KR101606291B1 - 신규한 미세조류 아크난티디움 및 이의 용도 - Google Patents

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조대현
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한국생명공학연구원
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Abstract

본 발명은 지질 함량이 높으면서 성장 속도가 빠른 신규한 미세조류에 관한 것으로, 본 발명의 신규한 미세조류 BS-001(KCTC12679BP)은 세포성장이 빠르고 지질 함량이 높으므로 바이오디젤 또는 친지성 추출물을 제조할 수 있다.

Description

신규한 미세조류 아크난티디움 및 이의 용도 {NOVEL MICROALGAE OF ACHNANTHIDIUM SP. AND ITS USE}
본 발명은 바이오디젤 생산 능력을 가진 신규한 미세조류 Achnanthidium sp. BS-001 및 이를 이용한 바이오디젤의 제조방법에 관한 것이다.
바이오디젤은 유기체를 원료로 하여 제조한 무공해 연료인 지방산 메틸에스테르(fatty acid methyl ester, FAME)로서 순도가 95% 이상인 것이며, 기존의 석유계 경유와 성질이 매우 유사하다. 또한, 연소 시 공해가 거의 발생하지 않아 석유계 경유와 섞어서 사용할 경우 대기오염의 주범인 자동차 공해를 획기적으로 줄일 수 있는 선진국형 청정 대체 에너지로 최근 그 수요와 필요성이 대폭 증대되고 있다. 바이오디젤은 재생 가능한 바이오매스에서 생산되므로 에너지자원의 고갈 문제가 없다. 지구 온난화를 야기하는 이산화탄소는 바이오매스의 생산과정에서 회수되므로 이산화탄소의 순배출량이 매우 적다. 아울러 바이오디젤은 산소함유량이 높으므로(산소 10% 이상) 완전 연소 비율이 높고, 발암 물질인 입자상 물질 등을 저감할 수 있으며, 특히 독성이 적고, 생분해도가 높아서 유출시 환경오염이 적다는 장점이 있다. 바이오디젤은 경유 대체 에너지뿐만 아니라 윤활유의 원료, 윤활유 첨가제 등으로 이용될 수 있으며 다양한 무공해 용제 및 생물농약으로 사용이 가능하다. 현재까지 이러한 바이오디젤의 생산은 다양한 동. 식물성 유지로부터 생산되고 있으며, 미생물을 이용한 바이오디젤 생산에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다.
현재까지 해바라기유, 폰가미아 핀나타, 마드후카 인디카, 카놀라유 등 여러 종류의 시료들을 대상으로 바이오디젤 추출연구가 진행되고 있다. 그러나, 육상작물을 이용하여 바이오디젤을 생산할 경우 곡물가격상승 및 식량공급 부족문제가 발생할 수 있는 단점이 있다.
한편, 미세조류의 섬유는 주로 셀룰로오스로서 식물계 셀룰로오스 섬유보다 상대적으로 일정한 지름을 가지고 있다. 따라서 식물성 셀룰로오스의 단점으로 지적되고 있는, 하나의 섬유 내에서 셀룰로오스 크기 불균형에 의해 복합 재료의 물성에 변화를 주는 단점을 극복할 수 있다. 또한, 미세조류는 해양에서의 기초생산, 즉 태양에너지를 이용하여 무기물로부터 유기물을 생산하며, 그 종류도 일반 미생물과 비교될 수 있을 정도로 다양할 뿐만 아니라 1차 생산자로서 미세조류가 갖는 중요성은 매우 크다고 할 수 있다. 미세조류는 종에 따라 차이는 있지만 일반적으로 섬유질을 많이 포함하고 있는 세포벽과 다양한 내부 물질로 나눌 수 있다. 일부 종에 있는 지질은 식물유와 매우 유사하여 이를 생물연료로 만드는데 아주 적합하다. 바이오디젤의 생산은 바로 이 지방의 함량에 비례하여 오일성분을 추출해 내고 촉매화 및 트랜스에스테르 반응을 거친 후에 생산해 낼 수 있는 것이다. 따라서, 미세조류를 이용한 바이오디젤 생산에 있어서 지질의 함량이 높으면서 성장 속도가 빠른 미세조류의 발굴이 요구되고 있다.
