KR20240034590A - 네트워크 구조를 포함하는 생체적합성 고분자를 포함하는, 엑소좀의 동결 보호용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 네트워크 구조를 포함하는 생체 적합성 고분자를 포함하는, 엑소좀의 동결 보호용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 엑소좀의 동결 보호용 조성물을 활용하여 동결 과정에서 엑소좀의 구조적 안정성을 유지시킬 수 있으며, 동결 과정 후 장기간 보관에 있어서, 엑소좀의 기능적 안정성을 유지시킬 수 있다.
Description
본 발명은 네트워크 구조를 포함하는 생체적합성 고분자를 포함하는, 엑소좀의 동결 보호용 조성물에 관한 것이다.
엑소좀(exosome)은 세포로부터 분비되는 30-200 nm 크기를 가지는 막 소포체로서 혈액, 소변 등을 포함한 체액에서 대부분 존재하고, 기원 세포(공여세포) 특유의 생물학적 기능을 반영하는 세포특이적 구성 성분을 함유하며, 인지질, mRNA, miRNA, DNA 외에도 다양한 수용성 단백질, 외재성 단백질 및 막관통 단백질 성분 등생물학적 활성을 보이는 다양한 물질을 포함한다.
엑소좀의 지질이중층은 기원 세포(공여세포)와 같은 인지질 이중막 구조로 되어 있으며, 세포가 세포외로 분비하는 물질의 구성체로 생리 활성 물질을 수용세포에 전달하여 세포-세포간의 커뮤니케이션 및 세포성 면역 중재 등 세포의 기능을 조절하는 신호전달 중재자 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다.
그러나, 엑소좀은 장기간 보관에 있어서 생체물질 자체의 한계로 인해, 물성 및 안정성에 변화가 생기고 엑소좀의 생리 활성 능력과 관련된 안정성이 저하될 수 있는 문제점을 지니고 있다.
현재까지 엑소좀의 장기간 보관에 대한 연구 개발이 활발이 이루어지고 있으며, 대표적인 엑소좀의 장기 보관법은 초저온 냉동법에 의한 것이다. 이는 엑소좀을 급속으로 냉동시켜 온도변화에 의한 생체물질의 변성을 막아주는 효과를 갖지만, 동결 과정에서 엑소좀 내 수분의 결정 형성으로 엑소좀의 구조적 손상을 발생시킨다는 단점이 있다. 한편, 대표적 동결보호제인 DMSO를 세포막 내부로 침투시켜 물 분자를 대체함으로써 결정 형성을 억제하여 초저온 냉동법에 의한 엑소좀의 구조적 손상을 방지할 수 있으나, 이는 유기물질 자체의 잠재적 독성에 대한 문제점을 가지고 있다.
따라서, 엑소좀의 생리활성 능력과 관련된 안정성을 유지하면서 엑소좀을 장기관 보관할 수 있는 새로운 동결보호 기술의 개발이 필요한 실정이다.
본 발명자들은 엑소좀의 생리활성 능력과 관련된 안정성을 유지하면서 엑소좀을 장기간 보관할 수 있는 기술을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 네트워크 구조를 포함하는 생체적합성 고분자를 포함하는 엑소좀의 동결보호용 조성물을 제조하고, 이를 장기간 보관 후에도 엑소좀의 기능이 안정적으로 유지되는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 네트워크 구조를 포함하는 생체적합성 고분자를 포함하는 엑소좀의 동결 보호용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 엑소좀의 동결 보호용 조성물을 이용하여 엑소좀의 장기간 보관시 안정성을 제공하는 것이다.
'엑소좀(exosome)'은 다양한 세포들로부터 분비되는 지질-이중층으로 구성된 막 구조를 갖는, 대략 30-200 nm 크기의 소포체를 의미한다. 엑소좀 내부에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, 핵산(예컨대, mRNA, miRNA, DNA) 및 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되어 있다.
상기 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서, 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다. 특히, 유래한 세포의 특성에 따라 항노화, 조직재생 및 각종 질병에 관여하는 세포의 기능을 조절하기 때문에 다양한 질환에 적용 가능한 신개념 바이오 소재로 사용될 수 있다.
그러나, 엑소좀은 보관 기간 및 방법에 따라 전체적인 엑소좀의 물성 및 안정성에 변화가 생기고 엑소좀의 유효한 생리 활성 물질들의 활성이 저하될 수 있는 문제점이 있다. 이에 엑소좀에 포함되어 있는 특이적인 유전물질과 생리 활성 인자들을 효과적으로 사용하기 위하여, 대표적인 엑소좀의 장기보관법인 초저온 냉동법을 적용할 수 있을 뿐만 아니라, 잠재적 독성 위험이 있는 DMSO를 동결보호제로 사용하여 초저온 냉동법에 따른 엑소좀의 구조적 손상을 방지하며 초저온 냉동법을 적용할 수도 있다.
따라서, 본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 네트워크 구조를 포함하는 생체 적합성 고분자를 포함하는, 엑소좀의 동결 보호용 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 엑소좀의 동결 과정에서 생체 적합성 고분자를 포함하는, 엑소좀의 동결 보호용 조성물을 사용하여 동결 과정에서 엑소좀의 구조적 안정성을 유지시킬 뿐 아니라, 동결 건조 후 장기간 보관시 엑소좀의 기능적 안정성을 유지시킬 수 있음을 확인하였다.
특히, 본 발명의 조성물을 사용하는 경우, 상술한 기존의 장기보관법에 있어서, 초저온 냉동시 유발되는 엑소좀의 구조적 손상 문제를 극복할 수 있을 뿐 아니라, 유기독성을 지닌 동결보호제 DMSO의 사용을 배제할 수 있음을 확인하였다.
