WO2023249340A1 - 고순도의 인삼 엑소좀 조성물 및 이의 기능성 화장품 용도 - Google Patents
고순도의 인삼 엑소좀 조성물 및 이의 기능성 화장품 용도 Download PDFInfo
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Definitions
- the present invention relates to a cosmetic composition containing ginseng exosomes as an active ingredient and functional cosmetics containing the same.
- Exosomes are nano-sized microvesicles secreted by various cells and contain proteins, lipids, mRNA and miRNA, and are reported to act as important mediators of intercellular communication by acting on the endocrine system. This role is attracting attention as a new treatment that can overcome the problems of existing stem cell treatments, such as engraftment rate and immunogenicity.
- exosomes isolated from edible plants are known to have no toxicity or immunogenicity compared to exosomes secreted from mammalian cells, and have very high in vivo stability and biocompatibility. Additionally, exosomes isolated from mammalian cells contain about 20% cholesterol, but edible plant exosomes have been reported to be cholesterol-free. In particular, compared to animal tissues or cell cultures, raw plants have the advantage of being obtained in large quantities.
- exosomes Depending on the plant from which it is derived, exosomes contain various proteins, but little is known about ginseng exosomes to date. In most studies, the characteristics of plant exosomes are confirmed by their size or shape, and in order to extract plant exosomes, a method to select the appropriate size and extract only exosomes is needed.
- the purpose of the present invention is to provide a highly purified ginseng exosome composition containing ginseng-derived exosomes as an active ingredient. More specifically, the present invention relates to the collagen synthesis, hyaluronic acid synthesis, and whitening efficacy of human skin tissue of plant exosomes containing ginsenosides Rg1 and Rb1 isolated and purified from ginseng.
- the purpose of the present invention is to promote skin regeneration and skin regeneration.
- the aim is to provide a cosmetic composition containing ginseng exosomes with whitening function as an active ingredient.
- Another object of the present invention is to provide functional cosmetics, such as skin protection, wrinkle improvement, skin barrier improvement, and skin whitening, manufactured using the composition as a cosmetic raw material.
- Another object of the present invention is to provide a skin whitening method comprising applying a cosmetic composition containing ginseng exosomes to a subject.
- Another object of the present invention is to provide a cosmetic use for skin whitening of a cosmetic composition containing ginseng exosomes.
- Another object of the present invention is to provide a cosmetic use for wrinkle improvement, skin regeneration, and skin barrier improvement of a cosmetic composition containing ginseng exosomes.
- the purpose of the present invention is to provide the following implementation examples.
- Embodiment Example 1 A high-purity ginseng exosome composition comprising ginseng exosomes isolated from ginseng as an active ingredient.
- Embodiment 2 A method of treating the skin of a subject in need thereof, comprising applying to the subject a ginseng exosome or a ginseng exosome composition isolated from ginseng, wherein the isolated ginseng exosome or ginseng exosome composition
- Embodiment 3 Use of ginseng exosomes or ginseng exosome compositions isolated from ginseng for providing (or producing) a cosmetic effect on skin (or human skin), wherein the isolated ginseng exosomes or ginseng exosome compositions are applied to the skin. Uses that provide anti-aging, antioxidant, collagen production, hyaluronic acid production, skin whitening, wrinkle improvement and/or skin cell regeneration effects.
- the ginseng exosomes isolated from the ginseng are included in an amount of 1 x 10 7 to 1 x 10 14 per unit volume of 1 mL of the composition.
- Embodiment 5 The method of any of the preceding embodiments, wherein the composition is a cosmetic composition.
- Embodiment 6 The method of any one of the preceding embodiments, wherein the composition has one or more skin cosmetic uses selected from the group consisting of anti-aging, antioxidant, collagen production, hyaluronic acid production, skin whitening, wrinkle improvement, and skin cell regeneration. is to have.
- Embodiment 7 The method of any one of the preceding embodiments, wherein the composition is a formulation selected from the group consisting of aqueous solutions, suspensions, emulsions, creams, frozen solutions, spray dried powders and lyophilized powders.
- Embodiment 8 The method of any one of the preceding embodiments, wherein the ginseng exosomes isolated from ginseng include ginsenoside Rb1 and ginsenoside Rg1.
- Embodiment 9 A cosmetic product comprising ginseng exosomes isolated from ginseng or a ginseng exosome composition according to any one of the preceding embodiments.
- the cosmetic product is mist, serum, nourishing lotion, softening lotion, softening water, emulsion, skin lotion, skin softener, skin toner, astringent, lotion, milk lotion, moisture lotion.
- It is a formulation selected from the group consisting of cream, cosmetic liquid, beauty pack, ointment, gel, linement, liquid, patch, spray, bath agent, sunscreen, sun oil, and hair product.
- the cosmetic is a functional cosmetic having one or more effects selected from the group consisting of preventing skin aging, skin whitening, wrinkle improvement, and skin cell regeneration.
- the cosmetic contains the ginseng exosomes in an amount of 1 x 10 6 to 1 x 10 12 per unit volume of 1 mL.
- Embodiment 13 A method for preparing a ginseng exosome composition according to any one of the preceding embodiments, comprising: performing centrifugation; And a step of performing tangential-flow filtration (TFF), wherein the composition contains ginseng-derived exosomes in an amount of 1 x 10 7 to 1 x 10 14 per unit volume of 1 mL.
- TFF tangential-flow filtration
- One aspect of the present invention is to provide a high-purity ginseng exosome composition containing ginseng-derived exosomes as an active ingredient.
- the ginseng-derived exosomes are 1 ⁇ 10 6 to 1 ⁇ 10 13 per unit volume of 1 mL of the composition, preferably 1 ⁇ 10 7 to 1 x 10 14 , more preferably 1 x 10 11 to 1 x. It may be included in an amount of 10 14 pieces, more preferably 1 x 10 12 to 1 x 10 14 pieces.
- exosome refers to exosomes extracted from ginseng and having a size of about 50 to 300 nm, preferably 50 to 200 nm, or extracellular vesicles containing exosomes. Ginseng exosomes form uniformly sized particles of 50 to 200 nm in the form of a double lipid membrane.
- exosomes are nanoparticles composed of a double lipid membrane and are absorbed into skin cells through receptor-mediated endocytosis and membrane fusion. Additionally, the active ingredients contained inside are not directly exposed to the outside, so they are not easily deteriorated and maintain biological activity for a long period of time. Because it can be maintained, it is very advantageous for commercial use in the cosmetics industry.
- Ginseng the raw material plant of the present invention, belongs to Panax ginseng, a type of ginseng genus.
- the raw plant parts can be used as a mixture of the entire ginseng plant or one or more parts including flowers, stems, buds, and fruits.
- the ginseng exosome composition of the present invention is a cosmetic composition, wherein the composition has one or more skin properties selected from the group consisting of anti-aging, antioxidant, collagen production, hyaluronic acid production, skin whitening, wrinkle improvement, and skin cell regeneration. It may have cosmetic uses.
- the ginseng exosome presented in the present invention contains an excessive amount of ginsenosides Rg1 and Rb1 and has the function of improving collagen production and hyaluronic acid production in human skin and inhibiting melanin synthesis.
- ginseng exosomes have skin regeneration and whitening functions due to functional substances including ginsenoside derived from ginseng, a raw plant.
- ginseng exosomes which contain a large amount of ginsenoside Rg1, ginsenoside Rb1, and polyphenols, which are known to have antioxidant functions, suppress free radicals accumulated in skin cells and exhibit effects such as skin regeneration and whitening.
- Ginseng exosomes have anti-aging and antioxidant functions due to the polyphenol components they contain, which promotes the decomposition of reactive oxygen species existing outside the cells and accumulated reactive oxygen species inside the cells.
- ginseng exosomes with antioxidant function are absorbed into skin cells through receptor-mediated endocytosis and membrane fusion, and the absorbed ginseng exosomes stimulate antioxidant signaling mechanisms within skin cells, increasing the expression of genes such as SOD and catalases (CAT). It increases anti-aging and antioxidant effects.
- genes such as SOD and catalases (CAT). It increases anti-aging and antioxidant effects.
- the ginseng exosome developed in the present invention contains an excessive amount of ginsenoside, a type of natural steroid glycoside or triterpene saponin.
- ginsenosides Rg1 and Rb1 have been proven to have antioxidant mechanisms and to have clinical effects such as improving immunity, improving fatigue, improving blood flow, and improving memory, as well as skin improvement such as skin whitening and collagen regeneration.