이에, 본 발명자들은 해수로부터 지질 함량이 높으면서 성장 속도가 빠른 신규한 미세조류를 발굴하였으며, 상기 미세조류를 선택적으로 최적 배양할 수 있는 조건을 확립하여 바이오디젤 및 친지성 추출물 생성 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
대한민국 공개특허공보 제2013-0124220호
본 발명의 목적은 바이오디젤 생산능을 가진 신규한 미세조류 Achnanthidium sp. BS-001를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 미세조류를 이용한 바이오디젤의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 미세조류를 이용한 친지성 추출물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 친지성 추출물을 함유하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 친지성 추출물을 함유하는 식품 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 바이오디젤 생산능을 가진 신규한 미세조류 Achnanthidium sp. BS-001을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "바이오디젤(biodiesel)"은 식물성 오일, 동물성 지방 및 폐유 또는 폐지방을 모두 지칭하는 것을 의미하며, 본 발명에서는 유기체인 미세조류를 가공하여 만들어 낸 것을 말한다. 상기 바이오디젤은 "FAME(fatty acid methyl esters)" 또는 "바이오연료(biofuel)"로도 기재될 수 있다. 본 발명의 상기 바이오디젤은 바람직하게 FAME(fatty acid methyl ester)일 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 상기 Achnanthidium sp. BS-001(KCTC12679BP)은 바람직하게 60 내지 70 g/L의 Na2SiO3·9H2O를 포함하는 배지에서 성장이 증가할 수 있다. 구체적으로 상기 Achnanthidium sp. BS-001의 배양은 기본 배지에서의 규소 함량보다 규소 농도가 2배 이상인 배지(Na2SiO3·9H2O기준 60-70 g/L)에서 배양되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 본 발명의 Achnanthidium sp. BS-001를 배양하여 배양물로부터 지질을 채취하는 것을 특징으로 하는 친지성 추출물의 제조방법을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 “친지성 추출물”은 식물성 오일, 동물성 지방 및 폐유 또는 폐지방을 모두 지칭하는 것을 의미하며, 본 발명에서는 유기체인 미세조류를 가공하여 만들어 낸 것을 말한다.
구체적으로 본 발명은 상기 Achnanthidium sp. BS-001(KCTC12679BP)을 배양한 뒤 상기 배양물에서 유기용매를 이용하여 지질을 추출하는 단계를 포함하는 친지성 추출물의 제조할 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 상기 유기용매는 클로로포름 및 메탄올의 혼합용액일 수 있다. 또한 상기 친지성 추출물의 제조방법에 있어서, 상기 Achnanthidium sp. BS-001(KCTC12679BP)의 배양은 60 내지 70 g/L의 Na2SiO3·9H2O를 포함하는 배지에서 배양한 것일 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 Achnanthidium sp. BS-001를 배양하여 배양물로부터 FAME을 채취하는 것을 특징으로 하는 바이오디젤의 제조방법을 제공한다.
구체적으로 상기 방법은,
1) Achnanthidium sp. BS-001(KCTC12679BP)을 배양하는 단계; 2) 상기 단계 1)에서 배양한 Achnanthidium sp. BS-001(KCTC12679BP)에 비누화(Saponification) 시약을 첨가하여 반응시키는 단계; 3) 상기 단계 2)의 반응 결과물에 메틸화(Methylation) 시약을 첨가하여 반응시키는 단계; 4) 상기 단계 3)의 반응 결과물에 추출(Extraction) 시약을 첨가하여 바이오디젤을 추출하는 단계를 포함하는 바이오디젤의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 구체예에서, 상기 바이오디젤은 FAME일 수 있다.
