KR20240056889A - 식물 유래 엑소좀의 추출 방법, 이에 따라 분리된 엑소좀, 및 이의 화장학적 용도 - Google Patents
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Abstract
본 개시는 엑소좀의 분리 효율이 증대되고, 안정성이 높은 엑소좀을 얻을 수 있는 엑소좀 분리 방법과, 주름개선, 세포 생장, 항염 또는 항노화 효과가 향상된 엑소좀을 포함하는 화장료 조성물을 제공하고자 한다. 본 개시는 (a) 식물을 세척 및 착즙하여 식물 착즙액을 수득하는 단계; (b) 식물 착즙액을 원심분리하여 1차 상층액을 수득하는 1차 원심분리 단계; (c) 1차 상층액을 원심분리하여 2차 상층액을 수득하는 2차 원심분리 단계; (d) 2차 상층액을 접선유동여과(tangential flow filtration, TFF)하여 분리물을 수득하는 단계; 및 (e) 분리물에 항체가 부착된 비드를 첨가하여 식물 유래 엑소좀 추출물을 얻는 단계;를 포함하는 식물 유래 엑소좀 추출 방법이고, 또 다른 개시는 식물 유래 엑소좀을 조성물 전체 중량에 대하여 0.1 내지 20중량% 포함하는 화장료 조성물이다.
Description
본 개시는 식물 유래 엑소좀 추출 방법, 이에 따라 분리된 엑소좀, 및 식물 유래 엑소좀의 화장학적 용도에 관한 것이다.
엑소좀(Exosome)이란 다양한 세포들로부터 분비되는 막 구조의 작은 소낭을 의미하며, 세포밖 소포체(Extracellular Vesicles, EVs)의 한 종류로 정의된다. 모든 세포들은 다른 세포들 또는 외부 환경과 정보 교환을 하며 이를 위해 세포밖 소포체를 분비한다. 엑소좀은 50 내지 200 nm 정도의 크기를 가지며 단백질, 지질, 핵산 등 생리활성 물질을 포함한다. 엑소좀은 포유류, 박테리아, 식물 등 다양한 세포에 존재하며 기원하는 세포들의 상태를 반영하고 있어 진단 및 치료에 활용할 수 있다. 엑소좀은 이중인지질막 구조체로 세포내 침투가 용이하고, 면역 반응, 신호전달과 같은 다양한 생리적, 병리적 기능을 수행한다.
최근에 식물에서 유래한 엑소좀의 다양한 효능에 관한 연구가 이루어지고 있으며, 항산화, 항염 등이 있음이 밝혀졌다. 식물 유래 엑소좀은 식물 세포 자체가 분비하는 생리활성 및 신호전달 물질이 들어있어 세포간의 이동과 흡수에 도움을 주는 천연 나노입자이며, 식물에서 정제한 엑소좀은 포유류 유래 엑소좀에 비해 독성이 없다고 알려져 있다.
이러한 엑소좀은 다양한 장점 및 활성으로 인해 의약품, 화장품, 식품 등의 분야에서 활용이 가능한 소재이나 인지질이중막으로 구성되어 있는 구조적인 특징으로 인해 분산력이 낮고 응집하려는 성질이 있다. 또한 고온에서 불안정하고, 화장품 제형을 제조하는 과정에서 쉽게 깨질 수 있으며, 이러한 성질은 제형 내 엑소좀의 안정성을 저하시키고 침전을 일으킬 수 있다. 따라서 지속적인 활성 유지를 위해 수용액 내의 엑소좀의 분산성을 높여 제형 내 안정성을 높일 필요가 있다.
현재까지 대다수의 연구에서 엑소좀은 유체상과의 밀도 및 크기 차이를 기반한 초고속원심분리(Ultracentrifugation) 방법을 통해 분리되었다. 그러나 초고속 원심분리 방법은 엑소좀에 과도한 충격을 주어 엑소좀이 깨질 우려가 있을 뿐만 아니라 노동집약적이며 많은 시간이 소모되는 등의 단점을 보유하고 있다. 또한 초고속원심분리 방법은 엑소좀 수율이 떨어지며, 한번에 많은 양의 시료를 분리할 수 없어 산업적 이용가능성이 떨어지는 문제가 있다.
또 다른 엑소좀 분리방법은 침전(precipitation)법으로, PEG(Polyethylene glycol)와 같은 물을 배제한 폴리머는 물 분자를 묶어 용해성이 적은 성분을 용액에서 빼내는 원리로 PEG를 포함하는 침전용액과 함께 침전하여 분리방법은 사용하기도 쉽고, 특별한 장비가 필요 없는 이점이 있으나 대량 생산이 어렵고 엑소좀이 응집(aggregates)되는 문제점이 있다.