본 명세서에서 용어 '생체 적합성 고분자'는 투여했을 때, 인체에 독성을 나타내지 않는 분자량이 대략 10,000 Da 이상인 큰 분자 물질을 의미하는 것으로, 우수한 생체 적합성 및 물질 고유의 생물학적 활성을 이용하여 생물학적 기능성을 가지는 재료로 활용할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 생체 적합성 고분자는 히알루론산(hyaluronic acid), 콜라겐(collagen), 알지네이트(alginate), 녹말(starch), 키토산(chitosan), 젤라틴(gelatin), 덱스트란(dextran), 셀룰로오스(cellulose), 알긴산(alginic acid), 콘드로이틴 설페이트(chondroitin sulfate), 및 헤파린(heparin)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 생체 적합성 고분자는 히알루론산(hyaluronic acid)일 수 있다.
본 명세서에서 용어 '히알루론산(hyaluronic acid, HA)'은 글루코사민글라이칸(glycosaminoglycan)의 하나로서, N-아세틸 글루코사민(N-acetyl glucosamine) 및 글루쿠론산(Glucuronic acid)으로 이루어진 반복 단위가 선형으로 연결되어 있는 생체 고분자 물질을 의미한다. 히알루론산은 세포 외 기질이나 결합조직 및 피부에 고농도로 존재하며, 특히, 세포 간극에서의 수분 유지, 조직 내의 젤리 형상의 매트릭스를 형성하는 것에 기초하는 세포의 유지, 조직의 윤활성과 유연성의 유지, 기계적 장해 등의 외력에 대한 저항, 및 세포 감염의 방지 등 많은 기능을 가지고 있다. 이 외에도 세포성장인자 및 영양성분의 저장 및 확산에 관여하고, 각질형성세포와 섬유아세포에 의해 합성되는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 엑소좀의 동결 보호용 조성물은 히알루론산 고분자를 0.01 내지 1.0 wt%(w/v), 0.01 내지 0.08 wt%(w/v), 0.01 내지 0.06 wt%(w/v), 0.01 내지 0.04 wt%(w/v), 0.02 내지 1.0 wt%(w/v), 0.02 내지 0.08 wt%(w/v), 0.02 내지 0.06 wt%(w/v), 0.02 내지 0.04 wt%(w/v), 0.04 내지 1.0 wt%(w/v), 0.04 내지 0.08 wt%(w/v), 0.04 내지 0.06 wt%(w/v), 0.06 내지 1.0 wt%(w/v), 0.06 내지 0.08 wt%(w/v) 또는 0.08 내지 1.0 wt%(w/v)을 포함하는 것일 수 있고, 구체적으로 0.01 내지 1.0 wt%(w/v)일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 엑소좀은 줄기세포 유래 엑소좀일 수 있다.
상기 "줄기세포(stem cell)"는 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 다른 종류의 세포로 분화할 수 있는 능력, 즉, 줄기세포성(stemness)을 가진 미분화 세포를 의미한다. 이러한 줄기세포는 크게 배아를 이용하여 제조할 수 있는 배아줄기세포(embryonic stem cell), 성체줄기세포(adult stem cell), 생식세포(gamete), 암 줄기세포(cancer stem cell) 등으로 나뉘며, 배아줄기세포는 배아의 발생과정에서 추출한 세포로서, 수정 후 14일이 안된 상태의 구체적 장기를 형성하기 이전의 세포 덩어리 단계를 말하며, 최근에는 역분화를 통하여 정상세포로부터 배아줄기세포를 제조하기도 한다. 따라서, 신체를 이루는 모든 세포와 조직으로 분화할 수 있는 세포라면 이에 제한되지 않는다. 성체줄기세포는 제대혈, 골수, 지방, 혈액 등으로부터 추출해 낸 것으로 뼈, 간, 혈액 등 구체적 장기의 세포로 분화되기 직전의 원시세포를 의미하며, 필요한 때에 신체 내 조직으로 발달할 수 있는 능력을 보유한 미분화 상태의 세포를 의미한다. 생식세포란, 생식을 통해서 유전 정보를 다음 세대로 전달하는 세포로서, 인간에게는 정자와 난자가 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 줄기세포는 자가 또는 동종 유래 줄기세포일 수 있고, 인간 및 비인간 포유류를 포함한 임의 유형의 동물 유래일 수 있으며, 성체로부터 유래된 줄기세포일 수 있고, 배아로부터 유래된 줄기세포일 수 있다. 예를 들어, 배아 줄기세포, 성체줄기세포 및 유도만능줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 줄기세포의 종류는 제한되지 않으나, 본 발명을 한정하지 않는 하나의 예시로서, 성체줄기세포일 수 있으며, 예를 들어, 인간 또는 동물 조직 기원의 성체줄기세포, 인간 또는 동물 조직 유래 중간엽 줄기세포, 인간 또는 동물 조직 기원의 유도만능줄기세포로부터 유래된 중간엽 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 인간 또는 동물 조직은 제대, 제대혈, 혈액, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
보다 구체적으로, 본 발명에서 상기 성체줄기세포의 종류는 제한되지 않으나, 본 발명을 한정하지 않는 하나의 예시로서, 중간엽 줄기세포, 예를 들어, 제대, 제대혈, 혈액, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 조직으로부터 유래된 중간엽 줄기세포일 수 있다.
