KR20240023949A - 초고압 나노균질기를 이용하여 수율이 향상된 엑소좀의 제조방법 - Google Patents
초고압 나노균질기를 이용하여 수율이 향상된 엑소좀의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 초고압 나노균질기를 이용하여 수율이 향상된 엑소좀의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 맥주 효모를 배양하는 단계; 상기 배양액을 초고압 나노균질기(high pressure homogenizer)를 이용하여 30,000~40,000 psi에서 분쇄하는 단계; 및 상기 분쇄액을 원심분리하는 단계; 및 상기 원심분리 후 상등액을 한외여과하는 단계;를 포함하는 맥주 효모 엑소좀의 제조방법에 관한 것이다.
상기 단계를 통해 맥주 효모 엑소좀은 높은 수율로 경제적이면서 효율적으로 제조되며, 특히 세포 독성이 없으며 세포 증식율이 높은 효과가 있다. 또한 항산화 능력 및 미백효과가 우수하다.
상기 단계를 통해 맥주 효모 엑소좀은 높은 수율로 경제적이면서 효율적으로 제조되며, 특히 세포 독성이 없으며 세포 증식율이 높은 효과가 있다. 또한 항산화 능력 및 미백효과가 우수하다.
Description
본 발명은 초고압 나노균질기를 이용하여 수율이 향상된 엑소좀의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 맥주 효모(Saccharomyces cerevisiae)를 상온 내지 43℃에서 15분 내지 60분간 배양하는 단계; 상기 배양액을 초고압 나노균질기(high pressure homogenizer)를 이용하여 30,000~40,000 psi에서 분쇄하는 단계; 및 상기 분쇄액을 원심분리하는 단계; 및 상기 원심분리 후 상등액을 한외여과하는 단계;를 포함하는 맥주 효모 엑소좀의 제조방법에 관한 것이다.
최근 경제적인 성장과 함께 삶의 질에 대한 관심이 높아짐에 따라 건강과 아름다움에 대한 관심 역시 높아지고 있다. 이에 따라 화장품 산업은 전체적으로 다른 제조업에 비하여 견고한 성장세를 보이고 있다. 우리나라 화장품 시장도 날로 성장하고 있으며 세계 시장 진출 역시 활발한 움직임을 보이고 있다.
고객들의 화장품에 대한 전반적인 지식 및 요구 수준이 높아짐에 따라 화장품 소재의 중요성도 높아지고 있으며 이에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다.
화장품에서는 동식물 소재를 이용하여 많은 원료를 개발하였다. 개발되는 물질을 시간순으로 구분을 하면 1세대(Extract)는 물을 포함하는 용매를 이용하는 추출물들이 주류를 이루고 있다. 2세대(Fermentation)는 1세대에서 얻어진 물질을 여러 가지 미생물을 이용한 발효라고 할 수 있다. 3세대(Bioconversion)는 단순한 발효가 아닌 특정한 미생물을 이용하여 개발자가 원하는 특정한 구조만을 변화시키는 공정이다. 4세대(Plant stem cell)는 식물의 캘러스(callus)를 이용하여 식물줄기세포라는 마케팅 용어를 이용하여 자연계에서 채취가 어렵거나 고가의 천연물을 실험실에서 대량으로 배양하여 사용하는 방법이다. 지금까지 1세대부터 4세대까지의 기술을 이용한 식물성 화장품 소재가 주류를 이루고 있었다.
하지만 엑소좀(exosome)은 1983년 필립 스탈(Philip Stahl) 교수팀에 의해 포유류의 미성숙 적혈구인 망상적혈구(reticulocyte)에서 처음 발견되었으나, 생물학적 의의나 질환과의 관계를 알지 못해 별로 주목받지 못했고, 1987년 로즈 존스톤(Rose M. Johnstone) 교수팀에 의해 다양한 작용 기전이 연구되어 상기 명칭이 사용되었다. 적혈구의 성숙 과정에서 엑소좀은 세포 내 단백질을 제거하는 역할을 수행하는 것으로 밝혀졌다. 이를 제5세대라고 한다.
이를 기점으로 2010년 이후 엑소좀의 연구 분야가 확장되면서 생명현상, 질병진단, 생물정보학 및 약물전달시스템 등 의료분야에 적극적으로 연구가 되고 있다.