한편, 병풀(Centella asiatica)은 쌍떡잎식물 이판화군 산형화목 미나리과의 여러해살이풀로, 오래 전부터 약용 식물로 사용되어 왔다. 병풀의 유효성분으로서 asiaticoside, madecasosside, asiatic acid, madecassic acid를 포함하는 pnetacyclic triterpenes가 알려져 있으며, 이들 성분은 피부 세포의 콜라겐 형성 효능과 항산화 활성, 피부 노화 억제 효능, 항염 효능, 피부 광노화 개선, 상처 치유 효능이 뛰어난 것으로 보고되어 있으며 국내에서도 화장품이나 상처치료 연고제의 원료로 사용되고 있다.
본 개시는 엑소좀의 분리 효율이 증대되고, 안정성이 높은 엑소좀을 얻을 수 있는 엑소좀 분리 방법을 제공하고자 한다.
본 개시는 항체가 부착된 비드를 통해 세포외 소포체에서 엑소좀을 추가로 분리하여 엑소좀의 분리 효율을 향상시킬 수 있다.
또한, 본 개시는 제타 포텐셜이 우수한 엑소좀을 제공하고자 한다.
또한, 본 개시는 주름개선, 항염 또는 항노화 효과가 향상된 엑소좀을 포함하는 화장료 조성물을 제공하고자 한다.
상술한 목적을 달성하기 위하여 본 개시의 일 양태는 (a) 식물을 세척 및 착즙하여 식물 착즙액을 수득하는 단계; (b) 식물 착즙액을 원심분리하여 1차 상층액을 수득하는 1차 원심분리 단계; (c) 1차 상층액을 원심분리하여 2차 상층액을 수득하는 2차 원심분리 단계; (d) 2차 상층액을 접선유동여과(tangential flow filtration, TFF)하여 분리물을 수득하는 단계; 및 (e) 분리물에 항체가 부착된 비드를 첨가하여 식물 유래 엑소좀을 포함하는 추출물을 얻는 단계;를 포함하는 식물 유래 엑소좀 추출 방법을 제공한다.
본 개시에서 상기 (a) 단계의 식물은 병풀일 수 있다.
본 개시에서 상기 (b) 단계의 1차 원심분리는 1,000xg 내지 3,000xg에서 10분 내지 50분간 진행된다.
본 개시에서 상기 (b) 단계의 2차 원심분리는 8,000xg 내지 12,000xg에서 40분 내지 80분간 진행된다.
본 개시에서 상기 (d) 단계의 접선유동여과는 분자량 컷오프(Molecular weight cutoff; MWCO)가 50,000 Da 내지 200,000 Da인 TFF 필터를 사용한다.
본 개시에서 상기 (e) 단계의 항체는 식물 유래 ABCG36 항체이다.
본 개시에서 상기 식물 유래 엑소좀의 제타 포텐셜(zeta potential)은 -30 내지 -15mV이다.
본 개시의 다른 양태는 상기 분리 방법으로 분리된 식물 유래 엑소좀을 제공한다.
본 개시의 또 다른 양태는 상기 식물 유래 엑소좀을 조성물 전체 중량에 대하여 0.1 내지 20중량% 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.
본 개시에서 상기 화장료 조성물은 주름개선, 세포 생장, 항염 또는 항노화용이다.
본 개시에 따른 식물 유래 엑소좀 분리 방법은 접선유동여과 및 항체가 부착된 비드를 함께 사용하여 엑소좀의 분리 효율을 향상시킬 수 있다.
또한, 본 개시에 따른 식물 유래 엑소좀은 제타 포텐셜이 우수하여 안정하고, 이를 포함하는 화장료 조성물은 우수한 주름개선, 세포 생장, 항염 또는 항노화 효과를 나타낼 수 있다.
도 1은 실시예의 병풀 유래 엑소좀의 NTA 분석 및 TEM 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 실시예 및 비교예 1 내지 3의 엑소좀의 크기 분포와 입자수를 확인하기 위한 NTA 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 실시예 및 비교예 1 내지 3의 엑소좀의 제타 포텐셜을 나타낸 도면이다.
도 4는 실시예 및 비교예 5의 엑소좀의 세포투과도를 확인한 도면이다.
도 5는 실시예의 엑소좀 및 비교예 4의 병풀 추출물의 진피세포 생장 효과를 나타낸 결과이다.
도 6은 실시예 및 비교예 5의 엑소좀의 피부세포 상처치유능을 평가한 결과이다.
도 7은 실시예의 엑소좀 및 비교예 4의 병풀 추출물의 NO(nitric oxide) 생성 억제 활성을 평가한 결과이다.
도 8은 실시예의 엑소좀 및 비교예 4의 병풀 추출물의 프로콜라겐 I형의 생성능을 평가한 결과이다.
도 9는 실시예의 병풀 유래 엑소좀의 온도 및 주차별 안정성을 나타낸 결과이다.
도 2는 실시예 및 비교예 1 내지 3의 엑소좀의 크기 분포와 입자수를 확인하기 위한 NTA 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 실시예 및 비교예 1 내지 3의 엑소좀의 제타 포텐셜을 나타낸 도면이다.
