KR101639467B1

KR101639467B1 - 신규한 미세조류 오돈텔라 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101639467B1
Application number: KR1020130083397A
Authority: KR
Inventors: 김희식; 오희목; 이지민; 조대현
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2013-07-16
Filing date: 2013-07-16
Publication date: 2016-07-13
Also published as: KR20150009219A

Abstract

본 발명은 지질 함량이 높으면서 성장 속도가 빠른 신규한 미세조류에 관한 것으로, 본 발명의 신규한 미세조류 BS-003(KCTC 12401BP)은 세포성장이 빠르고 지질 함량이 높으므로 이로부터 FAME 또는 친지성 추출물을 제조할 수 있어, 바이오디젤, 화장료 조성물 또는 식품 조성물로 이용할 수 있다.

Description

신규한 미세조류 오돈텔라 및 이의 용도{Novel microalgae of Odontella sp. and its use}

본 발명은 바이오디젤 생산 능력을 가진 신규한 미세조류 Odontella sp. BS-003 및 이의 용도에 관한 것이다.

지방산 메틸에스테르(fatty acid methyl ester, FAME)은 유기체를 원료로 하여 제조한 무공해 연료로서 순도가 95% 이상인 것이다. FAME은 재생 가능한 바이오매스에서 생산되므로 에너지자원의 고갈 문제가 없어 바이오디젤이라고 불리우고 연료로 사용되기도 한다. 지구 온난화를 야기하는 이산화탄소는 바이오매스의 생산과정에서 회수되므로 이산화탄소의 순배출량이 매우 적다. 아울러 바이오디젤은 산소함유량이 높으므로(산소 10% 이상) 완전 연소 비율이 높고, 발암 물질인 입자상 물질 등을 저감할 수 있으며, 특히 독성이 적고, 생분해도가 높아서 유출시 환경오염이 적다는 장점이 있다. 바이오디젤은 경유 대체 에너지뿐만 아니라 윤활유의 원료, 윤활유 첨가제 등으로 이용될 수 있으며 다양한 무공해 용제 및 생물농약으로 사용이 가능하다. 현재까지 이러한 바이오디젤의 생산은 다양한 동. 식물성 유지로부터 생산되고 있으며, 미생물을 이용한 바이오디젤 생산에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다.

현재까지 해바라기유, 폰가미아 핀나타, 마드후카 인디카, 카놀라유 등 여러 종류의 시료들을 대상으로 바이오디젤 추출연구가 진행되고 있다. 그러나, 육상작물을 이용하여 바이오디젤을 생산할 경우 곡물가격상승 및 식량공급 부족문제가 발생할 수 있는 단점이 있다.

한편, 미세조류의 섬유는 주로 셀룰로스로서 식물계 셀룰로스 섬유보다 상대적으로 일정한 지름을 가지고 있다. 따라서 식물성 셀룰로오스의 단점으로 지적되고 있는, 하나의 섬유 내에서 셀룰오오스 크기 불균형에 의해 복합 재료의 물성에 변화를 주는 단점을 극복할 수 있다. 또한, 미세조류는 해양에서의 기초생산, 즉 태양에너지를 이용하여 무기물로부터 유기물을 생산하며, 그 종류도 일반 미생물과 비교될 수 있을 정도로 다양할 뿐만 아니라 1차 생산자로서 미세조류가 갖는 중요성은 매우 크다고 할 수 있다. 미세조류는 종에 따라 차이는 있지만 일반적으로 섬유질을 많이 포함하고 있는 세포벽과 다양한 내부 물질로 나눌 수 있다. 일부 종에 있는 지질은 식물유와 매우 유사하여 이를 생물연료로 만드는데 아주 적합하다. 바이오디젤의 생산은 바로 이 지방의 함량에 비례하여 오일성분을 추출해 내고 촉매화 및 트랜스에스테르반응을 거친 후에 생산해 낼 수 있는 것이다. 따라서, 미세조류를 이용한 바이오디젤 생산에 있어서 지질의 함량이 높으면서 성장 속도가 빠른 미세조류의 발굴이 요구되고 있다.

