CN103965143A - 一种从海洋单细胞硅藻提取分离岩藻黄素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及岩藻黄素的提取与分离，具体的说是一种从海洋单细胞硅藻提取分离岩藻黄素的方法。海洋单细胞硅藻藻泥中加入脂溶性提取液震荡混匀后，于低温、黑暗和无氧化条件中提取2-10分钟，离心收集上清提取液，沉淀再次经提取液反复提取，合并上清液经液相色谱法分离，即得高纯度的岩藻黄素；所述提取液的用量为4-6ml/克藻泥。本发明操作简单，分离速度快，岩藻黄素的收率高，为工厂化生产奠定了基础，从而最终用于工厂化的大规模生产。

Description

一种从海洋单细胞硅藻提取分离岩藻黄素的方法
技术领域
本发明涉及岩藻黄素的提取与分离，具体的说是一种从海洋单细胞硅藻提取分离岩藻黄素的方法。
背景技术
岩藻黄素(fucoxanthin)，也叫岩藻黄质或墨角藻黄素，主要存在于褐藻和一些异鞭毛藻(heterokonts)中，是组成它们光收集复合体的重要辅助性色素。其分子式为C42H58O6，CAS登记号为:3351-86-8[CA INDEXNAME:b,b-Carotene,3-(acetyloxy)-6’,7’-didehydro-5,6-epoxy-5,5’,6,6’,7,8-hexahydro-3,5’-dihydroxy-8-oxo-,(3S,3’S,5R,’R,6S,6’R)];结构式为：
近几年的研究表明，岩藻黄素具有重要的药用价值和保健价值。日本学者Murakami于2002年的研究表明，岩藻黄素是哺乳动物复制型DNA聚合酶(Pola)的有效抑制剂。北海道大学细川雅史领导的研究小组发现(2003)，褐藻中的色素成分可以使癌细胞内阻碍癌细胞自然死亡的蛋白质大量减少，因此，具有抑制癌细胞大量增值的功能。他们的实验结果还证明，岩藻黄素抑制癌细胞增值的效果远远超过水果和蔬菜中的色素成分。HayatoMaeda等(2005)的研究结果表明，饲喂岩藻黄素的实验鼠，白色脂肪组织重量显著降低，产热素(thermogenin)表达增加，进而促进白色脂肪细胞内的脂肪的代谢。因此，岩藻黄素具有非常巨大的潜在的开发利用价值，表现在：(1)抗癌类药品的开发与应用；(2)抗衰老药品及化妆品等的添加剂；(3)食品、饮料等的添加剂；(4)水产品的饵料及禽畜饲料；(5)减肥等保健品的开发与应用。
岩藻黄素的大规模提取技术及其应用的研究在国内还没有开展，国内现有的有关岩藻黄素的提取大多是以大型褐藻，如海带、裙带菜等为原材料。这种方法存在以下的缺陷：
（1）费时费力，提取过程要将大藻体磨碎以提高提取效率；
（2）大型海藻如海带等含有大量的多糖和藻胶，影响到色素的提取；
（3）原材料中的岩藻黄素的含量不高，色素提取的得率不高。
硅藻是一类单细胞真核藻类(有的也以相互聚集，以丝状或带状的形式存在)，分布极其广泛，在海水和淡水中都有发现。硅藻是近海的优势类群，对环境的适应能力非常强，生长迅速，条件适宜时能在短时间内积累大量的生物量。据估计，硅藻约占全球初级生产力的20％。硅藻的光合色素主要由叶绿素a，c和岩藻黄素构成，其中岩藻黄素是硅藻主要的捕光色素，含量很高。利用硅藻作为大规模提取岩藻黄素的原材料具有广阔的市场前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种操作简单、速度快、收率高的一种从海洋单细胞硅藻提取分离岩藻黄素的方法。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种从海洋单细胞硅藻提取分离岩藻黄素的方法，海洋单细胞硅藻藻泥中加入脂溶性提取液震荡混匀后，于低温、黑暗和无氧化条件中提取2-10分钟，离心收集上清提取液，沉淀再次经提取液反复提取，合并上清液经液相色谱法分离，即得高纯度的岩藻黄素；所述提取液的用量为4-6ml/克藻泥。
所述藻泥为通过离心或过滤方式沉淀海洋硅藻的藻液，得到藻泥。