엑소좀이란 세포내에서 생성 후 세포 외부로 방출되는 정보교환 물질로 그 크기는 50~150nm로 소낭에 함유된 물질로, 세포(Cell)의 표면에 있는 엑소시토시스(Exocytosis)를 통하여 타켓으로 되는 다른 세포의 엔도시토시스(Endocytosis)를 통하여 전달된다. 그래서 엑소좀은 EXO와 Some의 합성어로 이는 Extra + Cellular + Vesicle이 축약된 용어로, 즉 세포의 외부로 나오는 구형의 입자를 의미한다.
엑소좀은 줄기세포 형성을 위한 정보, 구조, 창조에 관여를 하는 중요한 물질이고, 피부 세포를 위한 가장 작은 메신저라고도 한다.
과거 엑소좀은 세포 배설물 또는 세포 똥이라는 인식이 과학계에 지배적이었다. 이러한 이유로 엑소좀은 가치가 없는 물질로 인식되었으나, 근래에 들어와서 생명 유지 메커니즘과 관련된 성분인 세포성장인자와 유전물질들이 다량 함유되어 있음을 확인하게 된 후, 화장품 분야에도 적용되기 시작하였다.
유산균, 효모 등과 같은 물질을 화장품에 사용할 때 수㎛ 크기를 갖는 이러한 물질보다는 수nm 단위를 갖는 엑소좀이 매우 흡수가 용이하다는 점은 자명하다. 화장품의 유효성분이 피부에 흡수되기 위한 가장 손쉬운 방법은 모공을 통한 흡수이다. 일반적으로 모공의 직경은 20,000~50,000nm로 알려져 있으며 엑소좀의 일반적인 크기인 50~150nm와 비교시 수천배 작기 때문에 엑소좀의 흡수는 매우 용이한 크기를 갖고 있다.
화장품에서 줄기세포 배양액은 사용이 가능하지만 줄기세포는 화장품에 사용할 수 없는데, 이는 줄기세포에 의하여 일어날 수 있는 다양한 부작용 때문이다. 하지만 특이하게도 줄기세포를 배양(키운)한 배양액 또한 줄기세포처럼 다양한 효과가 있음이 밝혀져서, 최근에는 줄기세포 배양액을 화장품에 적극적으로 사용하고 있는 실정이다. 이는 어떤 줄기세포에서 다른 줄기세포로 엑소좀이 이동하고 이 엑소좀이배양액에 남아 있어서 이러한 효과가 있는 것으로 보고되고 있다.
이와 같은 엑소좀을 분리하는 종래기술로는 엑소좀 분리키트(isoloation kit), 한외여과법(ultrafiltration), 원심분리법(centrifugation), 밀도구배 원심법(density gradient centrifugation), 폴리머 기반 침전법(polymer based precipitation) 및 사이즈 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography) 등이 있다.
그러나 현재까지는 화장품 산업에 적용하기 위한 다양한 엑소좀의 개발이 아직은 미미하고 세포에 기인하는 엑소좀을 얻기 위한 분리 및 정제공정이 매우 복잡하고 수율이 낮은 문제로 엑소좀 소재는 매우 고가에 판매되고 있는 실정이다. 따라서 화장품 산업에서 엑소좀을 보다 더 적극적으로 활용하기 위해서는 기존의 방법과는 다른 혁신적인 제조 방법이 필요한 시점이다.
안인숙 외 8인, "B16F10 Mouse Melanoma 세포에서의 L-cysteine에 의한 멜라닌 생성 억제", 대한피부미용학회지 제5권 제2호, p239~246, 2007.
본 발명의 목적은 맥주 효모로부터 높은 수율로 경제적이면서 효율적으로 엑소좀을 분리하여 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 맥주 효모 엑소좀을 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 목적은 고수율의 맥주 효모 엑소좀을 제조하는 방법으로서, 맥주 효모를 상온 내지 43℃에서 15분 내지 60분간 배양하는 단계; 상기 배양액을 초고압 나노균질기(high pressure homogenizer)를 이용하여 30,000~40,000 psi에서 분쇄하는 단계; 및 상기 분쇄액을 원심분리하는 단계; 및 상기 원심분리 후 상등액을 한외여과하는 단계;를 포함하는 맥주 효모 엑소좀의 제조방법을 제공함에 의해 달성된다.
본 발명은 상기 분쇄하는 단계를 3회 이상 반복 수행하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 상기 맥주 효모는 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)를 선택하는 것을 특징으로 한다.
또한 상기 제조방법으로 제조된, 100 내지 150 nm 직경의 입자크기를 갖는 맥주 효모 엑소좀을 제공하는 것으로 한다.