도 4는 실시예 및 비교예 5의 엑소좀의 세포투과도를 확인한 도면이다.
도 5는 실시예의 엑소좀 및 비교예 4의 병풀 추출물의 진피세포 생장 효과를 나타낸 결과이다.
도 6은 실시예 및 비교예 5의 엑소좀의 피부세포 상처치유능을 평가한 결과이다.
도 7은 실시예의 엑소좀 및 비교예 4의 병풀 추출물의 NO(nitric oxide) 생성 억제 활성을 평가한 결과이다.
도 8은 실시예의 엑소좀 및 비교예 4의 병풀 추출물의 프로콜라겐 I형의 생성능을 평가한 결과이다.
도 9는 실시예의 병풀 유래 엑소좀의 온도 및 주차별 안정성을 나타낸 결과이다.
이하, 본 개시가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 개시의 실시예에 대하여 첨부한 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다. 그러나 본 개시는 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
본 개시에서 사용된 용어, "엑소좀"이란 식물에서 추출된 50 내지 200 nm 정도의 크기를 갖는 엑소좀 혹은 엑소좀 유사 세포외 소포체를 통칭한다.
본 개시는 식물 유래 엑소좀 추출 방법으로서, (a) 식물을 세척 및 착즙하여 식물 착즙액을 수득하는 단계; (b) 식물 착즙액을 원심분리하여 1차 상층액을 수득하는 1차 원심분리 단계; (c) 1차 상층액을 원심분리하여 2차 상층액을 수득하는 2차 원심분리 단계; (d) 2차 상층액을 접선유동여과(tangential flow filtration, TFF)하여 분리물을 수득하는 단계; 및 (e) 분리물에 항체가 부착된 비드를 첨가하여 식물 유래 엑소좀을 포함하는 추출물을 얻는 단계;를 포함한다.
상기 (a) 단계에서 식물은 병풀일 수 있으며, 상기 병풀은 생물 또는 건조물을 사용할 수 있고, 생물이 가장 바람직하다. 또한, 세척은 에탄올 또는 증류수를 이용하여 진행될 수 있고, 식물 착즙은 당업계에서 일반적으로 사용되는 착즙기를 사용하여 진행될 수 있으며, 바람직하게는 스크류 착즙기를 이용할 수 있다. 스크류 착즙기의 교반 속도는 20 내지 50 rpm인 것이 바람직하다.
상기 (b) 단계 및 (c) 단계의 원심분리법은 원심분리법은 고체와 고체를 둘러싼 액체 간의 밀도차를 이용하는 분리 방법으로서 고체가 침전(sedimentation)되는 것을 원심력을 이용하여 가속하는 방법을 의미한다. 원심분리는 공정을 계속적으로 반복할 수 있고, 많은 양을 짧은 시간 안에 처리할 수 있으며, 멸균상태에서 조업이 용이한 장점이 있다.
상기 (b) 단계의 1차 원심분리는 식물 착즙액을 저속 원심분리(low-speed centrifugation)하여 1차 상층액을 수득하기 위해 진행되는 것으로서, 1,000xg 내지 3,000xg에서 10분 내지 50분간 진행될 수 있으며, 바람직하게는 1,500xg 내지 2,500xg에서 20분 내지 40분간 진행될 수 있다. 상기 범위를 벗어나는 경우 엑소좀의 분리 효율이 저하될 수 있어, 상기 범위가 바람직하다.
상기 (c) 단계의 2차 원심분리는 1차 상층액을 고속 원심분리(high-speed centrifugation)하여 2차 상층액을 수득하기 위해 진행되는 것으로서, 8,000xg 내지 12,000xg에서 40분 내지 80분간 진행될 수 있으며, 바람직하게는 9,000xg 내지 11,000xg에서 50분 내지 70분간 진행될 수 있다. 상기 범위를 벗어나는 경우 엑소좀의 분리 효율이 저하될 수 있어, 상기 범위가 바람직하다.
또한, 본 개시에서 상기 (c) 단계 이후, 엑소좀 분리 효율을 향상시키기 위하여 수득한 2차 상층액을 감압조건 하에서 0.2 내지 0.3㎛의 필터로 잔여물을 제거할 수 있다.
상기 (d) 단계의 접선유동여과(tangential-flow filtration, TFF) 는 용액이 여과 막의 직각 방향으로 흘러가며, 용액 내에 존재하는 작은 크기의 불순물을 걸러내고 큰 크기의 엑소좀을 분리하는 여과 방식이다.
