KR102008667B1

KR102008667B1 - 안정화된 엑소좀의 필러 조성물

Info

Publication number: KR102008667B1
Application number: KR1020180130625A
Authority: KR
Inventors: 이용원; 김광일; 조병성
Original assignee: 주식회사 엑소코바이오
Priority date: 2017-11-02
Filing date: 2018-10-30
Publication date: 2019-08-08
Also published as: KR20190093541A; WO2019088656A1; KR20190050286A

Abstract

본 발명은 히알루론산, 히알루론산 염, 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종과, 상기 히알루론산, 히알루론산 염, 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종에 혼합되어 유지되는 엑소좀을 포함하는 안정화된 엑소좀의 필러 조성물을 제공한다. 본 발명의 안정화된 엑소좀의 필러 조성물은 엑소좀의 안정성이 증가됨에 따라 엑소좀으로부터 유래되는 미용적 또는 치료적 효과를 오래 지속할 수 있고, 미용적 또는 치료적 효과가 오래 지속되면서 주사가 편리하고 환자에게 고통을 덜 주는 히알루론산 기반의 필러의 구현에 적합하게 응용될 수 있다.

Description

안정화된 엑소좀의 필러 조성물{Filler composition of stabilized exosome}

본 발명은 안정화된 엑소좀의 필러 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 히알루론산 기반의 필러 조성물에 엑소좀을 함유시켜 엑소좀의 안정성을 증가시킨 필러 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 엑소좀의 안정성을 증가시키고, 히알루론산 기반 필러에 의한 미용 효과를 부가할 수 있는 안정화된 엑소좀의 필러 조성물에 관한 것이다.

최근 세포 분비물(secretome)에 세포의 행동(behavior)을 조절하는 다양한 생체활성인자가 포함되어 있다는 연구가 보고되고 있으며, 특히 세포 분비물 내에는 세포 간 신호전달 기능을 갖는 '엑소좀(exosome)'이 포함되어 있어 그 성분과 기능에 대한 연구가 활발히 진행 중에 있다.

세포는 세포외 환경에 다양한 막(membrane) 유형의 소포체를 방출하는데, 통상 이러한 방출 소포체들을 세포외 소포체(Extracellular vesicles, EV)라고 부르고 있다. 세포외 소포체는 세포막 유래 소포체, 엑토좀(ectosomes), 쉐딩 소포체(shedding vesicles), 마이크로파티클(microparticles), 엑소좀 등으로 불려지기도 하며, 경우에 따라서는 엑소좀과는 구별되어 사용되기도 한다.

엑소좀은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터 크기의 소포체로서 내부에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, 핵산(mRNA, miRNA 등) 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다. 엑소좀은 유래된 세포의 성질 및 상태에 따라 특이적인 유전물질과 생체활성 인자들이 포함되어 있다. 증식하는 줄기세포 유래 엑소좀의 경우 세포의 이동, 증식 및 분화와 같은 세포 행동을 조절하고, 조직 재생과 관련된 줄기세포의 특성이 반영되어 있다(Nature Review Immunology 2002 (2) 569-579).

그러나 엑소좀을 이용한 특정 질환의 치료에 대한 가능성 제시 등 다양한 연구가 이루어지고 있음에도 불구하고, 엑소좀을 안정적으로 유지·보관할 수 있는 새로운 제형 개발과 엑소좀의 사용 편의성 및 효능 증대 등을 위한 다양한 의료 내지는 미용기술과의 접목은 상대적으로 주목받고 있지 못하고 있다.

즉, 세포의 아바타라고 불리는 엑소좀은 세포와 유사하게 성장인자와 같은 생체활성 인자들이 포함되어 있는데, 엑소좀을 실온에서 보관할 경우 성장인자 등의 활성이 저하되는 안정성의 문제가 발생한다. 또한, 엑소좀을 단순 냉장 보관할 경우에도 보관 시간 및 방법 등에 따라 전체적인 엑소좀의 물성 및 안정성에 변화가 생기고, 엑소좀에 포함된 생체활성 인자들의 활성도 저하될 수 있다.

한편, 얼굴이나 신체 등의 외모에 대한 관심이 증가함에 따라 피부 상태를 개선하고 외모의 부족한 부분을 보완하고자 하는 미용 수요가 늘어나고 있다. 특히, 피부 주름이나 그 밖의 피부 외관 상태를 개선하는 것을 목적으로 하는 코스메틱 시술에 대한 관심이 높아지고 있다. 예를 들어, 보톡스나 필러를 국소적으로 피부에 주사하여 주름을 개선하는 방법이 있다.

히알루론산 또는 히알루로난(hyaluronan)은 N-아세틸-D-글루코사민과 D-글루쿠론산으로 이루어진 반복 단위가 선형으로 연결되어 있는 생체 고분자 물질로, 결합조직 및 피부에 고농도로 존재한다. 그 밖에 히알루론산은 닭벼슬, 체액, 안구의 유리액, 관절의 활액, 동물의 완충조직, 태반 등에서 발견된다. 히알루론산 또는 그의 염은 생체적합성, 생분해성 및 안정성이 우수하여 주름 개선용 필러, 관절염 개선 또는 치료제, 상처 치료제, 안구수술보조제, 유착방지제, 약물 전달체 등으로 활용되고 있다.

히알루론산 또는 그의 염을 이용한 필러는 예를 들어, 안면 라인 및 주름의 외양을 감소시키기 위해 환자에게 주입되는 제제이다. 히알루론산 기반의 필러는 안면 주름 및 패인 곳 등의 연부 조직에 주입되어 해당 조직에서 소실된 내인성 기질 폴리머를 대체하거나, 기존의 기질 폴리머의 기능을 향상시킴으로써 연조직 병태를 치료하는 효과를 나타낸다. 또한, 히알루론산 기반의 필러는 볼륨증대 효과를 기반으로 볼륨감이 작은 신체 부위, 예를 들어 입술, 코, 이마, 볼, 가슴, 성기 등에 국소적으로 적용함으로써 해당 신체 부위에 볼륨감을 줄 수 있다. 뿐만 아니라, 히알루론산 기반의 필러는 퇴행성 관절염 환자의 관절 내에 주사되어 증상을 개선 또는 호전시킬 수 있다.