상기 FAME(fatty acid methyl ether)의 채취는 이 기술분야에 공지된 다양한 추출방법을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 유기 추출용매로 추출하고 FAME-용매를 분리하여 유기용매 필터로 FAME을 여과하는 과정을 거쳐 얻을 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 FAME은 불포화지방산(오메가 3 지방산)을 포함하는 것이 바람직하며, 상기 불포화지방산은 EPA(eicosapentanoic acid)인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체예에서, 상기 단계 2)의 반응은 90 내지 110℃에서, 상기 단계 3)의 반응은 70 내지 90℃에서 수행할 수 있으며, 상기 단계 3)의 반응 후에 반응 결과물을 냉각시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 상기 Achnanthidium sp. BS-001(KCTC12679BP)의 배양은 60 내지 70 g/L의 Na2SiO3·9H2O를 포함하는 배지에서 배양하는 것일 수 있다.
본 발명은 또한 상기한 친지성 추출물의 제조방법으로 제조된 친지성 추출물을 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 화장료 조성물은 지방 물질, 유기용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부 과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 상기 보조제는 화장품학 또는 피부 과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입된다.
본 발명의 화장료 조성물의 외형은 화장품학 또는 피부과학적으로 허용 가능한 매질 또는 기제를 함유한다. 이는 국소적용에 적합한 모든 제형으로, 예를 들면, 용액, 겔, 고체, 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는, 이온형(리포좀) 및 비이온형의 소낭 분산제의 형태로, 또는 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 이들 조성물은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 또한 폼(foam)의 형태로 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 사용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 예를 들면, 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 아이에센스, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 파우더, 바디로션, 바디크림, 바디오일 및 바디에센스 등의 화장품으로 제형화될 수 있다.
상술한 바와 같은 화장료 조성물은 피부에 바르는 형태로 적용될 수도 있고, 마이크로 니들 등을 이용하여, 피부 내부로 흡수되는 형태로 적용될 수도 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 모발에 도포하기에 적당한 캐리어 또는 캐리어 혼합물을 포함하여 모발 조성물로 제조될 수 있다. 캐리어는 용매와 다른 캐리어 또는 모발 보호 조성물에 통상적으로 사용되는 비히클(vehicle) 성분을 포함하며, 전체 조성물의 조성물 중 약 0.5% 내지 99.5%, 바람직하게는 약 5.0% 내지 99.5%, 가장 바람직하게는 약 10.0% 내지 90.0%로 존재한다. 캐리어로서 용매는 제형화된 모발 조성물이 헤어 스프레이, 무스, 토닉 등과 같이 사용 후 모발에 남는 것이거나 샴푸, 컨디셔너 등과 같이 세정되는 것에 관계없이 사용하는 공중합체에 의해 선택된다. 본 발명에서 사용하는 적합한 용매는 물, 저급 알코올(에탄올, 이소프로판올 등), 하이드로알콜계 혼합물, 탄화수소(이소부탄, 헥산, 데센등), 아세톤, 할로겐화 탄화수소(프레온 등), 탄화수소 에스테르(에틸 아세테이트, 디부틸 프탈레이트 등), 휘발성 실리콘 유도체, 실록산(페닐 펜타메틸 디실록산, 메톡시프로필 헵타메틸 사이클로테트라실록산, 클로로프로필 펜타메틸 디실록산, 하이드록시프로필 펜타메틸 디실록산, 옥타메틸 사이클로테트라실록산, 데카메틸 사이클로펜타실록산 등) 및 이들의 혼합물을 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명은 또한 상기한 친지성 추출물의 제조방법으로 제조된 친지성 추출물을 함유하는 식품 조성물을 제공한다.
상기 식품 조성물은 불포화지방산을 포함하는 것이 바람직하며, EPA(eicosapentanoic acid)를 포함하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 건강기능성 식품은 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 식품은 본 발명에 따른 친지성 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 본 발명에 따른 친지성 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.
본 발명의 음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 0.01 ~ 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ~ 0.03 g 이다.