TFF에서 공급(feed) 용액의 빠른 유동은 막 또는 중공사 표면을 '쓸어내면서' 농도 분극(공극 표면의 제품 농도)을 감소시키는 작용을 한다. 또한 TFF법은 공극을 막을 수 있는 오염 물질의 증가를 방지한다. 이 신속한 cross flow는 압력을 떨어뜨리는데 이 때문에 멤브레인 또는 중공사의 공극보다 작은 피드 용액과 용해 분자 중 일부가 필터를 통과하도록 힘을 받을 수 있다. 공극을 통과한 용액을 여과액 또는 투과액이라고 하는데, 공극보다 큰 분자 또는 입자는 피드 용액에 남게 되어 효과적으로 농축된다. 바람직한 구현예에서 본 개시의 TFF는 한외여과 시스템이며, 상기와 같이 TFF 방법을 수행한 결과 원심분리된 추출액이 1/10 내지 1/100의 부피까지 효율적으로 농축될 수 있게 된다. 한외여과란 미세여과(microfiltration) 및 역삼투의 중간 영역에 위치하는 것으로서 막세공과 용질간의 크기 차에 의해 특정 물질을 분리하는 방법이다. 한외여과막은 막에 의해 90% 이상의 배제도를 나타내는 용질의 최소 분자량으로 정의되는 분획분자량(molecular weight cutoff, MWCO)으로서 그 분리 성능을 나타낼 수 있다.
상기 (d) 단계에서 접선유동여과는 분자량 컷오프(Molecular weight cutoff; MWCO)가 50,000 Da 내지 200,000 Da인 TFF 필터를 사용할 수 있고, 바람직하게는 80,000 Da 내지 120,000 Da인 TFF 필터를 사용하는 것이 바람직하다.
상기 (e) 단계는 접선유동여과에 따라 분리된 엑소좀을 포함하는 분리물에서 엑소좀을 포함하는 추출물을 얻는 단계로서, 항체가 부착된 비드를 첨가하여 진행될 수 있으며, 상기 항체가 부착된 비드는 항체 및 비드를 버퍼 내에서 혼합하여 제조되는 것일 수 있다.
본 개시에서 상기 항체는 분리물의 엑소좀 또는 엑소좀 유사 세포외 소포체 와 결합하여 최종적으로 엑소좀을 분리가능하도록 하는 것으로, 식물 세포외 소포체 막에 존재하는 단백질의 항체일 수 있으며, 엑소좀의 추출 효율을 향상시키기 위해 바람직하게는 식물 세포외 소포체 막 단백질의 항체인 ABCG36 항체일 수 있고, 상기 비드는 일반적으로 당업계에서 항체 부착을 위한 지지체로 사용되는 것이라면 제한 없이 사용 가능하다.
본 개시에서 사용된 항체 ABCG36(PEN3) 항체는 외부 병원체에 대한 침투 저항성 유전자로서, 표피 외부 원형질막 도메인에 여러 병원체에 대한 비숙주 내성을 부여할 수 있으며, 항균 방어 효과가 있어, 외부 병인균으로부터 방어기작 역할을 하며, 본 개시에서는 엑소좀의 추출 효율을 항상시킬 수 있다.
본 개시에서 항체가 부착된 비드의 사용량은 엑소좀을 포함하는 분리물 100중량부 대비 50~150중량부일 수 있고, 바람직하게는 80~120중량부일 수 있고, 가장 바람직하게는 동일한 100중량부일 수 있다. 항체가 부착된 비드의 사용량이 50중량부 미만이면 엑소좀의 분리 효율이 저하될 수 있으며, 150중량부를 초과하면 첨가량 대비 엑소좀 분리 효율이 크게 증가하지 않아 경제적이지 못하다.
본 개시에서 (e) 단계 이후, 엑소좀을 포함하는 추출물에서, 엑소좀을 최종 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 개시에 따라 분리된 식물 유래 엑소좀은 50nm 내지 200㎚의 크기일 수 있으며, 바람직하게는 100nm 내지 200㎚일 수 있고, 추출물 1ml 당 5×1010 내지 15×1010 개가 존재할 수 있으며, 바람직하게는 추출물 1ml 당 8×1010 내지 10×1010 개가 존재할 수 있다.
또한, 본 개시에 따라 분리된 식물 유래 엑소좀의 제타 포텐셜(zeta potential)은 -30 내지 -15mV일 수 있고, 바람직하게는 -25 내지 -18mV일 수 있으며, 상기 범위의 제타 포텐셜을 나타냄으로써, 수용액 내에서 높은 안정성을 나타낼 수 있다.
본 개시의 다른 양태는 전술한 분리 방법으로 분리된 식물 유래 엑소좀으로써, 특징은 전술한 바와 동일하여 이하 생략한다.
또한, 본 개시의 또 다른 양태는 분리된 식물 유래 엑소좀을 전체 중량에 대하여 0.1 내지 20중량% 포함하는 화장료 조성물로서, 상기 화장료 조성물은 주름개선, 세포 생장, 항염 또는 항노화용일 수 있다.
본 개시의 항노화 효과는 진피세포의 생장을 통해 확인하였고, 항염 효과는 NO 생성 억제 활성을 통해 확인하였고, 세포 생장(상처 치유)효과는 피부세포 상처치유능을 통해 확인하였고, 주름개선 효과는 프로 콜라겐 I형 생성능을 통해 확인하였다.