이에, 본 발명자들은 해수로부터 지질 함량이 높으면서 성장 속도가 빠른 신규한 미세조류를 발굴하였으며, 상기 미세조류를 선택적으로 최적 배양할 수 있는 조건을 확립하여 FAME 생성 효과를 확인하였고, 추출한 FAME에 유용한 불포함 지방산이 다량 존재하는 것을 확인하였다.

대한민국 공개특허공보 제2012-0111322호

본 발명의 목적은 FAME(fatty acid methyl ester) 생산능력을 가진 신규한 미세조류 Odontella sp. BS-003(KCTC 12401BP)을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 본 발명의 미세조류를 이용한 친지성 추출물의 제조방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 본 발명의 미세조류를 이용한 FAME의 제조방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 친지성 추출물을 함유하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

아울러, 본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 FAME을 함유하는 식품 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 FAME(fatty acid methyl ester) 생산능력을 가진 신규한 미세조류 Odontella sp. BS-003(KCTC 12401BP)을 제공한다.

또한, 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명의 미세조류를 이용한 친지성 추출물의 제조방법을 제공한다.

또한, 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명의 미세조류를 이용한 FAME의 제조방법을 제공한다.

또한, 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 친지성 추출물을 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.

아울러, 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 FAME을 함유하는 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 지질 함량이 높으면서 성장 속도가 빠른 신규한 미세조류는 세포 성장이 빠르고 지질 함량이 높아 FAME 또는 친지성 추출물을 이로부터 제조할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 본 발명에서 분리한 신규한 미세조류 Odontella sp. BS-003을 광학현미경 및 형광현미경으로 확인한 사진이다.
도 2는 본 발명에서 분리한 미세조류 Odontella sp. BS-003의 18S ribosomal RNA 염기서열을 NCBI의 blast 프로그램을 이용하여 확인한 도이다.
도 3은 배지 조성의 변화에 따른 본 발명의 Odontella sp. BS-003의 성장곡선을 나타낸 그래프이다:
F/2-Si(-): Si(규소)를 제외한 F/2 배지에서 배양한 BS-003의 균체량;
F/2: F/2 배지에서 배양한 BS-003의 균체량;
F/2-N(+): N(질소)를 제외한 F/2 배지에서 배양한 BS-003의 균체량; 및
F/2-Si(+): Si(규소)를 2배 이상 포함하도록 60 내지 90 g/L의 Na₂SiO₃·H₂O를 포함하는 F/2 배지에서 배양한 BS-003의 균체량.
도 4는 F/2-Si(+) 배지를 이용한 최적조건에서 Odontella sp. BS-003의 성장곡선을 나타낸 그래프이다.
도 5는 해수 시료를 4가지 광원에서 배양한 도이다:
W: 백색 LED 광원에서 배양한 시료;
G: 중심파장 525 nm의 녹색 LED 광원에서 배양한 시료;
B: 중심파장 470 nm의 청색 LED 광원에서 배양한 시료;
R: 중심파장 660 nm의 적색 LED 광원에서 배양한 시료; 및
아래: 배양된 BS-003의 균체량.
도 6은 4가지 파장의 광원에서 배양된 BS-003의 균체 중량을 확인한 그래프이다.
도 7은 본 발명의 BS-003을 nile red로 염색하여 중성지질을 확인한 도이다:
×400: 400배 확대; 및
×200: 200배 확대.
도 8은 본 발명의 BS-003의 지질 함량을 확인한 그래프이다.
도 9는 본 발명의 BS-003의 지방산 조성을 확인한 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "FAME(fatty acid methyl esters)" 또는 "친지성 추출물"은 식물성 오일, 동물성 지방 및 폐유 또는 폐지방을 모두 지칭하는 것을 의미하며, 본 발명에서는 유기체인 미세조류를 가공하여 만들어 낸 것을 말한다. FAME은 "바이오디젤(biodiesel)"로도 기재될 수 있다.

본 발명은 FAME(fatty acid methyl ester) 생산능력을 가진 신규한 미세조류 Odontella sp. BS-003(KCTC 12401BP)을 제공한다.

