KR101814523B1 - 미세조류 추출물을 이용한 기능성 화장료 조성물 및 그 제조방법 - Google Patents

미세조류 추출물을 이용한 기능성 화장료 조성물 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 미세조류 추출물을 이용한 기능성 화장료 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다. 본 발명은 미세조류로부터 유래된 기능성 물질을 포함하는 화장료 소재의 대량 양산화가 가능하고, 피부 주름 개선 및 미백 개선 등의 기능성 효과가 우수한 화장료 조성물 및 그 제조방법을 제공한다.

Description

미세조류 추출물을 이용한 기능성 화장료 조성물 및 그 제조방법 {FUNCTIONAL COSMETIC COMPOSITION USING MICROALGAE EXTRACTS AND METHOD FOR MANUFACTURING THE SAME}
본 발명은 미세조류 추출물을 이용한 기능성 화장료 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 미세조류로부터 유래된 기능성 물질을 포함하는 화장료(화장품) 소재의 대량 양산화가 가능하고, 피부 주름 개선 및 미백 개선 등의 기능성 효과가 우수한 화장료 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.
피부의 주름 및 노화 등의 원인에는 여러 가지가 있지만, 일반적으로 피부에 유해한 과산화지질의 증가와 색소 침착 등의 이유로 주름이나 노화 등이 발생하는 것으로 알려져 있다. 또한, 피부의 혈액순환이 좋지 않은 경우, 영양이 불충분한 경우, 진피속의 탄력 섬유질이 퇴화 및 위축되는 경우, 수분이나 피부 지방의 감소 유발하여 유해 산소인 활성산소에서의 자유라디칼이 생성되는 경우, 콜라겐이 부족한 경우, 및 탄력섬유질의 분해 요소인 엘라스라제의 활성이 증가한 경우 등 각종 다양한 원인에 의해 피부의 탄력성과 모공의 수축성이 약화되어 피부 주름이나 노화 등이 발생하는 것으로 알려져 있다.
피부의 미용과 건강에 관한 관심이 급증하는 가운데 피부의 주름 및 미백 개선 등을 위한 기능성 화장품이 다양하게 개발되어 왔으며, 그 연구가 활발히 진행되고 있다. 예를 들어, 레티놀(비타민 A), AHA(a-hydroxy acid) 및 아데노신 등은 콜라겐의 합성을 증가시키고, 표피 각화 과정을 정상화시켜 피부재생에 기여하는 물질로 많이 사용되고 있다. 또한, 피부 미백을 위한 기능성 물질로서는 알부틴(arbutin), 아스코빌글루코사이드 및 마그네슘아스코빌포스페이트 등이 있다.
그러나 대부분의 화학 제품 및 합성 제품은 화장료 제형에 균일하게 분산되기 어렵거나 눈에 대한 자극성, 임산부 사용제한, 부스럼증 및 가려움증(소양증) 등의 부작용이 있다. 이에, 피부 주름이나 미백 등의 개선을 위한 기능성 물질로서 합성 제품보다는 천연 소재를 이용한 화장료 제품에 대한 선호도가 크게 증가하고 있다.
최근에는 천연 소재로서 미세조류(microalge)를 화장료 조성물에 이용하는 기술이 시도되고 있다. 예를 들어, 대한민국 공개특허 제10-2009-0025431호, 대한민국 공개특허 제10-2012-0041404호, 대한민국 등록특허 제10-1410632호 및 대한민국 등록특허 제10-1502359호 등에는 미세조류로부터 유래된 기능성 물질(추출물)을 포함하는 화장료 조성물이 제시되어 있다.
일반적으로, 조류(algae)는 크기를 기준으로 김, 미역 등 수십 미터까지 성장하는 거대조류(macroalgae)와, 식물성 플랑크톤 등 수 마이크로미터 크기의 단세포 생물인 미세조류(microalgae)로 분류되고 있다. 미세조류는 식물 플랑크톤이라는 약 35억 년 전에 지구 해양에 출현한 최초의 생물 중 하나이다.
미세조류는 육상식물을 제외한 모든 광합성 생물의 통칭으로 분류학적 용어는 아니며, 매우 다양한 분류군을 지칭하는 일반 용어이다. 이들 중 현미경으로 관찰할 수 있는 단세포성 조류를 미세조류(microalgae)라 하며, 대부분의 식물성 플랑크톤이 이에 속한다. 미세조류는 지구상에서 전체 광합성의 90%를 담당하는 것으로 추정되고 있며, 지구 생태계의 1차 생산자로 매우 중요한 위치를 점하고 있다. 미세조류는 종류가 다양하고 증식 속도가 빠른 특징을 보유하고 있다. 알려진 것만 4만 종 이상이며, 미등록된 것을 포함하면 30만 종 이상의 종류가 있다고 추정되고 있다. 대부분은 바다 속에서 광합성을 통해 이산화탄소를 흡수하여 산소를 만들어 낸다.
또한, 미세조류는 물, 햇빛 및 CO2 등을 공급해주면 무제한 증식(배양)이 가능하다. 미세조류는 주로 광합성을 통해 세포 성장과 번식을 행하는 식물군 또는 넓은 의미로 일부는 세균으로 분류되고 있으며, 그 종류나 수에 있어서는 매우 다양하고 많다. 일반적으로, 미세조류는 지상 식물보다 훨씬 빨리 성장하고 생균체 생산성이 높은 점, 담수나 해수는 물론이고 빛 에너지를 확보할 수 있는 자연 환경에서는 쉽게 생육된다는 점, 다양한 조류에서 단백질, 지질, 당질 및 색소와 같은 산업적으로 흥미가 있는 생물 고분자 물질은 물론이고 특정의 생리 기능을 갖는 물질을 고농도로 생산할 수 있다는 점 등에서 중요한 생물 산업 소재로서 그 가능성이 충분하다고 할 수 있다. 이에 따라, 미세조류를 이용한 산업적 응용 가능 분야는 폐수처리, 대기 오염 정화(CO2 고정화), 양식 사료, 건강식품 소재, 생리활성 물질 생산, 가공용 소재 및 의약품 소재 등으로 매우 다양하다.
또한, 광합성 미생물인 미세조류는 지상 식물과 마찬가지로 빛을 필수 에너지원으로 하고 CO2를 기질로 하여 유기물을 합성하는 특성을 갖고 있으며, 이의 유기물 생산성은 식물에 비해 4 ~ 20배 가량 높은 것으로 알려져 있다. 미세조류에 의해 생산되는 유기물은 다양한 유용 물질(예: 불포화 지방산, 단백질, 비타민 및 다당류 물질 등)을 함유하고 있어 사용 균주에 따라 생물 의약, 생리 활성물질, 건강 보조식품 및 치어 양식용 사료 등 고부가가치 제품을 생산하는 공정에 활용이 가능하다는 장점이 있다.
이에, 미세조류는 기능성 화장료에는 물론 건강식품, 대체에너지원, 농축수산 양식용 사료, 의약 원료물질의 생산 및 생화학물질의 생산 등으로 그 이용성이 확대되고 있다. 미세조류의 산업적 이용에 대한 본격적 연구는 독일에서 2차 세계대전 중에 규조류의 대량 배양을 통한 식물성 지방과 오일(oil) 생산을 위하여 시작되었다. 이어서 녹조류인 클로렐라(chlorella)와 세네데스무스(scenedesmus)로부터 지방과 단백질 등의 생산에 관한 연구가 광범위하게 이루어졌다.
미세조류의 잠재성이 막대한 만큼 향후 에너지 분야, 화학 분야 및 환경 분야 등을 중심으로 활용성이 확대될 전망이다. 최근, 산업적으로 그 활용성이 증가하고 있는 대표적인 미세조류는 다음과 같다.
(1) 클로렐라(Chlorella)
단세포의 콜로니(colony)형 조류로 가장 널리 연구되어진 미세조류이며, 이는 산업적 이용 범위도 넓다. 무성생식으로 성장한 세포가 4, 8 또는 드물게 16개의 세포로 나누어 져 번식하며, 해수나 담수 모두에 성장하고 어느 곳에서나 쉽게 분리되며, 각기 특성이 다른 여러 종이 소개되고 있다. 이는 외형적인 모양에서뿐만 아니라 성장 요구 물질 또는 성장 특성(유기물질 필요성, 암기 배양 등)에 따라서도 다양한 종이 있으며, 카로테노이드(carotenoid) 색소를 형성하는 중요한 인자로 알려져 있는 염(1 ~ 5% NaCl) 내성도 chlorella sp.의 중요한 분류 특성이라고 할 수 있다.
Chlorella sp .의 화학 조성은 배양조건에 따라 매우 큰 폭으로 변화하는데, 단백질 50 ~ 60%, 당질 15 ~ 25%, 지질 2 ~ 65%로 특히 지질 함량 변화가 심하며, 이때에는 클로로필(chlorophyll) 색소의 함량과 밀접한 관련성을 가지는 것으로 알려져 있고, 구성 성분들의 함량은 chlorella sp .의 종에 따라 매우 다양하다. 또한, Chlorella sp .는 다량의 단백질이 함유되어 있어 건강식품 소재로서 널리 이용되고 있으며, 치어 양식을 위한 먹이로도 국내에서는 널리 이용되고 있고, 배양 성장 중에 만들어지는 일부 물질(CGF :chlorella growth factor)은 유용한 물질로 이용될 수 있다.
(2) 스피루리나(Spirulina)
Spirulina sp .는 다세포로 섬유상(filament)의 시아노박테리아로 나선 모양을 이루고 섬유상의 축을 따라 미끄럼 운동을 한다. 나선은 종에 따라 그 형태가 다르다. Spirulina sp .는 따뜻하고, 얕은 고농도 염수 호수에서 빠르게 성장하는 특징을 가지고 있으며, 일반적으로 아프리카의 알칼리성 염수조에서 쉽게 발견되는 조류이기도 하지만 다양한 환경에서 여러 종류의 Spirulina sp.가 발견되었다.
Spirulina sp .은 단백질, 지질(γ- linolenic acid), 비타민(B-12, B-2), 미네랄, 색소(β-carotene, 단백색소 등) 등의 성분이 풍부하고, 이들이 가지는 특이한 성분은 질병 치료, 치료식이, 상처치료, 호르몬, 항암, 노화현상 조절 및 효소 활성 등에도 유용한 것으로 알려져 있다.
(3) 두날리에라(Dunaliella)
Dunaliella sp .는 단세포로서, 이는 두 개의 섬모를 가져 운동성이 있으며, 다른 미세조류와 마찬가지로 성장에 있어서 온도, 빛 강도 및 이산화탄소 등에 영향을 받는다. Dunaliella sp .는 삼투조절 대사 기구의 이해에 중요한 실마리를 제공하였으며, 이와 관련하여 글리세롤(glycerol)의 함량이 중요한 삼투 조절 물질인 것으로 확인되었다. Dunaliella sp .에 의해 생산되는 중요한 물질 중의 하나가 β-카로텐(β-carotene)인데, 이는 식품 산업이나 기능성 소재로서 생산, 판매되고 있다.
(4) 포르피리디움(Porphyridium)
Porphyridium sp .는 다양한 서식환경에서 성장하며 담수, 염수, 해수뿐만 아니라 습한 토양의 표면 등에서도 성장하는 것으로 알려져 있다. Porphyridium sp.은 황산염으로 구성된 산성 헤테로폴리머(heteropolymer)를 대량 생산하고, 특히 2가 금속이온과 결합하여 매우 큰 분자량을 형성하며, 성장 정지기 동안 대량 다당류가 생산되는 것이 특징이다. 이러한 특징을 이용하여 산업적으로 포르피란(porphyran)류의 다당류를 생산하며, 아울러 균체는 지방산을 생산하기 위한 생물 소재로도 이용되고 있다. 최근에는 포르피란(porphyran) 다당류를 개질(modification)하여 새로운 생리 기능성 소재의 생산을 위한 연구도 진행 중에 있다.
일반적으로, 미세조류는 적정 배양 조건에서 옥외나 밀폐 배양조(광생물 반응기 등)에서 배양하고 있다. 예를 들어, 대한민국 공개특허 제10-2012-0095826호에는 밀폐 구조의 광생물 반응기에서 미세조류를 배양하고, 이후 응집을 통해 수확(회수)하는 방법이 제시되어 있다.
다양한 활용성을 가지는 미세조류를 산업적으로 유용하게 활용하기 위해서는 대량 배양기술이 중요하다. 즉, 미세조류를 화장료(화장품 등), 바이오디젤, 및 식품보조제 등의 분야에 상업적 및 경제적으로 적용하기 위해서는 미세조류를 고밀도로 대량 생산할 수 있는 배양기술이 중요하다. 또한, 미세조류를 배양함에 있어서는 대량 생산은 물론 세포 내의 지질(lipid) 함량이 고려되어야 한다. 즉, 미세조류에 함유된 대부분의 유효한 성분, 특히 생리 활성에 유용한 기능성 물질은 미세조류의 지질에 함유되어 있는데, 이러한 미세조류를 예를 들어 화장료 조성물 등에 저비용으로 적용하기 위해서는 지질 함량을 높여야 한다.