본 발명의 식품 조성물에서 포함할 수 있는 필수 성분으로서 상기 본 발명에 따른 친지성 추출물본 발명에 따른 친지성 추출물상의 식품과 같이 여러 가지 생약 추출물, 식품 보조 첨가제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 또한, 식품보조첨가제를 추가로 첨가할 수도 있는바 식품보조첨가제는 당업계에 통상적인 식품보조첨가제, 예를 들어 향미제, 풍미제, 착색제, 충진제, 안정화제 등을 포함한다. 상기 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 Ａ, 글리시르히진등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 외에 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 해수로부터 신규한 미세조류인 Achnanthidium sp. BS-001을 분리 및 동정한 뒤 KCTC12679BP로 기탁하였으며, 규소의 농도가 기존의 농도보다 2배 이상일 때 균주를 최적으로 배양할 수 있음을 확인하였다. 또한, 본 발명의 Achnanthidium sp. BS-001 균주가 세포 내에 많은 양의 중성지질을 포함하고 있으며, 세포 건조중량 대비 29%의 지질함량을 가짐을 확인하였다. 아울러, 본 발명의 신규한 균주로부터 추출한 FAME에서 C16이 약 60%, C18이 약 20%로 존재하였으며, 불포화 지방산(오메가 3 지방산)인 EPA(eicosapentaenoic acid)가 약 10%로 존재함을 확인하였다. 또한 카로티노이드 분석결과 다른 미세조류와 비교하여 다양한 종류의 카로티노이드가 높은 함량으로 존재하는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 지질 함량이 현저한 특성을 가지는 신규한 BS-003은 2배 이상의 규소 농도에서 성장 속도가 빨라 균체량이 증가하므로, 이를 배양하면 이로부터 친지성 추출물 또는 FAME을 채취하여 이를 바이오디젤, 화장료 조성물 또는 식품 조성물로서 이용할 수 있다.
본 발명의 지질 함량이 높으면서 성장 속도가 빠른 신규한 미세조류 Achnanthidium sp. BS-001는 세포 성장이 빠르고 지질 함량이 높아 바이오디젤 또는 친지성 추출물을 이로부터 제조할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명에서 분리한 신규한 미세조류 Achnanthidium sp. BS-001을 광학현미경(좌) 및 형광현미경(우)으로 확인한 사진이다.
도 2는 본 발명에서 분리한 신규한 미세조류 Achnanthidium sp. BS-001을 전자현미경으로 확인한 사진이다.
도 3는 본 발명에서 분리한 미세조류 Achnanthidium sp. BS-001의 규소 농도에 따른 성장률을 나타낸 그래프이다:
F/2(-Si): Si(규소)를 제외한 F/2 배지에서 배양한 BS-001의 균체량;
F/2(+Si): Si(규소)를 포함하는 F/2 배지에서 배양한 BS-001의 균체량.
F/2(+2Si): Si(규소)를 2배 이상 포함하는 F/2 배지에서 배양한 BS-001의 균체량; 및
F/2(+3Si): Si(규소)를 3배 이상 포함하는 F/2 배지에서 배양한 BS-001의 균체량.
도 4는 본 발명에서 분리한 미세조류 Achnanthidium sp. BS-001의 규소 농도에 따른 최대분열시간을 나타낸 그래프이다.
도 5는 F/2(+2SI) 배지를 이용한 최적조건에서 Achnanthidium sp. BS-001의 성장곡선을 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 BS-001; 규소 함량을 조절한 BS-001; Chlamydomonas reinhardtii; 및 Chlorella vulgaris의 지질 함량을 확인한 그래프이다.
도 7은 본 발명의 BS-001을 nile red로 염색하여 중성지질을 확인한 도이다.
도 8은 본 발명의 BS-001의 외부 충격에 의한 지질의 용출을 확인한 도이다.
도 9는 본 발명의 BS-001의 지방산 조성을 확인한 도이다.
도 10는 시간별로 Achnanthidium sp. BS-001의 자가응집 효율을 확인한 결과이다.
도 11은 Achnanthidium sp. BS-001의 5분후 세포 침강 정도를 확인한 사진이다.
도 12은 Achnanthidium sp. BS-001과 다른 미세조류와의 카로티노이드 생산 정도를 TLC 로 분석한 결과이다.