- the skin regeneration and whitening cosmetic composition containing ginseng exosomes of the present invention as an active ingredient is a formulation selected from the group consisting of aqueous solution, suspension, emulsion, cream, frozen solution, spray-dried powder, and freeze-dried powder. can be provided.
- Another aspect of the present invention is to provide a cosmetic product containing a cosmetic composition for skin regeneration and whitening containing ginseng exosomes as an active ingredient.
- the cosmetics can be mixed with general ingredients used in the manufacture of general skin cosmetics, such as oil, water, surfactants, moisturizers, lower alcohols, thickeners, chelating agents, pigments, preservatives, fragrances, etc., as needed.
- general ingredients used in the manufacture of general skin cosmetics such as oil, water, surfactants, moisturizers, lower alcohols, thickeners, chelating agents, pigments, preservatives, fragrances, etc., as needed.
- the cosmetics include mist, serum, nourishing lotion, softening lotion, softening water, emulsion, skin lotion, skin softener, skin toner, astringent, lotion, milk lotion, moisture lotion, nourishing lotion, massage cream, nourishing cream, moisture cream, Hand cream, foundation, powder, makeup base, essence, nutritional essence, pack, soap, cleansing foam, cleansing lotion, cleansing cream, body lotion, body cleanser, face wash, treatment, serum, beauty pack, ointment, gel, liniment.
- the cosmetics of the present invention may be functional cosmetics having one or more effects selected from the group consisting of collagen production, hyaluronic acid production, skin whitening, wrinkle improvement, skin barrier improvement, and skin cell regeneration.
- ginseng exosomes extracted from ginseng contain 1 ⁇ 10 or more, 1 ⁇ 10 2 or more, 1 ⁇ 10 3 or more, 1 ⁇ 10 4 or more, 1 ⁇ 10 5 or more, or 1 ⁇ 10 per unit volume of 1 mL of the cosmetic product. It may be included in a content of 6 or more particles, preferably 1 ⁇ 10 6 to 1 ⁇ 10 12 , more preferably 1 ⁇ 10 6 to 1 ⁇ 10 12 , even more preferably 1 ⁇ 10 7 to 1 ⁇ 10 12 . It can be contained in a content of 1 ⁇ 10 12 particles.
- Another aspect of the present invention is a method for producing a high-purity ginseng composition containing the ginseng exosomes as an active ingredient, comprising: performing centrifugation; and performing tangential-flow filtration (TFF).
- the manufacturing method of the present invention includes the steps of crushing ginseng; performing microfiltration and centrifugation; And it may include the step of performing tangential-flow filtration (TFF).
- the process of crushing the raw plant may include mechanically crushing a mixture of the raw plant and the buffer solution in a weight ratio ranging from 1:1 to 1:10, using a blade rotating at a speed of 10 to 1,000 rpm. This can be accomplished by mechanically grinding the plant mixture.
- the microfiltration method is performed by filtering the plant mixture through a filtration membrane having pores ranging in size from 10 ⁇ m to 200 nm, preferably from a combination of one or more types of filtration membranes with different pores.
- the centrifugation method may be selected from low-speed centrifugation, high-speed centrifugation, ultracentrifugation, and combinations thereof, preferably ultracentrifugation. It may include. Low-speed centrifugation can achieve speeds of less than 6,000 rpm (6,000 Ultracentrifugation refers to a centrifugation method with a maximum speed of about 40,000-80,000 rpm (600,000 xg).
- the tangential-flow filtration is a filtration method in which the solution flows in a direction perpendicular to the filtration membrane, filtering out small-sized impurities present in the solution and separating large-sized exosomes.
- the tangential flow filtration may be one or more selected from the group consisting of hollow fiber TFF and membrane TFF capable of performing ultrafiltration, and preferably has a molecular weight cutoff (MWCO) of 100,000.
- MWCO molecular weight cutoff
- ginseng exosomes according to the present invention can be separated from ginseng through mechanical grinding, stepwise ultracentrifugation, and tangential flow filtration (TFF), and these exosomes have skin regeneration, whitening, and antioxidant properties. It contains a large amount of functional polyphenols and ginsenosides.
- Ginseng exosomes have a double lipid membrane structure and are absorbed into skin cells. Ginsenosides Rg1 and Rb1, polyphenols, etc. contained within the absorbed ginseng exosomes stimulate antioxidant signaling mechanisms within skin cells, increasing the expression of various antioxidant genes. It shows antioxidant effect when applied. It has various functional cosmetic uses such as collagen production, hyaluronic acid production, whitening and anti-aging, and skin cell activation derived from the antioxidant effects of ginsenosides Rg1 and Rb1 and polyphenols contained in ginseng exosomes. In addition, the excellent stability of ginseng exosomes can be used in functional cosmetics in various forms such as aqueous solution, frozen solution, and freeze-dried powder.
- Figure 1 is a process schematic diagram of a plant exosome extraction method for separating plant exosomes from plant raw materials with high purity and high yield.
- Figure 2a shows the results of analyzing the characteristics of aloe exosomes through nanoparticle tracking analysis (NTA).
- Figure 2b shows the results of analyzing the characteristics of garlic exosomes through NTA.
- Figure 2c shows the results of analyzing the characteristics of seaweed exosomes through NTA.
- Figure 2d shows the results of confirming the number of ginseng exosomes through NTA (left) and the results of measuring the protein content in exosomes (right).
- Figure 3 shows the results of evaluating the total polyphenol content in ginseng exosomes.
- Figure 4 shows the results of evaluating the shape stability of ginseng exosomes using cryo-TEM after freezing (-70°C) and storing them at room temperature (25°C) for 3 months.
- Figure 5a shows the ginsenoside Rb1 detection reference.
- Figure 5b shows the ginsenoside Rg1 detection reference.
- Figure 5c shows the results of detecting ginsenoside Rg1 and ginsenoside Rb1 in ginseng exosomes.
- Figure 5d shows the results of detecting total polyphenol compounds in ginseng exosomes.
- Figure 6 shows the results confirming the efficacy of ginseng exosomes in increasing intracellular collagen production.
- Figure 7 shows the results confirming the efficacy of ginseng exosomes in increasing intracellular hyaluronic acid production.
- Figure 8 shows the results confirming the efficacy of ginseng exosomes in suppressing extracellular and intracellular melanin formation.
- plant exosomes can be isolated with high purity and yield from various plant raw materials ( Figure 1).
- a high-purity plant exosome composition was prepared using aloe, garlic, seaweed, and ginseng.
- Aloe exosomes were isolated from Aloe, the raw material plant, using ultracentrifugation and tangential flow filtration (TFF) methods. Specifically, aloe peel was mixed with phosphate-buffered saline (PBS) at a weight ratio of 1:2 (w/w), placed in a blender, and then ground. The supernatant was collected by centrifugation at 1,000 ⁇ g for 10 minutes, and the supernatant was sequentially centrifuged at 2000 ⁇ g for 20 minutes, 3,000 ⁇ g for 30 minutes, and 10,000 ⁇ g for 60 minutes. Afterwards, the supernatant was ultracentrifuged at 100,000 ⁇ g for 70 minutes at 4°C, and vacuoles were removed through this process.
- PBS phosphate-buffered saline
- the supernatant was discarded, the remaining pellet was suspended, and exosomes were separated using the TFF system. Specifically, it was filtered using a filter with a molecular cut off of 100 to 500 kDa in the TFF system, other impurity particles smaller than the pores of the filter were removed, and the solution containing exosomes was concentrated.
- Garlic-derived exosomes were isolated from garlic, the raw material plant, using ultracentrifugation and tangential flow filtration (TFF) methods. Specifically, peeled garlic was mixed with phosphate-buffered saline (PBS) at a weight ratio of 1:2 (w/w), placed in a blender, and then ground. The supernatant was collected by centrifugation at 1,000 ⁇ g for 10 minutes, and the supernatant was sequentially centrifuged at 2000 ⁇ g for 20 minutes, 3,000 ⁇ g for 30 minutes, and 10,000 ⁇ g for 60 minutes. Afterwards, the supernatant was ultracentrifuged at 100,000 ⁇ g for 70 minutes at 4°C, and vacuoles were removed through this process.
- PBS phosphate-buffered saline
- the supernatant was discarded, the remaining pellet was suspended, and exosomes were separated using the TFF system. Specifically, it was filtered using a filter with a molecular cut off of 100 to 500 kDa in the TFF system, other impurity particles smaller than the pores of the filter were removed, and the solution containing garlic-derived exosomes was concentrated.