그러나 종래 기술에 따른 배양방법은 대량 생산이 어렵다. 즉, 종래 기술에 따른 배양방법은 미세조류의 세포 성장률 및 바이오매스 생산성이 낮다. 무엇보다, 종래 기술에 따른 배양방법은 배양된 미세조류 세포 내의 지질 함량이 낮다. 이에 따라, 미세조류로부터 유래된 기능성 물질의 추출율이 낮고, 이는 결국 미세조류를 이용한 화장료(화장품)의 대량 양산화을 어렵게 하며, 화장료 제품 자체의 가격을 높이는 문제점이 있다. 아울러, 종래 기술에 따른 미세조류 추출물의 경우, 피부 주름 개선 및 미백 개선 등의 기능성 개선 효과가 낮은 문제점이 있다.
대한민국 공개특허 제10-2009-0025431호 대한민국 공개특허 제10-2012-0041404호 대한민국 등록특허 제10-1410632호 대한민국 등록특허 제10-1502359호 대한민국 공개특허 제10-2012-0095826호
이에, 본 발명은 미세조류의 개선된 배양방법, 및 이를 통하여 미세조류로부터 유래된 기능성 물질을 포함하는 화장료(화장품) 소재의 대량 양산화가 가능하고, 피부 주름 개선 및 미백 개선 등의 기능성 효과가 우수한 화장료 조성물 및 그 제조방법을 제공하는 데에 그 목적이 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 미세조류 배양 반응기의 배양액에서 미세조류를 배양하되, pH 7.5 ~ 13에서 이산화탄소(CO2)의 존재 하에서 배양하는 미세조류의 배양방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 미세조류 배양 반응기의 배양액에서 미세조류를 배양하되, pH 7.5 ~ 13에서 이산화탄소(CO2) 및 유기 탄소원의 존재 하에서 제1배양하는 제1배양 단계와; 상기 제1배양에 의해 질소가 고갈되면, 이산화탄소(CO2) 및 유기 탄소원의 존재 하에서 배양하되, 질소 결핍 배양액에서 제2배양하는 제2배양 단계를 포함하는 미세조류의 배양방법을 제공한다.
이때, 상기 1배양 단계의 배양액 내에 포함된 미세조류의 초기 농도는 0.01 ~ 5.0 g/L이고, 유기 탄소원의 초기 농도는 0.5 ~ 2 g/L일 수 있다. 또한, 상기 제2배양 단계에서는 제1배양에 의해 유기 탄소원이 고갈되면, 유기 탄소원을 주입하되 0.5 ~ 2 g/L의 농도로 주입하고, 유기 탄소원은 글리세롤(glycerol) 및 메탄올(methanol)로부터 선택된 하나 이상일 수 있다. 아울러, 상기 제2배양 단계를 진행한 미세조류는 지질 함량이 30중량% 이상일 수 있다.
또한, 본 발명은, 미세조류를 배양하는 배양공정; 상기 배양공정에서 배양된 미세조류를 추출하여 미세조류 추출물을 얻는 추출공정; 및 상기 추출공정에서 얻어진 미세조류 추출물을 화장료에 혼합하는 혼합공정을 포함하는 화장료 조성물의 제조방법을 제공한다. 이때, 배양공정은 상기 본 발명의 배양방법에 따른다.
아울러, 본 발명은 배양에 의해 세포 내 지질 함량이 30중량% 이상인 미세조류를 추출하여 얻어진 미세조류 추출물을 포함하고, 상기 미세조류 추출물은 주름 개선 및 미백 개선 중에서 선택된 하나 이상을 위한 유효 성분으로 포함된 기능성 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, 미세조류의 대량 배양이 가능하고 미세조류의 세포 성장률 및 바이오매스 생산성이 우수한 효과를 갖는다. 또한, 세포 성장률을 가짐은 물론 세포 내의 지질 함량이 높은 효과를 갖는다. 이에 따라, 본 발명에 따르면, 미세조류로부터 유래된 기능성 물질을 포함하는 화장료(화장품 등)의 대량 양산화가 가능하고, 고함량의 지질에 의해 피부 주름 개선 및 미백 개선 등의 기능성이 우수한 효과를 갖는다.
도 1은 본 발명의 예시적인 실시 형태에 따른 미세조류의 배양장치를 보인 구성도이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따라서 미세조류의 세포성장 및 바이오매스 생산량을 측정한 결과이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따라서 미세조류 배양액에 남은 질소의 양을 측정한 결과이다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따라서 미세조류 배양액의 pH를 측정한 결과이다.
도 5는 본 발명의 실시예에 따라 배양된 미세조류의 생화학적 조성을 측정한 결과이다.
도 6은 본 발명의 실시예에 따라 배양된 미세조류의 세포광학밀도(OD)를 측정한 결과이다.
도 7은 본 발명의 실시예에 따른 미세조류 배양액 중의 질소 농도를 측정한 결과이다.
도 8은 본 발명의 실시예에 따른 미세조류 배양액의 pH를 측정한 결과이다.
도 9는 본 발명의 실시예에 따라 배양된 미세조류의 세포건조중량(DCW)을 측정한 결과이다.
도 10은 본 발명의 실시예에 따라 배양된 미세조류의 바이오매스 생상량과 배양액의 질소농도를 측정한 결과이다.
도 11은 본 발명의 실시예에 따라 배양된 미세조류의 생화학적 조성을 측정한 결과이다.
도 12는 본 발명의 실시예에 따라 인(P) 결핍으로 배양된 미세조류의 생화학적 조성을 측정한 결과이다.
도 13은 본 발명의 실시예에 따라 배양된 미세조류의 세포광학밀도(OD) alc 지질 함량을 측정한 결과이다.
도 14은 본 발명의 실시예에 따라 배양된 미세조류의 세포건조중량(DCW)을 측정한 결과이다.
도 15는 본 발명의 실시예에 따라 배양된 미세조류의 세포광학밀도(OD)를 측정한 결과이다.
도 16은 본 발명의 실시예에 따른 배양액의 유기/무기 탄소원을 측정한 결과이다.
도 17은 본 발명의 실시예에 따른 미세조류 및 배양액의 세포건조중량(DCW), 지질 함량 및 유기/무기 탄소원을 측정한 결과이다.
도 18은 본 발명의 실시예에 따른 미세조류 추출물의 계통 분획 추출 과정을 보인 계통도이다.
도 19은 피부 세포 안정성 시험 결과이다.
도 20은 피부 세포 콜라겐(collagen) 합성 촉진능 시험 결과이다.
도 21은 Tyrosinase 활성 저해 시험 결과이다.
도 22는 본 발명의 실시예에 따른 화장료 조성물의 피부 수분 함유량 측정 결과이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "및/또는"은 전후에 나열한 구성요소들 중 적어도 하나 이상을 포함하는 의미로 사용된다. 본 발명에서 사용되는 용어 "하나 이상"은 하나 또는 둘 이상의 복수를 의미한다.
본 발명은 제1형태에 따라서 적어도 대량 배양이 가능한 미세조류의 배양방법을 제공한다. 본 발명은 제2형태에 따라서 개선된 기능성을 가지는 미세조류 추출물을 포함하는 화장료 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 제3형태에 따라서 미세조류를 이용한 화장료의 대량 양산화가 가능한 화장료 조성물의 제조방법을 제공한다.
먼저, 도 1을 참조하여 본 발명에 따른 미세조류의 배양방법(이하, "배양방법"으로 약칭한다.)을 설명한다.
도 1은 미세조류의 배양장치를 보인 구성도이다. 본 발명에 따른 배양방법은 도 1에 보인 배양장치를 통해 구현될 수 있다. 본 발명에 따른 배양방법은 미세조류 배양 반응기(10)의 배양액에서 미세조류를 배양하는 배양 단계를 포함한다. 이때, 미세조류의 배양 과정에서 pH는 7.5 ~ 13로 유지하여 배양한다. 즉, 배양 반응기(10) 내에 수용된 배양액을 pH 7.5 ~ 13 범위 내로 유지하여 배양한다.
본 발명에 따르면, 배양액의 pH를 위와 같은 범위 내로 유지하여 배양하는 경우, 미세조류의 높은 세포 성장률을 보여 대량 배양이 가능하다. 또한, 미세조류의 종류에 상관없이 일정한 성장률을 보인다. 보다 구체적인 실시 형태에 따라서, 배양 반응기(10) 내의 배양액을 pH 8 ~ 12의 범위 내로 유지하여 배양할 수 있다. 또한, 미세조류의 배양에서 이산화탄소(CO2)의 존재 하에서 배양한다. 도 1을 참조하면, 상기 이산화탄소(CO2)는 이산화탄소 공급조(40)에서 배양 반응기(10) 내로 공급될 수 있다.
본 발명에서, 미세조류의 종류는 특별히 제한되지 않는다. 미세조류는 미세조류 종(species)으로 분류될 수 있으면 좋다. 미세조류는, 예를 들어 앞서 언급한 4종을 포함할 수 있다. 구체적으로, 미세조류는 클로렐라(Chlorella), 스피루리나(Spirulina), 두날리엘라(Dunaliella) 및/또는 포르피리디움(Porphyridium) 등으로부터 선택될 수 있다. 미세조류는 상기 종류 이외에, 다른 예를 들어 세네데스무스(Scenedesmus), 보트리오코커스(Botryococcus) 및/또는 마이크래티니엄(Micractinium) 등을 들 수 있으나, 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
상기 미세조류의 배양에서 다른 조건은 제한되지 않는다. 미세조류의 배양은, 예를 들어 광독립영양(photoautotrophic), 혼합영양(mixotrophic) 및 종속영양(heterotrphic) 등으로부터 선택된 하나 이상의 영양조건에서 배양할 수 있다. 바람직하게는 광독립영양(photoautotrophic) 및/또는 혼합영양(mixotrophic) 조건에서 배양할 수 있다.
도 1을 참조하면, 배양 반응기(10)에는 초기에 미세조류와 배양액이 공급될 수 있다. 이때, 배양액은 배양액 공급조(20)를 통해 배양 반응기(10)의 내부로 주입, 공급될 수 있다. 또한, 배양 반응기(10)에는 공기 공급조(30)와 이산화탄소 공급조(40)가 연결될 수 있다. 이때, 상기 적어도 공기 공급조(30)와 이산화탄소 공급조(40)는 배양 반응기(10)의 하단에 연결되어, 공기와 이산화탄소(CO2)는 배양 반응기(10) 내부에 상향 흐름으로 공급될 수 있다. 이 경우, 블로잉(blowing)에 의해, 배양 반응기(10) 내에서는 순환 흐름이 발생되어 미세조류의 성장이 촉진될 수 있다.
상기 배양액은 제한되지 않는다. 배양액은 통상적으로 사용되는 것을 사용할 수 있다. 배양액은 미세조류의 생장에 필요한 무기 영양원, 유기 탄소원 및/또는 무기 탄소원 등을 포함할 수 있다. 이때, 상기 무기 영양원은 질소(N)와 인(P)의 염을 포함하되, 이들 이외에 다른 무기염을 포함할 수 있다. 이러한 배양액은, 예를 들어 당업계에서 사용되는 영양배지로서, BG-11 등을 사용할 수 있다.
또한, 상기 배양액은, 다른 예를 들어 액체 비료를 사용할 수 있다. 하나의 예시에서, 배양액은, 배양액 1L(리터) 기준으로 총 질소(N) 함량이 60 mg/L 이상, 총 인(P) 함량이 15 mg/L 이상인 용액을 사용할 수 있다. 구체적인 예를 들어, 배양액은 총 질소(N) 함량이 80 ~ 250mg/L, 총 인(P) 함량이 20 ~ 120mg/L인 수용액을 사용할 수 있다. 이때, 수용액은, 증류수는 물론 해수 및/또는 담수를 포함한다.
구체적인 실시 형태에 따라서, 상기 배양액 내에 포함된 미세조류의 초기 농도는 배양액 1L 기준으로, 예를 들어 0.01 ~ 5.0 g/L일 수 있으며, 구체적인 예를 들어 0.5 ~ 2.0 g/L일 수 있다. 상기 배양액은 미세조류의 성장 촉진을 위한 유기 탄소원을 포함하는 것이 바람직하며, 상기 유기 탄소원은 미세조류의 성장을 촉진하는 것이면 특별히 제한되지 않는다. 이때, 상기 유기 탄소원은 배양액 1L 기준으로 0.1 ~ 8 g/L로 포함될 수 있다. 즉, 미세조류의 성장 촉진을 위해, 배양액 내에 포함된 유기 탄소원의 초기 농도는 0.1 ~ 8 g/L일 수 있다. 바람직하게는, 미세조류의 초기 농도가 0.01 ~ 5.0 g/L인 경우, 유기 탄소원의 초기 농도는 0.5 ~ 2 g/L인 것이 좋다.