所述的海洋单细胞生物为含岩藻黄素的海洋单细胞类生物。所述含岩藻黄素的海洋单细胞类生物为三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)、假微型链球藻(Thalassiosira pseudonana)、梅尼小环藻(Cyclotellameneghiniana)、中肋异菱藻(Anomoeoneis costata)威氏海链藻(Thalassiosira Weissflogii)、中肋骨条藻(Skeletonema costatum)、尖刺拟菱形藻（Psudo-nitzschia pungens）、牟氏角毛藻（Chaetocerosmuelleri）中的一种或几种。
所述脂溶性提取液为甲醇与丙酮的混合液或二甲基亚砜；其中甲醇与丙酮的混合液按体积比计，甲醇：丙酮=1-4：1-4。优选甲醇与丙酮的混合液按体积比计，甲醇：丙酮=1：1。
所述合并后的上清液利用高压液相色谱法对所提取的色素混合物进行分离；流动相为水，甲醇和乙腈，流速为0.75ml/min,收集7-8分钟的洗脱组分，即为岩藻黄素。
更进一步的优选为：通过离心或过滤的方法收集海洋硅藻藻泥，在收集的藻泥中加入脂溶性提取液震荡，使藻细胞与提取液充分接触，而后于0-10度、黑暗（光照度低于10Lx）和无氧（以3-7L/分钟的通气量通氮气）的条件中提取，提取后离心收集上清液，沉淀再经脂溶性提取液再次提取，合并上清液经液相色谱法分离，即得高纯度的岩藻黄素；所述提取液的用量为4-6ml/克藻泥；每次经脂溶性提取液提取的时间为2-10分钟；
所述合并后的上清液利用高压液相色谱法对所提取的色素混合物进行分离，色谱柱是ODS反相色谱柱(Rx-C18)，柱温设为50摄氏度，流动相为水，甲醇和乙腈，梯度洗脱程序为：初始流动相为水(15％):甲醇(30％):乙腈(55％)，终止流动相为水(6％)：甲醇(21％)：乙腈(73％)，流速为每分钟0.75ml，收集7-8分钟的洗脱组分，即为岩藻黄素。
本发明具有如下优点：
1.操作过程简单。本发明所用的提取材料为单细胞海藻，无需研磨，可直接加提取液提取，提取时间短，操作工艺简单，分离效果好。
2.分离速度快。使用高压液相色谱法从含有多种色素的提取液中分离出高纯度的岩藻黄素仅仅只需要不到10分钟。
3.收率高。经过两次提取后，单细胞海藻中的色素被最大程度的提取出来；高压液相色谱法的分离速度快。整个提取和分离过程所用的时间短，因此不会造成岩藻黄素的降解。
4.为工厂化大规模提取和分离岩藻黄素奠定了基础。本发明提出了一种简便高效的从海洋硅藻等含有岩藻黄素的单细胞生物中提取分离得到高纯度岩藻黄素的方法，有助于工厂化大规模提取和分离岩藻黄素工艺的进一步研究，从而最终用于工厂化的大规模生产。
附图说明
图1为本发明实施例提供的从三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)中以甲醇丙酮作为提取液，提取的各种主要色素经过高压液相色谱法分离的结果图。其中岩藻黄素(Fx)的保留时间约为7.4分钟。
图2为本发明实施例提供的从三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)中以甲醇丙酮作为提取液，提取岩藻黄素的色谱分离结果图。整个洗脱时间缩短为9分钟，岩藻黄素的保留时间约为7.4分钟。
图3为本发明实施例提供采用液相色谱法以甲醇丙酮作为提取液分离三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)中得到的岩藻黄素峰的不同时间点的光谱吸收特征图。其中通过归一化后，从岩藻黄素峰上提取的五个时间点在400nm-800nm间的吸收光谱能重合得非常好，说明岩藻黄素峰的纯度非常高。
图4为本发明实施例提供的从假微型链球藻(Thalassiosirapseudonana)中以甲醇丙酮作为提取液，提取岩藻黄素的色谱分离结果图。其中岩藻黄素的保留时间约为7.4分钟。