도 13는 Achnanthidium sp. BS-001과 다른 미세조류와의 카로티노이드의 총 함량을 비교한 그래프이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 이 기술분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실시예 1> 해수로부터 미세조류 분리 및 동정
<1-1> 미세조류의 분리
남해 바다에서 바닷물 시료를 채취한 뒤 이를 Combi 514R(Hanil, Korea를 이용하여 원심분리법으로 농축하였다. 농축한 바닷물을 마이크로피펫팅(micropipetting)을 통해 각각의 미세조류로 분리하였으며, 분리된 미세조류들을 F/2 media (표 1 내지 표 3)가 들은 5L bottle에서 100μmol/m2/s의 광원하에 100 rpm으로 배양하였다. 분리한 미세조류 중에서 형태적으로 규조류 Achnanthidium sp.와 유사한 형태의 규조류인 BS-001을 분리하였다. 분리한 BS-001을 Nikon ECLIPSE 80i(nikon, Japan 현미경으로 광학 형광이미지를 관찰하였다. 또한 SEM(주사전자현미경)을 사용하여 미세조류의 세부형태를 관찰하였다. 분리된 규조류는 폭은 5 μm, 길이 10 μm 그리고 두께 2.5 μm의 직사각형 형태로 Achnanthidium sp.와 매우 유사함을 알 수 있었다 (도 1, 2).
F/2 배지 조성
Compound Quantity Stock sol.
NaNO3 1 ml 75 g/L dH2O
NaH2PO4·H2O 1 ml 5 g/L dH2O
Na2SiO3·9H2O 1 ml 30 g/L dH2O
F/2 Trace metal solution 1 ml (see below)
F/2 Vitamin solution 1 ml (see below)
Filtered seawater to 1 L
F/2 배지 첨가물(trace metal solution)
Compound Quantity Stock sol.
FeCl3·6H2O 3.15 g -
Na2EDTA·2H2O 4.36 g -
CuSo4·5H2O 1 ml 9.8 g/L
ZnSO4·7H2O 1 ml 22.0 g/L
Na2MoO4·2H2O 1 ml 6.3 g/L
CoCl2·6H2O 1 ml 10.0 g/L
MnCl2·4H2O 1 ml 180.0 g/L
dH2O to 1 L
제조 후 autoclave.
F/2 배지 첨가물 (vitamin solution)
Compound Quantity Stock sol .
Vitamin B12 (cyanocobalamin) 1 ml 1 g/L dH2O
Bioitin 10 ml 0.1 g/L dH2O
Thiamine.HCl 200 mg -
dH2O to 1 L
제조 후 autoclave한 뒤 빛을 피해 냉장 보관.
<1-2> 분리 미생물의 동정
상기 실시예 <1-1>에서 분리한 규조류 BS-001의 동정을 위해 유전학적 방법이 사용되었다.
구체적으로, 규조류 BS-001를 하기 표 4에 기재된 D512F와 D978R 프라이머(Jonas Z. et al, 2011,Barcoding diatoms:evaluation of th V4 subregionon the 18S rRNA gene, including new primers and protocols, Org Divers. Evol.) 쌍을 이용하여 동정하였다. PCR를 위한 혼합물은 표 5와 같은 구성으로 혼합되었고, PCR 운전조건은 표 5 및 6과 같은 조건으로 세팅하여 GeneAmp PCR system 2700(ABI, USA)으로 PCR를 진행하였다.
PCR 결과물의 염기서열 분석 결과, BS-001 18S ribosomal RNA gene partial sequence(서열번호 1)를 동정하였다.
그 결과, 96%내에 매칭되는 결과가 없어 신규한 미세조류임을 알 수 있었다. (도 2).