- Seaweed-derived exosomes were isolated from the raw material plant, seaweed, using ultracentrifugation and tangential flow filtration (TFF) methods. Specifically, the dried seaweed was mixed with phosphate-buffered saline (PBS) at a weight ratio of 1:2 (w/w), placed in a blender, and then ground. The supernatant was collected by centrifugation at 1,000 ⁇ g for 10 minutes, and the supernatant was sequentially centrifuged at 2000 ⁇ g for 20 minutes, 3,000 ⁇ g for 30 minutes, and 10,000 ⁇ g for 60 minutes. Afterwards, the supernatant was ultracentrifuged at 100,000 ⁇ g for 70 minutes at 4°C, and vacuoles were removed through this process.
- PBS phosphate-buffered saline
- the supernatant was discarded, the remaining pellet was suspended, and exosomes were separated using the TFF system. Specifically, it was filtered using a filter with a molecular cut off of 100 to 500 kDa in the TFF system, other impurity particles smaller than the pores of the filter were removed, and the solution containing exosomes was concentrated.
- Ginseng exosomes were isolated from ginseng, the raw material plant, using ultracentrifugation and tangential flow filtration (TFF) methods. Specifically, ginseng was added to a blender at a weight ratio of 1:2 (w/w) with phosphate-buffered saline (PBS) and then ground. The supernatant was collected by centrifugation at 1,000 ⁇ g for 10 minutes, and the supernatant was sequentially centrifuged at 2000 ⁇ g for 20 minutes, 3,000 ⁇ g for 30 minutes, and 10,000 ⁇ g for 60 minutes. Afterwards, the supernatant was ultracentrifuged at 100,000 ⁇ g for 70 minutes at 4°C, and vacuoles were removed through this process.
- TFF tangential flow filtration
- the supernatant was discarded, the remaining pellet was suspended, and exosomes were separated using the TFF system. Specifically, it was filtered using a filter with a molecular cut off of 100 to 500 kDa in the TFF system, other impurity particles smaller than the pores of the filter were removed, and the solution containing exosomes was concentrated.
- the ginseng exosomes isolated in Example 1 above were evaluated for exosome characteristics through the following method.
- the size of fine particles was analyzed through nanoparticle tracking analysis (NTA), and as described above, ginseng exosomes were confirmed to have a size of 50 to 300 nm, and through nanoparticle tracking analysis (NTA), ginseng produced once It was confirmed that exosomes showed a yield of about 1 ⁇ 10 13 or more per lot (left graph of Figure 2d).
- the protein content in exosomes was measured using the Micro BCA TM Protein Assay Kit from Thermo Scientific, and it was confirmed that it contained 10 to 1,000 ⁇ g/mL of protein per unit volume of 1 mL (right graph in Figure 2d).
- the total polyphenol content of the ginseng exosomes isolated in Example 1 was evaluated through the following method (FIG. 3).
- the ginseng exosomes isolated in Example 1 were extracted with water at 1 mg/mL using an ultrasonic shaker and used as a sample.
- 20 mg of ginseng exosomes were extracted with 5 mL of purified water by ultrasonic extraction at room temperature for 10 minutes, filtered through a 0.45um PVDF membrane filter, and used as a test solution.
- the exosome shape stability of the ginseng exosomes isolated in Example 1 was evaluated under cryogenic freezing and room temperature storage conditions. After diluting ginseng exosomes to a concentration of 10 8 p/mL to 10 10 p/mL, a cosmetic raw material formulation was prepared by adding trehalose, 1,3 propanediol, and 1,2 hexanediol. After manufacturing, it was frozen (-70 °C) and stored at room temperature (25 °C) for 3 months, and then the shape stability was evaluated using cryo-TEM. Both ginseng exosomes and raw material formulations were confirmed to maintain the form of exosomes even when stored for more than 3 months at room temperature and ultra-low temperature freezing conditions (Figure 4).
- the ginseng exosomes isolated in Example 1 were evaluated for the ginsenoside content in the exosomes through the following method.
- a sample was prepared by freeze-drying the ginseng exosomes isolated in Example 1. Freeze-dried exosomes were dissolved in methanol at a concentration of 117.9 mg/mL, dissolved in an ultrasonic shaker for 20 minutes, and then filtered through a 0.45um PVDF membrane filter to prepare a test solution.
- ginsenoside Rg1 and Rb1 Dissolve 1 mg each of ginsenoside Rg1 and Rb1 in methanol to make 1 mg/mL, dilute it (312.5, 195.313, 76.294, 47.684, 29.803 ppm) to make a standard stock solution, and dissolve it with an ultrasonic shaker for 20 minutes, then mix with a 0.45um PVDF membrane. It was filtered using a filter to obtain a standard solution. The contents of ginsenoside Rg1 and ginsenoside Rb1 in ginseng exosomes were measured using HPLC, and the mobile phase was purified under gradient solution conditions of purified water and acetonitrile.
- Ginsenoside Rg1 and ginsenoside Rb1 were detected in ginseng exosomes, and it was confirmed that 0.378 to 0.386 mg of ginsenoside Rg1 and 0.214 to 0.224 mg of ginsenoside Rb1 were contained within 1 g of freeze-dried ginseng exosomes ( Figure 5).
- HDFs human dermal fibroblasts
- Ginseng exosomes were confirmed to increase intracellular collagen production at a concentration of 1.6 ⁇ 10 8 to 6.3 ⁇ 10 8 p/mL (Figure 6).
- intracellular collagen production increases at a concentration of 2 ⁇ 10 8 to 6 ⁇ 10 8 p/mL, which has similar efficacy to the positive control TGF- ⁇ 1 (10ng/mL).
- the efficacy of ginseng exosomes is not limited to the efficacy of collagen production, but includes all functional cosmetic effects such as antioxidant, whitening, anti-aging, and collagen production.
- HDFs human dermal fibroblasts
- HDFs were inoculated into a 24-well plate at 5 ⁇ 10 4 cells/well, cultured for 24 hours, then exchanged for FBS-free medium containing ginseng exosomes diluted by concentration, and cultured for 24 hours. did. After 24 hours, each culture supernatant was centrifuged at 10,000 rpm for 10 minutes, and the absorbance of the supernatant from which Debris was removed was used to measure the amount of hyaluronic acid produced in the medium at 450 nm using a Human Hyaluronic Acid (HA) ELISA Kit. .
- HA Human Hyaluronic Acid
- Ginseng exosomes were confirmed to increase intracellular hyaluronic acid production at a concentration of 1.6 ⁇ 10 8 to 6.3 ⁇ 10 8 p/mL (FIG. 7).
- intracellular hyaluronic acid production was effectively increased at a concentration of 2 ⁇ 10 8 to 4 ⁇ 10 8 p/mL, which has similar efficacy to Retinoic acid, a positive control.
- the efficacy of ginseng exosomes is not limited to the efficacy of hyaluronic acid production, but includes all functional cosmetic effects such as antioxidant, whitening, anti-aging, and collagen production.
- B16F10 skin melanoma cells
- the amount of melanin was calculated from a calibration curve using synthetic melanin, and the amount of melanin was converted to the amount of melanin per protein.
- the cell culture was centrifuged, the supernatant was transferred to a 96-well plate, and the absorbance was measured at 400 nm.
- the amount of melanin was obtained from a calibration curve using synthetic melanin, and the amount of melanin was converted to the amount of melanin per protein.
- Ginseng exosomes were confirmed to be effective in suppressing extracellular and intracellular melanin formation at a concentration of 4 ⁇ 10 7 p/mL (FIG. 8). It was confirmed that ginseng exosomes effectively inhibit extracellular and intracellular melanin formation.
- the efficacy of ginseng exosomes is not limited to whitening efficacy, but includes all functional cosmetic effects such as whitening, anti-aging, and collagen production related to antioxidants.
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Abstract
본 발명은 인삼으로부터 유래된 식물 엑소좀을 유효성분으로 하는 기능성 화장료 조성물 및 이를 함유한 기능성 화장품에 관한 것이다. 인삼 엑소좀은 이중지질막 구조로서 피부 개선 및 미백에 영향을 주는 진세노사이드 Rb1과 Rg1이 풍부하게 포함되어 있다. 이러한 강력한 기능성소재인 진세노사이드 Rb1과 Rg1은 인삼엑소좀에 의해 피부 세포로 다량 흡수되며, 피부 세포의 콜라겐 합성, 히알루론산 합성을 향상시키고, 멜라닌 합성 억제 효능을 가짐을 입증하였다. 따라서 본 발명에서 제시하는 진세노사이드 Rb1 및 Rg1이 풍부하게 함유된 인삼엑소좀은 피부 노화 방지, 피부 미백, 주름 개선 및 피부 세포 재생을 위한 기능성 화장품 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.