본 발명자들은 엑소좀의 새로운 응용분야 및 의료 내지는 미용기술과의 접목에 대해 예의 연구를 거듭하던 중, 히알루론산 기반의 필러 조성물에 엑소좀을 함유시킨 경우 엑소좀의 안정성이 증가하고 히알루론산 기반 필러 본연의 미용 효과도 부가할 수 있는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

한편, 상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 본 발명의 "선행 기술"로서 이용될 수 있다는 승인으로서 인용한 것은 아님을 이해하여야 한다.

대한민국 등록특허공보 제10-1062320호 (2011.09.05) 대한민국 공개특허공보 제10-2008-0109774호 (2008.12.17) 대한민국 공개특허공보 제10-2012-0125293호 (2012.11.14) 대한민국 공개특허공보 제10-2016-0116802호 (2016.10.10)

Pin Li et al., Progress in Exosome Isolation Techniques, Theranostics, 2017, 7(3): 789-804 (2017.01.26) Coumans et al., Methodological Guidelines to Study Extracellular Vesicles, Circulation Research, 2017, 120:1632-1648 (2017.05.12)

본 발명의 목적은 안정화된 엑소좀의 필러 조성물을 제공하는 것으로서, 보다 상세하게는 히알루론산 기반의 필러 조성물에 엑소좀을 함유시켜 엑소좀의 안정성을 증가시킨 필러 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 엑소좀의 안정성을 증가시키고, 히알루론산 기반 필러에 의한 미용 효과를 부가할 수 있는 안정화된 엑소좀의 필러 조성물을 제공하는데 있다.

그러나, 전술한 바와 같은 본 발명의 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 히알루론산, 히알루론산 염(예를 들어 히알루론산 나트륨), 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종과, 상기 히알루론산, 히알루론산 염, 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종에 혼합되어 유지되는 엑소좀을 포함하는 안정화된 엑소좀의 필러 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 용어, "엑소좀(exosomes)"은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터(바람직하게는 대략 30~200 nm) 크기의 소포체를 의미한다(단, 분리 대상이 되는 세포 종류, 분리방법 및 측정방법에 따라 엑소좀의 입자 크기는 가변될 수 있음)(Vasiliy S. Chernyshev et al., "Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes", Anal Bioanal Chem, (2015) DOI 10.1007/s00216-015-8535-3). 엑소좀에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, 핵산(mRNA, miRNA 등) 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다.

본 명세서에서 용어, "생물학적 용액"은 생물기원의 액체 용액으로서 엑소좀이 분산, 현탁, 침전, 부유 또는 혼합되어 있는 용액을 의미하고, 예를 들어 세포 배양액, 세포 배양 상청액, 줄기세포 배양액, 줄기세포 배양 상청액, 전혈, 혈청, 제대혈, 혈장, 복수액, 뇌 및 뇌척수액, 태반 추출액 및 골수 흡입물 등을 들 수 있다. 그러나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니고 다양한 동물, 식물, 세균(bacteria), 균류(fungi), 조류(algae) 등 다양한 생물 기원의 용액을 배제하는 것이 아님은 물론이다. "생물학적 용액"은 엑소좀을 방출 및/또는 분비시키는 조건 하에서 배양 또는 인큐베이션될 수 있고, 냉동 및 해동될 수도 있다.

한편, 본 명세서에서 사용된 "엑소좀"이란 용어는 다양한 동물, 식물, 세균(bacteria), 균류(fungi), 조류(algae) 등의 세포, 바람직하게는 줄기세포에서 분비되어 세포외 공간으로 방출된 나노 크기의 베지클 구조를 갖고 있고 엑소좀과 유사한 조성을 갖는 베지클(예를 들어, 엑소좀-유사 베지클)을 모두 포함하는 것을 의미한다.

그러나 본 발명에서 사용되는 엑소좀은 히알루론산 기반 필러에 의한 미용 효과를 증가시키거나 적어도 감소시키지 않으면서 인체에 불리한 작용을 일으키지 않는 것이라면 당업계에서 사용되고 있거나 향후 사용될 수 있는 다양한 엑소좀을 사용할 수 있음은 물론이다. 따라서, 후술하는 실시예들의 분리방법에 따라 분리된 엑소좀은 본 발명에서 사용될 수 있는 엑소좀의 일례로서 이해되어야 하며, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아님을 명백히 밝혀 둔다.

본 발명의 일 구체예의 안정화된 엑소좀의 필러 조성물은, 히알루론산, 히알루론산 염, 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종과, 상기 히알루론산, 히알루론산 염, 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종에 혼합되어 유지되는 엑소좀을 포함한다.

본 발명의 일 구체예의 안정화된 엑소좀의 필러 조성물은, 가교되지 않은 히알루론산 겔 및/또는 가교된 히알루론산 겔을 더 포함할 수 있다. 상기 가교된 히알루론산 겔은 1,4-부탄다이올 다이글리시딜 에테르 (BDDE), 1,4-비스(2,3-에폭시프로폭시)부탄, 1,4-비스글리시딜옥시부탄, 1,2-비스(2,3-에폭시프로폭시)에틸렌 및 1-(2,3-에폭시프로필)-2,3-에폭시사이클로헥산 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 가교결합제로 가교결합된 히알루론산 겔일 수 있다.

본 발명을 한정하지 않는 예시로서, 상기 엑소좀은 줄기세포 유래의 엑소좀, 식물 유래의 엑소좀, 또는 효모 유래의 엑소좀일 수 있다.

예를 들어, 상기 줄기세포 유래의 엑소좀은 지방, 골수, 제대 또는 제대혈 줄기세포 유래의 엑소좀일 수 있다.

또한, 예를 들어, 상기 식물 유래의 엑소좀은 장미 줄기세포 유래의 엑소좀 또는 에델바이스 유래의 엑소좀일 수 있다.

상기 장미 줄기세포 유래의 엑소좀은 장미의 배(胚) 또는 잎 유래 캘러스의 배양액, 또는 장미의 형성층 또는 전형성층 유래 캘러스의 배양액으로부터 분리 정제된 것일 수 있다. "장미(Rosa spp.)"는 쌍떡잎 식물군, 장미목, 장미과 및 장미속에 속하는 식물을 총칭하며, 야생종과 개량을 가한 원예종을 모두 포함한다.