서열명칭 서열
D512F ATT CCA GCT CCA ATA GCG
D978R GAC TAC GAT GGT ATC TAA TC
반응 혼합물의 조성
DNA 1㎕
D512F 프라이머(12.5 pmol) 1㎕
D978R 프라이머(12.5 pmol) 1㎕
10mM dNTP 혼합물 1㎕
10x PCR 완충액 5㎕
보빈 시럼 알부민(BSA) 0.5㎕
Taq DNA 중합효소(Takara, 일본) 0.5㎕
dH20 18.5㎕
총 부피 25㎕
온도(℃) 시간(분) 횟수(cycle)
초기 변성(pre-denaturation) 95 5 1
변성(denaturation) 94 0.5 30
결합(annealing) 59 0.5
확장(extension) 72 0.5
최종 신장(post-elongation) 72 7 1
본 발명에서 분리한 미세조류 BS-001은 형태적으로 Achnanthidium과 매우 유사하여 Achnanthidium sp. BS-001으로 명명하였고, 2014년 09월 16 일에 KCTC(Korean Collection for Type Cultures에 기탁하였다 (KCTC12679BP).
<실시예 2> BS-001 균주의 최적 배양 조건
상기 <실시예 1>에서 분리한 BS-001 균주의 최적 규소 농도를 확립하기 위하여 규소의 농도를 조정하여 배양하면서 균주의 성장률을 조사하였다. 규소는 Na2SiO3·9H2O를 공급해주고 f/2배지의 Na2SiO3·9H2O의 농도는 0.058 mM이다.
규소의 농도는 구체적으로 0 mM(-SI), 0.058 mM(+SI), 0.106 mM(+2SI) 그리고 0.174 mM(+3SI)의 농도로 조정하여 Achnanthidium sp. BS-001를 배양하고 성장률 및 분열속도를 측정하였다.
그 결과, 규소를 제거한 배지에서는 미세조류의 성장이 둔화되었으며, 규소의 함량을 추가한 경우, 바이오매스 생산성(균체량)이 증가되었다. 규소가 2배 포함된 배지에서 생장률은 0.52로 일반적인 f/2배지보다 약 67%의 증가를 보였다 (도 3, 표7). 규소 농도 3배의 배지는 2배를 넣어준 배지와 크게 차이가 나지 않았다. 따라서, Achnanthidium sp. BS-001을 배양하기 위해 규소가 필수적임을 알 수 있었다.
아울러, F/2(+2SI) 배지를 이용하여 광생물 반응기를 이용하여 배양한 경우, 7일후에 바이오매스가 약 1.00 g/L 생산되었다 (도 4). Achnanthidium sp. BS-001의 바이오매스 생산량은 0.135 g/L/day였으며, 지질생산량은 회분식 배양기를 이용하였을 때 0.039 g/L/day로 높은 수치를 보였다(표 8).
Specific growth rate(μ) Generation time (day)
F/2(-SI) 0.1245 5.567068
F/2(+SI) 0.3121 2.220763
F/2(+2Si) 0.5234 1.324226
F/2(+3SI) 0.5321 1.302575
Specific growth rate (μ) Generation time (day) Biomass DCW(g/L) Lipid content (%) Biomass productivity
(g/L/day)		 Lipid porductivity
(g/L/day)
0.52 1.32 0.98 29 0.135 0.039
<실시예 3> BS-001 균주의 지방량 확인
본 발명의 BS-001 균주의 총 지질 함량을 확인하기 위하여 중성지질을 염색하고 지질을 추출하여 무게를 측정하였다.
구체적으로, nile red를 이용하여 중성지질을 염색하였다.
nile red 염색은 아세톤 10 μg/L의 농도로 nile red powder를 용해시킨 용액을 1 ml의 BS-003 배양액에 1 μl를 넣고 약 1 min간 혼합한다. 반응 후, Nikon ECLIPSE 80i(nikon, Japan)형광 현미경을 이용하여 nile red 염색을 확인한다. 모든 실험과정은 빛이 없는 곳에서 진행한다.
또한, 바이오디젤을 추출할 때 이용되는 녹조류인 Chlamydomonas reinhardtii, Chlorella vulgaris, 본 발명의 Achnanthidium sp. BS-001 그리고 Achnanthidium sp. BS-001를 하루동안 규소 제한상태에서 반응한 시료를 균주를 클로로포름 및 메탄올을 2:1로 혼합한 용매를 이용하여 지질을 추출한 뒤 무게를 측정하여 총 지질 함량을 결정하였다.