중간엽 줄기세포는 상술한 다양한 부분으로부터 얻을 수 있으나, 그 중에 지방 조직은 다양한 잠재성을 갖는 줄기세포의 풍부한 공급원으로 알려져 있다. 구체적으로, 지방 유래 줄기세포(adipose-derived stem cell, ASC)는 지방세포, 골모세포, 연골모세포, 근섬유세포 등 대부분의 중간엽 세포로 분화할 수 있는 지방 조직으로부터 분리된 줄기세포로서, 지방전구세포, 기질세포, 다분화능 지방유래 세포(multipotent adipose-derived cells) 또는 지방유래 성체줄기세포(adipose derived adult stem cell) 등으로 불려온 세포를 의미한다. 특히, 상기 지방 유래 줄기세포는 관절염, 심근 경색 등 다양한 질병에 대한 치료 효과를 나타낼 수 있으며, 세포 증식 속도가 빠르고 지방 조직에서 세포를 분리하는 절차가 비교적 용이하여 환자의 부담을 줄여주는 이점이 있는 것으로 알려져 있다. 상기 지방 유래 줄기세포는 통상적으로 지방 유래 중간엽 줄기세포를 의미한다.
따라서, 본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 지방 조직으로부터 분리된 지방 유래 중간엽 줄기세포(adipose-derived stem cells, ADSCs)일 수 있으며, 보다 구체적으로, 인간 유래 지방 중간엽 줄기세포일 수 있다. 많은 연구에 따르면, 줄기세포에서 분비되는 '줄기세포 유래 엑소좀'은 여러 생리 활성 인자 및 유전물질들을 함유하고 있어 세포의 이동, 증식 및 분화와 같은 세포 거동 조절, 및 세포 분화와 조직 재생과 관련된 줄기세포 특성이 반영되어 있으며, 특히, '인간 지방 유래 줄기세포 유래 엑소좀'은 인체 건강에 긍정적인 효과를 가져오는 다양한 유전적 정보의 생리 활성 물질을 담지한 유용한 물질로 잘 알려져 있다.
본 발명에 일 구현예에 있어서, 상기 엑소좀의 직경은 10 nm 내지 500 nm, 10 nm 내지 400 nm, 10 nm 내지 300 nm, 10 nm 내지 250 nm, 10 nm 내지 200 nm, 10 nm 내지 150 nm, 50 nm 내지 500 nm, 50 nm 내지 400 nm, 50 nm 내지 300 nm, 50 nm 내지 200 nm, 50 nm 내지 150 nm, 또는 80 nm 내지 140 nm일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 엑소좀은 상기 엑소좀의 동결 보호용 조성물 1 mL 당 1 x 109개 내지 1 x 1012개, 5 x 109개 내지 5 x 1012개, 1 x 109개 내지 1 x 1011개, 5 x 109개 내지 5 x 1011개, 1 x 109개 내지 1 x 1010개, 1 x 109개 내지 5 x 1010개, 5 x 109개 내지 1 x 1011개, 또는 1 x 1010개가 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 용어 '동결 보호'는 엑소좀의 장기간 보관을 위한 동결 과정에서 발생할 수 있는 손상으로부터 엑소좀을 보호하여 엑소좀의 구조, 기능, 및/또는 생물학적 활성을 유지하도록 하는 것을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 생체 적합성 고분자를 포함하는 엑소좀의 동결 보호용 조성물을 사용하여 동결 과정에서 발생할 수 있는 손상으로부터 엑소좀을 보호하여 엑소좀의 안정성을 유지시킬 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물의 생체 적합성 고분자인 히알루론산은 엑소좀 표면과의 CD44 수용체-리간드 작용으로 인해 상호간 결합함으로써 동결 과정에서 엑소좀의 구조적 안정성을 유지시킬 수 있다.
구체적으로, 상기 '엑소좀의 구조적 안정성'은 동결 과정 전후 엑소좀의 구형의 구조적 형태를 유지하는 것을 의미하는 것으로, 상기 조성물의 히알루론산과 엑소좀의 상호간 특이적 결합을 통해 히알루론산 고분자 잔기에 결합되어 있는 엑소좀 입자 간의 공간을 제공하여 동결 과정에서 발생하는 엑소좀 입자 간의 응집 현상에 의한 인지질 막의 구조적 손상을 최소화시킴으로써 얻을 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 조성물을 활용하여 동결 과정에서 엑소좀의 구조적 안정성이 유지되는 경우, 상기 엑소좀의 구조적 안정성은 장기간 보관에서도 지속적으로 유지될 수 있다.
본 발명자들은 실시예에서 상기 조성물에 의한 동결 건조 후 장기간 보관시, 엑소좀의 구형의 소포체 형태가 초기와 유사한 형태로 유지되는 것을 투과주사 현미경을 통해 확인하였다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 조성물은 엑소좀을 동결 건조 후 장기간 보관에 있어서, 엑소좀의 기능적 안정성을 유지시킬 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 기능적 안정성은 (a) 엑소좀의 농도; (b) 엑소좀의 효소활성능력; (c) 엑소좀의 총 단백질량; 또는 (d) 이들의 조합을 의미하는 것으로, 상기 지표를 측정하여 엑소좀의 기능적 안정성 유지 여부를 확인할 수 있다.
특히, 상기 기능적 안정성은 엑소좀을 일정 기간 보관할 경우, 상기 지표가 초기 값과 유사한 수준으로 유지되거나, 낮은 감소 수준을 나타내는 것을 통해 엑소좀의 기능적 안정성 유지 여부를 확인할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 안정성은 엑소좀을 4℃에서 6개월 내지 1년 동안 보관하는 경우, 상기 지표가 초기 값의 30% 이내의 범위로 감소되는 것일 수 있고, 또는 엑소좀을 40℃에서 15일 내지 30일 동안 보관하는 경우, 상기 지표가 초기 값의 20% 이내의 범위로 감소되는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, '유지'는 엑소좀의 안정성이 그대로 보존되거나 계속해서 존재하거나, 이의 감소가 지연되는 상태를 의미한다.