상기 에델바이스 유래의 엑소좀은 에델바이스의 잎 또는 줄기 조직으로부터 얻은 식물세포의 배양액, 또는 에델바이스 종자로부터 발아된 떡잎에 상처를 내어 유도시킨 캘러스의 배양액으로부터 분리 정제된 것일 수 있다. "에델바이스"는 레온토포디움 속 (Leontopodium sp.) 식물을 의미하며, 본 발명을 한정하지 않는 예시로서 레온토포디움 자포니쿰(Leontopodium japonicum)일 수 있다.

또한, 예를 들어, 상기 효모 유래의 엑소좀은 와인 효모 유래의 엑소좀 또는 갈락토마이세스 유래의 엑소좀일 수 있다.

상기 와인 효모 유래의 엑소좀은 와인 효모 배양액, 와인 효모 발효물 또는 포도주로부터 분리 정제된 것일 수 있다. "와인 효모"는 외기성 와인 효모(야생 와인 효모)와 배양된 와인 효모(드라이 와인 효모)를 모두 포함한다. 본 발명을 한정하지 않는 예시로서, 야생 와인 효모로는 칸디다(Candida), 피키아(Pichia), 한세니아스포라(Hanseniaspora), 자이고사카로마이세스(Zygosaccharomyces), 메트쉬니코비아케에(Metschnikowiaceae), 클로에케라(Kloeckera) 등이 있고, 일정한 품질의 포도주를 만들기 위해 사용되는 드라이 와인 효모로는 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)가 있다.

상기 갈락토마이세스 유래의 엑소좀은 갈락토마이세스 배양액 또는 갈락토마이세스 발효물로부터 분리 정제된 것일 수 있다. "갈락토마이세스"는 디포다스카세에(Dipodascaceae) 과(科)에 속하는 균류(fungi)로서, 양조 또는 발효 과정에 사용되는 갈락토마이세스 속(屬) 효모들을 지칭한다.

본 발명을 한정하지 않는 하나의 예시로서, 상기 엑소좀은 하기의 단계들을 수행하여 수득될 수 있다: (a) 생물학적 용액에 트레할로오스를 첨가하는 단계, (b) 상기 트레할로오스가 첨가된 생물학적 용액을 여과하는 단계, (c) 상기 여과된 생물학적 용액으로부터, TFF(Tangential Flow Filtration)를 이용하여 엑소좀을 분리하는 단계, 및 (d) 탈염과 버퍼교환(diafiltration)에 사용되는 완충용액에 트레할로오스를 첨가하고, 상기 트레할로오스가 첨가된 완충용액을 이용한 TFF(Tangential Flow Filtration)를 이용하여, 상기 분리된 엑소좀에 대한 탈염과 버퍼교환(diafiltration)을 수행하는 단계.

한편, 상기 (d) 단계에서 탈염과 버퍼교환(diafiltration)에 사용되는 완충용액에 트레할로오스를 첨가하면, 입자크기 분포가 균일하고 순도가 높은 엑소좀을 효과적으로 수득할 수 있다(도 6 참조). TFF에 의한 엑소좀 분리 전의 사전 여과 과정((b) 단계)과 엑소좀 분리 후 TFF에 의한 탈염 및 버퍼교환 과정((d) 단계)에서 트레할로우스를 사용하는 것에 의해 고순도의 입자크기 분포가 균일한 엑소좀을 높은 수율로 수득할 수 있다. 한편, 트레할로오스는 세포 잔해물, 노폐물, 단백질 및 거대 입자와 같은 불순물에 대해 엑소좀을 효율적으로 분별할 수 있는 기능을 부여한다.

상기 탈염과 버퍼교환은 연속적으로 수행하거나 단속적으로 수행할 수 있다. 시작 부피(starting volume)에 대하여 적어도 4배, 바람직하게는 6배 내지는 10배 이상, 보다 바람직하게는 12배 이상의 부피를 갖는 완충용액을 이용하여 탈염과 버퍼교환을 수행할 수 있다. 또한, TFF를 위해 MWCO(molecular weight cutoff) 100,000 Da(Dalton), 300,000 Da, 500,000 Da 또는 750,000 Da의 TFF 필터, 또는 0.05 ㎛ TFF 필터를 사용할 수 있다. 상기 (c) 단계는 TFF(Tangential Flow Filtration)를 이용하여 1/100 내지 1/25의 부피까지 농축하는 과정을 더 포함할 수 있다.

본 발명을 한정하지 않는 하나의 예시로서, 상기 생물학적 용액은 줄기세포 배양액일 수 있다. 상기 줄기세포의 종류는 제한되지 않으나, 바람직하게는 중간엽 줄기세포, 예를 들어 지방, 골수, 제대 또는 제대혈 유래 줄기세포일 수 있으며, 보다 바람직하게는 지방 유래 줄기세포일 수 있다. 상기 지방 유래 줄기세포의 종류는 병원체에 의한 감염의 위험이 없고 면역 거부 반응을 일으키지 않는 것이라면 제한되지 않으나, 바람직하게는 인간지방 유래 줄기세포일 수 있다.

그러나 본 발명에서 사용되는 엑소좀은 전술한 바와 같은 분리방법에 따라 수득된 엑소좀에 제한되는 것이 아니며, 당업계에서 사용되고 있거나 향후 사용될 수 있는 다양한 엑소좀을 사용할 수 있음은 물론이다. 상기 분리방법에 따라 분리된 엑소좀은 본 발명의 조성물에 사용될 수 있는 엑소좀의 일례로서 이해되어야 하며, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아님을 명백히 밝혀 둔다.

본 발명의 일 구체예의 안정화된 엑소좀의 필러 조성물에 있어서, 상기 엑소좀은 상기 히알루론산, 히알루론산 염, 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종과 혼합하기 전에 멸균 필터를 사용하여 제균하는 과정을 더 포함하여 얻을 수 있다.

본 발명의 일 구체예의 안정화된 엑소좀의 필러 조성물은 바람직하게는 주사 투여 방식으로 적용된다. 그러나, 이에 제한되는 것이 아니며 당업계에 알려진 다양한 투여 방법을 배제하지 않는다.