또한, 상기 배양장치는 배양 반응기(10)의 하측에 연결된 배출 포트(12)(drain port)를 포함하고, 상기 배출 포트(12)에는 미세조류 분리기(51)가 연결될 수 있다. 이와 함께, 미세조류 분리기(51)에는 미세조류 회수조(52)가 연결되고, 상기 미세조류 회수조(52)는 배양 반응기(10)와 연결될 수 있다.
상기 배양 반응기(10)에서 배양이 진행된 후, 미세조류는 배출 포트(12)를 통해 미세조류 분리기(51)로 공급되고, 미세조류 분리기(51)에서는 미세조류와 물이 분리된다. 미세조류 분리기(51)에서는, 예를 들어 침강, 여과 및/또는 응집 등의 방법으로 미세조류가 분리될 수 있다. 미세조류 분리기(51)를 통해 분리된 미세조류는 미세조류 회수조(52)에서 회수(수확), 저장된다. 이때, 미세조류 회수조(52)에 저장된 미세조류는, 경우에 따라 공기 브러워(53)(air blower)을 통해 배양 반응기(10)로 재순환된다. 이러한 재순환의 반복에 의해, 작은 규모의 배양 반응기(10)에서 미세조류를 고밀도로 대량 생산할 수 있다.
상기 배양 반응기(10)는 미세조류의 배양이 가능한 것이면 제한되지 않으며, 이는 원통형 및 탄원형으로부터 선택될 수 있다. 배양 반응기(10)는, 광독립영양양이나 혼합영양을 위해 광조명(도시하지 않음)이 설치될 수 있으며, 상기 광조명은 예를 들어 LED 및/또는 형광등 등으로부터 선택될 수 있다. 또한, 배양 반응기(10)는 외부 오염원의 차단을 위해 밀폐된 상태에서 배양이 진행될 수 있다.
바람직한 형태에 따라서, 본 발명에 따른 배양방법은, 미세조류 배양 반응기(10)의 배양액에서 미세조류를 배양하되, 이산화탄소(CO2) 및 유기 탄소원의 존재 하에서 제1배양하는 제1배양 단계와, 상기 제1배양에 의해 질소가 고갈되면 이산화탄소(CO2) 및 유기 탄소원의 존재 하에서 배양하되, 질소 결핍 배양액에서 제2배양하는 제2배양 단계를 포함한다.
이때, 상기 제1배양 단계에서는 배양액의 pH를 7.5 ~ 13로 유지하여 배양한다. 또한, 상기 제2배양 단계에서도 배양액의 pH를 7.5 ~ 13로 유지하여 배양할 수 있다. 구체적으로, 상기 제1배양 및 제2배양 단계에서는 각 배양액의 pH를 8 ~ 12 범위 내로 유지하여 배양하면 좋다.
본 발명의 바람직한 형태에 따라서, 위와 같이 2단계를 통해 배양을 진행하는 경우, 미세조류의 대량 배양이 가능함은 물론, 바이오매스 생산성과 지질(lipid) 함량이 높은 미세조류를 배양할 수 있다. 일반적으로, 미세조류의 대사(metabolism) 특성상, 최대 바이오매스 생산성과 최대 지질 함량을 동시에 얻기는 어렵다.
그러나 본 발명의 바람직한 형태에 따라서, 상기 2단계를 통해 배양하는 경우, 최대 바이오매스 생산성과 최대 지질 함량을 동시에 구현할 수 있다. 즉, 먼저 상기 제1배양 단계를 통해 최대 성장조건에서 고농도로 미세조류를 대량 배양한 다음, 이후 상기 제2배양 단계를 통해 질소 결핍 조건에 배양하게 되면 높은 지질 함량을 가지는 미세조류를 배양할 수 있다. 이는 하기의 실시예를 통해 확인될 수 있다.
또한, 구체적인 실시 형태에 따라서, 상기 제1배양 단계에서 배양액 내에 포함된 미세조류의 초기 농도는 0.01 ~ 5.0 g/L이고, 유기 탄소원의 초기 농도는 0.5 ~ 2 g/L인 것이 좋다. 그리고 상기 제2배양 단계에서는 제1배양에 의해 유기 탄소원이 고갈되면, 유기 탄소원을 주입하되 0.5 ~ 2 g/L의 농도로 주입하는 것이 좋다. 이와 같이, 제1배양 후에, 유기 탄소원을 재주입하게 되면 미세조류의 성장이 촉진되고 바이오매스의 생산성이 개선된다.
아울러, 상기 제1배양 및 제2배양 단계에서 사용되는 유기 탄소원은, 예를 들어 글루코스(glucose), 글리세롤(glycerol) 및 메탄올(methanol)로부터 선택된 하나 이상일 수 있다. 이때, 상기 글리세롤(glycerol) 및 메탄올(methanol)은 바이오디젤의 생산 공정에서 발생된 부산물을 사용하면 경제적으로 유리하다.
또한, 구체적인 실시 형태에 따라서, 상기 제2배양 단계에서는 제1배양에 의해 질소(N) 및 유기 탄소원이 고갈되면, 질소(N)를 제외한 영양원과 유기 탄소원을 포함하는 질소 결핍 배양액을 배양 반응기(10) 내에 주입하여 배양할 수 있다.
이때, 상기 질소 결핍 배양액은 질산염 등의 질소원을 포함하지 않은 것으로서, 이는 질소(N) 이외의 다른 무기 영양원과 유기 탄소원을 포함하는 것이면 좋다. 구체적으로, 상기 질소 결핍 배양액은 인(P) 등의 무기염을 포함하되, 이들 이외에 다른 무기염 영양원을 포함할 수 있다. 상기 질소 결핍 배양액은, 하나의 예시에서 무기 영양원으로서 인산염 등의 인(P) 화합물과, 유기 탄소원으로서 글루코스(glucose) 및/또는 글리세롤(glycerol)을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시 형태에 따라서, 위와 같은 2단계의 배양 조건으로서, 최대 성장조건(제1배양)과 질소 결핍을 통한 최대 지질 함량 조건(제2배양)을 통해 배양하는 경우, 최대 바이오매스 생산성과 최대 지질 함량을 동시에 구현할 수 있다. 상기 제2배양 단계를 진행한 미세조류는, 예를 들어 지질 함량이 30중량% 이상일 수 있다. 상기 제2배양 단계를 진행한 미세조류의 지질 함량은, 구체적인 예를 들어 30중량% 내지 60중량%, 더욱 구체적인 예를 들어 30중량% 내지 52중량%일 수 있다.
다른 실시 형태에 따라서, 본 발명에 따른 배양방법은 상기 제1배양 단계와 제2배양 단계를 1 사이클(cycle)로 하고, 이러한 1 사이클(cycle)을 2회 이상 수회 반복할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 화장료 조성물의 제조방법은, 상기 본 발명의 배양방법을 포함한다. 구체적으로, 본 발명에 따른 화장료 조성물의 제조방법은, 상기 본 발명의 배양방법으로 미세조류를 배양하는 배양공정과, 상기 배양공정에서 배양된 미세조류를 추출하여 미세조류 추출물을 얻는 추출공정과, 상기 추출공정에서 얻어진 미세조류 추출물을 화장료에 혼합하는 혼합공정을 포함한다.
상기 추출공정은 특별히 제한되지 않는다. 추출공정은, 당업계의 공지된 추출방법에 따르며, 이는 예를 들어 적어도 용매 추출을 포함할 수 있다. 추출공정은, 구체적으로 물 및/또는 유기 용매를 이용한 용매 추출 단계, 상기 용매 추출을 통해 얻어진 추출액을 농축하는 농축 단계, 상기 농축 단계를 통해 얻어진 농축액을 건조(감압 동결 건조 등)하는 건조 단계, 및/또는 상기 추출액, 농축물 또는 건조물을 계통 분획을 통해 기능성 활성 성분을 정제/분리하는 계통 분획 단계를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 미세조류 추출물을 포함한다. 본 발명에 따른 화장료 조성물은, 상기 본 발명의 제조방법을 통해 제조될 수 있다. 이때, 상기 미세조류 추출물은 본 발명의 배양방법을 통해 지질 함량이 30중량% 이상인 미세조류를 추출하여 얻어진 것을 포함한다. 상기 미세조류 추출물은 화장료 조성물에서 주름 개선 및 미백 개선 중에서 선택된 하나 이상을 위한 유효 성분으로 작용한다. 다른 예를 들어, 상기 미세조류 추출물은 화장료 조성물에서 피부 보습 및/또는 자외선 차단 등을 위한 유효 성분으로 작용할 수 있다.
본 발명에서, 상기 미세조류 추출물은 용매 추출을 통해 얻어진 액상의 추출액, 상기 액상의 추출액을 농축한 농축액, 상기 농축액을 건조(감압 동결 건조 등)한 고형 분말, 및/또는 이러한 수득물(액상, 농축, 분말)을 계통 분획을 통해 정제, 분리한 계통 분획물 등을 포함한다. 상기 미세조류 추출물은 본 발명에 따른 화장료 조성물 전체 중량 내에, 예를 들어 0.001중량% 내지 20중량%로 포함될 수 있으며, 구체적인 예를 들어 0.01중량% 내지 10중량%로 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서, 화장료 조성물은, 그 종류나 제형 등은 제한되지 않는다. 본 발명에서, 화장료 조성물은 인체의 피부나 모발 등에 적용되는 것이면 여기에 포함한다. 구체적으로, 본 발명에 따른 화장료 조성물은, 그 제품 형태의 종류에 있어서, 미적 아름다움이나 피부 보호 등을 위한 화장품; 및 피부의 미용과 청결을 위한 피부 세정제; 모발의 청결을 위한 모발 청결제(샴푸, 린스, 비누 등); 모발의 미용을 위한 모발 화장품; 및 탈모를 방지하는 탈모 방지제 등의 제품일 수 있다.
본 발명에 따른 화장료 조성물은, 예를 들어 화장품, 비누, 바디 세정제, 샴푸, 린스, 헤어 스프레이, 헤어젤, 헤어 커디셔닝제 등으로부터 선택된 제품이 될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 그 제형에 있어서 고형, 액상형, 분무형, 연고형 및/또는 젤형 등이 될 수 있으나, 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 화장료 조성물은 상기 미세조류 추출물을 포함하되, 그의 종류나 제형에 따른 화장료 베이스(cosmetic base)를 포함할 수 있다. 상기 화장료 베이스는 특별히 제한되지 않는다. 상기 화장료 베이스는 제품의 종류에 따라 다양하게 조성될 수 있다. 상기 화장료 베이스는, 예를 들어 상기한 바와 같은 화장품, 비누, 바디 세정제, 샴푸 및 린스 등의 베이스 성분으로부터 선택될 수 있으며, 이는 통상과 같이 조성될 수 있다.
상기 화장료 베이스는 수상, 유상 또는 수상과 유상의 혼합 제형을 포함한다. 상기 화장료 베이스는, 예를 들어 피부용 및/또는 모발용 베이스로서, 이는 보다 구체적인 예를 들어 화장품 베이스, 비누 베이스, 바디 세정제 베이스, 샴푸 베이스 및 린스 베이스 등으로부터 선택된 하나 이상의 조성물이 될 수 있다. 또한, 상기 각 화장료 베이스는 제품에 따라 다를 수 있지만, 예를 들어 계면활성제(음이온성, 양이온성, 비이온성, 양쪽 이온성 등), 유화제, 유화 안정제, 글리콜류, 알코올류, 보습제, 컨디셔닝제, 점도 조절제, 킬레이트제, 자외선 차단제, 향료 및 pH 조절제 등으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다. 이러한 각 화장료 베이스 성분은 통상과 같이 조성될 수 있으므로, 이에 대한 구체적인 설명을 생략한다.
또한, 상기 화장료 베이스가 예를 들어 피부 미용용 화장품 조성물인 경우, 상기 화장품 조성물은 액상, 크림상, 페이스트상, 거품상, 젤상 및 고상 등을 포함한다. 구체적으로, 상기 화장품 조성물은 예를 들어 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 아이크림, 아이에센스, 에센스, 클렌징크림, 클렌징로션, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 파우더, 보디로션, 보디크림, 보디에센스, 보디세정제, 연고, 젤, 패취, 분무제, 피부 접착타입 및 푸드 크림(food cream) 등의 제형을 가질 수 있다. 아울러, 화장료 베이스가 비누 조성물인 경우, 이는 액상 또는 고상 등의 비누를 포함한다.