Description
본 출원은 2022년 06월 20일 출원된 대한민국출원 제 10-2022-0075171호에 기초한 우선권을 주장하며, 해당 출원의 명세서 및 도면에 개시된 모든 내용은 본 출원에 원용된다.
본 발명은 인삼 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물 및 이를 포함하는 기능성 화장품에 관한 것이다.
엑소좀은 다양한 세포에서 분비되는 나노사이즈의 미세 소포체로서 단백질, 지질, mRNA 및 miRNA를 함유하고 내분비 계에 작용하여 세포 간 커뮤니케이션의 중요한 매개체 역할을 한다고 보고되었다. 이러한 역할은 기존 줄기세포 치료제의 문제점인 생착률 및 면역원성을 극복할 수 있는 새로운 치료제로 주목 받고 있다.
최근 연구에 따르면, 식용 식물에서 분리된 엑소좀은 포유류 세포에서 분비되는 엑소좀에 비해 독성이나 면역원성이 없어, 체내 안정성 및 생체적합성이 매우 높다고 알려져 있다. 또한 포유류 세포에서 분리된 엑소좀은 20% 정도의 콜레스테롤을 함유하고 있지만 식용 식물 엑소좀은 콜레스테롤이 없는 것으로 보고되었다. 특히 동물 조직 혹은 세포 배양액과 비교하여, 원료 식물은 다량으로 얻을 수 있는 장점이 있다.
유래 식물에 따라 엑소좀 내부에 다양한 단백질이 포함되어 있으나, 현재까지 인삼 엑소좀에 관한 것은 알려진 바가 거의 없다. 대부분의 연구에서 식물 엑소좀의 특성은 엑소좀의 크기나 형태로 확인하고 있으며, 식물 엑소좀을 추출하기 위해서는 적절한 크기를 선별해서 엑소좀만을 추출하는 방법이 필요하다.
종래 기술의 경우, sucrose gradient를 이용한 밀도 구배 초원심분리 방법을 통해 식물 엑소좀을 추출하려 시도된 바 있으나, 이러한 방식은 엑소좀의 상용화를 위한 생산공정에 활용하기에는 어려움이 있고, 수크로스가 추출물 중에 혼입되는 문제점이 있다. 또한, sucrose gradient를 이용한 밀도 구배 초원심분리 방법으로는 추출물 1 mL의 단위부피당 107개 이상의 함량으로 엑소좀이 고도로 농축된 고순도 엑소좀 조성물을 얻기는 불가능하다. 또한, 분리된 세포 외 소포체를 여과하여 여과필터의 기공보다 작은 크기의 물질을 얻는 방식이 있는데, 이는 많은 양의 식물 착즙물로부터 엑소좀을 추출 시에, 필터 기공에 불순물 혹은 엑소좀이 흡착 및 축적되어 여과 효율이 급격히 낮아지며 장기간 엑소좀 추출에 매우 불리하다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명의 목적은 인삼 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 고순도의 인삼 엑소좀 조성물을 제공하는 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 인삼으로부터 분리·정제한 진세노사이드 Rg1 및 Rb1을 포함하는 식물 엑소좀의 인간 피부 조직의 콜라겐 합성, 히알루론산 합성 및 미백 효능에 대한 것이며, 본 발명의 목적은 피부 재생 및 미백 기능을 갖는 인삼 엑소좀을 유효성분으로 하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 화장품 원료로서 사용하여 제조한, 피부 보호, 주름 개선, 피부 장벽 개선 및 피부 미백 등의 기능성 화장품을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 인삼 엑소좀을 포함하는 화장료 조성물을 대상체에 적용하는 것을 포함하는, 피부 미백 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 인삼 엑소좀을 포함하는 화장료 조성물의 피부 미백를 위한 화장품 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 인삼 엑소좀을 포함하는 화장료 조성물의 주름 개선 및 피부 재생, 피부 장벽 개선을 위한 화장품 용도를 제공하는 것이다.
더 상세하게는 본 발명의 목적은 다음의 구현예들을 제공하는 데 있다.
구현예 1. 인삼으로부터 분리된 인삼 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 고순도의 인삼 엑소좀 조성물.
구현예 2. 인삼으로부터 분리된 인삼 엑소좀 또는 인삼 엑소좀 조성물을 대상체에 적용하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체의 피부를 처리하는 방법으로서, 상기 분리된 인삼 엑소좀 또는 인삼 엑소좀 조성물은 피부에 항노화, 항산화, 콜라겐 생성, 히알루론산 생성, 피부 미백, 주름 개선 및/또는 피부 세포 재생 효과를 제공하는 것인 방법.
구현예 3. 피부(또는 인간 피부)에 미용 효과를 제공(또는 생산)하기 위한 인삼으로부터 분리된 인삼 엑소좀 또는 인삼 엑소좀 조성물의 용도로서, 상기 분리된 인삼 엑소좀 또는 인삼 엑소좀 조성물은 피부에 항노화, 항산화, 콜라겐 생성, 히알루론산 생성, 피부 미백, 주름 개선 및/또는 피부 세포 재생 효과를 제공하는 것인 용도.
구현예 4. 선행하는 구현예들 중 어느 하나에 있어서, 상기 인삼으로부터 분리된 인삼 엑소좀은 상기 조성물 1 mL의 단위부피 당 1 x 107개 내지 1 x 1014개의 함량으로 포함된다.
구현예 5. 선행하는 구현예들 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물은 화장료 조성물이다.
구현예 6. 선행하는 구현예들 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물은 항노화, 항산화, 콜라겐 생성, 히알루론산 생성, 피부 미백, 주름 개선 및 피부 세포 재생으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상의 피부 미용 용도를 갖는 것이다.
구현예 7. 선행하는 구현예들 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물은 수용액, 현탁액, 유화액, 크림, 동결 용액, 분무건조 분말 및 동결건조 분말로 이루어진 군으로부터 선택되는 제형이다.
구현예 8. 선행하는 구현예들 중 어느 하나에 있어서, 상기 인삼으로부터 분리된 인삼 엑소좀은 진세노사이드 알비원(ginsenoside Rb1) 및 진세노사이드 알지원(Ginsenoside Rg1)을 포함하는 것이다.
구현예 9. 선행하는 구현예들 중 어느 하나에 따른 인삼으로부터 분리된 인삼 엑소좀 또는 인삼 엑소좀 조성물을 포함하는 화장품.
구현예 10. 선행하는 구현예들 중 어느 하나에 있어서, 상기 화장품은 미스트, 세럼, 영양화장수, 유연화장수, 유연수, 유액, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 파우더, 메이크업베이스, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 세안제, 트리트먼트, 미용액, 미용팩, 연고제, 겔제, 리니멘트제, 액제, 패치, 분무제, 입욕제, 선스크린제, 선오일 및 헤어제품으로 이루어진 군으로부터 선택되는 제형이다.
구현예 11. 선행하는 구현예들 중 어느 하나에 있어서, 상기 화장품은 피부 노화 방지, 피부 미백, 주름 개선 및 피부 세포 재생으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상의 효능을 갖는 기능성 화장품이다.
구현예 12. 선행하는 구현예들 중 어느 하나에 있어서, 상기 화장품은 상기 인삼 엑소좀을 1 mL의 단위부피 당 1 x 106개 내지 1 x 1012개의 함량으로 포함하는 것이다.
구현예 13. 선행하는 구현예들 중 어느 하나에 따른 인삼 엑소좀 조성물을 제조하는 방법으로서, 원심분리를 수행하는 단계; 및 접선흐름여과(tangential-flow filtration, TFF)를 수행하는 단계를 포함하고, 상기 방법에 의하여 조성물 1 mL의 단위부피 당 1 x 107개 내지 1 x 1014개의 함량으로 인삼 유래 엑소좀을 포함하는 고순도의 인삼 엑소좀 조성물이 얻어지는 것을 특징으로 하는 방법.