본 개시의 화장료 조성물은 식물 유래 엑소좀 이외에 통상적으로 허용되는 성분들을 제한 없이 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.
본 개시에 따른 화장료 조성물은 용액, 외용연고, 크림, 폼, 영양화장수, 유연화장수, 팩, 유연수, 유액, 메이크업베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선 스크린크림, 선오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패치 및 스프레이로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 개시의 화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급 알콜, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 개시의 화장료 조성물에 포함되는 화장품학적으로 허용가능한 담체는 제형에 따라 다양하다.
본 개시의 제형이 연고, 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는, 담체성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있다.
본 개시의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 포함할 수 있다.
본 개시의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되며, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일이 이용될 수 있으며, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브 오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있다.
본 개시의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 개시의 제형이 비누인 경우에는 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속 염, 지방산 헤미에스테르 염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알콜, 식물성 유, 글리세롤, 당 등이 이용될 수 있다.
본 개시의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시테이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 오일, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
이하, 본 개시를 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 개시를 예시하는 것일 뿐, 본 개시의 내용이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
생병풀 1kg을 에탄올(90%) 및 증류수로 세척 후 남아 있는 물기를 제거했다. 세척이 완료된 생병풀을 일반 착즙기를 사용하여 30 rpm의 저속 스크류 착즙기로 병풀 착즙을 수행하였으며 수득한 병풀 착즙액은 메쉬망에 걸러 부유물을 제거하였다.
병풀 착즙액을 저속(2,000xg, 30min, 4℃) 원심 분리하여 잔여물을 제거하고 1차 상층액을 취하여 고속(12,000xg, 60min, 4℃) 에서 2차 원심 분리하여 남아있는 잔여물을 제거하고 2차 상층액을 취하였다.
2차 상층액을 감압조건 하에서 0.22 um filter로 걸러 잔여물을 최종적으로 제거하였다.
접선흐름여과(tangential-flow filtration, TFF) 시스템을 통해 잔여물이 제거된 2차 상층액에서 엑소좀을 추출하였다. 구체적으로, 100,000 Da MWCO membrane의 멤브레인이 설치된 접선유동여과 시스템을 이용하여 엑소좀을 분리 정제하였다.
ABCG36 항체(ABCG36 antibody, Phytoab사) 및 비드(7um streptavidin coated beads, Phytoab사)를 버퍼 내에서 혼합하여 ABCG36 항체를 비드에 부착한 후, TFF를 이용하여 분리한 분리물 500 ㎕에 ABCG36 항체가 부착된 비드를 500 ㎕ 넣어 HOMM 칩을 이용하여 10분동안 진행하여 엑소좀을 포함하는 추출물을 얻었다. 이후 EV(세포외소포)를 Elution buffer(더다봄 사)를 이용하여 떼어낸 후 엑소좀을 최종 분리하였다.
비교예 1
생병풀 1kg을 에탄올(90%) 및 증류수로 세척 후 남아 있는 물기를 제거했다. 세척이 완료된 생병풀을 일반 착즙기를 사용하여 30 rpm의 저속 스크류 착즙기로 병풀 착즙을 수행하였으며 수득한 병풀 착즙액은 메쉬망에 걸러 부유물을 제거하였다.
병풀 착즙액을 저속(2,000xg, 30min, 4℃) 원심 분리하여 잔여물을 제거하고 1차 상층액을 취하여 고속(12,000xg, 60min, 4℃)에서 2차 원심 분리하여 남아있는 잔여물을 제거하고 2차 상층액을 취하였다.
2차 상층액을 감압조건 하에서 0.22 um filter로 걸러 잔여물을 최종적으로 제거하였다.
잔여물이 제거된 2차 상층액을 초고속(150,000xg, 70min, 4℃)에서 3차 원심 분리하여 3차 상층액을 취하여 최종적으로 엑소좀을 추출하였다.
비교예 2
생병풀 1kg을 에탄올(90%) 및 증류수로 세척 후 남아 있는 물기를 제거했다. 세척이 완료된 생병풀을 일반 착즙기를 사용하여 30 rpm의 저속 스크류 착즙기로 병풀 착즙을 수행하였으며 수득한 병풀 착즙액은 메쉬망에 걸러 부유물을 제거하였다.
병풀 착즙액을 저속(2,000xg, 30min, 4℃) 원심 분리하여 잔여물을 제거하고 1차 상층액을 취하여 고속(12,000xg, 60min, 4℃)에서 2차 원심 분리하여 남아있는 잔여물을 제거하고 2차 상층액을 취하였다.
2차 상층액을 감압조건 하에서 0.22 um filter로 걸러 잔여물을 최종적으로 제거하였다.
2차 상층액과 PEG/Dextran 용액을 혼합한 후 1,000xg에서 10분동안 4℃에서 원심분리를 수행하였다. 원심분리 후 상층액을 제거하여 엑소좀을 추출하였다.
