JP7109110B2 - バラ幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含む化粧料組成物 - Google Patents
バラ幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含む化粧料組成物 Download PDFInfo
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Description
当業界に知られている植物幹細胞の製造及び培養方法によって、バラの胚芽及び/又は葉由来のカルスを誘導し、誘導されたバラカルスを細胞培養する。そして、成長の状態が良いカルスを選択して大量に培養し、バラ幹細胞培養液を準備する。
実施例1と同じ方法で製造されたバラ幹細胞培養液を(株)バイオエフディエンシー(大韓民国仁川広域市に所在するDamask Rose幹細胞培養液の供給業者)から入手した。バラ幹細胞培養液を0.22μmフィルタで濾過して細胞残骸物、老廃物及び巨大粒子などの不純物を除去した。濾過された培養液から、タンジェント流濾過装置(Tangential Flow Filtration;TFF)を用いて、バラ幹細胞由来のエキソソームを分離した。
バラ幹細胞由来のエキソソームが、ヒト皮膚繊維芽細胞(CEFO CO.,LTD.から購入)内に伝達されるか否かを確認するために、次のような分析を行った。実施例2で準備されたバラ幹細胞由来のエキソソームの膜を蛍光染色するためにPKH67(シグマから購入)の蛍光色素と反応させた。反応後、反応液をMW3000(Thermo Fisher Scientificから購入)のカラムで分画してエキソソーム膜に染色されていない遊離PHK67(free PKH67)を除去した。陰性対照群には、PKH67蛍光色素を緩衝溶液と反応させた後、MW3000カラムに分画したものを使用した。PKH67で染色されたエキソソームをあらかじめ培養して準備されたヒト皮膚繊維芽細胞とともに培養した後、時間によりエキソソームが細胞内に伝達されるか否かを蛍光顕微鏡を用いて観察した。細胞の核を染色するためにヘキスト(Hoechst)蛍光色素(シグマから購入)を使用し、細胞膜を染色するためにCellMask Orange蛍光染料を使用した。エキソソームが細胞内に伝達されるか否かを確認した結果、蛍光染色されたエキソソームが細胞内に伝達されて緑色蛍光が細胞内部に時間の経過に応じて蓄積されることを確認した(図3)。
ウシ胎児血清を含むDMEM培地に分散されたヒト皮膚繊維芽細胞(CEFO CO.,LTD.から購入)を、マルチウェルプレートに分株した後、24時間培養して無血清培地でさらに48時間培養した。その後、実施例2で準備されたバラ幹細胞培養液又はバラ幹細胞由来のエキソソームを無血清培地にそれぞれ20%、6%、2%になるように希釈した後、ヒト皮膚繊維芽細胞に処理して、ヒト皮膚繊維芽細胞を培養した。この時、処理されたバラ幹細胞のエキソソームの濃度は、それぞれ1.0×109粒子(particles)/mL(20%)、3.0×108粒子/mL(6%)、及び1.0×108粒子/mL(2%)になるようにした。その後、培養液を回収して遠心分離した後、遠心分離された培養液を準備した。プロコラーゲンタイプIC-ペプチド(PIP)に対するEIAキット(Takaraから購入)を用いて、ヒト皮膚繊維芽細胞から合成され、培養液に蓄積されたコラーゲンの量を測定した。細胞破砕液の総タンパク質の量はBCAタンパク質定量キット(ThermoFisher Scientificから購入)で測定した。相対的なコラーゲンの量は総タンパク質の量で補正した。コラーゲンの量を測定した結果、本発明のバラ幹細胞由来のエキソソームは、ヒト皮膚繊維芽細胞でコラーゲンの合成を増加させた(図4)。一方、濾過された培養液は、陰性対照群と比較して、コラーゲンの合成を減少させた(図4)。
ヒト毛乳頭細胞(human hair follicle dermal papilla cell(HDP);CEFO CO.,LTD.から購入)は、HDP培養培地(CEFO CO.,LTD.から購入)で培養した。ウェル当たり1.5×104個のHDP細胞を接種した後、37℃、5%CO2の条件で24時間培養した。バラ幹細胞培養液濾過液又はバラ幹細胞由来のエキソソームをHDP培養培地にそれぞれ2%、6%及び20%になるように添加した。この時、バラ幹細胞由来のエキソソームの濃度は、それぞれ1.0×108粒子(particles)/mL(2%)、3.0×108粒子/mL(6%)、及び1.0×109粒子/mL(20%)になるようにした。
Claims (8)
- 細胞毒性を減らすとともに皮膚でコラーゲン生成を促進する、皮膚再生、皮膚の弾力改善又は皮膚のしわ改善用化粧料組成物であって、バラ幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含む皮膚再生、皮膚の弾力改善又は皮膚のしわ改善用化粧料組成物。
- クリーム又はローションである、請求項1に記載の皮膚再生、皮膚の弾力改善又は皮膚のしわ改善用化粧料組成物。
- 請求項1に記載の化粧料組成物を用いて、治療用を除く皮膚再生、皮膚の弾力改善又は皮膚のしわ改善を通じて哺乳動物の皮膚の状態を調節する美容方法。
- (a)前記化粧料組成物を哺乳動物の皮膚に直接塗布すること、(b)前記化粧料組成物が塗布又は浸漬されたパッチ、マスクパック又はシートマスクを哺乳動物の皮膚に接触又は付着すること、若しくは前記(a)及び(b)を順次進行することを含む、請求項3に記載の美容方法。
- 前記(a)ステップでは、化粧料組成物としてローションやクリームが使用される、請求項4に記載の美容方法。
- (c)前記(b)ステップの後に、前記パッチ、マスクパック又はシートマスクを前記哺乳動物の皮膚から除去し、前記化粧料組成物を哺乳動物の皮膚に塗布するステップをさらに含む、請求項4又は5に記載の美容方法。
- 前記(c)ステップでは、化粧料組成物としてローションやクリームが使用される、請求項6に記載の美容方法。
- 前記哺乳動物は、ヒト、イヌ、ネコ、齧歯類、ウマ、ウシ、サル、又はブタである、請求項3~5のいずれか一項に記載の美容方法。
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