본 발명의 또 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 하나의 관점은 인삼 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 고순도의 인삼 엑소좀 조성물을 제공하는 것이다. 상기 인삼 유래 엑소좀은 조성물 1 mL의 단위부피 당 1 Х 106 내지 1 Х 1013개, 바람직하게는 1 Х 107 내지 1 x 1014개, 더욱 바람직하게는 1 x 1011개 내지 1 x 1014개, 더 더욱 바람직하게는 1 x 1012개 내지 1 x 1014개의 함량으로 포함될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어, "엑소좀"이란 인삼에서 추출된 50 ~ 300 nm 정도의 크기, 바람직하게는 50 ~ 200 nm의 크기를 갖는 엑소좀 혹은 엑소좀을 포함한 세포외소포체를 통칭한다. 인삼 엑소좀은 이중지질막으로 이루어진 형태의 50 내지 200 nm의 균일한 크기의 입자를 형성하고 있다.
기존 다양한 식물 추출물이 항노화 및 항산화 물질을 포함하는 것으로 알려져 있지만, 수용성 추출물 형태로는 피부 장벽 통과가 어렵고, 또한 추출과정 중 유효성분이 추출 용매에 노출되어 쉽게 파괴되므로 화장품 원료에 적용이 어려운 문제점이 있었다. 반면에 엑소좀은 이중지질막으로 이루어진 나노 입자로서 receptor-mediated endocytosis 및 membrane fusion에 의해 피부 세포로 흡수되며, 또한 내부에 포함되어 있는 유효성분들이 외부에 직접 노출되지 않아 쉽게 변질되지 않고 생물학적 활성을 장기간 유지할 수 있어 화장품 산업에 상업적으로 이용하기에 대단히 유리하다.
본 발명의 원료 식물인 인삼은 인삼속의 한 종류인 Panax ginseng에 속한다. 원료 식물 부위로는 인삼 전체 또는 꽃, 줄기, 새싹, 열매 등을 포함하는 1개 이상의 부위를 혼합하여 사용할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 인삼 엑소좀 조성물은 화장료 조성물인데, 상기 조성물은 항노화, 항산화, 콜라겐 생성, 히알루론산 생성, 피부 미백, 주름 개선 및 피부 세포 재생으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상의 피부 미용 용도를 갖는 것일 수 있다.
본 발명에서 제시하는 인삼 엑소좀은 진세노사이드 Rg1 및 Rb1을 과량 포함하는 것으로, 인간 피부의 콜라겐 생성 및 히알루론산 생성을 향상시키고 멜라닌 합성을 억제하는 기능을 갖는다.
본 발명에서 인삼 엑소좀은 원료 식물인 인삼에서 유래한 진세노사이드를 포함한 기능성 물질에 의해 피부 재생 및 미백 기능을 가진다. 구체적으로, 항산화 기능을 갖는다고 알려진 진세노사이드 Rg1 및 진세노사이드 Rb1, 폴리페놀 등이 다량 함유된 인삼 엑소좀은 피부 세포에 축적된 활성산소를 억제하여 피부 재생 및 미백 등의 효능을 나타낸다.
인삼 엑소좀은 자체적으로 포함하고 있는 폴리페놀 성분에 의해 항노화 및 항산화 기능을 갖으며, 이는 세포외부에 존재하는 활성산소와 세포내부에 축적된 활성산소의 분해를 촉진시킨다.
특히, 항산화 기능을 갖는 인삼 엑소좀은 receptor-mediated endocytosis 및 membrane fusion에 의해 피부 세포로 흡수되며, 흡수된 인삼 엑소좀은 피부 세포 내 항산화 신호기전을 자극하여 SOD, catalases(CAT) 등의 유전자 발현을 증가시키고 항노화 및 항산화 효능을 나타낸다.
본 발명에서 개발한 인삼 엑소좀은 천연 스테로이드 글리코사이드 혹은 트라이터펜 사포닌의 일종인 진세노사이드를 과량 함유하고 있다. 이중 진세노사이드 Rg1과 Rb1은 항산화 작용 기전을 가지며, 피부 미백 및 콜라겐 재생 등의 피부 개선뿐만 아니라 면역력 증진, 피로개선, 혈액 흐름 개선, 기억력 개선 등 임상적인 효능이 있음이 입증되었다.
일 구현예에서, 본 발명의 인삼 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부 재생 및 미백 화장료 조성물은 수용액, 현탁액, 유화액, 크림, 동결 용액, 분무건조 분말 및 동결건조 분말로 이루어진 군으로부터 선택되는 제형으로 제공될 수 있다.
본 발명의 다른 관점은 인삼 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부 재생 및 미백용 화장료 조성물을 포함하는 화장품을 제공하는 것이다.
상기 화장품은 일반 피부 화장품 제조에 사용되는 일반적인 성분, 예를 들면 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 필요한 만큼 적용 배합할 수 있다.
또한, 상기 화장품은 미스트, 세럼, 영양화장수, 유연화장수, 유연수, 유액, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 파우더, 메이크업베이스, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 세안제, 트리트먼트, 미용액, 미용팩, 연고제, 겔제, 리니멘트제, 액제, 패치, 분무제, 입욕제, 선스크린제, 선오일 및 헤어제품으로 이루어진 군으로부터 선택되는 제형으로 제조될 수 있으며, 이들 각 제형에 적합하고 당업계에 주지된 각종의 통상적인 담체와 첨가제를 포함할 수 있다.
이와 같은 본 발명의 화장품은 콜라겐 생성, 히알루론산 생성, 피부 미백, 주름 개선, 피부 장벽 개선 및 피부 세포 재생으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상의 효능을 갖는 기능성 화장품일 수 있다.
본 발명에서 인삼에서 추출한 인삼 엑소좀은 상기 화장품 1 mL의 단위부피 당 1 Х 10 이상, 1 Х 102 이상, 1 Х 103 이상, 1 Х 104 이상, 1 Х 105 이상 또는 1 Х 106 이상 입자 개수의 함량으로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 1 Х 106 내지 1 Х 1012 개, 더 바람직하게는 1 Х 106 내지 1 Х 1012 개, 더욱 더 바람직하게는 1 Х 107 내지 1 Х 1012 개 입자의 함량으로 포함될 수 있다.
본 발명의 또 다른 관점은 상기 인삼 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 고순도 인삼 조성물의 제조방법으로서, 원심분리를 수행하는 단계; 및 접선흐름여과(tangential-flow filtration, TFF)를 수행하는 단계를 포함하는 제조방법을 제공하는 것이다.
보다 구체적으로 본 발명의 제조방법은 인삼을 파쇄하는 단계; 미세여과 및 원심분리를 수행하는 단계; 및 접선흐름여과(tangential-flow filtration, TFF)를 수행하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 원료 식물을 파쇄하는 과정은 원료 식물과 버퍼 용액을 무게비로 1:1 내지 1:10 범위로 섞은 혼합물을 기계적 분쇄하는 과정을 포함하는 것일 수 있으며, 이는 10 내지 1,000 rpm의 속도로 회전하는 칼날에 의해 기계적으로 식물 혼합물을 분쇄하는 것에 의하여 수행될 수 있다.
상기 미세여과 방법은, 10 μm 내지 200 nm 크기의 공극을 갖는 여과막을 식물 혼합물을 여과하는 것으로 수행되며, 바람직하게는 각기 다른 공극을 갖는 여과막의 1종 이상의 조합으로부터 여과할 수 있다.
상기 원심분리 방법은 저속 원심분리(low-speed centrifugation), 고속 원심분리(high-speed centrifugation), 초원심분리(ultracentrifugation) 및 이들의 조합으로부터 선택될 수 있는데, 바람직하게는 초원심분리(ultracentrifugation)를 포함하는 것일 수 있다. 저속 원심분리는 6,000 rpm (6,000 xg) 이하의 속도를 낼 수 있고 주로 세포나 핵 등과 같이 쉽게 침전되는 시료의 원심 분리에 이용되고, 고속 원심분리는 최고속도가 20,000-25,000 rpm (60,000 xg) 정도이며, 초원심분리는 최고속도가 40,000-80,000 rpm (600,000 xg) 정도인 원심분리법을 의미한다.
상기 접선흐름여과법(tangential-flow filtration, TFF)은 용액이 여과 막의 직각 방향으로 흘러가며, 용액 내에 존재하는 작은 크기의 불순물을 걸러내고 큰 크기의 엑소좀을 분리하는 여과 방식이다. 종래 여과 방식보다 여과필터의 기공에 엑소좀의 흡착 혹은 막 기공의 막힘을 최소화할 수 있으며, 이에 따른 공정 스케일업(process scale-up) 및 cGMP(cosmetic good manufacturing procedure) 공정 응용에 용이하다. 상기 접선흐름여과는 한외여과를 수행할 수 있는 중공 섬유(Hollow fiber) TFF 및 막(membrane) TFF로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상일 수 있으며, 바람직하게는 분자량 컷오프(Molecular weight cutoff; MWCO)가 100,000 Da 내지 500,000 Da인 TFF 필터를 사용하는 것일 수 있다.