图5为本发明实施例提供的从三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)中以DMSO作为提取液，提取岩藻黄素的色谱分离结果图。其中岩藻黄素的保留时间约为7.4分钟。
具体实施方式
将实验所用海洋硅藻接种到f/2液体培养基(Guillard RL(1975)Culture of Phytoplankton for Feeding Marine Invertebrates,inCulture of Marine Invertebrates Animals,eds Smith WL,Chanley MH(Plenum,New York),pp 29-60.)中于20℃通空气培养(通气量为60升/分钟)，光照强度为80μmolm-2s-1，光暗周期为16h：8h。
实施例1
将上述培养好的三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)藻液分装至离心管中，平衡后装入离心机进行离心，离心力为3000g，离心时间为5分钟。待离心完成后，去除上清液，合并各管中的藻泥，称重。按照5ml/g的比例加入预冷（0-10度）的甲醇与丙酮混合液作为提取液(甲醇：丙酮=1：1（V/V）)，充分震荡使藻细胞与提取液充分接触，然后放到冰水浴中黑暗浸提5分钟。浸提过程中以3-7L/分钟的通气量充氮气防止氧化。离心收集上清部分，沉淀再次用提取液按照5ml/g的比例提取一次。离心，收集上清。沉淀再进行第三次提取，方法同第二次提取。将三次所得上清液分别用0.22μm孔径的滤膜过滤后直接进液相色谱系统分离，液相系统使用的是Agilent 1200，色谱柱为ODS反相色谱住(Rx-C18)，洗脱时间为30分钟，洗脱条件为：0-15分钟，流动相组成由水(15％)：甲醇(30％)：乙腈(55％)线性梯度至水(0％)：甲醇(15％)：乙腈(85％)；15-17分钟，线性梯度至甲醇(15％)：乙腈(35％)：乙酸乙酯(50％)；17-30分钟，再线性梯度至甲醇(22％)：乙腈(20％)：乙酸乙酯(58％)。柱温设置为50摄氏度，流速为0.75ml/分钟。各种色素的分离结果见图1。根据峰面积分别计算岩藻黄素和叶绿素a的含量，结果见表1。
表1每克三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)中岩藻黄素(Fx)和叶绿素a(Chla)的含量
处理 Fx(μg) Chla(mg) Fx/Chla(mg/mg)
第一次提取 450.726 1.186 0.38
第二次提取 50.594 0.133 0.38
第三次提取 1.082 0.0028 0.39
由表1可知，三角褐指藻的藻泥经过两次短时间提取后，藻细胞中的色素已经几乎全部被提取了出来，占三次提取总量的99.78％，因此，无需再经第三次提取。
由图1可以看出，岩藻黄素的保留时间是7.43分钟，与叶绿素c(保留时间为6.24分钟)，硅甲藻黄素(diadinoxanthin,保留时间为9.99分钟)以及叶绿素a(保留时间为27.95分钟)完全分离开。由于目标产物是岩藻黄素，为了缩短分离时间，提高效率，色谱分离步骤至9分钟即可结束。然后用纯甲醇冲洗色谱柱5分钟以洗掉色谱柱内残余的色素(如硅甲藻黄素和叶绿素a和胡萝卜素等)，然后进行下一次的分离。
实施例2
将培养好的三角褐指藻(Phaeodactylum tricornu tum)藻液分装至离心管中，平衡后装入离心机进行离心，离心力为3000g，离心时间为5分钟。待离心完成后，去除上清液，合并各管中的藻泥，称重。