이상에서 설명한 본 발명에 따르면, 미세조류의 대량 배양이 가능하고 미세조류의 세포 성장률 및 바이오매스 생산성이 개선된다. 또한, 우수한 세포 성장률을 가짐은 물론, 세포 내의 지질 함량이 높다. 이에 따라, 미세조류로부터 유래된 기능성 물질을 포함하는 화장료 제품의 대량 양산화가 가능하고, 고함량의 지질에 의해 피부 주름 개선 및 미백 개선 등의 기능성이 향상된다.
이하, 본 발명의 실시예를 예시한다. 하기의 실시예는 본 발명의 이해를 돕도록 하기 위해 예시적으로 제공되는 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] 미세조류의 배양
미세조류로부터 유용한 물질을 추출하고, 이를 상업화하기 위해서는 먼저 미세조류의 대량 배양이 가능해야 하며, 또한 대량 배양에 적합한 미세조류의 종(species)을 선정하고 배양 조건을 최적화하는 것이 중요하다.
이를 위해, 미세조류로서 Chlorella vulgaris AG10032, Chlorella vulgaris AG30007, Scenedesmus accuminatus, Scenedesmus quadricauda , 및 Botryococcus sp. 이상 5종을 선정하였다. 이들 미세조류는 한국생명공학연구원 생물자원센터로부터 분양받았다. 상기 5종의 미세조류에 대하여 광독립영양(photoautotrophic), 혼합영양(mixotrophic) 및 종속영양(heterotrphic) 조건에서 배양하여 비교하는 실험을 수행하였으며, 기본 배양배지(배양액)로 BG-11과 PAL-1을 이용하였다. 이때, 배양 시 모든 배지는 외부로부터의 오염을 막기 위해 오토클레이브(autoclave)로 120℃에서 30분간 고압증기를 통해 멸균하여 사용하였다.
BG-11(Allen and Stanier, 1968)은 담수종 미세조류를 광독립영양 조건에서 배양하기에 적합한 영양배지로서, 이는 아래의 [표 1]과 같이 질소원인 NaNO3가 풍부하고 무기 탄소원으로 Na2CO3가 함유되어 있으며 미량원소로 수용성 붕소, 몰리브덴 등 6종이 함유되어 있다.
PAL-1은 액체 비료(Liquid fertilizer)로서, 이는 아래의 [표 2]와 같이 미세조류의 성장에 적절한 N, P 등의 영양염 및 탄소원이 함유되어 있다. 이를 배양액(배양배지)으로 사용하기 위해 0.45 ㎛의 필터(filter)로 여과하였다.
< BG-11 배양배지의 조성 >
Composition of BG-11 medium
Component Final Concentration (M)
NaNO3 1.76 x 10-4
K2HPO4 1.75 x 10-4
MgSO4·7H2O 3.04 x10-4
CaCl2·2H2O 2.45 x 10-4
Na2CO3 1.89 x 10-4
Citric acid 3.12 x 10-4
Ferric ammonium citrate 3.00 x10-4
Na2EDTA 2.79 x 10-4
H3BO3 4.63 x 10-5
MnCl2·4H2O 19.15 x 10-6
ZnSO4·7H2O 7.65 x 10-7
Na2MoO4·2H2O 1.61 x 10-8
CuSO4·5H2O 3.16 x 10-7
Co(NO3)2·6H2O 1.70 x 10-7
< PAL-1 배양배지의 조성 >
Component Concentration (mg/L)
T-N 85 - 105
NO3-N 55 - 65
NH4-N 6 - 8
PO4-P 30 - 35
COD 200
TOC 231
상기 5종의 각 미세조류에 대하여, 각 영양조건(광독립영양, 혼합영양, 및 종속영양)에 따라 다음과 같이 배양 실험을 수행하고, 이후 배양된 미세조류 및 배양액에 대하여 분석을 진행하였다.
1. 미세조류의 배양 실험
먼저, 계대배양(sub-culture)을 위해 클린 벤치(clean bench)에서 무균조작하여 100 mL BG-11 배지가 들어있는 250 mL Erlenmeyer flask에 미세조류를 접종하고, shaking incubator(VS-8480SR, Vision Science, Korea)에서 광도(light intensity) 90 μmol m-2 s-1, 온도 25℃, 교반속도 160 rpm 조건 하에서 배양하였다. 아래의 [사진 1]은 위와 같이 계대배양한 일부 flask 샘플들의 사진이다.
Figure 112016024196665-pat00001
계대배양된 250 mL flask의 미세조류가 성장의 정체기(stationary phase)에 이른 뒤, 실험에 사용할 미세조류 개체수를 충분히 확보하기 위해 미세조류 배양액의 일부를 원심분리기로 고액분리 및 회수하여, 아래의 [사진 2]와 같이 외경 95 mm, 두께 2.5 mm, 유효용량 2 L의 원추형 끝을 가진 원통형 광생물 반응기(conical ended photobioreactor)로 옮겨 배양하였다. 이후, 이와 같은 방법으로 2 L 배양기로 주기적으로 계대배양하되, 배양 중에 사용된 배지를 새로운 배지로 교환해 주었다.
Figure 112016024196665-pat00002
광독립영양(Photoautotrophic) 및 혼합영양(Mixotrophic) 시 공급한 무기 탄소원으로는 CO2 기체(1~5 v/v %)를, 혼합영양 및 종속영양(Heterotrophic) 시 공급한 유기 탄소원으로는 기본적으로 글루코스(glucose)를 이용하였고 글리세롤(glycerol) 및 메탄올(methanol) 등의 다른 유기 탄소원의 영향을 비교하는 실험을 수행하였다.
종속영양 배양실험은 아래의 [사진 3]과 같이 shaker(25℃, 250 rpm) 위에서 1000 mL Flask를 aluminum foil로 빛을 차단한 상태로 수행하였으며, 광독립영양과 혼합영양 배양은 아래의 [사진 4]와 같이 유효용량 1 L의 원추형 광생물반응기(6.5 x 37 cm)를 이용하여 배양하였고, 반응기 하부에서 0.1 vvm의 비율로 0.2 μm PTFE 막(membrane)을 통해 멸균된 공기와 혼합된 CO2를 공급하였다. 이때, 종속영양 배양을 제외한 다른 배양실험에서는 인공광원으로 백색 형광등을 이용하여 120 ~ 150 μmol/m2/s의 광도로 24시간 연속적으로 빛을 공급하였다.
Figure 112016024196665-pat00003
Figure 112016024196665-pat00004
2. 분석 방법
(1) 세포건조중량(DCW) 및 세포광학밀도(OD)
각 배양실험에서 미세조류의 성장속도 및 바이오매스 생산성을 확인하기 위하여, 세포건조중량(Dry cell weight, DCW)과 세포광학밀도(Optical density, OD)를 측정하였다.
세포건조중량(DCW)을 측정하기 위해 미세조류 배양액(culture broth)의 일부를 배양중인 반응기로부터 취하여, 이 중 정확히 5.0 mL을 원심분리기로 고액분리한 후 증류수로 세척한 뒤 미리 80℃의 건조기(drying oven)에서 12시간 동안 건조시키고 무게(W0)를 측정한 다음, 셀룰로오스 필터(Cellulose nitrate filter)(47 mm, 0.45 ㎛)로 여과하였다. 여과한 뒤 같은 조건의 건조기(drying oven)에서 건조시키고 데시케이터(desiccator)에 보관하여 실온까지 냉각시킨 후 무게(W1)를 측정하였다. 세포건조중량(DCW)은 W1에서 W0를 뺀 값으로 평가하였다.(DCW = W1 W0)
세포광학밀도(OD)는 미세조류 개체수의 밀도를 간접적으로 측정하기 위한 방법이다. 세포광학밀도(OD)는 미세조류 배양액 시료로부터 1.0 mL을 취하여 증류수(distilled water)로 정확히 10배 희석하여 흡광광도계(Spectrophotometer, DR4000U, Hach, USA)를 이용하여 680 nm와 750 nm의 파장에서 각각 측정하였다.
(2) 질소 농도
미세조류 배양액 중의 질소 농도(Nitrate concentration)는 미세조류의 성장 및 생화학적 조성 변화에 영향을 미치는 중요한 요소이므로, 미세조류의 배양 시 질소농도 변화의 모니터링은 필수적이라 할 수 있다. 이에, 질산성질소(nitrate-nitrogen, NO3 -) 형태로써 검출되는 질소를 표준 방법(Standard Method) (APHA,1995)에 따라 측정하였다. 즉, 질소 농도는 배양액으로부터 취한 시료(sample)를 0.45 ㎛의 필터(syringe filter)(Whatman, UK)로 여과하여 미세조류 세포 및 협잡물(suspended solids)를 제거한 뒤 증류수를 이용하여 50배 희석하여 측정하였다. 이때, 측정 파장에서의 간섭물질을 산화시키기 위해 희석액에 1N의 HCl(1:50, HCl:sample v/v)을 넣고 voltex mixer를 이용하여 섞어준 뒤, 220 nm와 275 nm에서 흡광도(Absorbance)를 측정하여 미리 작성한 검량선 식에 대입하여 농도를 정량하였다.
(3) 생화학적 조성 및 지방산 등
미세조류의 생화학적 조성 및 지방산 분석을 위하여 일정량 회수된 바이오매스에 대하여, NREL(National Renewable Energy laboratory)의 Moisture-free biomass sample 준비방법(Wychen and Laurens, 2013)에 따라 40℃의 진공 오븐(vacuum oven)에서 24시간 동안 진공 건조하였고, 막자 및 막자사발을 이용하여 곱게 갈아 균질화하였다. 균질화된 미세조류 바이오매스의 수분을 완전히 제거하고 무게를 측정하기 위하여 다시 40℃ 진공 건조기에서 6시간 건조하였고, 건조 후에는 공기 유입을 차단한 채로 데시케이터(desiccator)에 보관하였다. 아래의 [사진 5]는 이와 같은 과정을 통해 얻어진 하나의 샘플 사진이다.
Figure 112016024196665-pat00005
지질 함량 분석을 위해, 위 건조 바이오매스로부터 정확한 무게를 측정하여 (50.0 mg) 용매 추출하였다. 또한, 탄수화물 및 단백질의 함량 측정을 위해 2.0 mg을 정확히 달아 5.0 mL의 증류수에 용해시켜 분석에 사용하였다. 그리고 지방산 분석을 위해 건조 바이오매스 10.0 mg을 사용하였다.
(a) 지질 분석
지질 추출은 Bligh & Dyer(1959)의 용매추출방법에 따라, 50.0 mg의 미세조류 건조 바이오매스 샘플에 7.5 mL의 혼합용매(Chloroform/methanol/water) (1/2/0.8, v/v/v)를 넣고 추출하였으며, 미세조류 세포내로부터의 원활한 추출을 위해 초음파기( ultrasonicator)(VCS 130, Sonics & Materials IN., CT, USA)를 이용하여 1분 동안 초음파 파쇄(세포 파쇄)를 진행하였다. 여기에 다시 클로로포름(Chloroform) 2.0 mL와 증류수 2.0 mL을 넣고 같은 방법으로 1분 동안 초음파 분쇄한 뒤, 와류 믹서(vortex mixer)를 이용하여 1분간 혼합하고 5분 동안 4500 rpm에서 원심 분리하였다.
원심분리 후, 층 분리된 혼합액 중 지질(crude lipid)이 함유된 가장 아래층(chloroform layer)을, 미리 무게를 측정한 알루미늄 접시에 피펫을 이용하여 옮기고 80℃의 건조기(drying oven)에 넣어서 클로로포름(chloroform)을 모두 증발시켰다. 아래의 [사진 6]은 알루미늄 접시에 옮겨진 클로로포름층이다. 이후, 데시케이터에 보관하여 실온까지 냉각시킨 뒤 전자저울(GH-200, A&D Company, Japan)로 무게를 측정하였고, 측정된 지질(crude lipid)을 세포 건조중량의 무게%로 나타내었다.
Figure 112016024196665-pat00006
(b) 탄수화물 분석
탄수화물 함량은 phenol-sulfuric acid method(Dubois et al., 1956)에 따라 분석하였다. 구체적으로, 무게를 정확히 측정한 2.0 mg의 건조 바이오패스(moisture-free biomass sample)를 5 mL 증류수에 용해시키고 잘 섞어준 뒤, 이로부터 0.5 mL을 취하여 유리병(glass vial)에 옮기고 0.5 mL의 5wt% 페놀(phenol) 용액과 2.5 mL의 황산(순도 95wt%)을 주입한 후에 와류 믹서(vortex mixer)에서 1분간 강하게 섞어주었다. 이후, 주황색으로 발색된 것을 확인하고, 약 10분간 상온(25℃)까지 냉각시킨 뒤, 490nm의 파장에서 흡광도를 측정하고 이를 미리 작성한 검량선 식에 대입하여 농도값을 구하였다.