이와 같이 본 발명에 따른 인삼 엑소좀은 기계적인 분쇄, 단계적인 초원심분리 및 접선유동여과(tangential flow filtration, TFF)법을 통해 인삼으로부터 분리될 수 있으며, 이들 엑소좀은 피부 재생, 미백 및 항산화 기능을 갖는 폴리페놀 및 진세노사이드 등을 다량 함유하고 있다.
인삼 엑소좀은 이중지질막 구조로서 피부 세포에 흡수되며, 흡수된 인삼 엑소좀 내부에 포함된 진세노사이드 Rg1 및 Rb1, 폴리페놀 등은 피부 세포 내에서 항산화 신호기전을 자극하여 다양한 항산화 유전자 발현을 증가시키는 것에 의하여 항산화 효능을 나타낸다. 인삼 엑소좀에 함유된 진세노사이드 Rg1 및 Rb1, 폴리페놀이 갖는 항산화 효능에 의해 파생되는 콜라겐 생성, 히알루론산 생성, 미백 및 항노화, 피부세포 활성화 등 다양한 기능성 화장품 용도를 갖는다. 또한, 인삼 엑소좀의 우수한 안정성은 수용액, 동결액 및 동결건조 파우더 등 다양한 형태로 기능성 화장품에 활용 가능하다.
도 1은 식물 원료로부터 식물 엑소좀을 고순도 및 고수율로 분리하는 식물 엑소좀 추출 방법에 대한 공정 모식도이다.
도 2a는 나노입자추적분석 (NTA)을 통해 알로에 엑소좀의 특성을 분석한 결과이다.
도 2b는 NTA를 통해 마늘 엑소좀의 특성을 분석한 결과이다.
도 2c는 NTA를 통해 미역 엑소좀의 특성을 분석한 결과이다.
도 2d는 NTA를 통해 인삼 엑소좀의 개수를 확인한 결과(좌) 및 엑소좀 내 단백질 함량을 측정한 결과(우)를 나타낸 것이다.
도 3은 인삼 엑소좀 내 총 폴리페놀 함량을 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 인삼 엑소좀을 냉동(-70 ℃)과 상온 (25 ℃)에서 3개월 보관한 후 cryo-TEM을 이용하여 형태 안정성을 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 5a는 ginsenoside Rb1 검출 참조를 나타낸 것이다.
도 5b는 ginsenoside Rg1 검출 참조를 나타낸 것이다.
도 5c는 인삼 엑소좀 내 ginsenoside Rg1, ginsenoside Rb1을 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 5d는 인삼 엑소좀 내 총 폴리페놀 화합물을 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 인삼 엑소좀의 세포 내 콜라겐 생성량 증가 효능을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 인삼 엑소좀의 세포 내 히알루론산 생성량 증가 효능을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 인삼 엑소좀의 세포 외 및 세포 내 멜라닌 형성 억제 효능을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
<실시예 1> 다양한 식물 원료로부터 엑소좀 분리
초원심분리(ultracentrifugation) 및 접선흐름여과(tangential-flow filtration, TFF)를 수행하는 것에 의하여, 다양한 식물 원료로부터 식물 엑소좀을 고순도 및 고수율로 분리할 수 있다(도 1). 본 실시예에서는 알로에, 마늘, 미역 및 인삼을 사용하여 고순도의 식물 엑소좀 조성물을 제조하였다.
(1) 알로에 유래 엑소좀 조성물의 제조
알로에 엑소좀은 원료 식물인 알로에로부터 초원심분리와 접선유동여과(TFF) 방법을 이용하여 분리하였다. 구체적으로, 알로에 껍질을 인산완충식염수(Phosphate-buffered saline, PBS)와 1:2(w/w)의 무게비를 맞추어 블랜더에 넣은 후 분쇄하였다. 1,000 Хg로 10분 동안 원심 분리하여 상층액을 수거하고, 상층액은 2000 Хg 20분, 3,000 Хg 30분, 그리고 10,000 Хg로 60분 동안 순차적으로 원심분리하였다. 이후 상층액은 4℃에서 100,000 Хg로 70분 동안 초원심분리하였고, 이 과정을 통해 액포(vacuole)를 제거하였다. 최종적으로 상층액은 버리고 남은 pellet을 현탁시킨 후 TFF 시스템을 통해 엑소좀을 분리하였다. 구체적으로, TFF 시스템 내 100 내지 500 kDa의 molecular cut off를 갖는 필터를 사용하여 여과하였으며, 필터의 기공보다 작은 기타 불순물 입자들을 제거하고 엑소좀을 함유한 용액을 농축하였다.
이렇게 한외여과인 TFF까지 수행하여 알로에 껍질 유래 엑소좀을 추출한 결과, 추출된 알로에 껍질 유래 엑소좀은 200 nm 이하 구형의 미세구조를 갖는 것이 확인되었고, 나노입자추적분석 (NTA)을 통해 1 mL의 단위부피당 1 x 109~11 개의 농도로 알로에 엑소좀이 농축된, 고순도 엑소좀 조성물이 얻어진 것을 확인하였다(도 2a).
(2) 마늘 유래 엑소좀 조성물의 제조
마늘 유래 엑소좀은 원료 식물인 마늘로부터 초원심분리와 접선유동여과(TFF) 방법을 이용하여 분리하였다. 구체적으로, 껍질을 제거한 마늘을 인산완충식염수(Phosphate-buffered saline, PBS)와 1:2(w/w)의 무게비를 맞추어 블랜더에 넣은 후 분쇄하였다. 1,000 Хg로 10분 동안 원심 분리하여 상층액을 수거하고, 상층액은 2000 Хg 20분, 3,000 Хg 30분, 그리고 10,000 Хg로 60분 동안 순차적으로 원심분리하였다. 이후 상층액은 4℃에서 100,000 Хg로 70분 동안 초원심분리하였고, 이 과정을 통해 액포(vacuole)를 제거하였다. 최종적으로 상층액은 버리고 남은 pellet을 현탁시킨 후 TFF 시스템을 통해 엑소좀을 분리하였다. 구체적으로, TFF 시스템 내 100 내지 500 kDa의 molecular cut off를 갖는 필터를 사용하여 여과하였으며, 필터의 기공보다 작은 기타 불순물 입자들을 제거하고 마늘 유래 엑소좀을 함유한 용액을 농축하였다.
이렇게 한외여과인 TFF까지 수행하여 마늘 유래 엑소좀을 추출한 결과, 마늘 유래 엑소좀은 200 nm 이하 구형의 미세구조를 갖는 것이 확인되었고, 나노입자추적분석 (NTA)을 통해 1 mL의 단위부피당 1 x 109~11 개의 농도로 마늘 엑소좀이 농축된, 고순도 엑소좀 조성물이 얻어진 것을 확인하였다(도 2b).
(3) 미역 유래 엑소좀 조성물의 제조
미역 유래 엑소좀은 원료 식물인 미역으로부터 초원심분리와 접선유동여과(TFF) 방법을 이용하여 분리하였다. 구체적으로, 물기를 제거한 미역을 인산완충식염수(Phosphate-buffered saline, PBS)와 1:2(w/w)의 무게비를 맞추어 블랜더에 넣은 후 분쇄하였다. 1,000 Хg로 10분 동안 원심 분리하여 상층액을 수거하고, 상층액은 2000 Хg 20분, 3,000 Хg 30분, 그리고 10,000 Хg로 60분 동안 순차적으로 원심분리하였다. 이후 상층액은 4℃에서 100,000 Хg로 70분 동안 초원심분리하였고, 이 과정을 통해 액포(vacuole)를 제거하였다. 최종적으로 상층액은 버리고 남은 pellet을 현탁시킨 후 TFF 시스템을 통해 엑소좀을 분리하였다. 구체적으로, TFF 시스템 내 100 내지 500 kDa의 molecular cut off를 갖는 필터를 사용하여 여과하였으며, 필터의 기공보다 작은 기타 불순물 입자들을 제거하고 엑소좀을 함유한 용액을 농축하였다.