본 발명의 일 구체예의 안정화된 엑소좀의 필러 조성물은 상처 치료, 흉터 치료, 관절염의 개선 또는 치료 등을 위한 약학 조성물로 제조될 수 있다.

본 발명의 다른 구체예는 상기 안정화된 엑소좀의 필러 조성물을 이용하여, 치료용을 제외한 포유동물 피부의 상태를 조절하는 미용방법을 제공한다. 본 발명의 미용방법에 있어서, 피부의 상태 조절이란 피부의 상태를 개선시키고/시키거나 피부의 상태를 예방적으로 조절하는 것을 의미하고, 피부의 상태 개선이란 피부 조직의 외관 및 느낌의 시각적 및/또는 촉각적으로 지각할 수 있는 긍정적인 변화를 의미한다. 예를 들어, 피부의 상태 개선이란 피부주름 개선, 피부재생, 피부보습, 피부탄력 개선, 볼륨감 증대 등(예를 들어, 볼륨업(volume-up), 피부팽만 등)일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예는 상기 안정화된 엑소좀의 필러 조성물을 이용한, 상처 치료, 흉터 치료, 관절염의 개선 또는 치료 방법을 제공한다.

본 발명의 안정화된 엑소좀의 필러 조성물은 엑소좀의 안정성을 증가시킬 수 있고 히알루론산 기반 필러 본연의 미용 효과를 부가할 수 있는 장점이 있다.

또한, 본 발명의 안정화된 엑소좀의 필러 조성물은 엑소좀의 안정성이 증가됨에 따라 엑소좀으로부터 유래되는 미용적 또는 치료적 효과를 오래 지속할 수 있고, 미용적 또는 치료적 효과가 오래 지속되면서 주사가 편리하고 환자에게 고통을 덜 주는 히알루론산 기반의 필러의 구현에 적합하게 응용될 수 있다.

아울러, 본 발명은 고유 분리방법에 의해 분리 정제된 엑소좀을 저농도로 히알루론산 기반의 필러에 혼합 제조가 가능하고 엑소좀 입자수를 많이 필요로 하는 경우 보다 균질한 혼합이 용이하다. 이로써, 본 발명은 미용이나 치료적 효과를 위해 엑소좀을 혼합하는 경우 발생할 수 있는 히알루론산 기반의 필러 조성물의 전체 볼륨이 증가하는 문제를 방지할 수 있다.

한편, 전술한 바와 같은 효과들에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

도 1은 본 발명의 일 구체예에 따라 생물학적 용액으로부터 엑소좀을 제조하는 방법에 있어서 엑소좀을 분리 및 정제하는 과정을 설명하는 플로우챠트이다.
도 2는 본 발명의 일 구체예에 따라 생물학적 용액, 예를 들어 줄기세포 배양액으로부터 엑소좀을 제조하는 단계(step)별로 용액 내에 포함되어 있는 단백질의 총량 비율(Relative amount of protein)을 측정한 결과를 나타낸다. 각 단계별 단백질 총량의 비율은 생물학적 용액 전체에 대한 단백질 총량의 상대적 비율로 나타내었다. 실험 결과는 2개의 서로 다른 배치에서 얻어진 결과를 각각 도시하였다.
도 3은 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀의 생산성(productivity)과 순도(purity)를 측정한 결과를 도시한 것이다. 엑소좀의 생산성은 "생물학적 용액, 예를 들어 줄기세포 배양액(CM) 단위 mL 당 얻어진 엑소좀의 입자수"로 계산하였고, 엑소좀의 순도는 "최종 분획물에 포함되어 있는 단백질 단위 μg 당 엑소좀의 입자수"로 계산하였다. 실험 결과는 5개의 서로 다른 배치(batch)에서 얻어진 결과를 도시하였다.
도 4는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀의 물리적 특성 분석 결과를 도시한 것이다. "도 4A"는 TRPS(tunable resistive pulse sensing) 분석에 의한 입자 크기 분포와 입자수를 나타낸다. "도 4B"는 NTA(nanoparticle tracking analysis) 분석에 의한 입자 크기 분포와 입자수를 나타낸다. "도 4C"는 TEM(transmitted electron microscopy) 분석에 의한 입자 이미지를 배율에 따라 도시하였다. "도 4D"는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀의 웨스턴 블랏 결과를 나타낸다. "도 4E"는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀에 대한 마커 분석에 있어서 CD63 및 CD81에 대한 유세포분석 결과를 나타낸다.
도 5는 트레할로오스 첨가에 따라 입자크기 분포가 균일하고 순도가 높은 엑소좀이 수득되는 것을 보여주는 입자 크기 분포에 관한 NTA 분석 결과를 도시한다. 첨가된 트레할로오스의 양이 증가함에 따라 단일한 피크를 갖는 입자 크기 분포 결과를 얻을 수 있다.
도 6은 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀의 제조과정에서 트레할로오스 첨가 여부에 따른 입자 크기 분포를 나타내는 NTA 분석 결과를 도시한다. "도 6A"는 제조 과정 전과정에서 트레할로오스를 첨가한 경우, "도 6B"는 세포 배양액을 동결 보관하였다가 해동한 후 트레할로오스를 첨가한 경우, "도 6C"는 트레할로오스를 첨가하지 않고 제조한 결과를 나타낸다. "도 6D"에는 도 6A 내지 도 6C 방법에 의하여 분리한 엑소좀의 상대적인 생산성(Relative productivity)과 상대 농도(Relative concentration)를 비교한 결과를 도시하였다. "도 6E"에는 도 6A 내지 도 6C 방법에 의하여 분리한 엑소좀의 평균 입자크기(Mean size)를 도시하였다.
도 7은 인체 피부섬유아세포인 HS68 세포에 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀을 처리한 후 세포 독성이 없음을 확인한 결과를 도시한다.
도 8은 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀을 히알루론산 필러에 섞은 후 NTA 장비를 이용하여 촬영한 사진이다.
도 9는 본 발명의 안정화된 엑소좀의 필러 조성물의 경우 엑소좀의 표면 단백질인 CD63이 트립신 처리에도 분해되지 않고 안정적으로 유지되고 있는 것을 나타내는 웨스턴 블랏 결과이다.

이하 본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌들은 본 발명에 참고로서 통합된다.