상기 맥주 효모 엑소좀은, WST-1 assay에서 각질형성세포와 섬유아세포의 생존율이 높아지는 것을 특징으로 하는 피부 재생용 화장료 조성물을 제공하는 것으로 한다.
상기 맥주 효모 엑소좀은, DPPH assay에서 자유라디칼 소거율이 농도 의존적으로 높아지는 것을 특징으로 하는 항산화용 화장료 조성물을 제공하는 것으로 한다.
상기 맥주 효모 엑소좀은, 멜라닌 형성 저해율이 농도 의존적으로 높아지는 것을 특징으로 하는 피부미백용 화장료 조성물을 제공하는 것으로 한다.
본 발명은 상기 화장료 조성물의 전체 중량에 대해 상기 맥주 효모 엑소좀을 1.0 내지 5.0 중량% 포함하여 이루어지는 것으로 한다.
본 발명에 따르면, 초고압 나노균질기를 이용한 엑소좀의 제조방법은 경제적으로 저가 비용으로 고농도의 수득량을 효율적으로 엑소좀을 분리할 수 있는 장점이 있다.
또한 본 발명의 방법에 따르면, 종래의 분리 방법과 비교하여 항산화, 피부미백 효과가 우수한 엑소좀 및 이를 포함하는 화장료 조성물을 대량으로 생산할 수 있다. 특히 세포 독성이 없고 세포 증식율이 높은 엑소좀을 제공하는 탁월한 효과를 나타낸다.
도 1은 본 발명에 따른 맥주 효모 엑소좀을 압력크기에 따라 Olympus CX3으로 확인한 현미경 사진들이다.
도 2는 본 발명에 따른 맥주 효모 엑소좀의 Nanoparticle Tracking Analysis (NTA, NanoSight NS300)로 분석된 평균 입자크기를 나타낸 것이다.
도 3은 맥주 효모 추출물(Brewers'yeast Extract)과 본 발명의 실시예를 통해 제조된 엑소좀(Brewers'yeast EXO)의 세포독성평가를 농도에 따라 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 4는 맥주 효모 추출물(Brewers'yeast Extract)과 본 발명의 실시예를 통해 제조된 엑소좀(Brewers'yeast EXO)의 DPPH Assay를 통한 항산화력을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 5는 맥주 효모 추출물(Brewers'yeast Extract)과 본 발명의 실시예를 통해 제조된 엑소좀(Brewers'yeast EXO)의 멜라닌 합성 저해(Melanin contents assay) 효과를 농도에 따라 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명에 따른 맥주 효모 엑소좀의 Nanoparticle Tracking Analysis (NTA, NanoSight NS300)로 분석된 평균 입자크기를 나타낸 것이다.
도 3은 맥주 효모 추출물(Brewers'yeast Extract)과 본 발명의 실시예를 통해 제조된 엑소좀(Brewers'yeast EXO)의 세포독성평가를 농도에 따라 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 4는 맥주 효모 추출물(Brewers'yeast Extract)과 본 발명의 실시예를 통해 제조된 엑소좀(Brewers'yeast EXO)의 DPPH Assay를 통한 항산화력을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 5는 맥주 효모 추출물(Brewers'yeast Extract)과 본 발명의 실시예를 통해 제조된 엑소좀(Brewers'yeast EXO)의 멜라닌 합성 저해(Melanin contents assay) 효과를 농도에 따라 측정하여 나타낸 그래프이다.
이하에는, 본 발명의 바람직한 실시예와 실험예를 상세하게 설명하되, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 발명을 쉽게 실시할 수 있을 정도로 상세하게 설명하기 위한 것이지, 이로 인해 본 발명의 기술적인 사상 및 범주가 한정되는 것을 의미하지는 않는다.
엑소좀은 살아 있는 동식물의 세포뿐만 아니라 타액에서도 존재한다고 알려져 있다. 하지만 본 발명에서는 맥주의 발효 후 폐기되는 맥주 효모 세포로부터 엑소좀을 분리하였다.
본 발명의 실시예에서 사용하는, 맥주 발효의 부산물인 사카로미세스(Saccharomyces)속 효모로, 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)로 한정하여 설명하고 있으나, 이에 한정되지 아니한다. 이는 맥주를 만드는 과정에서 상기 효모를 따로 분리한 후 건조시킨 것이다.