이렇게 한외여과인 TFF까지 수행하여 미역 유래 엑소좀을 추출한 결과, 미역 유래 엑소좀은 200 nm 이하 구형의 미세구조를 갖는 것으로 확인되었으며, 나노입자추적분석 (NTA)을 통해 1 mL의 단위부피당 1 x 109~11 개의 농도로 미역 엑소좀이 농축된, 고순도 엑소좀 조성물이 얻어진 것을 확인하였다(도 2c).
(4) 인삼 유래 엑소좀
인삼 엑소좀은 원료 식물인 인삼으로부터 초원심분리와 접선유동여과(TFF) 방법을 이용하여 분리하였다. 구체적으로, 인삼을 인산완충식염수(Phosphate-buffered saline, PBS)와 1:2(w/w)의 무게비를 맞추어 블랜더에 넣은 후 분쇄하였다. 1,000 Хg로 10분 동안 원심 분리하여 상층액을 수거하고, 상층액은 2000 Хg 20분, 3,000 Хg 30분, 그리고 10,000 Хg로 60분 동안 순차적으로 원심분리하였다. 이후 상층액은 4℃에서 100,000 Хg로 70분 동안 초원심분리하였고, 이 과정을 통해 액포(vacuole)를 제거하였다. 최종적으로 상층액은 버리고 남은 pellet을 현탁시킨 후 TFF 시스템을 통해 엑소좀을 분리하였다. 구체적으로, TFF 시스템 내 100 내지 500 kDa의 molecular cut off를 갖는 필터를 사용하여 여과하였으며, 필터의 기공보다 작은 기타 불순물 입자들을 제거하고 엑소좀을 함유한 용액을 농축하였다.
이렇게 한외여과인 TFF까지 수행하여 인삼 유래 엑소좀을 추출한 결과, 인삼 유래 엑소좀은 50 내지 300 nm의 크기를 갖는 것으로 확인되었고, 나노입자추적분석 (NTA)을 통해 1 mL의 단위부피당 1Х1013개 이상의 농도로 인삼 엑소좀이 농축된, 고순도 엑소좀 조성물이 얻어진 것을 확인하였다(도 2d 좌측 그래프).
상기와 같이 초원심분리 및 TFF방법의 조합은, 여러 식물 원료 중 특히 인삼에 적용하는 경우 현저하게 높은 단위 부피당 입자 수로 엑소좀이 농축된 고순도의 엑소좀 조성물이 달성될 수 있음이 확인되었다. 그리하여 이하에서는 가장 높은 순도의 엑소좀 조성물이 제공될 수 있는 것으로 확인된 인삼 엑소좀을 사용하여 추가 연구를 수행하였다.
<실시예 2> 인삼 엑소좀의 특성 평가
상기에서 실시예 1에서 분리된 인삼 엑소좀은 다음의 방법을 통하여 엑소좀 특성 평가를 진행하였다. 미세입자 크기는 나노입자추적분석(NTA)을 통해 분석하였으며, 전술한 바와 같이 인삼 엑소좀은 50 내지 300 nm의 크기를 갖는 것을 확인되었고, 나노입자추적분석(NTA)을 통해 1회 생산된 인삼 엑소좀은 로트 당 약 1Х1013개 이상의 수율을 보이는 것으로 확인되었다(도 2d 좌측 그래프). 또한, 엑소좀 내 단백질 함량은 Thermo Scientific 사의 Micro BCATM Protein Assay Kit를 이용하여 측정하였으며, 1 mL의 단위부피당 10 내지 1,000 μg/mL의 단백질을 함유하고 있음을 확인하였다(도면 2d 우측 그래프).
<실시예 3> 인삼 엑소좀의 총 폴리페놀 함량 평가
상기 실시예 1에서 분리된 인삼 엑소좀은 다음의 방법을 통하여 엑소좀 내 총 폴리페놀 함량을 평가하였다(도 3). 실시예 1에서 분리된 인삼 엑소좀을 물에 1 mg/mL로 초음파 진탕기 추출한 후 검체로 하였다. 인삼 엑소좀 20 mg을 5 mL 정제수에 상온에서 10분간 초음파 추출하여 0.45um PVDF 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 하였다. 시험관에 시험용액 1 mL와 정제수 7.5 mL을 넣고 시험관에 2 N-Folin-ciocalteu Reagent 0.5 mL씩 첨가하고 23% Sodium carbonate solution 1 mL씩 첨가하여 실온의 암소에서 1시간 동안 반응시켰다. 표준물질로 Gallic acid 1 mg을 1 mL 정제수로 상온에서 10 분간 초음파 추출하여 0.45um PVDF 멤브레인 필터로 여과하여 표준원액으로 하고(250, 125, 62.5, 31.25, 15.625, 7.8125, 3.90625 ppm), 농도별로 시험관에 표준용액을 1 mL씩 첨가하고 시험관에 2 N-Folin-ciocalteu Reagent 0.5 mL씩 첨가하고 23% Sodium carbonate solution 1 mL씩 첨가하여 실온의 암소에서 1시간 동안 반응시켰다. Epoch Microplate Spectrophotometer를 이용하여 760 nm 파장 조건에서 흡광도를 측정하여 인삼엑소좀 내 총 폴리페놀 함량을 정량하였다. 실험결과, 인삼엑소좀 조성물 내 총폴리페놀 함량은 20 내지 30 mg/g이 포함되어 있는 것으로 확인되었다. 한편 알로에 엑소좀 조성물 내 총 폴리페놀 함량은 38 내지 41 mg/g이 포함되어 있는 것으로 확인되었다.
<실시예 4> 인삼 엑소좀 형태 및 보관 안정성 평가
상기 실시예 1에서 분리된 인삼엑소좀의 초저온냉동과 상온 보관 조건에서 엑소좀 형태 안정성을 평가하였다. 인삼 엑소좀을 108 p/mL 내지 1010 p/mL 농도로 희석한 후, 트레할로즈 및 1,3 프로판다이올, 1,2 헥산다이올을 첨가한 화장품 원료 제형을 제조하였다. 제조 후 냉동(-70 ℃)과 상온 (25 ℃)에서 3개월 보관한 후 cryo-TEM을 이용하여 형태 안정성을 평가하였다. 인삼엑소좀과 원료 제형 모두 상온 및 초저온 냉동 조건에서 3개월 이상 보관하여도 엑소좀의 형태를 유지하는 것으로 확인되었다(도 4).
<실시예 5> 인삼 엑소좀의 진세노사이드 함량 평가
상기 실시예 1에서 분리된 인삼 엑소좀은 다음의 방법을 통하여 엑소좀 내 진세노사이드 함량을 평가하였다. 실시예 1에서 분리된 인삼 엑소좀을 동결건조하여 검체를 준비하였다. 동결건조 엑소좀을 메탄올에 117.9 mg/mL 농도로 용해한 후 초음파 진탕기로 20분간 녹인 후 0.45um PVDF 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 하였다. Ginsenoside Rg1 및 Rb1을 각 1 mg을 메탄올에 용해하여 1 mg/mL가 되게 녹인 후 희석하여(312.5, 195.313, 76.294, 47.684, 29.803 ppm) 표준원액으로 하고 초음파 진탕기로 20분간 녹인 후 0.45um PVDF 멤브레인 필터로 여과하여 표준용액으로 하였다. HPLC를 이용하여 인삼엑소좀 내 ginsenoside Rg1, ginsenoside Rb1의 함량을 측정하였으며, 이동상은 정제수와 아세토니트릴의 그래디언트 용액 조건에서 정제하였다. 인삼엑소좀 내 ginsenoside Rg1, ginsenoside Rb1이 검출되었고, 1 g의 동결건조한 인삼 엑소좀 내부에 0.378 내지 0.386 mg의 ginsenoside Rg1, 0.214 내지 0.224 mg의 ginsenoside Rb1이 함유되어 있음을 확인하였다(도 5).