본 발명에 있어서, '장기간 보관'은 예컨대 2주 이상, 1개월 이상, 2개월 이상, 3개월 이상, 4개월 이상, 5개월 이상, 6개월 이상, 또는 수년 동안 보관하는 것을 의미하며, 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 조성물을 활용하여 엑소좀의 보관 온도에 따라, 예컨대 4℃에서 6개월 내지 1년 동안 보관이 가능한 것일 수 있거나, 40℃에서 15일 내지 30일 동안 보관이 가능한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명자들은 실시예에서 생체 적합성 고분자를 포함하지 않거나, 일반적인 동결 건조 보호제, 예를 들어, 트레할로스를 포함하는 조성물을 대조군으로 사용하여 엑소좀의 기능적 안정성 평가를 위한 지표들을 비교 분석하였다. 결과적으로, 상기 지표들의 값이 상기 대조군과 비교하여 본 발명의 조성물을 이용한 실험군에서 더 낮은 감소 수준을 나타내는 것을 통해, 본 발명의 조성물에 따른 엑소좀의 기능적 안정성이 효과적으로 유지되는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 생체 적합성 고분자를 포함하는 조성물은, 생체 적합성 고분자를 포함하지 않는 조성물에 비해 높은 엑소좀 안정성을 유지시킬 수 있다.
본 발명의 생체 적합성 고분자를 포함하는, 엑소좀의 동결 보호용 조성물을 활용하여 동결 과정에서 엑소좀의 구조적 안정성을 유지시킬 수 있으며, 동결 과정 후 장기간 보관에 있어서, 엑소좀의 기능적 안정성을 유지시킬 수 있다.
도 1은 본 발명의 엑소좀-히알루론산 조성물에서 엑소좀과 히알루론산 고분자 간의 특이적 결합을 통하여 동결 시 엑소좀 간의 막 손상을 방지하고 안정성을 유지함을 나타내는 개략도이다.
도 2는 엑소좀과 히알루론산 고분자 간의 CD44 수용체-리간드에 의한 특이적 결합력을 분석한 결과를 나타낸다.
도 3은 가속조건(40℃/30일)에서의 엑소좀-히알루론산 조성물 내 히알루론산 함량에 따른 엑소좀의 농도변화를 측정한 결과를 나타낸다.
도 4는 가속조건(40℃/30일)에서의 엑소좀-히알루론산 조성물 내 엑소좀 (a)농도, (b)효소활성 능력 및 (c)단백질량 변화를 측정한 결과를 나타낸다.
도 5는 실시간조건(4℃/30일)에서의 엑소좀-히알루론산 조성물 내 엑소좀 (a)농도, (b)효소활성 능력 및 (c)단백질량 변화를 측정한 결과를 나타낸다.
도 6은 엑소좀 조성물에 따른 엑소좀의 형태학적 분석을 위한 투과주사현미경 이미지를 나타낸다.
도 7a는 엑소좀 보관시 엑소좀-히알루론산의 특이적 결합에 의한 엑소좀의 세포이동능력을 평가한 결과를 나타낸다.
도 7b는 상기 도 7a를 정량적으로 평가한 결과를 나타낸다.
도 2는 엑소좀과 히알루론산 고분자 간의 CD44 수용체-리간드에 의한 특이적 결합력을 분석한 결과를 나타낸다.
도 3은 가속조건(40℃/30일)에서의 엑소좀-히알루론산 조성물 내 히알루론산 함량에 따른 엑소좀의 농도변화를 측정한 결과를 나타낸다.
도 4는 가속조건(40℃/30일)에서의 엑소좀-히알루론산 조성물 내 엑소좀 (a)농도, (b)효소활성 능력 및 (c)단백질량 변화를 측정한 결과를 나타낸다.
도 5는 실시간조건(4℃/30일)에서의 엑소좀-히알루론산 조성물 내 엑소좀 (a)농도, (b)효소활성 능력 및 (c)단백질량 변화를 측정한 결과를 나타낸다.
도 6은 엑소좀 조성물에 따른 엑소좀의 형태학적 분석을 위한 투과주사현미경 이미지를 나타낸다.
도 7a는 엑소좀 보관시 엑소좀-히알루론산의 특이적 결합에 의한 엑소좀의 세포이동능력을 평가한 결과를 나타낸다.
도 7b는 상기 도 7a를 정량적으로 평가한 결과를 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.
실시예
준비예 1. 인간 지방 줄기세포로부터 콜라겐 생성에 유효한 엑소좀의 추출
먼저, 인간 지방 줄기세포 유래 엑소좀은 인간 지방 줄기세포를 배양하는 과정에서 추출하였다.
준비예 1.1. 인간 지방 줄기세포의 배양
구체적으로, 인간 지방 줄기세포를 일반 배양배지(Gibco, Cat#: 11995065)에서 배양하고 엑소좀을 추출하기 24시간 전에 무혈청, 무항생제, 무페놀레드인 배지(Gibco, Cat#: 31053028)로 교체하여 24시간 동안 배양하였다.