명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

실시예

실시예 1: 세포의 배양

인체 피부 섬유아세포(human dermal fibroblast)인 HS68 세포는 ATCC에서 구입하여, 10% 우태아 혈청 (fetal bovine serum: ThermoFisher Scientific에서 구입) 및 1% 항생제-항진균제 (antibiotics-antimycotics: ThermoFisher Scientific에서 구입)가 함유된 DMEM (ThermoFisher Scientific에서 구입) 배지에 5% CO₂, 37℃ 조건에서 계대 배양하였다.

당해 발명이 속하는 기술분야에 알려진 세포배양 방법에 따라 5% CO₂, 37℃ 조건에서 지방 유래 줄기세포를 배양하였다. 그 다음, 인산염 완충용액(phosphate-buffered saline)(ThermoFisher Scientific에서 구입)으로 세척 후, 무혈청, 무페놀레드 배지로 교체하여 1일 내지 10일간 배양하고 그 상층액(이하, 배양액)을 회수하였다.

엑소좀의 분리 과정에서 입자크기 분포가 균일하고 순도가 높은 엑소좀을 수득하기 위하여 배양액에 트레할로오스를 2 중량% 첨가하였다. 트레할로오스를 첨가한 후 배양액을 0.22 μm 필터로 여과하여 세포 잔해물, 노폐물 및 거대 입자 등의 불순물을 제거해 주었다. 여과된 배양액은 즉시 분리 과정을 통해 엑소좀을 분리하였다. 또한, 여과된 배양액은 냉장고(영상 10℃ 이하)에서 보관한 후 엑소좀 분리에 사용하였다. 또한, 여과된 배양액은 -60℃ 이하의 초저온 냉동고에서 동결 보관하였다가 해동시킨 후 엑소좀 분리를 수행하였다. 이후, 배양액으로부터 접선흐름여과장치(Tangential Flow Filtration; TFF)를 이용하여 엑소좀을 분리하였다.

실시예 2: TFF 방법에 의한 엑소좀의 분리 및 정제

실시예 1에서 0.22 μm 필터로 여과된 배양액으로부터 엑소좀을 분리, 농축, 탈염과 버퍼교환(diafiltration)을 위해 TFF(Tangential Flow Filtration) 방법을 사용하였다. TFF 방법을 위한 필터로는 카트리지 필터(cartridge filter, 일명 hollow fiber filter; GE Healthcare에서 구입) 또는 카세트 필터(cassette filter; Pall 또는 Sartorius 또는 Merck Millipore에서 구입)를 사용하였다. TFF 필터는 다양한 분자량 차단(molecular weight cutoff; MWCO)에 의해 선택될 수 있다. 선택된 MWCO에 의해 선별적으로 엑소좀을 분리, 농축하였고, MWCO보다 작은 입자나 단백질, 지질, 핵산, 저분자 화합물 등은 제거하였다.

엑소좀을 분리, 농축하기 위하여 MWCO 100,000 Da(Dalton), 300,000 Da, 또는 500,000 Da의 TFF 필터를 사용하였다. 배양액을 TFF 방법을 이용하여 1/100 내지 1/25 정도의 부피가 될 때까지 농축하면서, MWCO보다 작은 물질들은 제거하여 엑소좀을 분리하였다.

분리, 농축된 엑소좀 용액은 TFF 방법을 이용하여 추가로 탈염과 버퍼교환(diafiltration)을 수행하였다. 이때, 탈염과 버퍼교환은 연속적으로 수행(continuous diafiltration)하거나 단속적으로 수행(discontinuous diafiltration)하였으며, 시작 부피(starting volume)에 대하여 적어도 4배, 바람직하게는 6배 내지는 10배 이상, 보다 바람직하게는 12배 이상의 부피를 갖는 완충용액을 이용하여 수행하였다. 완충용액에는 입자크기 분포가 균일하고 순도가 높은 엑소좀을 수득하기 위하여 PBS에 녹인 2 중량%의 트레할로오스를 첨가하였다. 트레할로오스 처리에 따라 고순도이면서 입자크기 분포가 균일한 엑소좀을 높은 수율로 수득할 수 있는 효과를 확인한 결과는 도 6에 도시하였다.

실시예 3: 분리된 엑소좀의 특성 분석

분리된 엑소좀, 배양액, 및 TFF 분리과정의 분획물에서 단백질의 양은 BCA 발색법(ThermoFisher Scientific에서 구입) 또는 플루오로프로파일(FluoroProfile) 형광법(Sigma에서 구입)을 이용하여 측정하였다. 본 발명의 일 구체예의 TFF 방법에 의해 엑소좀이 분리, 농축되고 단백질, 지질, 핵산, 저분자 화합물 등이 제거되는 정도는 단백질 정량법에 의하여 모니터링하여 그 결과를 도 2에 도시하였다. 그 결과 본 발명의 일 구체예의 TFF 방법에 의하여 매우 효과적으로 배양액에 존재하는 단백질이 제거됨을 알 수 있었다.

본 발명의 일 구체예의 TFF 방법에 의해 엑소좀을 분리하는 경우 생산성과 순도를 독립적인 다섯 배치에서 비교한 결과를 도 3에 도시하였다. 독립적인 다섯 배치로부터 얻어진 결과를 분석한 결과, 본 발명의 일 구체예의 TFF 방법에 의하여 매우 안정적으로 엑소좀을 분리할 수 있음을 확인하였다.

분리된 엑소좀은 나노입자 트랙킹 분석(nanoparticle tracking analysis:　NTA; Malvern에서 구입) 또는 가변 저항펄스 감지(tunable resistive pulse sensing: TRPS; Izon Science에서 구입)에 의해 입자의 크기와 농도를 측정하였다. 분리된 엑소좀의 균일도와 크기는 투과전자현미경(transmitted electron microscopy: TEM)을 이용하여 분석하였다. 본 발명의 일 구체예에 따라 분리된 엑소좀의 TRPS, NTA, TEM 분석 결과는 도 4A 내지 도 4C에 도시하였다.