비교예 3
생병풀 1kg을 에탄올(90%) 및 증류수로 세척 후 남아 있는 물기를 제거했다. 세척이 완료된 생병풀을 일반 착즙기를 사용하여 30 rpm의 저속 스크류 착즙기로 병풀 착즙을 수행하였으며 수득한 병풀 착즙액은 메쉬망에 걸러 부유물을 제거하였다.
병풀 착즙액을 저속(2,000xg, 30min, 4℃) 원심 분리하여 잔여물을 제거하고 1차 상층액을 취하여 고속(12,000xg, 60min, 4℃)에서 2차 원심 분리하여 남아있는 잔여물을 제거하고 2차 상층액을 취하였다.
2차 상층액을 감압조건 하에서 0.22 um filter로 걸러 잔여물을 최종적으로 제거하여 엑소좀을 추출하였다.
비교예 4
병풀 추출물을 시중(월드코스텍 사)에서 구입하여 준비하였다.
비교예 5
비교예 4의 병풀 추출물을 저속(2,000xg, 30min, 4℃) 원심 분리하여 잔여물을 제거하고 1차 상층액을 취하여 고속(12,000xg, 60min, 4℃) 에서 2차 원심 분리하여 남아있는 잔여물을 제거하고 2차 상층액을 취하였다.
2차 상층액을 감압조건 하에서 0.22 um filter로 걸러 잔여물을 최종적으로 제거하였다.
접선흐름여과(tangential-flow filtration, TFF) 시스템을 통해 잔여물이 제거된 2차 상층액에서 엑소좀을 추출하였다. 구체적으로, 100,000 Da MWCO membrane의 멤브레인이 설치된 접선유동여과 시스템을 이용하여 엑소좀을 분리 정제하여 엑소좀을 추출하였다.
실험예 1
실시예에서 추출된 엑소좀의 입자 크기 분포와 단위 부피당 입자 수 및 모양을 확인하기 위해 나노입자추적분석(Nanoparticle Tracking Analysis, NTA) 및 투과 전자 현미경(TEM)으로 분석하였고, 이에 대한 결과는 도 1에 나타내었다.
도 1을 참조하면, 실시예에 따라 추출된 엑소좀 입자들의 크기는 평균 100 내지 200nm이었으며, 1 mL의 단위 부피당 개수는 약 9.3 x 1010개인 것을 확인할 수 있다. 또한, TEM 분석 결과 구형의 인지질 이중층 구조로 된 약 150nm의 입자의 존재를 확인하였다.
실험예 2
실시예 및 비교예 1 내지 3에서 추출된 엑소좀의 입자 크기 분포와 단위 부피당 입자 수를 확인하기 위해 나노입자추적분석(Nanoparticle Tracking Analysis, NTA)으로 분석하였으며, 이에 대한 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2a는 병풀 유래 엑소좀의 크기 분포를 나타낸 도면이고, 도 2b는 엑소좀의 1ml 당 입자수를 나타낸 도면이다.
도 2a를 참조하면, 실시예 및 비교예 1 내지 3에 따라 추출된 엑소좀 입자들의 크기는 100 내지 200nm로 유사하였다.
도 2b를 참조하면, 1 mL의 단위 부피당 개수는 실시예의 경우 약 9.3 x 1010개이고, 비교예 1은 약 4.1 x 1010개, 비교예 2는 약 2.0 x 1010개, 비교예 3은 약 4.2 x 1010개로, TFF 및 항체를 부착한 비드를 이용한 경우(실시예), 가장 많은 양의 엑소좀을 추출할 수 있음을 확인하였다.
실험예 3
용액 내 분산되어 있는 입자인 콜로이드는 수용액 내에 존재 시 입자 표면의 표면극성기의 해리와 이온의 흡착에 의하여 전하를 띤다. 입자들 간의 반발력의 정도가 콜로이드의 안정성을 평가하는 중요한 척도로 사용된다.
즉, 음(-) 또는 양(+)의 제타전위 값이 크다면 입자들간의 반발력이 크고 분산 안정성이 좋다고 볼 수 있고, 작으면 입자들간의 인력이 크게 작용하여 응집력이 크다고 볼 수 있다. 따라서 실시예 및 비교예 1 내지 3에 따라 추출한 엑소좀의 용액 내 분산 및 응집을 확인하기 위해 Zetasizer를 통해 zeta potential(제타 전위) 분석을 진행하였고, 이에 대한 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3을 참조하면, 제타 포텐셜은 실시예의 경우 - 21.3mV이고, 비교예 1은 -21.6mV, 비교예 2는 -8.8mV, 비교예 3은 -16.3mV로, TFF 및 항체를 부착한 비드를 이용한 경우(실시예), 실시예에 따라 추출한 병풀 유래 엑소좀의 분산 안정성이 가장 우수한 것을 확인할 수 있다.