按照5ml/g的比例加入预冷（0-10度）的甲醇与丙酮混合液作为提取液(甲醇：丙酮=1：1（V/V）)，充分震荡，使藻细胞与提取液充分接触，然后放到冰水浴中黑暗浸提5分钟。浸提过程中充氮气以防止氧化。离心收集上清部分，沉淀再次用提取液按照5ml/g的比例提取一次。离心，收集上清。提取液用0.22μm孔径的滤膜过滤后直接进液相色谱系统分离，洗脱条件为：初始流动相为水(15％):甲醇(30％):乙腈(55％)，终止流动相为水(6％)：甲醇(21％)：乙腈(73％)，洗脱时间为9分钟，走线性梯度，流速为每分钟0.75ml。柱温设置为50摄氏度。色谱分离图见图2。运行完第一个样品后，用纯甲醇冲洗色谱柱5分钟。然后进行下一个样品的分离。如此重复5次，计算岩藻黄素的保留时间的相对标准偏差(RSD)，结果见表2。在岩藻黄素峰的上升阶段和下降阶段各选取两个时间点，加上峰顶点共五个点，提取这五个点400-800nm处的光谱吸收信号进行比对，按照下面的公式计算光谱的匹配程度：
其中，x,y是某一波长下相比较的两个光谱的吸收值，n是所要比较的数据点的数量。匹配因子为0时说明比较的两种光谱完全不匹配，为1000时说明比较的两种光谱是完全相同的。从岩藻黄素峰上提取的五个点的光谱吸收数据比较的结果见图3。
表2液相色谱法分离岩藻黄素的保留时间(RT)及其相对标准偏差(RSD)
进样次数 1 2 3 4 5 均值 标准差 RSD
RT(分钟) 7.372 7.365 7.36 7.380 7.374 7.37 0.0078 0.11％
从表2的结果可以看出，实例2中的液相色谱分离方法具有很高的可重复性，连续5次重复进样，岩藻黄素保留时间的相对标准偏差仅为0.11％。高度可重复的保留时间为目标产物的精确收集提供了保障。
从图3看出，从岩藻黄素峰上选择的五个点的光谱吸收经过归一化后可以非常好地重合在一起，说明这五个时间点上的流出物的光谱吸收特征非常的一致。计算得到的匹配因子为999.996，高于阈值999.980。可以认为从7.245分钟到7.485分钟这段时间洗脱出的是纯度非常高的岩藻黄素。
实施例3
将培养好的假微型链球藻(Thalassiosira pseudonana)藻液分装至离心管中，平衡后装入离心机进行离心，离心力为3000g，离心时间为5分钟。待离心完成后，去除上清液，合并各管中的藻泥，称重。
按照5ml/g的比例加入预冷（0-10度）的甲醇与丙酮混合液作为提取液(甲醇：丙酮=1：1（V/V）)，充分震荡，使藻细胞与提取液充分接触，然后放到冰水浴中黑暗浸提5分钟。浸提过程中充氮气以防止氧化。离心收集上清部分，沉淀再次用提取液按照5ml/g的比例提取一次。离心，收集上清。提取液用0.22μm孔径的滤膜过滤后直接进液相色谱系统分离，色谱分离方法同实施例2。色谱的分离结果见图4。根据峰面积计算岩藻黄素的含量，结果见表3。
表3每克假微型链球藻(Thalassiosira pseudonana)中岩藻黄素(Fx)含量
提取次数 第一次提取 第二次提取 总量
岩藻黄素含量(μg) 432.35 43.62 475.87
实施例4
将培养好的三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)藻液分装至离心管中，平衡后装入离心机进行离心，离心力为3000g，离心时间为5分钟。待离心完成后，去除上清液，合并各管中的藻泥，称重。按照5ml/g的比例加入预冷(0-10度)的二甲基亚砜(二甲基亚砜,dimethyl sulfoxide,DMSO)作为提取液，充分震荡，使藻细胞与提取液充分接触，然后放到冰水浴中黑暗浸提5分钟。浸提过程中充氮气以防止氧化。离心收集上清部分，沉淀再次用预冷的DMSO按照5ml/g的比例提取一次。离心，收集上清。提取液用0.22μm孔径的滤膜过滤后直接进液相色谱系统分离，色谱分离方法同实施例2。色谱的分离结果见图5。根据峰面积计算岩藻黄素的含量，结果见表4。
表4每克三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)中岩藻黄素(Fx)的含量
提取次数 第一次提取 第二次提取 总量
岩藻黄素含量(μg) 470.5 28.64 499.14