상기 Odontella sp. BS-003은 중심파장이 525 nm인 495 내지 570 nm의 녹색 파장에서 선택적으로 배양되므로 다양한 종이 혼재하는 시료에서 상기 균주만을 선택적으로 배양하여 상기 균주가 우점하게 할 수 있다.

상기 Odontella sp. BS-003(KCTC 12401BP)은 기존 배지(F/2)에서의 규소의 함량보다 2배 이상의 규소 함량의 배지에서 성장이 증가할 수 있으며, 60 내지 90 g/L의 Na₂SiO₃·H₂O를 포함하는 배지에서 성장이 증가할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 Odontella sp. BS-003(KCTC 12401BP)를 배양한 뒤 유기용매를 이용하여 상기 균주로부터 지질을 추출하는 단계를 포함하는 친지성 추출물의 제조방법을 제공한다.

상기 유기용매는 클로로포름 및 메탄올의 혼합용액인 것이 바람직하며, 클로로포름 및 메탄올을 2:1로 혼합한 혼합용액인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 Odontella sp. BS-003(KCTC 12401BP)의 배양은 60 내지 90 g/L의 Na₂SiO₃·H₂O를 포함하는 배지에서 배양되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

다양한 균주가 혼입된 시료에서 본 발명의 Odontella sp. BS-003(KCTC 12401BP)를 선택적으로 배양하기 위하여 시료에 495 내지 570 nm의 녹색 파장을 처리할 수 있다.

또한, 본 발명은

1) 제 1항의 Odontella sp. BS-003(KCTC 12401BP)을 배양하는 단계;

2) 상기 단계 1)에서 배양한 Odontella sp. BS-003(KCTC 12401BP)에 비누화(Saponification) 시약을 첨가하여 반응시키는 단계;

3) 상기 단계 2)의 반응 결과물에 메틸화(Methylation) 시약을 첨가하여 반응시키는 단계;

4) 상기 단계 3)의 반응 결과물에 추출(Extraction) 시약을 첨가하여 FAME을 추출하는 단계를 포함하는 FAME의 제조방법을 제공한다.

상기 단계 2)의 반응은 90 내지 110℃에서, 상기 단계 3)의 반응은 70 내지 90℃에서 수행되는 것이 바람직하며, 상기 단계 3)의 반응 후에 냉각시키는 단계를 추가로 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 FAME(fatty acid methyl ether)의 채취는 이 기술분야에 공지된 다양한 추출방법을 이용할 수 있다.

상기 FAME은 불포화지방산(오메가 3 지방산)을 포함하는 것이 바람직하며, 상기 불포화지방산은 EPA(eicosapentanoic acid)인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명은 본 발명의 Odontella sp. BS-003(KCTC 12401BP)로부터 추출한 친지성 추출물을 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 화장료 조성물은 지방 물질, 유기용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부 과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 상기 보조제는 화장품학 또는 피부 과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입된다.

본 발명의 화장료 조성물의 외형은 화장품학 또는 피부과학적으로 허용 가능한 매질 또는 기제를 함유한다. 이는 국소적용에 적합한 모든 제형으로, 예를 들면, 용액, 겔, 고체, 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는, 이온형(리포좀) 및 비이온형의 소낭 분산제의 형태로, 또는 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 이들 조성물은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 또한 폼(foam)의 형태로 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 사용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 예를 들면, 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 아이에센스, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 파우더, 바디로션, 바디크림, 바디오일 및 바디에센스 등의 화장품으로 제형화될 수 있다.