<실시예 6> 인삼 엑소좀의 in vitro 콜라겐 생성 효능 평가
상기 실시예 1에서 분리된 인삼 엑소좀의 화장품 효능 평가를 확인하기 위해, Human Dermal Fibroblasts(HDFs)에 엑소좀을 처리하여 세포내 콜라겐 생성량(PIP)을 확인하였다. 콜라겐 생성량 측정 전 세포 생존율 분석을 통해 6.3×108 p/mL 이하의 농도에서 세포 독성이 없는 것을 확인하였다. 세포 내 콜라겐 생성량 측정시에는 용매대조군(Solvent control)으로 시험 물질이 포함되지 않은 세포 배양 배지를 사용하였고, 양성대조군(Positive control)으로는 TGF-β110 ng/mL을 사용하였다. 콜라겐 생성량 확인은 5×104 내지개의 HDFs 세포에 인삼 엑소좀을 포함한 세포배양액을 처리하였으며, 24시간 동안 배양 후 각각의 배양한 상층액은 10,000rpm에서 10분간 원심분리 하였고, Debris가 제거된 상층액으로 Procollagen의 양을 Procollagen Type Ⅰ C-Peptide(PIP) Kit을 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
인삼 엑소좀은 1.6×108 내지 6.3×108 p/mL 농도에서 세포내 콜라겐 생성량 증가되는 것을 확인하였다(도 6). 바람직하게, 2×108 내지 6×108 p/mL 농도에서 세포내 콜라겐 생성량 증가시키며, 이는 양성대조군인 TGF-β1(10ng/mL)과 유사한 효능을 가진다. 본 실시예에서 인삼엑소좀 효능을 콜라겐 생성 효능으로 한정하지 않으며, 항산화, 미백, 노화방지, 콜라겐 생성 등 기능성 화장품 효능을 모두 포함한다.
<실시예 7> 인삼 엑소좀의 in vitro 히알루론산 생성 효능 평가
상기 실시예 1에서 분리된 인삼 엑소좀의 화장품 효능 평가를 확인하기 위해, 성인 피부에서 분리한 Primary Cell인 Human dermal fibroblasts(HDFs)에 엑소좀을 처리하여 세포내 히알루론산 생성량을 측정하였다. 히알루론산 생성량 측정 전 세포 생존율 분석을 통해 6.3×108 p/mL이하의 농도에서 세포 독성이 없는 것을 확인하였다. 세포 내 히알루론산 생성량 측정시 용매대조군(Solvent control)으로 시험물질이 포함되지 않은 세포 배양 배지를 사용하였고, 양성대조군(Positive control)으로는 Retinoic acid 3 ㎍/mL을 사용하였다. 세포 내 히알루론산 생성량 측정에서 HDFs는 24-well plate에 5×104 cells/well로 접종하여 24시간 배양한 뒤, 농도별로 희석한 인삼엑소좀이 포함된 FBS 미함유 배지로 교환 후 24시간 배양하였다. 24시간 후 각각의 배양 상층액은 10,000 rpm에서 10분간 원심분리 하였고, Debris가 제거된 상층액으로 배지중 포함된 히알루론산 생성량을 Human Hyaluronic Acid(HA) ELISA Kit를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
인삼 엑소좀은 1.6×108 내지 6.3×108 p/mL의 농도에서 세포 내 히알루론산 생성량을 증가시키는 것을 확인하였다(도 7). 바람직하게, 2×108 내지 4×108 p/mL의 농도에서 세포 내 히알루론산 생성을 효과적으로 증가시켰으며, 이는 양성대조군인 Retinoic acid과 유사한 효능을 가진다. 본 실시예에서 인삼엑소좀 효능을 히알루론산 생성 효능으로 한정하지 않으며, 항산화, 미백, 노화방지, 콜라겐 생성 등 기능성 화장품 효능을 모두 포함한다.
<실시예 8> 인삼 엑소좀의 in vitro 멜라닌 생성 저해 효능 평가
상기 실시예 1에서 분리된 인삼 엑소좀의 화장품 효능 평가를 확인하기 위해, 피부 melanoma cell(B16F10)에 엑소좀을 처리하여 멜라닌 생성을 저해하는지 확인하였다. 멜라닌 생성량 측정 전 4×107 p/mL 이하의 농도에서 세포 독성이 없는 것을 확인하였다. 멜라닌 생성량 측정시 용매대조군(Solvent control)으로는 시험물질이 포함되지 않은 세포배양 배지를 사용하였고, 양성대조군(Positive control)으로는 100 mg/mL Arbutin을 사용하였다. 세포의 총 멜라닌 생성량 측정은 B16F10 세포를 6-well plate에 1×105 cells/well의 농도로 접종하여 24시간 배양하였다. 24시간 후 각 well의 배지를 제거하고 세포를 PBS로 세척한 뒤 4×107 p/mL의 인삼엑소좀과 100 nM α-MSH를 함유한 Phenol red가 포함되지 않은 새로운 배양 배지를 넣고 72시간 배양하였다. 배양한 세포는 세포내 멜라닌 양 측정을 위해 사용하였고, 세포 배양액은 세포외 멜라닌 양 측정을 위해 사용하였다. 세포의 총 멜라닌 생성량은 세포내와 세포외의 각 멜라닌 양을 합하여 산출하였다. 세포내의 멜라닌 양 측정을 위해 배양한 B16F10 세포는 PBS로 세척하고 각 well 마다 1M NaOH를 넣어 60℃에서 용해하였다. 세포 용해액은 400 nm에서 흡광도를 측정한 후, 합성 멜라닌을 이용한 검량선으로부터 멜라닌 양을 구하고, 멜라닌 양은 단백질당 멜라닌 양으로 환산하였다. 세포외의 멜라닌 양 측정을 위해 세포 배양액을 원심분리한 후 상층액을 96-well plate에 옮겨 400 nm에서 흡광도를 측정하였다. 합성 멜라닌을 이용한 검량선으로부터 멜라닌 양을 구하고, 멜라닌 양은 단백질당 멜라닌 양으로 환산하였다.
인삼엑소좀은 4×107 p/mL 의 농도에서 세포외 및 세포내 멜라닌 형성을 억제하는데 효과가 있음을 확인하였다(도 8). 인삼엑소좀은 세포외 및 세포내 멜라닌 형성을 효과적으로 저해함을 확인하였다. 본 실시예에서 인삼엑소좀 효능을 미백 효능으로 한정하지 않으며, 항산화와 관련한 미백, 노화방지, 콜라겐 생성 등 기능성 화장품 효능을 모두 포함한다.
Claims (11)
- 인삼 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 고순도의 인삼 엑소좀 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 인삼 유래 엑소좀은 상기 조성물 1 mL의 단위부피 당 1 x 107개 내지 1 x 1014개의 함량으로 포함되는 것을 특징으로 하는 인삼 엑소좀 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 화장료 조성물인 것을 특징으로 하는 인삼 엑소좀 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 항노화, 항산화, 콜라겐 생성, 히알루론산 생성, 피부 미백, 주름 개선 및 피부 세포 재생으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상의 피부 미용 용도를 갖는 것을 특징으로 하는 인삼 엑소좀 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 수용액, 현탁액, 유화액, 크림, 동결 용액, 분무건조 분말 및 동결건조 분말로 이루어진 군으로부터 선택되는 제형인 것을 특징으로 하는 인삼 엑소좀 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 인삼 유래 엑소좀은 진세노사이드 알비원(ginsenoside Rb1) 및 진세노사이드 알지원(Ginsenoside Rg1)을 포함하는 것을 특징으로 하는 인삼 엑소좀 조성물.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 따른 인삼 엑소좀 조성물을 포함하는 화장품.
- 제7항에 있어서, 상기 화장품은 미스트, 세럼, 영양화장수, 유연화장수, 유연수, 유액, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 파우더, 메이크업베이스, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 세안제, 트리트먼트, 미용액, 미용팩, 연고제, 겔제, 리니멘트제, 액제, 패치, 분무제, 입욕제, 선스크린제, 선오일 및 헤어제품으로 이루어진 군으로부터 선택되는 제형인 것인 화장품.
- 제7항에 있어서, 상기 화장품은 피부 노화 방지, 피부 미백, 주름 개선 및 피부 세포 재생으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상의 효능을 갖는 기능성 화장품인 것을 특징으로 하는 화장품.
- 제7항에 있어서, 상기 화장품은 상기 인삼 유래 엑소좀을 1 mL의 단위부피 당 1 x 106개 내지 1 x 1012개의 함량으로 포함하는 것을 특징으로 하는 화장품.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 따른 인삼 엑소좀 조성물을 제조하는 방법으로서,원심분리를 수행하는 단계; 및접선흐름여과(tangential-flow filtration, TFF)를 수행하는 단계를 포함하고,상기 방법에 의하여 조성물 1 mL의 단위부피 당 1 x 107개 내지 1 x 1014개의 함량으로 인삼 유래 엑소좀을 포함하는 고순도의 인삼 엑소좀 조성물이 얻어지는 것을 특징으로 하는 방법.
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