TFF 방법으로 엑소좀을 분리한 후, 트레할로오스의 첨가 여부에 따른 엑소좀의 크기 분포를 NTA 분석한 결과를 도 5에 도시하였다. 트레할로오스 농도를 0 중량%, 1 중량% 및 2 중량%로 증가시켰고(도 5의 위에서부터 아래), 3회 반복하여 실험하였다. 트레할로오스가 존재하지 않은 경우 300 nm 이상의 크기를 갖는 입자가 확인되는 반면, 트레할로오스의 첨가량을 늘려주면 300 nm 이상의 크기를 갖는 입자가 줄어들고 엑소좀의 크기 분포가 균일해지는 것을 확인하였다.

TFF 방법으로 엑소좀을 분리하는 과정에 트레할로오스의 첨가에 따른 효과를 추가로 조사하였다. 도 6에서 보는 바와 같이 엑소좀의 제조과정 전과정에 PBS에 녹인 2 중량%의 트레할로오스를 첨가한 경우, 균일한 크기 분포를 갖는 엑소좀을 얻을 수 있었다(도 6A). 반면 트레할로오스를 첨가하지 않고 동결 보관하였던 배양액을 사용하되, 탈염과 버퍼교환 과정에서만 트레할로오스를 첨가하여 TFF 과정을 진행한 경우나, 트레할로오스를 전혀 첨가하지 않고 TFF 과정을 진행한 경우, 크기가 큰 입자가 많이 포함된 불균일한 엑소좀을 얻었다(도 6B 및 도 6C).

분리된 엑소좀의 상대적인 생산성과 농도를 비교한 결과, 엑소좀의 제조과정 전과정에 트레할로오스를 첨가한 경우 매우 높은 생산성으로 엑소좀을 얻을 수 있었으며, 얻어진 엑소좀의 농도도 5배 이상 높았다(도 6D). NTA 분석 결과에서 나타난 바와 같이, 분리된 엑소좀의 평균 크기도 엑소좀의 제조과정 전과정에 트레할로오스를 첨가한 경우 200 nm로 균일하게 확인되었다(도 6E).

도 4D는 본 발명의 일 구체예의 방법에 따라 분리된 엑소좀에 대해 웨스턴 블랏을 수행한 결과로서, CD9, CD63, CD81 및 TSG101 마커의 존재를 확인하였다. 각 마커에 대한 항체로는 각각 항-CD9 (Abcam에서 구입), 항-CD63 (System Biosciences에서 구입), 항-CD81 (System Biosciences에서 구입), 및 항-TSG101 (Abcam에서 구입)을 사용하였다.

도 4E는 본 발명의 일 구체예의 방법에 따라 분리된 엑소좀에 대해 유세포분석기를 이용하여 분석한 결과로서 CD63 및 CD81 마커의 존재를 확인하였다. CD63에 대해 양성(positive)인 엑소좀을 분리하기 위하여 엑소좀-휴먼 CD63 분리/검출 키트(ThermoFisher Scientific에서 구입)를 제조사의 방법에 따라 사용하였고, PE-마우스 항-인간 CD63 (PE-Mouse anti-human CD63)(BD에서 구입) 및 PE-마우스 항-인간 CD81 (PE-mouse anti-human CD81)(BD에서 구입)을 사용하여 마커를 염색한 후, 유세포분석기 (ACEA Biosciences)를 이용하여 분석하였다.

한편, 본 발명의 히알루론산 기반의 필러 조성물에 사용되는 엑소좀은 전술한 바와 같은 실시예들의 엑소좀에 제한되는 것이 아니며, 당업계에서 사용되고 있거나 향후 사용될 수 있는 다양한 엑소좀을 사용할 수 있음은 물론이다. 상기 실시예들에 따라 분리된 엑소좀은 본 발명의 히알루론산 기반의 필러 조성물에 사용될 수 있는 엑소좀의 일례로서 이해되어야 하며, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아님을 명백히 밝혀 둔다.

실시예 4: 엑소좀 처리에 따른 세포 독성 측정

인체 피부 섬유아세포인 HS68 세포에서 본 발명의 일 구체예의 분리 방법에 따라 수득된 엑소좀의 독성을 평가하기 위해 세포에 농도별로 엑소좀을 처리하고 세포의 증식률을 확인하였다. HS68 세포를 10% FBS를 포함한 DMEM에 현탁시킨 후 80 내지 90%의 밀집도(confluency)를 갖도록 분주하고 37℃, 5% CO₂인큐베이터에서 24시간 배양하였다. 24시간 후, 배양액을 제거하고 실시예 2에서 준비된 엑소좀을 농도 별로 처리하여 24 내지 72시간 동안 배양하면서 세포 생존율을 평가하였다. 세포 생존율을 WST-1 시약(WST-1 reagent)(Takara에서 구입), MTT 시약(Sigma에서 구입), 셀타이터-글로 시약(CellTiter-Glo reagent)(Promega에서 구입), 또는 아라마르 블루 시약(alamarBlue reagent)(ThermoFisher Scientific에서 구입)과 마이크로플레이트 리더(microplate reader)(Molecular Devices에서 구입)를 이용하여 측정하였다.

비교군은 엑소좀이 처리되지 않은 일반 세포배양배지에서 배양된 세포수를 기준으로 하였고, 시험된 농도 범위 내에서 엑소좀에 의한 세포 독성이 나타나지 않음을 확인하였다(도 7).

실시예 5: 안정화된 엑소좀의 필러 조성물의 준비

실시예 2에서 준비된 엑소좀을 히알루론산, 히알루론산 염, 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종과 혼합하여 안정화된 엑소좀의 필러 조성물을 제조하였다. 히알루론산 염을 사용하는 경우에는 히알루론산 나트륨을 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것이 아니며 당업계에서 사용되는 다양한 히알루론산 염이 사용될 수 있다. 또한, 히알루론산 겔은 가교되지 않은 히알루론산 또는 가교된 히알루론산 겔을 사용할 수 있는데, 가교된 겔로서는, 예를 들어 레스틸렌을 사용할 수 있다.