약 5.0+E07 정도의 BS-001 배양액 10 ml을 원심분리하여 pellet을 모은 후 15 ml의 CH/ME(2:1) 용매를 첨가하여 ultrasonicator를 이용하여 5분간 cell 파쇄 및 지질을 추출 하였다. 그 후 funnel shaker에서 300 rpm으로 15분간 추출하고 추출된 용액을 DDW를 10 ml을 첨가하고 원심분리하여 유기용매와 물층으로 나누고 유기용매층을 20 ml vial에 넣는다. evaporator로 유기용매를 완전히 증발시킨다. 건조된 무게를 측정하여 cell의 건조중량 대비 지질함량을 계산하였다.
그 결과, 중량비로 지질의 량을 분석한 결과 지질함량이 세포 건조 중량 대비 29%인 것으로 확인되어 다른 미세조류인 Chlamydomonas reinhardtii 및 Chlorella vulgaris 균주들에 비해 약 150% 수준의 높은 지질 함유량을 보였고, 규소 제한 조건에서는 38%로 지질함량이 증가하였다(도 6). 또한 규소제한 상태에서의 nile red염색 후 현미경 본 발명의 Achnanthidium sp. BS-001의 세포 내에 많은 양의 중성지질이 포함된 것이 관찰되었다(도 7). 상기와 같이 영양소 결핍에 의해 지질이 축척된 후, Nile red로 염색된 Achnanthidium sp. BS-001은 파이펫팅, 슬라이드 글라스의 압력 수준과 같은 작은 외부 충격에 의해서도 세포 내 지질, 즉, 중성지질이 쉽게 세포 밖으로 용출되는 것을 현미경으로 확인하였다(도 8).
이러한 세포의 특성은 미세조류를 이용한 바이오에너지 산업에서 본 발명의 BS-001 미세조류를 수확한 후 지질추출 공정을 거칠 때, 적은 에너지를 사용하더라도 지질을 회수할 수 있는 장점을 갖는 것이다.
<실시예 4> BS-001 균주를 이용하여 생산한 FAME의 조성 분석
본 발명의 BS-001 균주로부터 FAME을 추출하였다.
또한, BS-001 균주가 생산한 FAME의 조성을 분석하였다.
구체적으로, 배양한 균주로부터 추출한 FAME을 midi 방법을 이용하여 지질내의 지방산을 메틸레이션하여 GC-FID에서 wax 컬럼을 이용하여 분석하였다.
배양액 5 ml를 취하여 원심분리하여 미세조류 균체를 모은 후, 유리 튜브에 옮겨 표 9의 reagent 1를 1 ml 첨가한다. 미세조류 균체가 잘 분산되도록 vortexing을 한 후, 100℃에서 5분간 반응시킨다. 다시 vortexing을 한 후, 25분간 반응시킨다. 반응액의 온도가 상온 정도로 낮아지면 reagent 2를 2 ml 넣고 vortexing 후, 80℃에서 10분간 반응한 후, 빠르게 냉각시킨다. 냉각된 반응물에 reagent 3을 1.25 ml 넣어 10분간 교반하여 FAME를 추출한다. 마지막으로 reagent 3 ml를 넣어 세척한 후 1 ml 취하여 PTFE(Polytetrafluoroethylene) 유기용매 필터를 이용하여 GC 바이알(vial)로 필터링하여 옮긴 뒤 C17 내부표준물질 (internal standard, Fluka 제품) 50 ㎕를 첨가하여 분석용 샘플을 만들었다. FAME 분석은 가스크로마토그래피 (Shimadzu GC-2010, Japan)를 이용하였으며, wax column(Zebron, ZB-WAX,maximum temperature: 250℃, phonomenex, USA) 과 FID detector(flame ionization detector, 최대온도: 300℃)을 사용하여 FAME를 검출하였다. 검출에 사용된 injection volume은 1 ㎕ 였고, 총 검출시간은 25 분으로 한정하였다. 바이오디젤 분석을 위한 표준 물질로서 Supelco의 FAME mix 18918(c8~c24)를 사용하였다. 각 샘플의의 피크 지점과 표준 물질의 피크지점을 상대 비교한 뒤, 반응조건에 따른 바이오디젤 값을 정량하였다.