이에 본 발명에 사용되는 사카로미세스(Saccharomyces)속 효모는 사카로미세스 세리비시아, 사카로미세스 유바룸, 사카로미세스 엘립소이데우스, 사카로미세스 카를스베르겐시스, 사카로미세스 사케, 사카로미세스 코레아누스, 사카로미세스 리폴리티카, 사카로미세스 보울라디 및 사카로미세스 파스토리아누스로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 2종 이상의 혼합형태를 사용할 수 있다.
상기 맥주 효모(사카로미세스 효모)에는 단백질, 비타민 B 복합체, 크롬 및 셀레늄 등의 미네랄이 들어있고, 특히 맥주 효모에 풍부한 비타민 B 복합체는 건강한 피부를 유지하는 데 도움이 된다. 셀레늄, 크롬 및 단백질 또한 마찬가지다.
여기서 비타민 B 복합체는 세포가 복제되는 것을 돕고 크롬은 피부 세포가 지방, 탄수화물, 단백질로부터 에너지를 얻는 데 도움을 준다. 특히 모발 생성을 위한 단백질 대사에 필수적인 비타민 B군인 비오틴과 모발 단백질을 구성하는 시스틴, 메티오닌 등이 함유되어 있어 탈모방지에 매우 효과적이다. 아울러 면역세포의 생성을 도와 면역증진과 노화 방지에도 도움이 된다. 따라서 항산화가 요구되는 화장품 분야에 유용하게 적용될 수 있다.
한편 본 발명의 사카로미세스속 효모 분해 추출물은, 일반적으로 물이나 트립신 또는 프로타아제 등의 단백질분해효소를 사용하여 추출할 수 있으며, 이에 한정되지는 아니한다.
본 발명의 사카로미세스속 효모분해 추출물의 제조방법에서, 배양은 상온 내지 최대 43℃ 이내에서 수행하고, 가장 바람직하게는 43℃에서 15분 내지 60분간 수행되는 것이고 상온 수행 시 72시간까지 연장시킬 수도 있다. 상기에서 배양온도 43℃를 초과하면, 단백질 효소의 변성이 우려되어 바람직하지 않고, 배양시간은 상기 배양온도에 따라 결정되며, 배양온도 43℃일 때, 15분 내지 60분, 더욱 바람직하게는 30분 내지 60분간 수행될 때, 사카로미세스속 건조효모로 유래된 유효성분을 고농도로 추출할 수 있다.
이에, 상기 배양온도에 따라 배양시간은 반비례 관계로 결정되고, 배양단계가 짧은 시간 이내에 유효성분을 고농도로 추출할 수 있도록 추출 효율성을 고려하여 결정한다.
엑소좀은 무게 측정이 어려울 정도로 매우 작기 때문에 분리 및 정제에 시간이 많이 소모되고 번거롭고 비용이 많이 필요하다.
기존의 엑소좀 분리키트를 이용하는 방법은 매우 간단하지만, 고가의 1회용 키트 사용으로 상업화는 어려운 문제가 있다. 즉 엑소좀과 결합을 할 수 있는 물질을 넣어 엑소좀을 분리하는 방법으로, 엑소좀 수득 후 다시 결합 물질을 제거해야 하는 불편함과 최대 100ml 수준의 엑소좀 소량 획득과 소량 생산으로 인한 생산단가 상승으로 산업화에는 한계가 있다.
또 한외여과법(ultrafiltration)은 미세 물질을 크기별로 선별하는 방법으로 상기 분리키트보다는 상대적으로 대량 생산이 가능하다. 이는 미세여과(microfiltration) 및 역삼투의 중간 영역에 위치하는 것으로서 막세공과 용질간의 크기 차에 의해 특정 물질을 분리하는 방법이다. 하지만 이는 매우 고가의 장비이고 맴브레인 필터는 1회용으로 초기 투자비와 지속적인 투자가 필요하다. 또한 분리하고자 하는 세포의 종류에 따라 맴브레인 필터의 종류가 상이하고 분리할 수 있는 양이 적은 단점이 있다.
현재 원심분리법을 가장 많이 사용하고 있으며, 이는 300G(저속), 2,000G(중속), 10,000G(고속), 100,000G(초고속) 순으로 원심분리의 회전수를 증가시켜 입자의 무게별로 분리하는 기술이다. 하지만 고속 이상의 원심분리기는 한번에 처리할 수 있는 양이 3kg 미만이며 반복적으로 원심분리를 해야 하므로 다량의 엑소좀을 얻기에는 이 또한 한계가 있다.
또한 수율 향상을 위해서는 원심분리법과 한외여과법을 조합하여 사용하기도 한다.