준비예 1.2. 엑소좀의 분리 및 정제
세포 배양 상층액을 회수하여 일차적으로 2,000 xg로 4분 내지 5분 동안 원심분리하는 단계 및 이차적으로 10,000 xg로, 4분 내지 30분 동안 원심분리하는 단계를 거쳐 세포 잔해물 및 노폐물을 제거하였다. 그런 다음, 회수한 세포 배양 상층액은 일차적으로 3,000 xg로, 4℃에서 20분 동안 원심분리하는 하는 단계 및 이차적으로 0.22 ㎛ 필터로 여과하는 단계를 거쳐 세포 잔해물 및 노폐물을 제거해주었다. 이후 상기 여과를 거친 세포 배양 상층액을 300 kDa 필터를 이용한 접선 흐름 여과(Tangential Flow Filtration, TFF) 시스템을 이용하여 여과함으로써 엑소좀을 분리 및 정제하였다.
실시예 1. 엑소좀과 히알루론산 고분자 간의 CD44 수용체-리간드 작용에 의한 특이적 결합력 검증
생분자 반응 분석기(Bio-layer interferonmetry)를 이용하여 엑소좀 표면의 존재하는 CD44 수용체와 히알루론산 고분자 사슬에 존재하는 CD44 리간드 간의 특이적 결합력을 검증하였다.
먼저, 엑소좀과 히알루론산 고분자 간의 특이적 결합이 존재하는지 여부를 확인하고자 하였다. 이에, 바이오센서 기판에 히알루론산 고분자(hyaluronic acid, MW: 1,000 kDa)를 접합시킨 후, 상기 준비예 1에서 인간 지방 줄기세포에서 추출한 엑소좀의 단백질 농도별(0.2, 1 및 2 mg/mL)로 바이오센서 기판에 흘려줌으로써 생분자 반응 분석기에 나타나는 신호에 의한 히알루론산 고분자와 엑소좀 간의 결합력을 측정하였다.
결과는 도 2의 a에 나타내었다.
도 2의 a에 나타낸 바와 같이, 히알루론산 고분자를 접합시킨 바이오센서 기판에 농도별 엑소좀을 흘려주었을 때, 엑소좀의 농도가 증가할수록 히알루론산 고분자와 결합하는 양도 증가하는 것을 확인함으로써 두 물질 간의 특이적 결합이 존재함을 확인할 수 있었다.
다음으로, 엑소좀 표면에 존재하는 CD44 수용체를 차단하였을 때 실제로 히알루론산 고분자와의 결합 능력에 차이를 보이는지 검증하고자, CD44 항체와 반응시킨 엑소좀을 이용하여 히알루론산과의 결합 능력을 비교하였다.
CD44 항체와 반응시킨 엑소좀, 즉, CD44 수용체가 차단된 엑소좀은 1 mL의 엑소좀 용액(1.5x1010 입자)과 10 ㎕의 항-CD44 항체 용액을 섞어 4℃에서 3시간 동안 반응시켜 준비하였으며, 엑소좀과 히알루론산 간의 결합력은 상기 동일한 방법을 통해 측정되었다.
결과는 도 2의 b에 나타내었다.
도 2의 b에 나타낸 바와 같이, 일반 엑소좀은 CD44 항체에 의해 수용체가 차단된 엑소좀과 비교하여 히알루론산 고분자와의 결합력이 2배 이상 높게 측정되었다. 이를 통해, 엑소좀 표면의 CD44 수용체의 유무가 실제로 히알루론산 고분자와의 특이적 결합에 있어 유의미한 영향을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 2. 엑소좀 농도 유지를 위한 조성물 내 히알루론산 함량 최적화
엑소좀 농도 유지를 위한 조성물 내 히알루론산의 최적 함량을 확인하고자, 히알루론산 함량별 조성물의 동결건조 제형 샘플을 40℃의 가속 조건에서 9일 동안 나노입자 추적 분석 시스템(NanoSight LM10; Malvern Instruments, Malvern, UK)을 사용하여 조성물 내 히알루론산 함량에 따른 엑소좀의 농도 변화를 정량적으로 분석하였다.
먼저, 공점도용 공전/자전형 믹서(Centrifugal mixer)를 이용하여 히알루론산(hyaluronic acid, MW: 1,000 kDa) 고분자를 함량별로 10 mM 인산완충용액 0.25 mL에 단계별로 용해시킨 후(1 단계: 0 wt%(w/v), 2 단계: 0.005 wt%(w/v), 3 단계: 0.01 wt%(w/v), 4 단계: 0.05 wt%(w/v), 5 단계: 0.1 wt%(w/v), 6 단계: 0.5 wt%(w/v)), 0.25 mL의 엑소좀 용액(1 x 109 입자)와 섞어 24시간 동안 동결건조시켰다. 대조군으로는 트레할로스를 0.5 wt%(w/v) 포함하는 10 mM 인산완충용액을 같은 양으로 녹인 후에 동결건조한 샘플을 사용하였다.
그런 다음, 나노입자 추적 분석을 위하여 상기 동결건조된 샘플을 10 mM 인산완충용액 0.5 mL에 용해시킨 후, 400 U/mL의 히알루로니다아제(hyaluronidase) 용액을 0.25 mL 추가한 뒤, 상온에서 10분 동안 반응시켜 나노입자 추적 분석용 샘플용액으로 사용하였다.
결과는 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 조성물의 보관 9일 후, 4 단계, 5 단계 및 6 단계 샘플의 엑소좀 농도는 0일 차의 초기 농도와 유사하게 유지되었지만, 트레할로스 동결건조 보호제를 포함하는 샘플 및 2단계 이하의 샘플에서는 엑소좀 농도가 30% 이상 감소된 것을 확인할 수 있었다.