히알루론산, 히알루론산 염, 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종이 혼합된 히알루론산 기반의 필러 조성물을 가열 멸균 또는 멸균 필터를 이용하여 제균하였다. 멸균된 히알루론산, 히알루론산 염, 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종이 혼합된 히알루론산 기반의 필러 조성물에 엑소좀을 혼합하여 안정화된 엑소좀의 필러 조성물을 제조하였다. 이때, 엑소좀을 히알루론산 기반의 필러 조성물에 혼합하기 전 멸균 필터를 이용하여 추가로 멸균할 수 있다. 안정화된 엑소좀의 필러 조성물 내의 엑소좀의 농도는 예를 들어 대략 1×10⁵ 입자/mL 내지 1×10¹¹ 입자/mL (또는 단백질 농도로는 대략 0.001 내지 1000 μg/mL)로 조정될 수 있다.

실시예 2에서 준비된 엑소좀을 1×10⁸ 입자/mL 농도로 히알루론산 필러에 섞은 후 즉시 NTA 장비를 이용하여 엑소좀이 히알루론산 기반의 필러 조성물 내에 잘 혼합되었는지를 확인하였다(도 8). 또한, 엑소좀이 혼합된 히알루론산 기반의 필러를 영하 20℃에 30일 간 보관한 후 다시 NTA 장비를 이용하여 촬영하여 엑소좀이 히알루론산 기반의 필러 조성물 내에 양호하게 유지되고 있는지를 확인하였다(도 8). 그 결과, 도 8에 도시된 바와 같이, 엑소좀이 히알루론산 기반의 필러 조성물 내에 잘 혼합되어 있고 냉동 보관 후에도 혼합 상태가 양호하게 유지되고 있음을 촬영 이미지로부터 확인할 수 있었다. 한편, 도 8의 오른쪽 마지막 사진은 엑소좀이 없는 음성대조군 사진으로서, 엑소좀이 혼합되어 있지 않은 필러에는 거의 입자가 존재하지 않은 것을 확인시켜 주고 있다.

상기와 같은 결과들로부터 본 발명의 안정화된 엑소좀의 필러 조성물은 미용적 또는 치료적 효과가 오래 지속되면서 주사가 편리하고 환자에게 고통을 덜 주는 히알루론산 기반의 필러의 구현에 적합하게 응용될 수 있음을 알 수 있다.

실시예 6: 히알루론산에 의한 엑소좀의 안정성 증가 확인 실험

CD63 단백질은 엑소좀의 표면에 특이적으로 존재하는 막단백질로서 세포로부터 분비 또는 방출된 소포체가 엑소좀인지 여부를 확인할 때 사용되는 중요한 마커 단백질이다. 줄기세포 배양액으로부터 분리된 소포체에서 CD63 단백질이 검출되지 않으면 해당 배양액에 엑소좀이 존재하지 않거나 엑소좀이 안정성 문제 때문에 고유 특성을 잃은 것으로 판단할 수 있다. 따라서, 특정 조건에서 CD63 마커 단백질의 검출여부에 의해 엑소좀의 안정성을 평가할 수 있다. 본 발명의 안정화된 엑소좀의 필러 조성물에서 히알루론산에 의한 엑소좀의 안정성 증대 효과를 확인하기 위하여 하기와 같이 실험을 진행하였다.

실시예 2에서 준비된 엑소좀을 8배 농축한 엑소좀 샘플과, 이러한 엑소좀에 히알루론산을 혼합한 샘플(본 발명의 안정화된 엑소좀의 필러 조성물에 해당)에 대해, 단백질 분해 효소인 트립신을 처리하고 엑소좀 표면 마커 단백질인 CD63을 웨스턴 블랏을 통해 확인하였다. 본 발명의 안정화된 엑소좀의 필러 조성물은 실시예 2에서 준비된 엑소좀을 8배 농축한 엑소좀에 24 mg/mL 농도의 히알루론산 30 mg을 혼합하여 준비하였다. 상기 엑소좀 단독 샘플과, 상기 엑소좀에 히알루론산을 혼합한 샘플에 대해 5 μL의 트립신(Sigma에서 구입)을 처리하여 37℃에서 30분 동안 반응시켰다. 그런 다음, 프로테아제 저해제 칵테일(Protease inhibitor cocktail)(Sigma에서 구입)을 처리하여 트립신의 활성을 억제하였다.

SDS-PAGE 겔에 상기 샘플들의 로딩을 용이하게 하기 위하여, 히알루론산을 분해하는 히알루로니다아제 (hyaluronidase)(Sigma에서 구입)를 최종 농도로 1.25 mg/mL의 농도로 처리하고 37℃에서 30분 동안 반응시켰다. 엑소좀 샘플에 트립신을 처리하지 않은 음성대조군도 전기영동하였다. 먼저, 동량의 단백질을 8% SDS-폴리아크릴아마이드 겔에서 전기영동하여 전개시킨 후 PVDF 막에 전기적으로 블로팅하였다. 항-CD63 항체와 단백질 간의 비특이적 결합을 차단하기 위해 상기 막을 5% 스킴 밀크(skim milk)가 포함된 TBS-T 완충용액 (TBS 내의 0.1% Tween-20)에 넣어 1시간 동안 상온에서 블로킹하였다. 이후 항-CD63 항체를 4℃에서 하룻밤 동안 1차 처리하고 TBS-T 완충용액으로 10분간 3회 세척한 후, HRP가 연결된 항-토끼 면역글로불린 G(Jackson Immuno Research　Laboratories Inc.)를 상온에서 1시간 동안 2차 처리하고 다시 TBS-T 완충용액으로 10분간 3회 세척하였다. 최종 PVDF 막에 화학발광시약(SuperSignal West Femto Maximum sensitivity Substrate, Thermo Scientific)을 이용하여 CD63 특이적인 단백질 발현을 확인하였다.

상기와 같은 웨스턴 블랏을 수행한 결과, 엑소좀과 히알루론산을 혼합한 샘플(본 발명의 안정화된 엑소좀의 필러 조성물)은 트립신에 의한 CD63 엑소좀 표면 단백질 분해를 억제하고 엑소좀의 안정성을 증가시키는 효과가 있음을 확인하였다(도 9의 가운데 레인 참조). 반면에, 엑소좀 단독 샘플의 경우 트립신 처리에 의해 CD63 엑소좀 표면 단백질이 관찰되지 않아 CD63 단백질의 분해 및 엑소좀의 변성 내지는 파괴가 있었음을 알 수 있다(도 9의 오른쪽 레인).