이에 본 발명은 고수율 향상을 위해서 초고압 나노 균질기를 이용하고 원심분리법과 한외여과법을 조합하여 엑소좀을 제조하였다.
본 발명에 따른 엑소좀의 제조방법은, 맥주 효모를 배양하는 단계; 상기 배양액을 초고압 나노균질기(high pressure homogenizer)를 이용하여 10,000~40,000 psi 에서 분쇄하는 단계; 및 상기 분쇄액을 원심분리하는 단계; 및 상기 원심분리 후 상등액을 한외여과하는 단계;를 포함한다. 이때 상기 분쇄하는 단계의 압력은 30,000~40,000 psi 에서 수행하는 것이 가장 바람직하다. 또한 상기 분쇄하는 단계를 3회 이상 반복 수행하는 것을 특징으로 한다.
10,000~15,000 psi에서도 조금씩 미생물의 세포벽이 파괴되기 시작하지만, 초고압 30,000~40,000 psi에서 분쇄하게 되면, 세포 안에 있는 엑소좀과 세포 밖에 있는 엑소좀을 모두 얻을 수 있게 되어, 이 과정에서 불필요한 세균류와 곰팡이류 등도 모두 멸균되는 효과가 있으며, 기존 기술 대비 생산성과 수득률이 높고 작업 시간도 단축되는 장점을 가진다.
즉 이러한 초고압 범위에서 분쇄하는 과정을 거치는 단계를 포함하는 기술구성으로 인해, 기존에는 얻을 수 없었던 고수율의 엑소좀을 얻을 수 있었다.
본 발명의 일 예의 제조방법에 있어서, 제조된 엑소좀은 각질형성세포(Keratinocyte)와 섬유아세포(Fibroblast)를 이용한 WST-1 assay를 실시한 결과, 맥주 효모 추출물(Brewers'yeast Extract)은 10.0% 이상 사용 시 각질형성세포와 섬유아세포 모두 생존율이 낮아졌다. 하지만 맥주 효모 엑소좀(Brewers'yeast EXO)은 실험 설계 농도 내에서 세포가 죽지 않고 늘어나는 결과를 보였다. 이를 통하여 맥주 효모 엑소좀은 세포독성(cytotoxicity)이 없고 세포증식(Cell proliferation) 효과가 우수하여 세포재생 능력이 있음을 가늠할 수 있다.
본 발명의 일 예의 제조방법에 있어서, 제조된 맥주 효모 추출물과 맥주 효모 엑소좀의 항산화력(DPPH assay)을 비교 평가한 결과, 모든 농도에서 추출물보다 엑소좀의 항산화 능력이 우수하였다. 즉 자유라디칼 소거율이 높아질수록 항산화 효과가 높아짐을 의미한다.
본 발명의 일 예의 제조방법에 있어서, 제조된 맥주 효모 추출물과 맥주 효모 엑소좀의 멜라닌 합성 저해능을 비교 평가한 결과, 추출물보다 엑소좀의 멜라닌 합성 저해 효과가 우수하여 엑소좀이 미백 효과가 더 높은 것으로 확인하였다.
따라서 항산화 또는 항염증이 요구되거나, 피부미백 및 피부재생 효과를 위한 화장품 분야에 적용될 수 있다.
본 발명의 다른 구체 예는 전술한 바와 같은 제조방법을 이용하여 맥주 효모로부터 제조된 추출물과 엑소좀 및 이를 포함하는 화장료 조성물로 제조될 수 있다. 여기서 화장료 조성물은 전체 중량에 대해 상기 맥주 효모 엑소좀을 0.1 내지 10.0 중량%, 바람직하게는 1.0 내지 5.0 중량% 정도 포함하는 것이 좋다.
상기 화장료 조성물에는 엑소좀 이외에 기능성 첨가물 및 일반적인 화장료 조성물에 포함되는 성분이 추가로 포함될 수 있다. 상기 기능성 첨가물로는 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 성분을 포함할 수 있다. 이외에 포함되는 배합 성분으로서 는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.
상기 화장료 조성물은 제형이 특별히 한정되지 않으며, 목적하는 바에 따라 적절히 선택할 수 있다. 예를 들어, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양 크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클린저로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 제형으로 제조될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다.
실시예 1. 본 발명에 따른 엑소좀
사카로미세스 세레비시아(Leibar 회사 효모)로 발효시킨 맥주로부터 엑소좀을 분리하였다. 구체적으로, 43℃에서 45분 동안 합성 완전 배지에서 셰이킹하여 배양 후 유효성분을 고농도로 추출하였다.