상술한 바와 같은 화장료 조성물은 피부에 바르는 형태로 적용될 수도 있고, 마이크로 니들 등을 이용하여, 피부 내부로 흡수되는 형태로 적용될 수도 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 모발에 도포하기에 적당한 캐리어 또는 캐리어 혼합물을 포함하여 모발 조성물로 제조될 수 있다. 캐리어는 용매와 다른 캐리어 또는 모발 보호 조성물에 통상적으로 사용되는 비히클(vehicle) 성분을 포함하며, 전체 조성물의 조성물 중 약 0.5% 내지 99.5%, 바람직하게는 약 5.0% 내지 99.5%, 가장 바람직하게는 약 10.0% 내지 90.0%로 존재한다. 캐리어로서 용매는 제형화된 모발 조성물이 헤어 스프레이, 무스, 토닉 등과 같이 사용 후 모발에 남는 것이거나 샴푸, 컨디셔너 등과 같이 세정되는 것에 관계없이 사용하는 공중합체에 의해 선택된다. 본 발명에서 사용하는 적합한 용매는 물, 저급 알코올(에탄올, 이소프로판올 등), 하이드로알콜계 혼합물, 탄화수소(이소부탄, 헥산, 데센등), 아세톤, 할로겐화 탄화수소(프레온 등), 탄화수소 에스테르(에틸 아세테이트, 디부틸 프탈레이트 등), 휘발성 실리콘 유도체, 실록산(페닐 펜타메틸 디실록산, 메톡시프로필 헵타메틸 사이클로테트라실록산, 클로로프로필 펜타메틸 디실록산, 하이드록시프로필 펜타메틸 디실록산, 옥타메틸 사이클로테트라실록산, 데카메틸 사이클로펜타실록산 등) 및 이들의 혼합물을 포함하는 것이 바람직하다.

아울러, 본 발명은 본 발명에 따른 Odontella sp. BS-003(KCTC 12401BP)로부터 제조한 FAME을 함유하는 식품 조성물을 제공한다.

상기 식품 조성물은 불포화지방산을 포함하는 것이 바람직하며, EPA(eicosapentanoic acid)를 포함하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 건강기능성 식품은 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 식품은 본 발명에 따른 친지성 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 본 발명에 따른 친지성 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.

본 발명의 음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 0.01 ~ 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ~ 0.03 g 이다.

본 발명의 식품 조성물에서 포함할 수 있는 필수 성분으로서 상기 본 발명에 따른 친지성 추출물본 발명에 따른 친지성 추출물상의 식품과 같이 여러 가지 생약 추출물, 식품 보조 첨가제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 또한, 식품보조첨가제를 추가로 첨가할 수도 있는바 식품보조첨가제는 당업계에 통상적인 식품보조첨가제, 예를 들어 향미제, 풍미제, 착색제, 충진제, 안정화제 등을 포함한다. 상기 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 Ａ, 글리시르히진등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 외에 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 해수로부터 신규한 미세조류인 BS-003을 분리 및 동정한 뒤 KCTC 12401BP로 기탁하였으며, 규소의 농도가 기존의 농도보다 2배 이상일 때 균주를 최적으로 배양할 수 있음을 확인하였다. 또한, 다양한 종이 혼합된 상태에서 본 발명의 미세조류인 Odontella sp. BS-003를 녹색 파장의 LED를 조사함으로써 선택적으로 배양할 수 있음을 확인하였다. 또한, 본 발명의 BS-003 균주가 세포 내에 많은 양의 중성지질을 포함하고 있으며, 세포 건조중량 대비 38%의 지질함량을 가짐을 확인하였다. 아울러, 본 발명의 신규한 균주로부터 추출한 FAME에서 C16이 약 60%, C18이 약 20%로 존재하였으며, 불포화 지방산(오메가 3 지방산)인 EPA(eicosapentaenoic acid)가 약 10%로 존재함을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 지질 함량이 현저한 특성을 가지는 신규한 BS-003은 2배 이상의 규소 농도에서 성장 속도가 빨라 균체량이 증가하고, 녹색 파장에서 선택적으로 성장이 증가하여 균체량이 증가하므로, 이를 배양하면 이로부터 친지성 추출물 또는 FAME을 채취하여 이를 바이오디젤, 화장료 조성물 또는 식품 조성물로서 이용할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 이 기술분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실시예 1> 해수로부터 미세조류 분리 및 동정

<1-1> 미세조류의 분리

남해 바닷에서 바닷물 시료를 채취한 뒤 이를 Combi 514R (Hanil, 한국)를 이용하여 농축하였다. 농축한 바닷물을 마이크로피펫팅(micropipetting)을 통해 각가의 미세조류로 분리하였으며, 분리된 미세조류들을 F/2 media (표 1)가 들은 5L bottle에서 100μmol/m²/s의 광원하에 100 rpm으로 배양하였다. 분리한 미세조류 중에서 형태적으로 규조류 Odontella sp.와 유사한 형태의 규조류인 JBS-003을 분리하였다. 분리한 BS-003을 광학현미경(Nicon ECLIPSE 80i, nikon, Japan) 및 형광현미경(Nicon ECLIPSE 80i, nikon, Japan)으로 관찰하였다.