실험예 4
실시예 및 비교예 5의 엑소좀의 세포투과 여부를 측정하기 위하여 EV의 지질층을 염색할 수 있는 Dil 염색 시약을 이용하여 EV 표면의 지질층을 염색한 후, 염색되지 않은 염색약은 사이즈 크로마토그래피 방법을 이용하여 제거하였다. 그 후에 HaCaT 세포주에 EV를 동일한 양을 처리한 후 4시간 뒤에 핵을 염색하는 Hoechst을 이용하여 염색한 후 엑소좀이 HaCaT 세포에 전달된 비율을 측정하였다. 세포 비율은 Confocal LSM 880 (Zeiss)을 이용하여 측정하였으며, 이에 대한 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4를 참조하면, 병풀 추출물에서 추출한 엑소좀(비교예 5)보다 병풀 생물에서 추출한 엑소좀(실시예)의 세포투과도가 우수한 것을 확인할 수 있다.
실험예 5
실시예의 엑소좀 및 비교예 4의 병풀 추출물의 진피세포 생장 효능을 측정하고, 이에 대한 결과를 도 5에 나타내었다.
인간진피 섬유아세포(Human foreskin Fibroblasts, HS68)는 ATCC (USA)에서 구매하여 사용하였다. 세포배양액은 Dulbeco's Modified Eagle's Medium (DMEM; Gibco, USA)에 10% fetal bovine serum (FBS; Gibco), 10% penicillin (100 unit/mL)과 streptomycin (100 g/mL)를 첨가하여 사용하였다. 배양조건은 37℃, 95% 습도, 5% CO2 incubator에서 배양하였으며, 3-10세대 사이의 세포를 실험에 사용하였다.
인간진피 섬유아세포인 nHDF 세포에 실시예의 엑소좀 및 비교예 4의 병풀 추출물을 0.036, 0.125, 0.25, 0.5 및 1 %의 농도로 처리 후에 24시간 동안 세포를 배양하였고, 이 후 세포의 MTT을 이용하여 viability를 측정하였다.
도 5를 참조하면, 병풀 유래 엑소좀(실시예)의 경우, 병풀 추출물(비교예 4)보다 모든 농도에서 우수한 생장 향상 효능을 나타내고 있으며, 1%의 농도에서 가장 우수한 생장 향상 효능을 나타내고 있음을 확인할 수 있다.
실험예 6
실시예 및 비교예 5의 엑소좀의 상처 치료 효능을 확인하기 위하여, 각질세포에 상처를 가한 후 상처 치유활성을 확인하였고, 이에 대한 결과를 도 6에 나타내었다.
구체적으로, 2.5×105 세포/㎖의 인간 각질세포 HaCaT 세포를 6 웰 플레이트에 옮기고, 10%(v/v)의 우태아 혈청(FBS, Fetal Bovine Serum)을 포함하는 DMEM 배지에서 24시간동안 배양한 후, HaCaT 세포 단일층을 p200 피펫칩으로 "긁힘-손상"을 유도하였다. "긁힘-손상"된 HaCaT 세포층에 상기 실시예 및 비교예 5에서 추출된 엑소좀을 1X108 particles/㎖ 처리한 후, 다시 12시간, 24시간 및 36시간 동안 더 배양하였다. 이후, Scion-Image (Scion Corporation, MA) 프로그램을 이용하여 면적비를 계산하였다.
도 6은 긁힌 면적을 형태학적으로 비교한 사진과 상기 결과를 Scion-Image (Scion Corporation, MA) 프로그램을 이용하여 면적비를 구하여 그래프로 나타낸 결과로서, 실시예를 처리한 실험군이 24시간 및 36시간 처리한 경우 모두 음성 대조군(control) 및 비교예 5와 비교하였을 때, 상기 "긁힘-손상"이 치유되어 긁힌 면적이 감소되었음을 확인할 수 있으며, 병풀 유래 엑소좀(실시예)은 음성 대조군에 비하여 상처 치유 활성이 현저하게 높고, 병풀 추출물 유래 엑소좀(비교예 5)보다 현저하게 높은 것을 확인할 수 있다.
실험예 7
실시예의 엑소좀 및 비교예 4의 병풀 추출물의 항염 효능을 확인하기 위해 No(Nitric oxide) 생성 억제율 평가를 진행하였고, 이에 대한 결과를 도 7에 나타내었다.
Raw264.7 대식세포를 96well plate에 1x104 cells/well 로 분주하였고 24시간 배양한 후, 실시예의 엑소좀 및 비교예 4의 병풀 추출물을 1시간 동안 각각 처리하였다. 처리 후 LPS를 200ng/ml 농도로 처리하고 24시간 배양하여 염증을 유발하였다. 그 후 세포배양 상층액 100ul와 Griess 시약을 동량 혼합하여 10분간 실온 암소 반응시킨 후 Spectrophotometer를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다.