(c) 단백질 분석
단백질 함량은 Lowry method(Lowry et al., 1951)에 따라 770 nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. 구체적으로, 단백질 정량에 필요한 Lowry 용액을 당일 조제하고, 미리 만들어 둔 Solution A는 Na2CO3 20g (2wt%) + NaOH 4g (0.1N)와 Solution B CuSO4·5H2O 1g (0.5wt%) + Sodium potassium tartrate 2g (1wt%)를 50:1의 부피비로 혼합하여 조제하였다. 탄수화물 정량과 같은 방법으로 준비한 미세조류 바이오매스 시료 0.1 mL에 1.0 mL의 준비된 Lowry 용액을 넣고 30초 동안 와류 믹서(voltex mixer)로 혼합하여 10분간 반응시킨 뒤, 0.1 mL의 1N Folin 용액을 넣고 30분간 더 반응시켰다. 파란색으로 발색된 화합물을 770 nm의 파장에서 흡광도를 측정하고, 미리 작성된 검량선 식에 대입하여 농도를 계산하였다.
(d) 지방산 분석
또한, 미세조류 바이오매스의 지방산 분석을 위하여 NREL(National Renewable Energy laboratory)의 Direct-transesterification method (Wychen and Laurens, 2013)에 따라 트랜스에스테르화 반응을 시켰다. 배양액으로부터 회수된 미세조류 샘플은 원심분리기로 고액분리하여 상등액을 버리고 증류수로 1회 세척하여 다시 원심분리 한 뒤 40℃ 진공건조기에서 약 24시간 동안 건조시켰다.
막자 및 막자사발로 곱게 균질화한 후 정확히 10.0 mg을 취하여 유리바이알에 담고 다시 40℃ 진공건조기에서 6시간 건조시켜 수분을 완전히 제거하였다. 트랜스에스테르화 반응을 위해 0.2 mL의 Chloroform/MeOH (2:1, v/v) 혼합용액과 0.3 mL의 0.6 M HCl 용액(in methanol)을 넣어 혼합한 뒤, 85℃에서 1시간 동안 중탕으로 가열하고, 가열 후 최소 15분 이상 방치하여 상온까지 냉각시킨 후, 1.0 mL의 n-Hexane을 넣고 잘 섞어준 뒤 1시간 동안 층 분리(separation)시키고 이로부터 상등액(hexane 층)을 마이크로피펫을 이용하여 GC 바이알에 옮겨 가스 크로마로마토그래피(Gas chromatography) 분석을 준비하였다. 아래의 [사진 7]은 GC 바이알로 옮겨진 일부 샘플들의 사진이다.
Figure 112016024196665-pat00007
상기 GC 바이알로 옮겨진 지방산 함유 n-hexane 층으로부터 미세 주사기(Micro syringe)를 이용하여 정확히 1.0μL을 취하고 Gas chromatography(GC)를 이용하여 지방산 조성을 분석하였다. 분석 장비는 FID detector와 capillary column(30 m x 0.32 mm id x 0.50 ㎛ HP-INNOWAX, Agilient 19091N-213)이 장착된 GC(YL6500 GC, Younglin Instrument, Korea)를 사용하였으며, 다음 조건에서 분석하였다.
< 분석 조건 >
1.0 μL injection at 10:1 split ratio, inlet temperature of 260℃, constant flow of 1 mL/min helium, oven temperature of 140℃ for 5 min, 4 ℃/min up to 240℃ and hold for 10 min, FID temperature of 260℃, flow rate of 300 mL/min zero air, 35 mL/min H2, 20mL/min helium.
또한, 분석을 위한 표준물질로는 FAME mix 14 C8-C24(Sigma Aldrich #18918-1AMP)를 이용하였고, 미리 농도별로 측정/분석하여 Retention Time(RT)과 각 지방산 성분의 농도에 대한 검량선을 소프트웨어(YL-Clarity, Yougnlin Instrument Co., Korea)를 통해 작성하고 동일한 시료를 2회 이상 분석하여 그 평균값을 분석 결과물로 하였다.
(e) 기타 분석
혼합영양(mixotrophic)과 종속영양(heterotrophic) 배양 시 투입된 유기/무기 탄소원의 주입농도와 성장에 따라 감소되는 탄소원 농도의 변화를 모니터링하기 위하여 TC(total carbon, 총 탄소), DIC(dissolved inorganic carbon, 용존무가탄소) 및 COD(화학적 산소 요구량)를 측정하였다.
TC와 DIC는 미세조류 배양액을 0.45 ㎛의 필터(syringe filter)로 여과하고 10배 희석하여 TOC analyzer(TOC-VCSH, Shimadzu, Japan)로 각 3회씩 측정한 뒤 그 평균값을 기록하였고, COD는 같은 방법으로 준비한 시료를 USEPA의 Standard Method (5220 D)에 따라 COD High Range kit(20 to 1,500 mg/L, Hach)를 이용하여 분석하고 흡광광도계(Spectrophotometer)로 흡광도를 측정하여 농도를 정량하였다.
또한, 종속영양 배양을 제외한 모든 실험의 경우 배양 시작 전, 광도계(Light meter, LI-COR, LI-250A, USA)를 이용하여 배양기로 입사되는 인공광원의 광도(light intensity)를 측정하고, 형광등과 반응기 사이의 거리를 조정하여 광도를 모두 일정 범위내로 동일하게 조정하였으며, 배양액 상태를 확인하기 위하여 pH meter로 pH 값을 모니터링 하였다. 종속영양 배양 실험 및 50.0 L 대량배양 실험을 제외한 모든 배양은 온도가 25℃로 유지되는 격리된 배양공간에서 이루어졌다.
3. 미세조류 배양 실험 결과
(1) 영양조건에 따른 바이오매스 생산성
도 2는 미세조류 종(species) 및 영양조건에 따른 세포성장 및 바이오매스 생산량의 비교 결과로서, 이는 배양시간(Cultivation time)에 따른 세포건조중량(DCW) 측정 결과이다. 미세조류 최적 종 선정을 위한 다양한 영양조건에서의 배양 실험 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 5종의 미세조류는 대체로 광독립영양 또는 종속영양 조건보다는 혼합영양 조건에서 더 빠른 성장률을 보였다.
특히, 혼합영양 조건에서 C. vulgaris AG30007의 경우, 15일 평균 바이오매스 생산성은 0.24 g L-1 d-1, 최대 생산성(P max)은 0.40 g L-1 d- 1를 나타내어 가장 높은 바이오매스 생산성을 보였다. 또한, Scenedesmus quadricauda의 경우에도 역시 혼합영양 조건에서 빠른 세포성장을 보였으며, 이는 C. vulgaris AG30007 다음으로 높은 바이오매스 생산성(0.23 g L-1 d-1)을 보였다.
위와 같이, 혼합영양 조건이 다른 영양조건에 비해 바이오매스 생산성(및 세포 성장)이 높게 나타났으며, 특히 C. vulgaris AG30007의 생산성이 다른 종에 비해 높게 나타남을 알 수 있었다.
또한, 도 3은 각 영양조건에서 미세조류가 성장하면서 소모하는 질소의 양을 확인하기 위해 배양액에 남은 질소(Nitrate-nitrogen)를 측정한 결과이다. 도 3에 타난 바와 같이, 광독립영양 조건에서 미세조류의 성장속도가 낮으므로 그만큼 질소의 소모가 적은 것을 확인할 수 있었으며, 혼합영양 조건에서 세포의 성장이 급격히 이루어지기 때문에 약 2주 후에는 배양액 중 질소가 모두 고갈되는 결과가 나타났다.
일반적으로, 종속영양 미세조류는 유기 탄소원을 에너지원 및 탄소원으로 하여 고농도로 성장할 수 있다고 알려져 있으나, 본 실험예에 따르면 C. vulgaris AG10032, AG30007의 경우 배양액 중 질소를 급격히 소모했음에도 불구하고 고농도로 성장하지 못하였다. 따라서 본 실험예를 통해, 종속영양 배양은 C. vulgaris 의 배양조건으로 적합하지 않음을 확인할 수 있었다.
도 4는 영양조건에 따른 배양액 중 pH의 측정값을 보인 결과이다. 미세조류의 배양 시, 성장이 진행함에 따라 pH가 증가하며, pH의 변화에 따라 배양액 중 중탄산(HCO3 -), 탄산(CO3 2-)의 농도가 변화하고, 또한 pH가 급격히 변화할 경우 미세조류의 성장에 저해를 나타냄을 알 수 있었다. 이에, 영양조건별 배양 시 pH를 모니터링한 결과, pH 변화의 범위는 pH 8 내지 pH 12 사이에서 종에 따른 차이가 나타나거나 급격한 변화가 나타나지는 않음을 알 수 있었다. 즉, 본 실험예를 통해, 각 영양조건에서의 배양 시, pH값이 8 내지 pH 12 사이로 유지되면, 미세조류의 종에 상관없이 일정한 성장률을 보임을 알 수 있었다. 하기 [표 3] 내지 [표 5]에 영양조건에 따른 각 항목별 분석 결과(측정 값)를 나타내었다.
< 광독립영양 배양 시 각 항목별 분석 결과 >
OD750nm
elapsed
time(d)		 1 2 3 4 5
0 0.0615 0.062 0.2235 0.0545 0.062
2 0.255 0.28 0.18 0.165 0.19
4 0.46 0.53 0.385 0.27 0.4
7 0.81 0.84 0.665 0.4 0.545
9 1.26 1.54 1.11 0.94 0.775
11 1.475 1.68 1.46 1.13 1.03
14 1.64 1.895 1.75 1.29 1.205
DCW (g/L)
elapsed
time(d)		 1 2 3 4 5
0 0.12 0.08 0.18 0.1 0.1
4 0.42 0.26 0.34 0.24 0.42
7 0.7 0.4 0.74 0.36 0.62
11 1.2 0.76 1 0.94 0.88
14 1.26 0.84 1.22 1.18 1.16
Nitrate (NaNO3 g/L)
elapsed
time(d)		 1 2 3 4 5
0 1.48 1.47 1.48 1.48 1.48
2 1.44 1.48 1.39 1.50 1.45
4 1.39 1.41 1.37 1.38 1.36
7 1.18 1.22 1.18 1.22 1.20
9 1.08 1.10 1.08 1.13 1.12
11 1.09 1.05 1.08 1.13 1.12
14 1.07 1.03 1.09 1.11 1.13
pH
elapsed
time(d)		 1 2 3 4 5
0 7.13 7.27 7.03 7.13 6.54
2 11.01 10.89 11.17 11.32 11.3
4 11.72 11.29 11.56 11.56 11.72
7 11.1 11.47 11.35 11.76 11.76
9 12.22 11.56 11.65 12.1 12.1
11 12.24 11.3 11.4 12.15 12.13
< 혼합영양 배양 시 각 항목별 분석 결과 >
OD750nm
elapsed
time(d)		 1 2 3 4 5
0 0.32 0.09 0.30 0.32 0.31
2 0.56 1.32 1.15 0.58 0.74
4 0.85 1.98 1.55 0.85 1.13
7 1.56 2.44 1.75 1.70 1.73
9 2.20 2.71 1.89 1.95 1.85
11 3.16 3.26 3.18 2.48 2.98
14 4.88 5.57 4.69 3.80 3.84
16 4.75 5.76 4.87 4.38 4.22
DCW (g/L)
elapsed
time(d)		 1 2 3 4 5
0 0.40 0.08 0.26 0.36 0.36
2 0.78 0.78 1.06 0.80 1.04
7 1.52 0.96 1.04 1.52 1.56
9 1.74 0.94 1.34 1.66 1.68
11 3.02 1.42 3.02 2.92 3.30
14 4.64 2.60 4.08 4.08 3.66
15 4.50 2.65 4.35 4.59 3.96
Nitrate(NaNO3 g/L)
elapsed
time(d)		 1 2 3 4 5
0 1.44 1.46 1.45 1.46 1.46
2 1.45 1.17 1.17 1.45 1.37
4 1.35 1.11 1.10 1.36 1.16
7 1.12 1.05 1.03 0.99 0.95
9 0.96 0.98 1.03 0.92 0.91
11 0.82 0.94 0.82 0.87 0.62
14 0.08 0.18 0.32 0.11 0.00
pH
elapsed
time(d)		 1 2 3 4 5
0 9.64 8.79 7.76 9.67 8.68
2 11.25 9.93 10.22 11.39 11.48
4 11.74 10.85 11.37 11.76 11.92
7 11.94 11.37 11.25 11.13 11.89
9 11.34 11.44 11.43 12.23 12.12
11 9.33 10.41 9.80 10.28 9.80
14 9.44 9.25 9.33 9.43 9.40
< 종속영양 배양 시 각 항목별 분석 결과 >
OD750nm
elapsed
time(d)		 1 2 3 4 5
0 0.29 0.54 0.28 0.35 0.33
1 0.58 1.19 0.67 0.47 0.62
2 0.46 0.84 0.61 0.34 0.62
3 1.07 1.74 0.92 0.65 1.44
5 1.12 1.43 1.05 0.77 1.33
7 1.09 1.63 1.10 0.94 1.42
9 1.64 3.12 1.86 1.17 2.01
11 1.35 2.27 1.25 1.27 2.03
DCW (g/L)
elapsed
time(d)		 1 2 3 4 5
0 0.36 0.34 0.32 0.58 0.44
1 0.66 0.74 0.64 0.62 0.76
2 0.98 0.96 0.94 0.84 1.12
3 1.30 1.12 0.96 0.94 1.60
5 1.02 0.78 0.68 0.80 1.36
7 1.00 0.76 0.74 0.74 1.32
9 1.64 1.40 1.10 1.20 2.12
11 1.18 1.16 0.80 0.58 1.80
Nitrate(NaNO3 g/L)
elapsed
time(d)		 1 2 3 4 5
0 1.26 1.22 1.25 1.25 1.25
1 1.56 1.47 1.54 1.56 1.51
2 1.59 1.16 1.32 1.54 1.45
3 1.42 0.04 0.43 1.55 1.40
5 1.30 0.00 0.46 1.40 1.28
7 1.15 0.00 0.44 1.15 1.17
9 1.06 0.00 0.00 0.90 1.08
11 0.93 0.00 0.00 0.35 1.04
pH
elapsed
time(d)		 1 2 3 4 5
0 7.42 6.94 7.14 6.48 7.25
1 5.60 6.11 6.02 5.93 6.05
2 5.94 6.40 6.34 5.49 6.23
3 5.86 6.73 6.25 4.80 6.53
5 5.98 7.43 7.35 6.00 6.92
7 6.83 7.52 7.60 6.37 6.89
9 6.45 6.93 6.91 6.60 6.53
11 6.67 7.14 7.16 7.14 6.77
(2) 미세조류 종에 따른 생화학적 조성
위와 같이 5종의 미세조류를 배양하면서, 생화학적 조성(biochemical composition)에 어떠한 변화가 나타나는지 확인하기 위하여 배양 중 약 5일 간격으로 지질(lipid), 탄수화물(carbohydrate), 및 단백질(protein)의 함량을 측정하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다. 이러한 생화학적 조성의 측정방법은 앞서 설명한 바와 같다.