실험예 1. 엑소좀-히알루론산 조성물 내 엑소좀 안정성 유지 평가
실험예 1.1. 장기간 가속 조건에서의 엑소좀-히알루론산 조성물 내 엑소좀 안정성 유지 평가
본 실시예는'4℃에서 1년 동안의 실시간 조건'에 해당하는 '40℃에서 30일 동안의 가속조건'에서, 상기 실시예 2에서 최적화된 히알루론산 함유량(4 단계, 0.05 wt%)을 포함하는 엑소좀-히알루론산 조성물을 사용하여 본 발명에 따른 엑소좀 안정성 유지 효과를 평가하고자 하였다.
음성대조군으로는 DPBS 조성물의 동결건조제형 샘플을 사용하였고, 트레할로스 함유(0.05 wt%, Tre) 조성물, 히알루론산 함유(0.05 wt%, HA) 조성물, 및 히알루론산(0.05 wt%) 및 트레할로스(0.05 wt%)를 함께 포함하는 조성물(HA+Tre)의 동결건조제형 샘플을 각각 실험군으로 사용하였다.
실험예 1.1.1. 엑소좀-히알루론산 조성물 내 엑소좀 농도 유지 평가
나노입자 추적 분석 시스템(NanoSight LM10; Malvern Instruments, Malvern, UK)을 이용하여 엑소좀-히알루론산 조성물 내 엑소좀 농도를 측정하였으며, 조성물 내 엑소좀의 농도 유지 효율은 초기 농도 대비 감소되는 엑소좀의 농도 변화를 통해 평가하였다.
결과는 도 4의 a에 나타내었다.
도 4의 a에 나타낸 바와 같이, 보관 30일 이후, 본 발명의 4단계 히알루론산 함유 샘플(HA)에서는 초기 엑소좀 농도 대비 35%의 감소량을 보여주었고, 이는 엑소좀 외에 아무것도 함유되지 않은 샘플(DPBS) 대비 2.3배, 트레할로스가 함유된 샘플(Tre) 대비 1.8배의 농도 유지 효율을 나타내었다.
반면, 히알루론산과 트레할로스를 함께 포함한 샘플(HA+Tre)에서는 엑소좀 농도가 히알루론산을 함유하는 샘플(HA)과 큰 차이가 없는 것으로 나타났다.
상기 결과로부터, 히알루론산에 트레할로스를 추가적으로 함유시키는 것은 엑소좀의 농도 유지에 유의미한 영향을 주지 않는 것을 알 수 있었다.
실험예 1.1.2. 엑소좀-히알루론산 조성물 내 엑소좀 효소활성능력 유지 평가
Amplite Colorimetric Acetylcholinesterase Assay Kit(AAT Bioquest, CA, US)를 사용하여 엑소좀 아세틸콜린에스터라아제(AchE)의 농도를 측정하여 엑소좀의 막단백질 중 하나인 아세틸콜린에스터라아제(Acethylcholineesterase, AchE)의 효소 활성을 평가하였다. 엑소좀-히알루론산 조성물 내 엑소좀의 초기 대비 감소되는 엑소좀의 효소활성능력의 변화를 측정함으로써, 상기 조성물이 엑소좀의 효소활성능력을 유지할 수 있는지를 평가하는 것이 가능하다.
결과는 도 4의 b에 나타내었다.
도 4의 b에 나타낸 바와 같이, 보관 30일 이후, 본 발명의 히알루론산 함유 샘플(HA, HA+Tre)에서는 초기 0일차와 비교하여 엑소좀 효소활성능력이 14% 감소한 것을 확인하였고, 이는 엑소좀 외 미함유 샘플(DPBS) 대비 2.1배, 트레할로스가 함유된 샘플(Tre) 대비 1.6배의 효소활성능력의 유지 효율을 나타내었다. 상기 결과로부터 본 발명의 히알루론산 함유 조성물이 엑소좀의 농도를 유지하는 것 뿐만 아니라, 엑소좀의 효소활성 능력을 유지하는 데에도 매우 유용함을 알 수 있었다.
실험예 1.1.3. 엑소좀-히알루론산 조성물 내 엑소좀 총 단백질량 유지 평가
단백질 정량법(BCA assay)를 통해 엑소좀-히알루론산 조성물 내 엑소좀의 단백질 총량을 변화를 측정함으로써, 상기 조성물 내 엑소좀의 총 단백질량 유지 효율을 평가하였다.
결과는 도 4의 c에 나타내었다.
도 4의 c에 나타낸 바와 같이, 보관 30일 이후, 본 발명의 히알루론산 함유 샘플(HA, HA+Tre)에서는 초기 0일차와 비교하여 엑소좀 내 단백질량이 15% 감소한 것을 확인하였고, 이는 엑소좀 외 미함유 샘플(DPBS) 대비 1.7배, 트레할로스가 함유된 샘플(Tre) 대비 1.6배의 엑소좀 내 총단백질량 유지 효율을 나타낸다.
상기 결과로부터, 본 발명의 히알루론산 함유 조성물은 장기간 가속조건에서도 엑소좀의 총 단백질량을 유지하는 효과가 매우 우수함을 알 수 있었다.
실험예 1.2. 장기간 실시간 조건에서의 엑소좀-히알루론산 조성물 내 엑소좀 안정성 유지 평가
본 실시예는 '4℃의 30일 동안의 실시간 조건'에서, 상기 실시예 2에서 최적화된 히알루론산 함유량(4 단계, 0.05 wt%)을 포함하는 엑소좀-히알루론산 조성물을 사용하여 본 발명에 따른 엑소좀 안정성 유지 효과를 평가하고자 하였다.
