하여 분리된 장미 줄기세포 유래의 엑소좀을 "100 kDa 엑소좀"이라고 하고, 500 kDa TFF 필터를 사용하여 분리된 장미 줄기세포 유래의 엑소좀을 "500 kDa 엑소좀"이라 한다.

분리된 장미 줄기세포 유래 엑소좀의 크기와 농도는 NS300(Malvern Panalytical에서 구입)을 이용한 나노입자트래킹분석(nanoparticle tracking analysis; NTA)으로 확인하였다(도 1A 및 도 1B).

실시예 4: 멜라닌 생성 억제 효과

실시예 3에서 준비된 장미 줄기세포 배양액 혹은 장미 줄기세포 유래의 엑소좀(100 kDa 엑소좀 및 500 kDa 엑소좀 각각)에 의한 미백효과를 마우스 멜라노마 세포에서 멜라닌 생성 억제 정도를 통해 확인하였다. 상기 멜라노마 세포는 마우스 흑색종에서 유래한 세포이며, 멜라닌이라는 흑색 색소를 분비하는 세포이다. 멜라노마 세포를 48-웰 플레이트에 단위 면적당 7,000 세포씩 분주한 후 5% CO₂, 37℃ 조건에서 24시간 배양하였다.

장미 줄기세포 배양액을 멜라닌 합성 자극제인 α-MSH가 혼합된 배양배지에 20%가 되도록 희석하여 멜라노마 세포에 처리한 후 5% CO₂, 37℃ 조건에서 48시간 동안 멜라노마 세포를 배양하였다. 또한, 장미 줄기세포 유래의 엑소좀(100 kDa 엑소좀 또는 500 kDa 엑소좀)을 α-MSH가 혼합된 배양배지에 20%, 6%가 되도록 희석하여 멜라노마 세포에 처리한 후 5% CO₂, 37℃ 조건에서 48시간 동안 멜라노마 세포를 배양하였다. 이때 처리된 장미 줄기세포 유래의 엑소좀(100 kDa 엑소좀 또는 500 kDa 엑소좀)의 농도는 2.5×10⁹ 입자(particles)/mL(20%) 및 8.0×10⁸ 입자/mL(6%)가 되도록 하였다. 양성대조군인 알부틴(Arbutin)(최종농도: 1 mM) 또한 α-MSH가 혼합된 배양배지에 희석하여 멜라노마 세포에 처리하였다. 이후, 배양액을 회수하고 세척용액(PBS; ThermoFisher에서 구입)을 이용하여 멜라노마 세포를 세척하였다.

상기 회수된 배양배지와 CCK-8 어세이 시약(Dojindo)을 혼합하였고, 5% CO₂, 37℃ 조건에서 1시간 30분 동안 인큐베이션한 후 상층액을 96-웰 플레이트로 옮겨 405 nm 흡광도를 측정하였다. 또한, 48-웰 플레이트 내 멜라노마 세포를 세척용액으로 세척한 후, 세척된 멜라노마 세포에 대해 10% DMSO를 혼합한 1 N NaOH(MerckMillipore에서 구입)를 처리한 후 플레이트를 밀봉하고 80℃ 조건에서 30분간 가열하여 멜라노마 세포 내 멜라닌을 추출하였다. 추출한 멜라닌은 405 nm 흡광도를 측정하여 멜라닌 양을 계산하였다.

그 결과, 본 발명의 장미 줄기세포 엑소좀(100 kDa 엑소좀 및 500 kDa 엑소좀)은 농도 의존적으로 멜라노마 세포에서의 멜라닌 합성을 감소시켰으며, 특히 장미 줄기세포 배양액보다 멜라노마 세포에서의 멜라닌 합성을 현저히 감소시키는 것을 확인할 수 있었다(도 2 참조). 또한, 100 kDa 엑소좀의 멜라닌 합성 감소 효능(미백 효능)은 미백제로 널리 사용되고 있는 알부틴과 대등한 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 장미 줄기세포 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물은 미백 효과를 가지며, 미백용 화장료 조성물의 유효 성분으로서 유용하게 활용될 수 있다.

실시예 5: 세포 생존율에 대한 영향 확인

본 실시예에서는 마우스 멜라노마 세포인 B16F10 세포에서 엑소좀의 독성을 평가하기 위해 실시예 3에서 준비된 장미 줄기세포 배양액 혹은 장미 줄기세포 유래의 엑소좀(100 kDa 엑소좀 또는 500 kDa 엑소좀)을 B16F10 세포에 처리하고 세포의 증식률을 확인하였다.

B16F10 세포를 10% FBS를 포함한 DMEM에 현탁시킨 후 48-웰 플레이트 내 각 웰 당 7,000 개의 세포를 분주하고 37℃, 5% CO₂인큐베이터에서 24시간 배양하였다. 24시간 후 배양액을 제거하고, 양성대조군인 알부틴, 장미 줄기세포 배양액, 100 kDa 엑소좀 및 500 kDa 엑소좀 각각을 실시예 4와 같은 농도로 B16F10 세포에 처리하여 48시간 동안 배양하면서 세포 생존율을 평가하였다. 세포 생존율(cell viability)을 CCK-8 시약(CCK-8 assay reagent)(Dojindo에서 구입)과 마이크로플레이트 리더(microplate reader)(Molecular Devices에서 구입)를 이용하여 측정하였다.

세포 생존율 측정 결과, 장미 줄기세포 배양액 여과물을 처리한 경우에는 세포 생존율이 떨어지는 반면에, 본 발명의 장미 줄기세포 유래 엑소좀(100 kDa 엑소좀 및 500 kDa 엑소좀)을 처리한 경우에는 세포 생존율의 변화가 없어 세포 생존율에 미치는 영향, 즉 세포 독성이 적은 것을 확인하였다(도 3).

이상, 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.

Claims

장미 줄기세포 배양액으로부터 분리된 장미 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 미백용 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
크림 또는 로션인, 미백용 화장료 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 장미 줄기세포는 장미의 배(胚) 또는 잎 유래 캘러스를 유도한 후 세포 배양하여 얻은 것을 특징으로 하는 미백용 화장료 조성물.
장미 줄기세포 배양액으로부터 분리된 장미 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 미백용 화장료 조성물을 포유동물의 피부에 적용하는 것을 포함하는, 피부 미백방법.
제4항에 있어서,
(a) 상기 미백용 화장료 조성물을 포유동물의 피부에 직접 도포하는 것, (b) 상기 미백용 화장료 조성물이 도포되거나 침적된 패취, 마스크팩 또는 마스크시트를 포유동물의 피부에 접촉 또는 부착하는 것, 또는 상기 (a) 및 (b)를 순차적으로 진행하는 것을 포함하는, 피부 미백방법.
제5항에 있어서,
상기 (a) 단계에서는 미백용 화장료 조성물로서 로션이나 크림이 사용되는, 피부 미백방법.
제5항 또는 제6항에 있어서,
(c) 상기 (b) 단계 이후에 상기 패취, 마스크팩 또는 마스크시트를 상기 포유동물의 피부로부터 제거하고, 상기 미백용 화장료 조성물을 포유동물의 피부에 도포하는 단계를 더 포함하는, 피부 미백방법.
제7항에 있어서,
상기 (c) 단계에서는 미백용 화장료 조성물로서 로션이나 크림이 사용되는, 피부 미백방법.
제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 포유동물은 인간, 개, 고양이, 설치류, 말, 소, 원숭이, 또는 돼지인, 피부 미백방법.