以上提取的方法同样适用于采用其它含岩藻黄素的海洋单细胞类生物，如三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)、假微型链球藻(Thalassiosira pseudonana)、梅尼小环藻(Cyclotella meneghiniana)、中肋异菱藻(Anomoeoneis costata)威氏海链藻(ThalassiosiraWeissflogii)、中肋骨条藻(Skeletonema costatum)、尖刺拟菱形藻（Psudo-nitzschia pungens）、牟氏角毛藻（Chaetoceros muelleri）中的一种或几种。
其中提取液中甲醇与丙酮之间的混合比例可在1-4:1-4之间任选，各个比例均能实现本发明目的。

Claims (8)

1.一种从海洋单细胞硅藻提取分离岩藻黄素的方法，其特征在于：海洋单细胞硅藻藻泥中加入脂溶性提取液震荡混匀后，于低温、黑暗和无氧化条件中提取2-10分钟，离心收集上清提取液，沉淀再次经提取液反复提取，合并上清液经液相色谱法分离，即得高纯度的岩藻黄素；所述提取液的用量为4-6ml/克藻泥。
2.按权利要求1所述的从海洋单细胞硅藻提取分离岩藻黄素的方法，其特征在于：所述藻泥为通过离心或过滤方式沉淀海洋硅藻的藻液，得到藻泥。
3.按权利要求1或2所述的的从海洋单细胞硅藻提取分离岩藻黄素的方法，其特征在于：所述的海洋单细胞生物为含岩藻黄素的海洋单细胞类生物。
4.按权利要求3所述的的从海洋单细胞硅藻提取分离岩藻黄素的方法，其特征在于：所述含岩藻黄素的海洋单细胞类生物为三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)、假微型链球藻(Thalssiosirapseudonana)、梅尼小环藻(Cyclotella meneghiniana)、中肋异菱藻(Anomoeoneis costata)威氏海链藻(Thalassiosira Weissflogii)、中肋骨条藻(Skeletonema costatum)、尖刺拟菱形藻（Psudo-nitzschiapungens）、牟氏角毛藻（Chaetoceros muelleri）中的一种或几种。
5.按权利要求1所述的的从海洋单细胞硅藻提取分离岩藻黄素的方法，其特征在于：所述脂溶性提取液为甲醇与丙酮的混合液或二甲基亚砜。
6.按权利要求5所述的的从海洋单细胞硅藻提取分离岩藻黄素的方法，其特征在于：所述甲醇与丙酮的混合液按体积比计，甲醇：丙酮=1-4：1-4。
7.按权利要求1所述的的从海洋单细胞硅藻提取分离岩藻黄素的方法，其特征在于：所述合并后的上清液利用高压液相色谱法对所提取的色素混合物进行分离；流动相为水，甲醇和乙腈，流速为0.75ml/min,收集7-8分钟的洗脱组分，即为岩藻黄素。
8.按权利要求1所述的的从海洋单细胞硅藻提取分离岩藻黄素的方法，其特征在于：通过离心或过滤的方法收集海洋硅藻藻泥，在收集的藻泥中加入脂溶性提取液震荡，使藻细胞与提取液充分接触，而后于0-10度、光照度低于10Lx和以3-7L/分钟的通气量通氮气的条件中提取，提取后离心收集上清液，沉淀再经脂溶性提取液再次提取，合并上清液经液相色谱法分离，即得高纯度的岩藻黄素；所述提取液的用量为4-6ml/克藻泥；每次经脂溶性提取液提取的时间为2-10分钟；
所述合并后的上清液利用高压液相色谱法对所提取的色素混合物进行分离，色谱柱是ODS反相色谱柱(Rx-C18)，柱温设为50摄氏度，流动相为水，甲醇和乙腈，梯度洗脱程序为：初始流动相为水(15％):甲醇(30％):乙腈(55％)，终止流动相为水(6％)：甲醇(21％)：乙腈(73％)，流速为每分钟0.75ml，收集7-8分钟的洗脱组分，即为岩藻黄素。
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