음성대조군으로는 DPBS 조성물의 동결건조제형 샘플을 사용하였고, 트레할로스 함유(0.05 wt%) 조성물(Tre) 및 히알루론산 함유(0.05 wt%) 조성물, 히알루론산(0.05 wt%) 및 트레할로스(0.05 wt%)를 함께 포함하는 조성물(HA+Tre)의 동결건조제형 샘플을 각각 실험군으로 사용하였다.
실험예 1.2.1. 엑소좀-히알루론산 조성물 내 엑소좀 농도 유지 평가
나노입자 추적 분석 시스템(NanoSight LM10; Mlavern Instruments, Malvern, UK)을 이용하여 엑소좀-히알루론산 조성물 내 엑소좀의 농도를 측정하였다.
결과는 도 5의 a에 나타내었다.
도 5의 a에 나타낸 바와 같이, 보관 30일 이후, 본 발명의 히알루론산 함유 샘플(HA)에서는 초기 엑소좀 농도 대비 20%의 감소량을 보여주었고, 이는 엑소좀 외에 아무것도 함유되지 않은 샘플(DPBS) 대비 2.1배, 트레할로스가 함유된 샘플(Tre) 대비 1.7배의 농도 유지 효율을 나타내었다.
상기 결과로부터 본 발명의 히알루론산 함유 조성물은 장기간 실시간 조건에서 엑소좀을 안정적으로 유지하는데 매우 유용함을 알 수 있었다.
실험예 1.2.2. 엑소좀-히알루론산 조성물 내 엑소좀 효소활성능력 유지 평가
아세틸콜린 분해효소 분석법을 통해 조성물 내 엑소좀의 효소활성능력을 측정하였다.
결과는 도 5의 b에 나타내었다.
도 5의 b에 나타낸 바와 같이, 보관 30일 이후, 본 발명의 히알루론산 함유 샘플(HA, HA+Tre) 및 트레할로스 함유 샘플(Tre)의 엑소좀의 효소활성능력은 초기 0일차와 대비하여 거의 차이가 없이 유지되는 것을 확인하였다. 반면, 엑소좀 외 미함유 샘플(DPBS)은 초기 0일차 대비 8%나 감소된 엑소좀의 효소활성능력을 나타내었다.
상기 결과로부터 본 발명의 히알루론산 함유 조성물은 장기간 실시간 조건에서 본 발명의 히알루론산 함유 조성물이 엑소좀의 농도를 유지하는 것 뿐만 아니라, 엑소좀의 효소활성 능력을 유지하는 데에도 매우 유용함을 알 수 있었다.
실험예 1.2.3. 엑소좀-히알루론산 조성물 내 엑소좀 총 단백질량 유지 평가
단백질 정량법(BCA assay)를 통해 조성물 내 엑소좀의 총 단백질량을 측정하였다. 결과는 도 5의 c에 나타내었다.
도 5의 c에 나타낸 바와 같이, 실시간 조건에서는 보관 30일 차에서 히알루론산 함유 샘플(HA, HA+Tre), 트레할로스 함유 샘플(Tre) 및 DPBS 샘플 내 엑소좀의 단백질 총량의 변화는 거의 나타나지 않는 것을 확인하였다.
상기 결과로부터, 본 발명의 히알루론산 함유 조성물은 장기간 실시간 조건에서도 엑소좀의 총 단백질량을 유지하는 효과가 매우 우수함을 알 수 있었다.
실험예 2. 장기간 가속 조건에서의 엑소좀-히알루론산 조성물에 따른 엑소좀의 형태학적 분석
장기간 가속 조건에서의 엑소좀-히알루론산 조성물에 따른 엑소좀의 형태학적 분석을 수행하고자, 상기 실험예 1에서 사용한 각 조성물의 동결건조 제형을 동일하게 사용하여 투과 주사 현미경을 통하여 각 조성물에 따른 엑소좀의 형태 변화를 비교분석하였다. 구체적으로 각 조성물의 동결건조 제형을 40℃의 가속조건에서 30일간 보관 후, 각 조성물에 따른 엑소좀의 형태 변화를 0일차 구형의 엑소좀 형태와 비교하였다.
결과는 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 히알루론산 미함유 샘플(DPBS) 및 트레할로스 함유 샘플(Tre)의 엑소좀 형태는 구형의 소포체 형태에서 찌그러진 불규칙적의 형태를 나타내는 반면, 본 발명의 히알루론산 함유 샘플(HA, HA+Tre)의 엑소좀은 0일차의 엑소좀과 유사한 구형의 형태가 유지되는 것을 확인하였다.
상기 결과로부터, 본 발명의 히알루론산 함유 조성물은 장기간 가속 조건에서도 엑소좀의 기능뿐만 아니라 형태를 유지하는 효과가 매우 우수함을 알 수 있었다.
실험예 3. 엑소좀의 장기간 보관시 엑소좀 내 CD44 수용체 유무 차이에 따른 엑소좀의 기능 유지력 검증
본 실험예에서는 상기 실험예 1 및 2에서 확인한 엑소좀-히알루론산 조성물에 따른 엑소좀의 장기간 보관시 엑소좀의 안정성 유지가 히알루론산과 엑소좀 간의 CD44-특이적 결합으로 인해 나타나는 효과인지 확인하고자 하였다.
구체적으로, 엑소좀의 장기간 보관시 히알루론산 고분자와의 특이적 결합에 의한 엑소좀의 안정성 유지, 즉, 엑소좀의 기능 유지를 확인하고자 세포이동능력을 평가하였다.