도 5에 나타난 바와 같이, 미세조류의 생화학적 조성은 종에 따라, 그리고 배양시간이 지남에 따라 차이를 보였다. Botryococcus sp.의 경우 지질, 단백질에 비하여 탄수화물 함량이 높은 것으로 나타났으며, 배양 2주 후 탄수화물 함량이 약 40wt%에 달하는 것으로 나타났다. 또한, C. vulgaris AG10032의 경우 초기 지질 함량이 약 28wt%로 탄수화물 및 단백질의 함량보다 약간 높게 나타났으나, 배양 시간이 지남에 따라 지질 함량은 감소하고 탄수화물 및 단백질의 함량이 다소 증가하는 것으로 나타났다.
Scenedesmus accuminatus와 Scenedesmus quadricauda 의 경우, 다른 미세조류 종들에 비해 지질 함량이 상대적으로 낮게(20wt% 이하) 나타났지만 탄수화물 함량은 높게(최대 45wt%) 나타났다. 그리고 앞서 바이오매스 생산성이 가장 높았던 C. vulgaris AG30007의 경우 배양 2주 동안 지질 함량이 약 20 ~ 30wt% 범위 내로 유지되었으며, 이는 다른 종들에 비해 대체로 높은 지질 함량을 보였다.
따라서, 바이오매스 생산성 및 지질 함량을 종합적으로 고려할 경우, 상기 5종의 담수종 중 C. vulgaris AG30007이 비교적 높은 바이오매스 생산성을 보임과 동시에 지질 함량도 다른 종에 비하여 높게 나타났다. 이에, C. vulgaris AG30007은 향후 대량 배양 및 그 활용에 적합할 것으로 판단되어, 미세조류로서 상기 Chlorella vulgaris AG30007을 최적 종(species)으로 선정하였고, 이하의 실험에서는 모두 C. vulgaris AG30007에 대하여 수행하였다.
(3) 50 L 대량 배양 시 C. vulgaris의 바이오매스 생산성
위와 같이 미세조류의 최적 종(species)으로서 C. vulgaris AG30007을 선정하고, 앞선 배양 실험의 영양조건에서 가장 양호한 결과를 보였던 혼합영양 조건에 배양하였다. 이때, 실험실 규모인 2 L 보다 더 큰 규모로 확장하여 배양하기 위해, 도 1에 보인 바와 같이 설계된 배양장치를 이용하였다. 이때, 상기 배양장치는 폴리카보네이트(PC, polycarbonate) 재질의 직경 72 cm, 높이 107 cm, 두께 8 cm로 제작된 50 L 타원형 광생물반응기(Photobioreactor)가 설치되고, 광생물반응기 하부의 에이어레이션 포트(Aeration port)를 통해 이산화탄소 및 공기가 주입되어 배양액의 혼합이 이루어지며, 배양 후 가동을 멈추고 일정 시간동안 자연 침강 시킨 후 하부의 배출 포트(drain port)로 미세조류 농축액을 회수할 수 있다는 점 등에서 운전조건의 제어가 쉬운 장점이 있다.
상기 타원형 50 L 광생물반응기에 미세조류를 배양하기 위하여 미리 작은 규모에서 배양된 C. vulgaris AG30007를 초기농도 약 0.05 ~ 0.08 g L-1의 범위로 접종(inoculum)하고, 교반 및 이산화탄소 공급을 위해 송풍 펌프(air pump)를 이용하여 0.5 vvm의 유속으로 에이어레이션(Aeration)하였다. 인공광원으로는 배양기 뒤편에 있는 LED 조명을 이용하였고, 광원에 장착된 제어판으로 광도를 약 200 μmol/m²/s 로 조절하여 빛을 조사하였다. 또한, 기본 배양액(배양배지)으로는 무기 탄소원이 포함된 BG-11을 사용하였으며, 혼합영양 조건을 유지하기 위하여 유기 탄소원으로 글루코스(glucose)를 공급하였고, 원활한 세포성장을 위해 일정기간 배양 후 글로코스(glucose)를 재주입하여 배양하였다.
약 15일간 배양하며 모니터링 한 결과, 세포농도(DCW, 건조중량)는 초기 0.08 g L-1 에서 배양 2일 후 0.94 g L-1 d-1로 크게 증가하였으며 약 1주일 동안 평균 바이오매스 생산성은 0.2 g L-1 d- 1를 유지하는 결과를 나타내었다. 그리고 구간 최대 바이오매스 생산성(P max)은 배양 2일 후 약 0.43 g L-1 d- 1 로 나타났다. 이러한 50 L 대량 배양 시의 각 항목별 평가 결과를 도 6 내지 도 9에 나타내었다. 도 6은 세포광학밀도(OD), 도 7은 배양액 중의 질소 농도, 도 8은 배양액의 pH 변화, 도 9는 바이오매스 생산성으로서의 세포건조중량(DCW)을 측정한 결과이다.
따라서, 50 L 배양기를 이용하여 미세조류 바이오매스를 생산할 경우, 혼합영양 조건에서 적정 pH를 유지해 주고, 배양 과정에서 세포광학밀도(OD) 및 유기탄소원 농도를 측정하여 모니터링하면서 적절한 시기에 유기 탄소원(예, glucose 등)을 재주입하면 대량 배양이 가능하고 높은 생산성을 가짐을 알 수 있었다.
(4) 지질 함량 증진
C. vulgaris AG30007의 지질 함량을 증가시키기 위하여 다음과 같이 질소 결핍, 인 결핍, NaCl 첨가, 다양한 유기 탄소원으로서 글리세롤(glycerol)과 메탄올(methanol) 등의 첨가에 의한 C. vulgaris의 지질 함량 변화를 알아보았다.
(a) 질소(N) 결핍
배양 중 질소원이 완전히 결핍되었을 때 C. vulgaris의 지질 함량이 어떻게 변화하는 지를 알아보기 위하여 배양액 중 질소원이 고갈되기 전과 후를 포함하여 약 2주간 광독립영양(Photoautotrophic) 및 혼합영양(Mixotrophic) 조건 하에서 C. vulgaris 를 배양하였다. 그리고 각 경우에 대해, 바이오매스 생상량(세포건조중량, DCW)과 질소농도를 측정하고, 그 결과를 도 10에 나타내었다. 또한, 각 경우에 대하여 지질, 탄수화물 및 단백질의 함량을 측정하고, 그 결과를 도 11에 나타내었다.
먼저, 도 10에 나타난 바와 같이, 미세조류의 세포성장에 따라 배양액 중 질소원이 배양 4일 이내에 모두 고갈되었으며, 혼합영양 조건의 경우 광독립영양 조건에서보다 세포성장이 빠르게 일어나며 질소고갈 역시 2일 내에 빠르게 일어남을 알 수 있다. 또한, 도 11에 나타난 바와 같이, 질소원이 완전히 결핍되기 시작한 2일에서 4일부터 그 이후로, C. vulgaris 의 지질 함량이 증가하기 시작하였으며 초기 약 15wt%에서 최대 50.1wt%에 이르렀고(혼합영양 배양), 유기 탄소원이 공급되지 않은 광독립영양 조건에서도 지질 함량이 최대 48wt%까지 증가하였다. 또한, 도 11에 나타난 바와 같이, 지질 함량이 증가함과 동시에 탄수화물 및 단백질 함량은 감소하였다.
상기 결과를 통해, 미세조류는 광독립영양이나 혼합영양 조건에 상관 없이 배양액 중 질소(N)가 결핍되는 스트레스 환경조건에 놓일 경우 탄소흐름(carbon flux)를 변경하여 탄수화물과 단백질을 축적하는 대신 세포내 지질을 축적함을 알 수 있었다.
(b) 인(P) 결핍
또한, 질소(N) 이외의 다른 영양염의 결핍이 C. vulgaris 의 지질 함량을 증가시킬 수 있는지에 대해 알아보았다. 이를 위해, 질소원 다음으로 중요한 인(P)의 결핍조건에 대하여 확인해보는 실험을 수행하였다. 보다 정확한 실험을 위해 같은 영양조건을 두 개의 배양기에 각각 도입하여 실험하였고, 그 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12에 나타난 바와 같이, 인(P)은 배양 5일 이내로 모두 고갈되었으며, 인(P) 결핍에 따른 세포성장의 저해는 크게 나타나지 않았다. 또한 지질 함량은 증가하기보다 오히려 다소 감소하는 결과를 보였다. 따라서, 인(P) 결핍에 의한 C. vulgaris 의 세포내 지질 축적은 일어나지 않음을 알 수 있었다.
(c) NaCl 첨가
또한, 미세조류 배양을 위해 공급하는 질소(N)나 인(P) 이외에, 다른 미량원소들의 주입농도는 상대적으로 낮고, 또한 이들의 결핍이 미세조류의 생화학적 조성 변화에 미치는 영향이 크지 않을 것으로 판단되어, 영양염을 제한하는 실험 이외에 특정 요소를 첨가하여 지질 함량을 증가시킬 수 있는 지에 대하여 실험하였다.
문헌을 통해 고찰해 본 결과, 담수 미세조류의 성장에 스트레스를 주어 지질축적을 일으킬 수 있는 요소로써 염도변화(salinity change)를 적용하는 기술이 제안되어 있어, 이를 확인하기 위해 C. vulgaris를 배양하고 배양 중 세포성장률(OD) 및 지질 함량 변화를 확인하였다. 즉, 고농도로 성장한 미세조류 배양액에 각각 다른 농도범위로 NaCl을 첨가하여 약 72시간 동안 배양한 후, 세포광학밀도(OD) 및 지질 함량을 측정하였다. 그 결과를 도 13에 나타내었다.
도 13에 나타난 바와 같이, 담수(freshwater, NaCl 0 M) 및 저농도의 NaCl (0.1 M) 첨가 조건에서는 C. vulgaris 의 세포성장이 지속되었으나, NaCl 농도가 0.25 M 이상인 경우에는 세포성장이 크게 저하되었으며 배양 72시간에 이르러 세포농도가 1/2 이하로 크게 낮아짐을 알 수 있었다. 또한, 지질 함량은 고농도의 NaCl을 첨가한 조건(0.25 ~ 0.5 M)에서 배양 12시간 후 다소 증가하는 경향을 보였으나, 이후 뚜렷한 지질 축적 경향은 나타나지 않았다. 따라서, NaCl 첨가에 의한 C. vulgaris 의 지질 함량 증가는 크게 나타나지 않으며, 오히려 NaCl의 농도 증가에 따라 세포성장을 저해함을 알 수 있었다.