그 결과, 형태적으로 Odontella aurita와 유사함을 알 수 있었다 (도 1).

<1-2> 분리 미생물의 동정

상기 실시예 <1-1>에서 분리한 규조류 BS-003를 동정하기 위해 유전학적 방법이 사용되었다.

구체적으로, 하기 표 2에 기재된 서열번호 2 및 3의 프라이머 쌍을 이용하여 하기 표 3과 같은 구성으로 PCR을 위한 혼합물을 혼합한 뒤 표 4의 PCR 조건으로 GeneAmp PCR system 2700 (ABI, USA)을 이용하여 규조류 BS-003의 BS-003의 18S rRNA (서열번호 1)을 동정하였다.

동정한 BS-003의 18S rRNA 서열을 ncbi의 blast 프로그램을 이용하여 확인한 결과, Odontella aurita와 96% 유사한 것으로 동정되어 신규한 미세조류임을 알 수 있었다 (도 2).

서열명칭	서열	서열번호
D512F	ATT CCA GCT CCA ATA GCG	2
D978R	GAC TAC GAT GGT ATC TAA TC	3

반응 혼합물의 조성
DNA	1
D512F 프라이머(12.5 pmol)	1
D978R 프라이머(12.5 pmol)	1
10mM dNTP 혼합물	1
10x PCR 완충액	5
보빈 시럼 알부민(BSA)	0.5
Taq DNA 중합효소(Takara, 일본)	0.5
dH₂0	18.5
총 부피 25

	온도()	시간(분)	횟수(cycle)
초기 변성(pre-denaturation)	95	5	1
변성(denaturation)	94	0.5	30
결합(annealing)	59	0.5
확장(extension)	72	0.5
최종 신장(post-elongation)	72	7	1

따라서, 본 발명에서 분리한 미세조류 BS-003을 Odontella sp. BS-003으로 명명하고 2013년 04월 10일에 KCTC(Korean Collection for Type Cultures에 기탁하였다 (KCTC 12401BP).

< 실시예 2> BS -003 균주의 배지 조성에 따른 배양 확인

<2-1> 최적 배양 배지 조성 검색

상기 <실시예 1>에서 분리한 BS-003 균주의 최적 배양 조건을 확립하기 위하여 F/2 배지의 조성에서 질소와 규소의 농도를 조정하여 배양하면서 균주의 성장률을 조사하였다.

구체적으로, F/2 배지에 규소를 넣지 않은 F/2-si(-) 배지, F/2 배지의 질소 농도의 2배의 질소를 넣은 F/2-N(+) 배지(150 g/L의 NaNO₃를 포함하는 배지) 및 F/2 배지의 규소 농도의 2배의 규소를 넣은 F/2-si(+) 배지(60 내지 90 g/L의 Na₂SiO₃·H₂O를 포함하는 배지)를 이용하여 Odontella sp. BS-003를 배양한 뒤 성장 정도를 확인하였다.

그 결과, 규소를 제거한 배지에서는 미세조류의 성장이 둔화되었으며, 규소의 함량을 추가한 경우, 바이오매스 생산성(균체량)이 증가되었다. 질소의 양을 추가한 것은 바이오매스 생산에 영향을 미치지 않았다. 또한, 규소가 2배 포함된 배지에서 생장률은 0.52로 규소를 넣지 않은 배지에서와 비교하였을 때 약 50%의 증가를 보였다 (표 5 및 도 3).