도 7을 참조하면, 병풀 유래 엑소좀(실시예)을 처리하였을 때 농도 의존적으로 NO생성량이 감소하였으며 NO 생성 억제 활성이 병풀 추출물(비교예 4)보다 우수한 것을 확인할 수 있다.
실험예 8
실시예의 엑소좀 및 비교예 4의 병풀 추출물의 주름개선 효능 확인하기 위해 Procollagen Type Ⅰ 생성능 평가를 진행하였고, 이에 대한 결과를 도 8에 나타내었다. 인간 피부 섬유아세포 HS68세포 (human skin fibroblasts)를 10% 우태아 혈청 (fetal bovine serum : FBS)에 페니실린 7.5mg/L, 스트렙토마이신 7.5mg/L를 함유하고 있는 DMEM 배지를 사용하여 37℃로 24시간동안 5% CO2 하에 배양하였다. 해양 후 배지를 버리고 10% PBS로 세척 후 새로운 배지에 실시예의 엑소좀 및 비교예 4의 병풀 추출물을 각각 처리하고 24시간 배양하였다. 그 후 배양액을 수거하여 Procollagen type-ⅠC peptide (PIP) ELASA kit(takara)를 사용하여 배양액 내 콜라겐 생성량을 측정하였다. 이때 음성 대조군으로는 PBS를 처리하였고, 양성 대조군으로는 TGF-β1를 5ng/mL를 처리하였다.
도 8을 참조하면, 병풀 유래 엑소좀(실시예)을 처리하였을 때 농도 의존적으로 콜라겐 생성량이 증가하였으며 콜라겐 생성능이 병풀 추출물(비교예 4)보다 우수한 것을 확인할 수 있다.
실험예 9
실시예에 따라 추출된 엑소좀의 안정성을 확인하기 위하여 병풀 유래 엑소좀을 4주 간 -20℃, 4℃, 25℃ 및 50℃ 에서 보관 후 실험예 1 및 2와 동일하게 입자의 크기, 농도 및 제타 포텐션을 측정하고, 이에 대한 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9를 참조하면, 병풀 유래 엑소좀(실시예)의 경우, 온도 및 시간의 경과에 따라 크기 및 농도가 크게 변화되지 않으며, 제타 포테셜의 경우 25℃ 및 3주차에 가장 우수함을 확인할 수 있다.
이와 같이, 본 개시에 따른 식물 유래 엑소좀 추출 방법은 엑소좀의 추출 효율을 향상시키고, 이에 따라 추출된 엑소좀은 우수한 안정성을 나타낼 수 있다.
Claims (10)
- (a) 식물을 세척 및 착즙하여 식물 착즙액을 수득하는 단계;
(b) 식물 착즙액을 원심분리하여 1차 상층액을 수득하는 1차 원심분리 단계;
(c) 1차 상층액을 원심분리하여 2차 상층액을 수득하는 2차 원심분리 단계;
(d) 2차 상층액을 접선유동여과(tangential flow filtration, TFF)하여 분리물을 수득하는 단계; 및
(e) 분리물에 항체가 부착된 비드를 첨가하여 식물 유래 엑소좀을 포함하는 추출물을 얻는 단계;
를 포함하는 식물 유래 엑소좀 추출 방법. - 제1항에 있어서,
상기 (a) 단계에서, 식물은 병풀인 것을 특징으로 하는 식물 유래 엑소좀 추출 방법. - 제1항에 있어서,
상기 (b) 단계에서,
1차 원심분리 단계는 1,000xg 내지 3,000xg에서 10분 내지 50분간 진행되는 것을 특징으로 하는 식물 유래 엑소좀 추출 방법. - 제1항에 있어서,
상기 (c) 단계에서,
상기 2차 원심분리 단계는 8,000xg 내지 12,000xg에서 40분 내지 80분간 진행되는 것을 특징으로 하는 식물 유래 엑소좀 추출 방법. - 제1항에 있어서,
상기 (d) 단계에서,
상기 접선유동여과는 분자량 컷오프(Molecular weight cutoff; MWCO)가 50,000 Da 내지 200,000 Da인 TFF 필터를 사용하는 것을 특징으로 하는 식물 유래 엑소좀 추출 방법. - 제1항에 있어서,
상기 (e) 단계에서,
상기 항체는 식물 유래 ABCG36 항체인 것을 특징으로 하는 식물 유래 엑소좀 추출 방법. - 제1항에 있어서,
상기 식물 유래 엑소좀의 제타 포텐셜(zeta potential)은 -30 내지 -15mV인 것을 특징으로 하는 식물 유래 엑소좀 추출 방법. - 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 추출 방법으로 추출된 식물 유래 엑소좀.
- 제8항의 식물 유래 엑소좀을 조성물 전체 중량에 대하여 0.1 내지 20중량% 포함하는 화장료 조성물.
- 제9항에 있어서,
상기 화장료 조성물은 주름개선, 세포 생장, 항염 또는 항노화용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
Priority Applications (2)
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