상기 추출 배양액을 초고압 나노균질기(high pressure homogenizer, 이를 nanogenizer라고도 부른다)를 이용하여 10,000 psi에서 3회 이상 반복하여 분쇄하였다. 이에 대한 실험결과는 현미경(OLYMPUS, CX-33)으로 관찰하여 맥주 효모의 입자 상태를 관찰하였다(도 1 참조). 분쇄한 후, 이를 먼저 10,000 rpm에서 30분 동안 원심분리(Hanil Science Industrial, Continent 512R Plus) 후 상등액을 한외여과하여 맥주 효모 엑소좀을 채취하였다.
실시예 2. 본 발명에 따른 엑소좀
상기 실시예 1의 초고압 나노균질기의 압력을 15,000 psi로 3회 처리한 점을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일하게 수행하였다.
실시예 3. 본 발명에 따른 엑소좀
상기 실시예 1의 초고압 나노균질기의 압력을 20,000 psi로 3회 처리한 점을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일하게 수행하였다.
실시예 4. 본 발명에 따른 엑소좀
상기 실시예 1의 초고압 나노균질기의 압력을 25,000 psi로 3회 처리한 점을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일하게 수행하였다.
실시예 5. 본 발명에 따른 엑소좀
상기 실시예 1의 초고압 나노균질기의 압력을 30,000 psi로 3회 처리한 점을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일하게 수행하였다.
실시예 6. 본 발명에 따른 엑소좀
상기 실시예 1의 초고압 나노균질기의 압력을 35,000 psi로 3회 처리한 점을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일하게 수행하였다.
도 1의 현미경 사진을 보면, 15,000 psi에서 조금씩 맥주 효모균의 세포벽이 파괴되면서, 30,000 psi 이상부터는 다른 압력과 비교해 볼 때 세포벽이 다수 파괴됨을 알 수 있다. 특히 35,000 psi로 3회 처리 시, 한 개의 맥주 효모균을 제외한 모든 맥주 효모균 세포가 파괴되었음을 확인할 수 있었다. 이 압력 조건이 가장 바람직한 입자 상태를 보여주고 있다.
즉 실시예 6(35,000 psi)에 따라 채취한 맥주 효모 엑소좀의 형상은, 투명한 액상이고 pH는 6.60±0.2이고 평균 입자 크기는 101.5nm이며 수득한 농도는 420,000,000,000 particles/ml 인데, 이는 실시예 2(15,000 psi)에 따라 채취한 엑소좀의 농도 17,400,000,000 partucles/ml 보다 24배로 매우 높다. 이에 대한 구체적인 실험 결과값은 표 1과 도 2에 있다.
| 구분 | 고압범위(psi) | 평균입자크기(nm) | 엑소좀 농도(particles/ml) |
| 실시예 1 | 10,000 | 147.8 | 18,100,000,000 |
| 실시예 2 | 15,000 | 119.8 | 17,400,000,000 |
| 실시예 3 | 20,000 | 102.6 | 112,000,000,000 |
| 실시예 4 | 25,000 | 107.0 | 226,000,000,000 |
| 실시예 5 | 30,000 | 107.2 | 334,000,000,000 |
| 실시예 6 | 35,000 | 101.5 | 420,000,000,000 |
비교예 1. 기존의 방법에 따른 맥주 효모 추출물
이는 맥주 효모의 단순 추출물에 관한 것으로 고압균질기를 사용하지 않았다. 즉 상기 실시예의 엑소좀을 제조하기 위해 사용하였던 효모와 동일한 농도를, 정제수에 혼합 후 70~75℃에서 3시간 동안 추출하였다. 이렇게 얻어진 추출물은 용해되지 않은 고형분을 제거하기 위하여 원심분리와 한외여과를 진행하여 최종적으로 맥주 효모 추출물을 제조하였다.
실험예 1. 세포독성평가(WST-1 assay)
본 발명의 실시예 6을 통하여 제조된 맥주 효모 엑소좀과 비교예 1에서 제조된 맥주 효모 추출물에 대한 세포증식 능력과 세포 생존능력을 확인하기 위하여 WST-1 assay를 실시하였다. 96-well plate의 well 당 1×104 cells/well을 200 μL씩 분주한 후 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 24시간 배양하였다. 배양 후 FBS가 함유되지 않은 DMEM 배지와 실시예 6과 비교예 1을 농도별로 처리하고 24시간 반응시켰다. 각각의 well에 WST-1 용액(Cell Proliferation Reagent WST-1)을 전체의 10%가 되도록 20μL를 넣은 뒤 37℃, 5% CO2 세포배양기에서 2시간 동안 반응 후 Microplate spectrophotometer를 이용하여 450nm, 620nm의 구간에서 흡광도를 측정하였다. 세포의 생존비는 대조군을 기준으로 계산하였다.