음성대조군으로는 DPBS 조성물의 동결건조제형 샘플을 사용하였고, 트레할로스 함유(0.05 wt%, Tre) 조성물 및 히알루론산 함유(0.05 wt%, HA) 조성물의 동결건조제형 샘플을 각각 실험군으로 사용하였으며, 추가적으로, 상기 실시예 1에서 제조된 CD44 수용체가 차단된 엑소좀을 적용하여 각 실험군에 대한 음성대조군으로 사용하였다.
엑소좀의 세포이동능력를 평가하기 위해 세포를 이용한 상처치유 분석법을 수행하였다. 섬유아세포가 배양된 접시 중앙 부위를 긁어낸 후, 가속조건(40℃에서 보관 0일차 및 10일차의 일반 엑소좀 조성물 및 CD44 수용체가 차단된 엑소좀 조성물을 각각 처리한 후, 40시간 이후의 세포차지공간의 너비 차이를 현미경을 통해 확인하였다.
결과는 도 7에 나타내었다.
도 7a에 나타낸 바와 같이, 40℃의 가속조건 내 보관 0일차의 일반 엑소좀 조성물을 섬유아세포에 처리해주었을 때, 조성물 간의 세포이동능력 및 엑소좀의 CD44 수용체 차단 유무에 의한 세포이동능력에 유의미한 차이가 없음을 확인할 수 있었다.
그러나, 40℃의 가속조건 내 보관 10일차의 엑소좀 조성물을 처리해 주었을 때, CD44 수용체가 온전한 일반 엑소좀 조성물의 경우, 히알루론산 함유 샘플(HA/Exo)에서 히알루론산 미함유 샘플(DPBS/Exo) 대비 1.5배, 트레할로스 샘플(Tre/Exo) 대비 1.3배 이상의 세포이동능력 효율을 나타내었으며, 히알루론산 함유의 CD44 수용체가 차단된 엑소좀 샘플(HA/b-Exo)과 비교하여 1.4배 이상의 세포이동능력의 효율을 보여주었다.
상기 결과로부터, 본 발명의 엑소좀의 장기간 보관시 엑소좀-히알루론산 조성물에 따른 엑소좀의 기능적/구조적 안정성의 유지는 엑소좀과 히알루론산 간 CD44 수용체-리간드 결합에 의해 나타나는 효과임을 확인할 수 있었다.
Claims (12)
- 네트워크 구조를 포함하는 생체 적합성 고분자를 포함하는, 엑소좀의 동결 보호용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 생체 적합성 고분자는 히알루론산(hyaluronic acid), 콜라겐(collagen), 알지네이트(alginate), 녹말(starch), 키토산(chitosan), 젤라틴(gelatin), 덱스트란(dextran), 셀룰로오스(cellulose), 알긴산(alginic acid), 콘드로이틴 설페이트(chondroitin sulfate), 및 헤파린(heparin)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 엑소좀의 동결 보호용 조성물.
- 제 2항에 있어서, 상기 생체 적합성 고분자는 히알루론산인, 엑소좀의 동결 보호용 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 히알루론산은 엑소좀의 CD44 수용체와 결합하는 것인, 엑소좀의 동결 보호용 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 엑소좀은 줄기세포 유래 엑소좀인 것인, 엑소좀의 동결 보호용 조성물.
- 제 5항에 있어서, 상기 줄기세포는 제대, 제대혈, 혈액, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반 등으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 조직으로부터 유래된 중간엽 줄기세포(mesenchymal stromal cell)인 것인, 엑소좀의 동결 보호용 조성물.
- 제 6항에 있어서, 상기 줄기세포는 지방 유래 줄기세포(adipose-derived stem cells, ASCs)인, 엑소좀의 동결 보호용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 히알루론산 고분자를 0.01 내지 1.0 wt%(w/v) 포함하는 것인, 엑소좀의 동결 보호용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 전체 조성물 1 mL 당 1 x 109 내지 1 x 1012의 엑소좀을 포함하는 것인, 엑소좀의 동결 보호용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 동결 과정에서 생체적합성 고분자를 포함하지 않는 조성물에 비해 엑소좀의 안정성 감소를 저해하는 것인, 엑소좀의 동결 보호용 조성물.
- 제10항에 있어서, 상기 엑소좀의 안정성은 다음을 의미하는 것인, 엑소좀의 동결 보호용 조성물:
(a) 엑소좀의 농도;
(b) 엑소좀의 효소활성능력;
(c) 엑소좀의 총 단백질량; 또는
(d) 이들의 조합.
- 제11항에 있어서, 상기 조성물은,
(i) 4℃에서 6개월 내지 1년 동안 보관시 상기 (a) 내지 (d)의 지표가 초기 값의 30% 이내의 범위에서 감소되게 하거나, 또는
(ii) 40℃에서 15일 내지 30일 동안 보관시 상기 (a) 내지 (d)의 지표가 초기 값의 20% 이내의 범위로 감소되게 하는 것인, 엑소좀의 동결 보호용 조성물
Priority Applications (2)
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|---|---|---|---|
| KR1020220113811A KR20240034590A (ko) | 2022-09-07 | 2022-09-07 | 네트워크 구조를 포함하는 생체적합성 고분자를 포함하는, 엑소좀의 동결 보호용 조성물 |
| PCT/KR2023/013220 WO2024053985A1 (ko) | 2022-09-07 | 2023-09-05 | 네트워크 구조를 포함하는 생체적합성 고분자를 포함하는, 엑소좀의 동결 보호용 조성물 |
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