결과적으로, 위와 같이 질소(N) 결핍 조건에서 지질 함량 증진이 가능하였으며, 인(P) 결핍이나 NaCl 주입을 통해 염도(salinity)를 변화시키는 조건 등은 C. vulgaris 의 지질 함량 증진에 별다른 효과가 없는 것으로 나타났다.
(5) 다양한 유기 탄소원의 활용
또한, 질소(N) 결핍 이외에, 그밖의 다른 어떤 요소들이 미세조류의 배양에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여, 다음과 같이 혼합영양 배양조건 하에서 기존에 투입했던 유기 탄소원인 글루코스(glucose) 대신 다른 종류의 유기 탄소원으로 대체하여 배양하는 실험을 수행하였다.
먼저, 글루코스(glucose)를 대체할 비교적 낮은 가격의 유기 탄소원으로서, 바이오디젤 생산 공정의 부산물인 글리세롤(glycerol)을 투입하여 세포성장 및 바이오매스 생산성을 확인하였으며, 또한 BG-11이나 PAL-1 등의 영양배지 대신 주요 영양염인 질산염(Nitrate)과 인산염(Phosphate)만을 포함한 증류수를 배양액으로 공급했을 때에도 바이오매스 생산성이 향상될 수 있는지에 대해 알아보았다.
즉, 실험의 비교를 위해, (1) 멸균된 BG-11 배지를 이용한 배양액과 (2) BG-11 배지와 같은 농도의 N과 P만 주입한 증류수에서의 배양액을 사용하여 비교 실험하였다. 그리고 각 배양액에 유기 탄소원으로서 글리세롤(glycerol)을 초기 주입농도 1 g/L로, CO2는 2.5v%로 일반공기와 혼합하여 0.2 vvm의 유량으로 공급해주었다. 즉, (1) 멸균된 BG-11 배지에 글리세롤(glycerol)을 1 g/L의 농도로 혼합한 배양액과, (2) 증류수, 질산염(Nitrate) 및 인산염(Phosphate)의 혼합액에 글리세롤(glycerol)을 1 g/L의 농도로 혼합한 배양액을 이용하여, 초기 세포 농도 약 0.2g/L의 혼합영양 배양조건에서 C. vulgaris를 배양하고, 각 경우에 대한 세포성장, 질소농도, pH 변화 등을 측정하였다. 그 결과를 도 14 및 도 15에 나타내었다.
먼저, 도 14에 나타난 바와 같이, 배양 시작 후 약 2일 동안은 두 배양(culture) 모두 비슷한 성장률을 보였으나, 3일째부터 차이를 보이기 시작하였으며, 여러 미량요소를 포함한 BG-11 배지 기반의 혼합영양 배양에서 세포 성장률이 확연히 높았으며, 배양 11일째 세포건조중량(DCW)에서도 결국 큰 차이를 나타내었다.
또한, 세포광학밀도(OD)의 측정 결과에서는 7~9일째 흡광도(680nm) 값이 감소하였으나, 이는 세포성장이 감소한 것이 아니며, C. vulgaris 세포들이 플록(floc)을 형성하며 성장하여 빛의 투과도가 높아지고, 이에 따라 흡광도를 측정했을 때 광학밀도(optical density)가 낮게 평가된 것이다. 결국, 글리세롤(glycerol)의 사용에 의해, 세포광학밀도(OD) 및 세포건조중량(DCW)은 지속적으로 증가한 것이며, 플록(floc)을 형성하며 성장하는 현상은 배양액의 빛 투과도를 높게 하여 세포성장에 장점이 될 수 있다. 또한, 이는 세포 회수 시에도 플록(floc)을 형성한 세포 군집을 손쉽게 회수될 수 있는 추가적인 장점이 있다.
아울러, 도 15에 나타난 바와 같이, 배양액 중 질소농도는 세포성장이 일어남에 따라 감소하였고, 성장률이 비교적 낮았던 증류수 기반의 배양(culture)에서 질소농도 감소율은 예상대로 낮게 측정되었다. 세포성장에 의한 pH 증가는 크지 않았고 pH 범위가 약 7~8로 유지되었다. 배양 1일 후 나타난 pH 증가현상은 중도에 CO2 공급이 중단되어 나타난 현상이며(이산화탄소 가스실린더 고갈), CO2 공급이 재개된 이후 다시 pH가 약 7~8 범위로 돌아옴을 알 수 있었다.
또한, 미세조류가 성장하며 흡수, 고정한 유기/무기 탄소원의 양이 얼마나 되는지 확인하기 위하여 TOC analyzer로 TC(total carbon)와 DIC(dissolved inorganic carbon)를 측정하였다. 그리고 공급된 글리세롤(glycerol)의 농도 감소 확인을 위해 COD(chemical oxygen demand)를 측정하였다. 이의 결과를 도 16에 나타내었다.
도 16에 나타난 바와 같이, 두 배양 모두 1.0 g/L의 글리세롤(glycerol)을 첨가하였을 때 초기 TC 농도 및 COD는 각각 640, 1260 mg/L였으며, 미세조류의 성장에 유기/무기 탄소원이 이용되면서 점차 TC 및 COD 농도도 감소하였다. 배양 11일째 COD의 농도가 약 130 mg/L(BG-11)까지 떨어졌으며, 배양액 중 DIC 농도는 유기 탄소원의 분해 및 이산화탄소의 용해에 의해 점차 증가됨을 확인하였다.
따라서, 위 결과를 통해, 글리세롤(glycerol)은 미세조류의 대량 배양을 증가시킬 수 있음을 알 수 있었다. 또한, 바이오매스 증가 및 탄소원의 소모율을 종합적으로 비교했을 때, 초기 세포 농도가 0.2 g/L 정도일 경우 글리세롤(glycerol)의 첨가농도는 약 1 g/L가 적절하고, 장기간 배양 시 탄소원이 고갈, 소진될 경우, 농도측정 후에 재주입하는 것이 바람직함을 알 수 있었다.
또한, 글리세롤(glycerol) 이외에 다른 유기 탄소원으로서의 메탄올(methanol)은 글리세롤(glycerol)과 마찬가지로 바이오디젤 생산 공정의 부산물이며, 이는 구체적으로 바이오디젤로의 전환 시 투입되고 증류를 통해 다시 회수되어 재이용되는 반응물질이다. 이에, 메탄올(methanol)이 글리세롤과 같이 미세조류의 또 다른 유기 탄소원으로서 쓰일 수 있는지와 지질 함량 증가에 영향이 있는 지를 확인하기 위하여 실험을 수행하였다. 단, 메탄올(methanol)은 세포에 대하여 독성물질이고 고농도로 주입할 경우 세포성장에 큰 저해를 일으킬 것으로 판단되어, 저농도인 3 wt% 이하의 농도범위 내로 메탄올(methanol) 수용액을 투입하고 그 밖의 배양 조건들은 앞선 실험과 같은 조건 하에 수행하여 C. vulgaris의 세포성장, COD 및 지질 함량 변화를 측정하였다. 그 결과를 도 17에 나타내었다.
도 17에 나타난 바와 같이, 메탄올(methanol)의 여러 농도 조건에서 C. vulgaris를 배양한 결과, 약 4일 동안 세포성장이 지속되었으며, COD 농도가 꾸준히 감소한 것으로 보아 미세조류가 메탄올(methanol)을 탄소원으로 사용하여 성장한 것으로 판단된다. 그러나 메탄올(methanol)의 투입여부와 투입농도에 따른 지질 함량의 변화에는 큰 차이가 나타나지 않아 지질 함량의 증가요소로는 작용하지 않았다. 또한, 메탄올(methanol)은 초기 세포 농도 약 0.5 g/L에서 배양 4일 후 최종농도 약 1.5 g/L에 이르며, 평균 바이오매스 생산성 0.25 g/L/d를 나타낸 것으로 보아 위 농도 범위에서 혼합영양 배양 시 유기 탄소원으로 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
위와 같이 다양한 조건에서 미세조류(C. vulgaris)를 배양하고, 이에 대해 세포성장 및 지질 함량 등을 분석, 비교한 결과, 바이오매스 생산성은 유기 탄소원으로서 글루코스(glucose)나 글리세롤(glycerol)을 이용한 혼합영양 조건의 배양 시에 가장 높게 나타났다. 즉, 글루코스(glucose)를 대체하여, 바이오디젤 생산 공정의 부산물로 발생된 글리세롤(glycerol)을 유기 탄소원으로 사용하는 경우에도 바이오매스 생산성이 높게 나타났다.
또한, 글루코스(glucose)와 글리세롤(glycerol)은 반응기 내에 초기 주입 시 0.5 ~ 2 g/L의 농도로 주입하면 충분하며, 이후 배양 중 COD나 TOC 측정을 통해 탄소농도를 확인하여 탄소원이 고갈된 후 동일한 농도로 재주입하는 것이 바람직함을 알 수 있다. 아울러, 바이오디젤 생산 공정의 부산물인 메탄올(methanol)의 경우에도 저농도로 주입된다면 유기 탄소원으로 작용하여 바이오매스 생산성을 개선할 수 있음을 알 수 있다. 즉, 위와 같은 조건으로 미세조류를 배양했을 때, 평균 바이오매스 생산성은 0.2 g/L/d 이상 도달할 수 있음을 알 수 있다.
한편, 미세조류의 대사(metabolism) 특성상 최대 바이오매스 생산성과 최대 지질 함량을 동시에 얻기는 어렵다. 그러나 상기 실험예들에서 확인되는 바와 같이, 최적 성장조건에서 고농도로 미세조류를 먼저 대량 배양한 후, 이후 지질 함량 증진 조건을 도입하여 배양하는 경우, 최대 바이오매스 생산성과 최대 지질 함량을 동시에 구현할 수 있음을 알 수 있다.
즉, 상기 실험예들에서 확인되는 바와 같이, 질소(N) 결핍, 인(P) 결핍, NaCl 공급을 통한 염도변화 및 다양한 유기 탄소원의 공급 등을 비교 실험한 결과, 미세조류(C. vulgaris)의 지질 함량을 최대로 증가시킬 수 있는 요소는 질소 결핍(Nitrate deficient)임을 알 수 있다. 예를 들어, 상기 실험예의 혼합영양 조건에서, 배양 반응기 내의 배양액 중 질소 농도가 고갈된 이후, 약 6일째에 미세조류(C. vulgaris)의 지질 함량이 30wt% 이상(도 11에서, 배양 후 8일째)으로 높게 증가됨을 알 수 있다. 또한, 이후 질소 결핍 조건에서 계속 배양한 결과, 즉 질소(N) 이외의 다른 영양원이나 유기 탄소원의 존재 하에서 계속 배양한 결과, 미세조류(C. vulgaris)의 지질 함량이 최대 50.1wt%(도 11에서, 배양 후 14일째)으로 높게 증가됨을 알 수 있다. 이에 따라, 이 시기의 미세조류를 수확(회수)하는 경우, 고함량의 지질을 함유한 미세조류를 배양/수확할 수 있음을 알 수 있다.
[실시예 2] 화장료 조성물 제조
1. 미세조류 추출 및 분획물
상기 실시예 1의 결과에 기초하여, 가장 양호한 배양 조건을 통해 미세조류를 배양하고, 이를 침강 분리하여 지질이 고함량으로 함유된 고농도 미세조류를 수확(회수)하였다.
구체적으로, 본 실험에서는 미세조류로서 C. vulgaris를 선정하고, 이에 대해 광배양반응기에서 종속영양 조건(광조사/CO2/공기 blower 공급) 및 초기 세포 농도 약 0.2 g/L의 BG-11 배양액을 이용하여, 먼저 최적 성장조건을 위해 유기 탄소원으로서 글루코스(glucose)를 1 g/L로 주입하여 pH 8 ~ 12에서 배양하였다. 다음으로, 일정 기간이 지나 반응기 내 배양액의 질소 농도와 탄소원이 고갈된 것을 측정을 통해 확인하고, 세포 내의 지질 축적을 위해 질소(N)를 제외한 다른 영양염과 글리세롤(glycerol)을 포함하는 질소 결핍 배양액을 0.1 g/L로 주입하여 pH 8 ~ 12에서 계속 배양하였다. 이후, 배양된 C. vulgaris를 침강 분리 및 탈수시켜 최적 성장 및 고지질 함량의 C. vulgaris를 수확(회수)하였다.