그 결과, 맥주 효모 추출물은 10% 농도까지는 Keratinocyte와 Fibroblast 모두 세포가 증식하는 효과를 보였으나, 그 이후의 농도부터는 급격하게 Keratinocyte와 Fibroblast가 감소하는 효과를 보였다. 그러나, 맥주 효모 엑소좀은 농도 의존적으로 Keratinocyte와 Fibroblast 모두 세포가 증식되는 결과를 보여주고 있다(도 3 참고).
실험예 2. 항산화 효과(DPPH Assay)
DPPH법은 DPPH(2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl), free radical이라는 유리기를 사용하여 환원력에 의한 항산화 효과를 측정한다. 실시예 6과 비교예 1에 의하여 DPPH가 환원되어 흡광도가 감소하는 정도를 공시험액의 흡광도와 비교하여 파장 560nm에서 자유라디칼 소거율(%)을 측정한다. 사용한 시약으로서는 2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl), free radical (Sigma aldrich, MW=618.76) 0.1mM 용액으로서 61.88mg을 에탄올에 용해하여 100mL로 한다. 96 well micro plate에 에탄올에 용해한 DPPH 용액 100㎕(0.4mM)과 상기 실시예 6의 엑소좀과 비교예 1의 추출물을 0.0% ~ 100.0%의 농도로 동량의 시료를 가하여 37℃에서 30분간 반응하였다. 반응 후 560nm에서 효소 면역 분석법(Enzyme-linked Immunosorbent Assay, ELISA)으로 흡광도를 측정하여 DPPH radical 소거활성을 측정하였다.
자유라디칼 소거율(%)의 결과는 하기 식에 의하여 산출하였다.
자유라디칼 소거율(%) = 〔1-(St - S0)/(Bt - B0)〕 × 100
St: 시료용액의 자유라디칼 소거 후의 560nm에서의 흡광도
Bt: 공시험용액의 자유라디칼 소거 후의 560nm에서의 흡광도
S0: 시료용액의 자유라디칼 무첨가시 반응 전의 560nm에서의 흡광도
B0: 공시험용액의 자유라디칼 무첨가시 반응 전의 560nm에서의 흡광도
그 결과, 모든 농도에서 비교예 1의 맥주 효모 추출물보다 실시예 6의 맥주 효모 엑소좀의 항산화 효과가 우수하게 확인되었다(도 4 참조).
실험예 3. 멜라닌 형성억제 효과(Melanin contents assay)
상기 실시예 6의 엑소좀과 비교예 1의 추출물을 B16F10 mouse melanoma 세포 배양 배지에 첨가하여 세포 수준에서의 미백효과를 실험하였다. 맥주 효모 추출물과 맥주 효모 엑소좀의 농도는 1.0%, 5.0% 그리고 10.0%가 되도록 하여 B16F10 mouse melanoma의 배양배지에 첨가하여 24시간 동안 배양한 후 부착하여 성장하는 세포를 트립신-EDTA 용액을 처리하여 배양용기로부터 떼어내 원심분리한 후 생성된 멜라닌을 추출하였다. 멜라닌은 상기 추출물과 엑소좀에 1N NaOH 용액 1mL을 가하여 10분간 끓여 멜라닌을 녹인 다음, 상온으로 식혀 분광광도계를 사용하여 400nm에서 흡광도를 측정함으로써 생성된 멜라닌의 양을 단위 세포수 당 흡광도로 나타내었다(104 cells). 대조군(β-arbutin, 1.0%)에 대한 상대적인 멜라닌 생성량을 저해율로 계산하여 그 결과를 도 5에 나타내었다.
그 결과, 맥주 효모 엑소좀은 대조군으로 사용된 단일 성분인 미백 기능성 고시성분인 β-arbutin 보다는 동일 농도에서 멜라닌 생성 낮은 억제 효과를 보였으나, 일반적인 추출물 방법에 의하여 제조된 맥주 효모 추출물보다 동일 농도에서 모두 높은 멜라닌 합성 저해 효과를 보였다. 즉 맥주 효모 엑소좀의 미백효과가 2 내지 4배 이상 우수하다고 볼 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 수율이 향상된 맥주 효모 엑소좀의 제조방법은 초고압 나노 균질기를 이용하게 되어, 세포에서 아직 미배출 된 세포 안에 있는 엑소좀과 이미 세포 밖으로 배출된 엑소좀을 모두 얻게 되므로 생산성과 수득률이 높아지고, 불필요한 세균류 등이 모두 멸균되는 효과가 있어서 피부 독성이 거의 없는 엑소좀을 제공한다.