<2-2> 균주의 배지 조성에 따른 지질 생산량 및 바이오매스량 확인

본 발명의 BS-003 균주를 F/2-si(+) 배지를 이용하여 15 내지 18℃의 온도, 100 μmol/m²/s의 광원, 120 rpm로 교반, 0.5 vvm 공기주입의 조건으로 10L 유리 광생물 반응기 (Biotron GX, Hanil science medical, Korea)에서 회분식 배양 생산하면서 바이오매스(biomass)를 확인하였다. 상기 생산한 바이오매스로부터 클로로포름과 메탄올을 2:1로 혼합한 용액을 이용하여 지질 성분을 용출한 뒤, evaporator에서 수분을 증발시키고 지질 성분의 무게를 측정하여 지질 생산량을 계산하였다.

그 결과, 5일 동안 바이오매스가 1.83 g/L 생산되어 Odontella sp. BS-003의 바이오매스 생산량은 0.342 g/L/day였다 (도 4 및 표 5). 아울러, 지질생산량은 회분식 배양기를 이용하였을 때 0.13 g/L/day로 높은 수치를 보였다 (표 6).

	Specific growth rate(μ)	Generation time (day)
F/2-Si(-)	0.346331	2.000975
F/2	0.475909	1.45616
F/2-N(+)	0.468361	1.479627
F/2-Si(+)	0.519051	1.335129

Specific growth rate (μ)	Generation time (day)	Biomass DCW(g/L)	Lipid content (%)	Biomass productivity (g/L/day)	Lipid porductivity (g/L/day)
0.54	1.27	1.83	38	0.342	0.12996

따라서, Odontella sp. BS-003을 배양하기 위해 규소가 필수적임을 알 수 있었다.

< 실시예 3> BS -003 균주를 선택 배양하기 위한 시스템 확립

미세조류에 따라 선호하는 파장이 있고 이에 의해 성장에 차이가 있을 것으로 예측하여, 다양한 종이 혼합된 상태에서 본 발명의 규조류만을 선택적으로 배양하기 위해 특정파장을 조사한 뒤 BS-003의 성장을 확인하였다. 대부분의 광합성 미세조류는 녹색 파장을 가장 이용하지 않고, 규조류는 다른 녹조류 및 적조류에 비해 상대적으로 청색 파장을 많이 이용하는 것으로 알려져 있다.

구체적으로, BS-003 균주 및 다른 미세조류들이 포함된 시료를 각기 다른 파장의 광원인 백색, 495~570 nm의 녹색 (중심파장 약 525 nm), 450~495 nm의 청색 (중심파장 약 470 nm) 및 620~780 nm의 적색 LED (중심파장 약 660 nm)가 설치된 50 μmol/m²/s의 광량을 가지는 광원 장치하에서 교반 배양하였다.

그 결과, 청색파장에서 가장 높은 바이오매스를 얻었으나, 이는 녹조류에 의한 오염에 의한 것이었으며, 녹조류의 오염은 적색 및 백색 파장에서도 관찰되었다. 그러나, 녹색 파장에서는 바이오매스의 양은 다른 파장에 비해 상대적으로 적었지만, 다른 조류의 오염 없이 본 발명의 미세조류인 BS-003만이 배양된 것을 확인할 수 있었다 (도 5 및 도 6).

따라서, 녹색 LED를 조사하여 배양한 시료에서 본 발명의 Odontella sp. BS-003이 우점하며 다른 조류가 배양되지 않았으므로, 녹색 파장의 LED를 이용하면 본원발명의 BS-003를 선택적으로 배양할 수 있음을 알 수 있었다.

< 실시예 4> BS -003 균주의 지방량 확인

<4-1> BS -003 균주의 중성지질 확인

아세톤 10 μg/L의 농도로 nile red powder를 용해시킨 용액을 1 ml의 BS-003 균주 배양액에 1 ㎕ 넣고 약 1 분 동안 혼합하여 반응시켰다. 반응 후, Nikon ECLIPSE 80i(nikon, Japan) 형광 현미경을 이용하여 nile red 염색에 의한 중성지질의 염색을 확인하였다. 모든 실험과정은 빛이 없는 곳에서 진행하였다.