상기 수확된 C. vulgaris에 대하여, 통상과 같은 방법으로 메탄올 추출 및 계통 분획을 실시하여 3개의 시료를 얻었다. 이때, 메탄올 추출은 70wt% MeOH 수용액을 이용하여 실온에서 추출을 진행하였으며, 2일간 2회 반복 추출하였다. 이후, 여과를 진행한 다음, 감압 농축하였다. 다음으로, 상기 얻어진 농축물을 증류수에 혼합한 후, 헥산 추출을 진행하였다. 이후, 헥산층을 제거한 여액층(water layer)에 대하여 통상과 같은 계통 분획 추출을 통하여 EtOAc(에틸아세테이트)층, BuOH(부탄올)층, 및 물층을 얻고, 이들 각층으로부터 컬럼 분획기를 이용하여 최종 분획 추출물을 각각 분리/정제하여 회수한 3개의 시료(시료 1, 시료 2 및 시료 3)를 얻었다. 도 18은 위와 같은 계통 분획 추출 과정의 계통도를 보인 것이다.
2. 피부 개선능 평가
상기 얻어진 3개의 분획 추출물 시료에 대하여, 아래와 같이 피부 세포 안정성 시험(세포 독성 시험) 및 피부 개선능을 평가하였다. 아래에서, 시료 1은 EtOAc층에서 얻어진 계통 분획 추출물(도 18에서, #6)이고, 시료 2는 BuOH층에서 얻어진 계통 분획 추출물(도 18에서, #11)이며, 시료 3은 물층에서 얻어진 계통 분획 추출물(도 18에서, #5)이다.
(1) 세포 배양
Human fibroblast (Detroit 551)를 배양 접시의 바닥에 접종한 후 페니실린 (100 IU/ml), 스트랩토마이신 (100 μg/ml), 10% FBS (fatal bovine serum)를 함유하는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지를 넣고 37℃를 유지하며 CO2를 포함하는 배양기 내에서 배양하였다.
(2) 피부 세포 안정성 시험(MTT assay)
fibroblast (Detroit 551 cell)를 96 well plate에 1x104/well의 상태로 분주한 후 세포 배양 조건에서 24시간 배양하였다. 배지를 버리고 PBS로 세척한 다음, 새로운 배지로 갈아주고 상기 시료 1 및 시료 2를 최종 농도 0.01, 0.03, 0.1, 0.5 wt%가 되도록 처리하고, 24시간 동안 배양하였다. MTT 용액(0.5% 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide액)을 각 well에 4 μl씩을 첨가하고, 4시간 동안 배양하였다. 배양액을 제거한 다음 dimethyl sulfoxide (DMSO) 용액 200 μl씩을 넣고 10분간 흔들어 준 다음 100 μl씩 96 well에 취하여 Spectrophotometer로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
세포 독성 정도는 수학식 1에 따라 순수한 물을 사용한 대조군의 흡광 강도를 기준으로 백분율로 표시하였다. 그 결과를 도 19에 나타내었다.
[수학식 1]
Cell viability (%) = (시험군의 흡광도/대조군의 흡광도) x 100
(3) 피부 세포 콜라겐(collagen) 합성 촉진능 시험
콜라겐(Collagen)은 세포 내에서 procollagen으로 합성된 후 세포 외로 분비되어 collagen 섬유로 중합된다. 이때, procollagen의 N-말단 및 C-말단의 propeptide가 endopeptidase에 의해 유리되는 것으로 밝혀졌다. 본 실험에서는, Human procollagen I형의 C-말단 peptide (PIP) 특이항체를 이용하여 세포에서 분비된 배지 내의 procollagen을 검출하고, 이를 통해 콜라겐(collagen) 합성 촉진능을 알아 보았다.
먼저, Fibroblast (Detroit 551 cell)를 48 well plate에 5x104/well의 상태로 분주한 후, 세포 배양 조건에서 24시간 배양하였다. 배지를 버리고 PBS로 세척한 다음, 새로운 starvation 배지로 갈아주고 시료 1 및 시료 2를 최종 농도 0.01, 0.1 및 0.5 wt%가 되도록 처리하였다. 시료 처리 48시간 후, antibody coated microtiter plate를 ice에 둔 상태에서 100 μl의 peroxidase 표식 antibody solution을 각 well에 첨가하였다. Cell이 평판되어 있는 plate의 각 well에서 취한 배지를 원심분리 하여, 상층액 20 μl를 antibody coated microtiter plate의 각 well에 첨가하고 37℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 배지를 제거하여 250 μl의 Ice-cold PBS로 4회 세척한 후, 각 well에 100 μl의 substrate solution을 첨가하고 차광한 상태에서 15분간 실온에서 반응시켰다. 이후, 100 μl stop solution (1N H2SO4)을 첨가하고, 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 도 20에 나타내었다.
도 19 및 도 20에 나타난 바와 같이, 시료 1의 경우, 0.01 wt% 처리시 대조군과 비교하여 약 13% 정도로 PIP 양이 증가하였다. 0.05 wt% 처리의 경우에는 PIP 합성 증가에 영향을 미치지 않않고, 0.1 wt% 처리의 경우에는 Cell cytotoxicity에 의한 독성으로 인한 viability 감소로 감소된 PIP 경향을 확인하였다. 시료 2의 경우, Cell viability에 영향을 미치지 않는 0.01 wt% 농도에서도 대조군과 유사하였고, 0.05 wt% 및 0.1 wt% 처리에 의해서는 viability 감소로 인하여 감소된 PIP 확인하였다.
따라서, 0.01 wt%의 시료 1은 Cell viability에 영향을 미치지 않으면서 PIP 합성을 증가시켜 주름 개선에 효과를 보임을 알 수 있었다.
(4) Tyrosinase 활성 저해 시험
0.1M sodium phosphate buffer(pH 6.8)에 상기 시료 3을 0.1, 0.5 및 1 wt% 농도로 준비하고, 또한 동일한 buffer로 50μg/ml mushroom tyrosinase를 만든 후 아래의 [표 6]과 같이 96 well plate에 넣어 혼합하였다.
비 고 Sample Blank 양성대조군
Sodium phosphate
buffer(pH 6.8)		 50 μl 60 μl 50 μl
Mushroom
tyrosinase		 20 μl - 20 μl
시료 10 μl - 양성대조군 50 μl
그 후 1.5mM L-Tyrosine을 각 well에 20μl씩 첨가하여 혼합한 뒤, spectrophotometer를 사용하여 37℃에서 1시간동안 10분마다 490nm에서 흡광도를 측정하였다. 그리고 아래의 수학식 2에 따라 저해율을 평가하였으며, 그 결과를 도 21에 나타내었다.
[수학식 2]
저해율(%) = 1 (시료용액의 흡광도/대조군의 흡광도) x 100
도 21에 나타낸 바와 같이, tyrosinase의 기질로 L-tyrosine을 사용하여 평가한 결과, 시료 3은 0.1 wt% 처리 시 39%, 0.5 wt% 처리 시 65%, 1wt% 처리 시 88 %의 tyrosinase 활성 억제 효과를 보였다. 시료 3은 양성 대조군으로 사용한 미백기능성 고시원료인 2 wt% Arbutin(34%)과 비교하여, 농도가 증가할수록 tyrosinase 활성 억제능 우수하여, 이는 미백 개선 효과가 매우 우수함을 알 수 있었다.
3. 화장료 조성물의 제조
통상의 크림 베이스에 상기 시료 1 및 시료 2를 혼합하여 크림 제형의 화장료 조성물을 제조하였다. 구체적으로, 하기 [표 7]에 보인 바와 같은 성분 및 함량으로 크림 제형의 화장료 조성물을 제조하였다.
< 화장료 조성물의 성분 및 함량, 단위 중량% >
원료명/상품명 제형예 1 제형예 2
Danisol M 0.15 0.15
Danisol P 0.03 0.03
Propylene Glycol 5.00 5.00
EDTA-2Na 0.02 0.02
Carbopol#980 0.64 0.64
Perfume 0.10 0.10
KF-96 (100cs) 0.10 0.10
KHU 8 0.10 0.10
시료 0.10 0.10
Neo Heliopan E1000 4.50 4.50
Parsol MCX 7.50 7.50
KF-995 5.50 5.50
Al-Stearate 0.50 0.50
Base Ⅴ 8.0 8.0
KSG-16 0.50 0.50
Abil EM 90 2.20 2.20
D.I.Water 5.00 5.00
TEA 1.14 1.14
　시료 1 0.10 -
　시료 2 - 0.10
D.I.Water To 100 To 100
상기 [표 7]에 따른 크림 제형예 1 및 제형예 2를 피부에 도포 적용하여 피부 수분 함유량의 변화를 평가하였다. 피부 수분 함유량은 피부 수분 측정기기로서 Cutometer MPA 580(일본)를 사용하여 피부 표면의 수분 함량을 정전부하 용량계측법으로 측정하는 방법을 이용하였다. 이때, 각 제형예를 도포한 후, 도포 30분, 60분, 120분, 240분, 360분 후의 최초 측정시간 하루에 한번씩 4일 간 측정하였으며, 그 결과를 도 22에 나타내었다. 또한, 대조군(control)으로는 미세조류 추출물(분획물)을 포함하지 않은 것으로서, 이는 시중에서 상용되는 기능성 크림을 사용하였다. 도 22에서, sam-B는 상기 [표 7]의 제형예 1에 따른 화장료 시편이고, sam-D는 상기 [표 7]의 제형예 2에 따른 화장료 시편이다.
도 22에 나타낸 바와 같이, 본 실시예에 따라 미세조류 추출물(분획물)을 포함하는 크림 제형의 화장료는 시중의 대조군에 비하여 피부의 수분 함유량이 높음을 알 수 있었다. 또한, 수분 함유량은 도포 30분 후에 가장 높은 것으로 평가되었다.
10 : 미세조류 배양 반응기 20 : 배양액 공급조
30 : 공기 공급조 40 : 이산화탄소 공급조
51 : 미세조류 분리기 52 : 미세조류 회수조
53 : 공기 브러워

Claims (6)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 미세조류 배양 반응기(10)의 배양액에서 클로렐라(Chlorella), 세네데스무스(Scenedesmus) 및 보트리오코커스(Botryococcus) 종으로부터 선택된 하나 이상의 미세조류를 배양하되, pH 7.5 ~ 13의 배양액에서 이산화탄소(CO2) 및 유기 탄소원의 존재 하에 제1배양하는 제1배양 단계와;
    상기 제1배양에 의해 질소가 고갈되면, pH 7.5 ~ 13의 배양액에서 이산화탄소(CO2) 및 유기 탄소원의 존재 하에 배양하되, 질소 결핍 배양액에서 제2배양하는 제2배양 단계를 포함하고,
    상기 제1배양 단계의 배양액 내에 포함된 미세조류의 초기 농도는 0.01 ~ 5.0 g/L이고, 유기 탄소원의 초기 농도는 0.5 ~ 2 g/L이며,
    상기 제2배양 단계에서는 제1배양에 의해 유기 탄소원이 고갈되면, 유기 탄소원을 주입하되 0.5 ~ 2 g/L의 농도로 주입하고,
    상기 제2배양 단계를 진행한 미세조류는 지질 함량이 30중량% 이상이 되도록 하는 미세조류의 배양방법으로서,
    상기 미세조류의 배양방법은 배양장치를 이용하되,
    상기 배양장치는,
    배양 반응기(10)와,
    상기 배양 반응기(10)에 배양액을 공급하는 배양액 공급조(20)와,
    상기 배양 반응기(10)에 공기를 공급하는 공기 공급조(30)와,
    상기 배양 반응기(10)에 이산화탄소(CO2)를 공급하는 이산화탄소 공급조(40)와,
    상기 배양 반응기(10)의 하측에 배출 포트(drain port)를 통해 연결되고, 미세조류를 분리하는 미세조류 분리기(51)와,
    상기 미세조류 분리기(51)를 통해 분리된 미세조류를 저장하는 미세조류 회수조(52)와,
    상기 미세조류 회수조(52)에 저장된 미세조류를 상기 배양 반응기(10)로 재순환시키는 블러워(53)를 포함하고,
    상기 제2배양 단계에서는 제1배양에 의해 질소 및 유기 탄소원이 고갈되면, 질소를 제외한 영양원과 유기 탄소원을 포함하는 질소 결핍 배양액을 상기 배양 반응기(10) 내에 주입하여 배양하며,
    상기 제2배양 단계에서 주입되는 유기 탄소원은 메탄올(methanol) 및 글루코스(glucose)를 포함하고,
    상기 메탄올(methanol)은 바이오디젤의 생산 공정에서 발생된 부산물인 것을 특징으로 하는 미세조류의 배양방법.
  5. 제4항에 따른 미세조류의 배양방법으로 미세조류를 배양하는 배양공정;
    상기 배양공정에서 배양된 미세조류를 추출하여 미세조류 추출물을 얻는 추출공정; 및
    상기 추출공정에서 얻어진 미세조류 추출물을 화장료에 혼합하는 혼합공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물의 제조방법.
  6. 삭제
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