또한, 당업계에서 사용되는 맥주 효모 추출물과 비교시 세포 독성이 나타나지 않고 농도 의존적으로 세포 증식능력이 매우 우수하였다. 이를 통하여 손상된 각질세포의 재생 능력과 맥주 효모 추출물보다 우수한 항산화력과 미백 효과를 제공한다.
이상에서 본 발명은 실시예를 중심으로 상세히 설명되었지만 본 발명의 기술사상 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속함은 당연한 것이다.
Claims (8)
- 고수율의 엑소좀을 제조하는 방법으로서,
맥주 효모를 상온 내지 43℃에서 15분 내지 60분간 배양하는 단계;
상기 배양액을 초고압 나노균질기(high pressure homogenizer)를 이용하여 30,000~40,000 psi에서 분쇄하는 단계;
상기 분쇄액을 원심분리하는 단계; 및
상기 원심분리 후 상등액을 한외여과하는 단계;를 포함하는 맥주 효모 엑소좀의 제조방법 - 청구항 1에 있어서, 상기 분쇄하는 단계를 3회 이상 반복 수행하는 맥주 효모 엑소좀의 제조방법
- 청구항 1에 있어서, 상기 맥주 효모는 사카로미세스 세레비시아인 맥주 효모 엑소좀의 제조방법
- 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항의 제조방법으로 제조된, 100 내지 150 nm 직경의 입자크기를 갖는 맥주 효모 엑소좀
- 청구항 4의 맥주 효모 엑소좀은, WST-1 assay에서 각질형성세포와 섬유아세포의 생존율이 높아지는 것을 특징으로 하는 피부 재생용 화장료 조성물
- 청구항 4의 맥주 효모 엑소좀은, DPPH assay에서 자유라디칼 소거율이 농도 의존적으로 높아지는 것을 특징으로 하는 항산화용 화장료 조성물
- 청구항 4의 맥주 효모 엑소좀은, 멜라닌 형성 저해율이 농도 의존적으로 높아지는 것을 특징으로 하는 피부미백용 화장료 조성물
- 청구항 5 내지 청구항 7 중 어는 한 항에 있어서, 상기 화장료 조성물의 전체 중량에 대해 상기 맥주 효모 엑소좀을 1.0 내지 5.0 중량% 포함하는 화장료 조성물
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| KR101927701B1 (ko) | 2018-02-23 | 2018-12-11 | 아이큐어 주식회사 | 디이노코커스 라디오두란스 추출물의 제조방법 및 이의 응용 |
| KR102008667B1 (ko) | 2017-11-02 | 2019-08-08 | 주식회사 엑소코바이오 | 안정화된 엑소좀의 필러 조성물 |
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Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101807081B1 (ko) | 2015-12-22 | 2017-12-08 | 박민선 | 사카로미세스속 효모분해 추출물 및 그의 제조방법 |
| KR20180003344A (ko) | 2016-06-30 | 2018-01-09 | (주)아모레퍼시픽 | 효모 유래 세포밖 소포체를 포함하는 항염 조성물 |
| KR101895916B1 (ko) | 2017-08-11 | 2018-09-07 | 주식회사 엑소코바이오 | 엑소좀 및/또는 세포외 소포체 및 이를 포함하는 조성물의 제조 방법 |
| KR102008667B1 (ko) | 2017-11-02 | 2019-08-08 | 주식회사 엑소코바이오 | 안정화된 엑소좀의 필러 조성물 |
| KR101927701B1 (ko) | 2018-02-23 | 2018-12-11 | 아이큐어 주식회사 | 디이노코커스 라디오두란스 추출물의 제조방법 및 이의 응용 |
| KR102125567B1 (ko) | 2019-07-02 | 2020-06-22 | 한양대학교 에리카산학협력단 | 식물 엑소좀의 대량 생산 방법 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 안인숙 외 8인, "B16F10 Mouse Melanoma 세포에서의 L-cysteine에 의한 멜라닌 생성 억제", 대한피부미용학회지 제5권 제2호, p239~246, 2007. |
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