그 결과, 본 발명의 Odontella sp. BS-003의 세포 내에 많은 양의 중성지질이 포함된 것이 관찰되었다 (도 7).

<4-2> BS -003 균주의 총 지질함량 확인

바이오디젤을 추출할 때 이용되는 녹조류인 Chlamydomonas reinhardtii 및 Chlorella vulgaris와 본 발명의 Odontella sp. BS-003 균주를 배양한 뒤, 약 5.0+E07 정도의 배양액 10 ml을 원심분리하여 펠릿을 모았다. 모은 펠릿에 15 ml의 클로로포름(CH)/메탄올(ME) (2:1) 용매를 첨가하고 ultrasonicator를 이용하여 5분 동안 세포를 파쇄하였다. 300 rpm의 funnel shaker를 이용하여 파쇄된 세포로부터 지질을 15분 동안 추출하였다. 추출된 용액에 DDW를 10 ml 첨가하고 원심분리하여 유기용매와 물층으로 나눈 뒤, 유기 용매층을 20 ml vial에 넣었다. 유기용매층에서 유기용매를 evaporator로 완전히 증발시켰다. 그 후, 건조된 무게를 측정하여 세포의 건조중량 대비 지질함량을 계산하였다.

그 결과, 중량비로 지질의 량을 분석한 결과 지질함량이 세포 건조 중량 대비 38%인 것으로 확인되어 다른 미세조류인 Chlamydomonas reinhardtii 및 Chlorella vulgaris 균주들에 비해 약 150 내지 180% 수준의 높은 지질 함유량을 보였다 (도 8).

< 실시예 5> BS -003 균주를 이용하여 생산한 FAME 의 조성 분석

본 발명의 BS-003 균주로부터 FAME을 추출하여 이의 조성을 분석하였다.

구체적으로, BS-003 균주 배양액 5 ml를 취한 뒤 이를 원심분리하여 미세조류 균체를 모았다. 모은 균체를 유리 튜브에 옮겨 표 7의 reagent 1를 1 ml 첨가하였다. 그 후 미세조류 균체가 잘 분산되도록 vortexing을 하고 100℃에서 5분 동안 반응시켰다. 그 후 또다시 vortexing을 하고 25분 동안 반응시켰다. 상기 반응액의 온도가 상온 정도로 낮아지면 reagent 2를 2 ml 넣고 vortexing한 뒤, 80℃에서 10분 동안 반응시키고 빠르게 냉각시켰다. 냉각된 반응물에 reagent 3을 1.25 ml 넣고 10분 동안 교반하여 FAME를 추출하였다. 그 후, reagent 4를 3 ml 넣어 추출한 FAME을 세척한 뒤, 이 중 1 ml을 취하여 PTFE(Polytetrafluoroethylene) 유기용매 필터를 이용하여 GC 바이알(vial)로 필터링하여 옮겼다. 옮긴 시료에 C17 내부표준물질 (internal standard, Fluka 제품) 50 ㎕를 첨가하여 FAME 조성 분석용 샘플을 만들었다. FAME 분석은 가스크로마토그래피 (Shimadzu GC-2010, Japan)를 이용하였으며, wax column(Zebron, ZB-WAX,maximum temperature: 250℃, phonomenex, USA) 및 FID detector(flame ionization detector, 최대온도: 300℃)을 사용하여 FAME를 검출하였다. 검출에 사용된 injection volume은 1 ㎕ 였고, 총 검출시간은 25분으로 한정하였다. 바이오디젤 분석을 위한 표준 물질로서 Supelco의 FAME mix 18918(c8~c24)를 사용하였다. 분석 후 각 샘플의의 피크 지점과 표준 물질의 피크지점을 상대 비교한 뒤, 반응조건에 따른 바이오디젤 값을 정량하였다.