도 9에 도시된 바와 같이 본 발명의 안정화된 엑소좀의 필러 조성물(도 9의 가운데 레인)은 엑소좀의 표면 단백질인 CD63이 트립신 처리에도 분해되지 않고 안정적으로 유지되고 있는 것을 알 수 있다. 본 발명의 안정화된 엑소좀의 필러 조성물에 대한 트립신 처리 후 CD63 단백질 웨스턴 블랏 결과는 엑소좀에 트립신이 처리되지 않은 샘플(도 9의 왼쪽 레인)과 거의 동일하다.

이러한 결과를 종합하면, 본 발명의 안정화된 엑소좀의 필러 조성물은 엑소좀의 안정성을 증가시키는 효과가 있다고 할 수 있다. 따라서, 본 발명의 안정화된 엑소좀의 필러 조성물은 엑소좀의 안정성이 증가됨에 따라 엑소좀으로부터 유래되는 미용적 또는 치료적 효과를 오래 지속할 수 있고, 미용적 또는 치료적 효과가 오래 지속되면서 주사가 편리하고 환자에게 고통을 덜 주는 히알루론산 기반의 필러의 구현에 적합하게 응용될 수 있다.

이상, 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.

Claims

(a) 생물학적 용액에 트레할로오스를 첨가하는 단계;
(b) 상기 트레할로오스가 첨가된 생물학적 용액을 여과하는 단계;
(c) 상기 여과된 생물학적 용액으로부터, TFF(Tangential Flow Filtration)를 이용하여 엑소좀을 분리하는 단계;
(d) 탈염과 버퍼교환(diafiltration)에 사용되는 완충용액에 트레할로오스를 첨가하고, 상기 트레할로오스가 첨가된 완충용액을 이용한 TFF(Tangential Flow Filtration)를 이용하여, 상기 분리된 엑소좀에 대한 탈염과 버퍼교환(diafiltration)을 수행하는 단계; 및
(e) 상기 (a) 단계부터 (d) 단계를 통해 얻어진 엑소좀을 히알루론산, 히알루론산 염, 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종에 혼합하여 유지시키는 단계를 포함하는, 안정화된 엑소좀의 수득방법.
제1항에 있어서,
상기 히알루론산 겔은 가교되지 않은 히알루론산 겔, 또는 가교된 히알루론산 겔인, 안정화된 엑소좀의 수득방법.
제2항에 있어서,
상기 가교된 히알루론산 겔은 1,4-부탄다이올 다이글리시딜 에테르 (BDDE), 1,4-비스(2,3-에폭시프로폭시)부탄, 1,4-비스글리시딜옥시부탄, 1,2-비스(2,3-에폭시프로폭시)에틸렌 및 1-(2,3-에폭시프로필)-2,3-에폭시사이클로헥산 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 가교결합제로 가교결합된 히알루론산 겔인, 안정화된 엑소좀의 수득방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 엑소좀은 줄기세포 유래의 엑소좀, 식물 유래의 엑소좀, 또는 효모 유래의 엑소좀인, 안정화된 엑소좀의 수득방법.
제4항에 있어서,
상기 줄기세포 유래의 엑소좀은 지방, 골수, 제대 또는 제대혈 줄기세포 유래의 엑소좀인, 안정화된 엑소좀의 수득방법.
제4항에 있어서,
상기 식물 유래의 엑소좀은 장미 줄기세포 유래의 엑소좀 또는 에델바이스 유래의 엑소좀인, 안정화된 엑소좀의 수득방법.
제6항에 있어서,
상기 장미 줄기세포 유래의 엑소좀은 장미의 배(胚) 또는 잎 유래 캘러스의 배양액, 또는 장미의 형성층 또는 전형성층 유래 캘러스의 배양액으로부터 분리 정제된 것인, 안정화된 엑소좀의 수득방법.
제6항에 있어서,
상기 에델바이스 유래의 엑소좀은 에델바이스의 잎 또는 줄기 조직으로부터 얻은 식물세포의 배양액, 또는 에델바이스 종자로부터 발아된 떡잎에 상처를 내어 유도시킨 캘러스의 배양액으로부터 분리 정제된 것인, 안정화된 엑소좀의 수득방법.
제4항에 있어서,
상기 효모 유래의 엑소좀은 와인 효모 유래의 엑소좀 또는 갈락토마이세스 유래의 엑소좀인, 안정화된 엑소좀의 수득방법.
제9항에 있어서,
상기 와인 효모 유래의 엑소좀은 와인 효모 배양액, 와인 효모 발효물 또는 포도주로부터 분리 정제된 것인, 안정화된 엑소좀의 수득방법.
제9항에 있어서,
상기 갈락토마이세스 유래의 엑소좀은 갈락토마이세스 배양액 또는 갈락토마이세스 발효물로부터 분리 정제된 것인, 안정화된 엑소좀의 수득방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 엑소좀은 상기 히알루론산, 히알루론산 염, 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종과 혼합하기 전에 멸균 필터를 사용하여 제균하는 것을 특징으로 하는, 안정화된 엑소좀의 수득방법.
삭제
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 탈염과 버퍼교환은 연속적으로 수행하거나 단속적으로 수행하는 것을 특징으로 하는, 안정화된 엑소좀의 수득방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
시작 부피(starting volume)에 대하여 적어도 4배의 부피를 갖는 완충용액을 이용하여 탈염과 버퍼교환을 수행하는 것을 특징으로 하는, 안정화된 엑소좀의 수득방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
TFF(Tangential Flow Filtration)를 위해 MWCO(molecular weight cutoff) 100,000 Da, 300,000 Da, 500,000 Da 또는 750,000 Da의 TFF 필터, 또는 0.05 μm TFF 필터를 사용하는 것을 특징으로 하는, 안정화된 엑소좀의 수득방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 (c) 단계는 TFF(Tangential Flow Filtration)를 이용하여 1/100 내지 1/25의 부피까지 농축하는 과정을 더 포함하는, 안정화된 엑소좀의 수득방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 생물학적 용액은 줄기세포 배양액인, 안정화된 엑소좀의 수득방법.
제18항에 있어서,
상기 줄기세포는 지방, 골수, 제대 또는 제대혈 유래 줄기세포인, 안정화된 엑소좀의 수득방법.
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