Reagent 1	Saponification Reagent
	NaOH 45 g, Methanol 150 ml, DDW 150 ml
Reagent 2	Methylation Reagent
	6N HCl 325 ml, Methanol 275 ml
Reagent 3	Extraction Solvent
	Hexane 200 ml, Methyl tert-butyl ether 200ml
Reagent 4	Base Wash
	NaOH 10.8 g, DDW 900ml

그 결과, BS-003 균주로부터 균체량 당 16%의 FAME이 추출되는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 추출한 FAME의 성분을 분석한 결과, C16이 전체 지방산의 60%정도로 존재했으며, C18이 20%정도로 지방산 조성에서 높은 함유량을 보였다. 아울러, DHA, DPA와 함께 음식물을 통해 섭취해야만 하는 불포화 지방산(오메가 3 지방산)으로 콜레스테롤 저하, 뇌기능 촉진 등 각종 질병 예방에 효과가 있다고 알려진 EPA(eicosapentaenoic acid)가 10% 수준으로 존재하는 것을 확인하였다 (도 9).

한국생명공학연구원

KCTC12401BP

20130410

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Novel microalgae of Odontella sp. and its use <130> p130710 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 445 <212> DNA <213> Odontella <400> 1 tgactacgan tgtatctaat catcttcgat ccyccaactt tcgttcttga ttaatgaaaa 60 catccttggt aaatgctttc gcagtagttc atcttccgta aatccaagaa tttcacctct 120 gacaacggaa tatgaatacc cccgactgtt cctattaatc attacttcgg cgcgcaaacc 180 aacaaaatag taccggagtc ctatcttatt attccatgct aatatattca acggcataag 240 cctgctttga acactctaat tttttcacag taaacgatgg ggatcccctg cacgacaacc 300 taatgccaca caggctctcc ccaaggatgg ccggagtcaa ttgaagtacc cgcacagagt 360 gcgagaccca ttgctcccac cagatatcca actacgagct ttttaactgc aacaacttta 420 atatacgcta ttgaaactgg aataa 445 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D512F forward primer <400> 2 attccagctc caatagcg 18 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D978R reverse primer <400> 3 gactacgatg gtatctaatc 20

Claims

FAME(fatty acid methyl ester) 생산능력을 가진 신규한 미세조류 Odontella sp. BS-003(KCTC 12401BP).
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제 1항의 Odontella sp. BS-003(KCTC 12401BP)을 배양한 뒤 유기용매를 이용하여 지질을 추출하는 단계를 포함하는 친지성 추출물의 제조방법.
제 4항에 있어서, 상기 유기용매는 클로로포름 및 메탄올의 혼합용액인 것을 특징으로 하는 친지성 추출물의 제조방법.
제 4항에 있어서, 상기 Odontella sp. BS-003(KCTC 12401BP)를 60 내지 90 g/L의 Na₂SiO₃·H₂O를 포함하는 배지에서 배양하여 균주의 성장을 증가시키는 것에 의하여 친지성 추출물의 양을 증가시키는 것을 특징으로 하는 친지성 추출물의 제조방법.
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1) 제 1항의 Odontella sp. BS-003(KCTC 12401BP)을 배양하는 단계;
2) 상기 단계 1)에서 배양한 Odontella sp. BS-003(KCTC 12401BP)에 비누화(Saponification) 시약을 첨가하여 반응시키는 단계;
3) 상기 단계 2)의 반응 결과물에 메틸화(Methylation) 시약을 첨가하여 반응시키는 단계;
4) 상기 단계 3)의 반응 결과물에 추출(Extraction) 시약을 첨가하여 FAME을 추출하는 단계를 포함하는 FAME의 제조방법.
제 8항에 있어서, 상기 단계 2)의 반응은 90 내지 110℃에서, 상기 단계 3)의 반응은 70 내지 90℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는 FAME의 제조방법.
제 8항에 있어서, 상기 단계 3)의 반응 후에 냉각시키는 것을 특징으로 하는 FAME의 제조방법.
제 8항에 있어서, 상기 단계 1)에서 Odontella sp. BS-003(KCTC 12401BP)를 60 내지 90 g/L의 Na₂SiO₃·H₂O를 포함하는 배지에서 배양하여 균주의 성장을 증가시키는 것에 의하여 상기 단계 4)에서 FAME의 추출양을 증가시키는 것을 특징으로 하는 FAME의 제조방법.
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