Reagent 1 Saponification Reagent
NaOH 45 g, Methanol 150 ml, DDW 150 ml
Reagent 2 Methylation Reagent
6N HCl 325 ml, Methanol 275 ml
Reagent 3 Extraction Solvent
Hexane 200 ml, Methyl tert-butyl ether 200ml
Reagent 4 Base Wash
NaOH 10.8 g, DDW 900ml
추출한 FAME의 성분을 분석한 결과, C16이 전체 지방산의 60%정도로 존재했으며, C18이 20%정도로 지방산 조성에서 높은 함유량을 보였다. 아울러, DPA와 함께 음식물을 통해 섭취해야만 하는 불포화 지방산(오메가 3 지방산)으로 콜레스테롤 저하, 뇌기능 촉진 등 각종 질병 예방에 효과가 있다고 알려진 EPA(eicosapentaenoic acid)가 10% 수준으로 존재하는 것을 확인하였다(도 9).
<실시예 6> BS-001 균주의 응집 효율 분석
본 발명의 BS-001 균주는 다른 미세조류에 비해 매우 빠른 자가응집효율을 보이는 것을 다음의 실험으로 확인하였다. 먼저, 미세조류 응집을 위해 스펙트로미터(Spectrophotometer)를 이용하여 세포 밀도(cell density)를 측정함으로써 미세조류의 침강된 정도를 확인하였다.
미세조류의 침강을 확인하기 위해 BS-001 배양액 50 ml 튜브에 옮겨 충분히 혼탁한 후, 실험 테이블위에 정치하였다. 침강이 시작되는 시점부터 1 분마다 tube의 중간지점에서 1 ml를 수집하여 OD680 nm에서 OD값을 측정하여 자가응집효율를 계산하였다. 그 결과, 정치 1분 후에 큰 크기의 파티클은 60% 응집 및 침강이 발생하였으며, 작은 파티클이 서서히 응집 후 침강을 시작하여 5분 후 87%에 도달하였다(도 10 및 도 11). 통상적으로 미세조류 배양 후 수확을 위해서는 많은 에너지가 소모되나, BS-001의 이러한 응집 및 침강 속도는 다른 미세조류에 비해 매우 빠른 침강속도임을 확인하였다. BS-001의 빠른 응집 및 침강속도는 미세조류의 biomass 수확에 큰 경쟁력을 갖는다.
<실시예 7> BS-001 균주의 carotenoides 분석
BS-001의 카로티노이드 분석은 TLC(Thin-layer chromatography)를 이용하여 수행하였다. 수행방법은 미세조류 10 ml를 수확하여 petroleum ether 2 ml과 acetone 2ml로 추출하고 10% NaCl 2 ml로 saponification을 수행한 후, 용매층을 수확하여 10배 농축하였다. 사용한 TLC는 silica gel plate를 사용하였으며, mobile phase는 100 ml의 petroleum ether, 11 ml의 acetone 그리고 1 ml의 DW를 혼합한 용매를 사용하였다. 아크난티디움 BS-001과 기타 미세조류의 카로티노이드의 비교를 위해 오돈텔라, 클로렐라 그리고 파라클로렐라를 동일한 세포 농도에서 동일한 추출과정을 통하여 추출한 후 함께 TLC를 수행하였다. TLC분석 후, Gene tool image 분석 시스템을 이용하여 TLC band의 RF값 및 농도를 측정하였다. 분석결과 오돈텔라는 5 종류의 카로티노이드, 클로렐라는 6종류의 카로티노이드, 파라클로렐라는 3 종의 카로티노이드 그리고 아크난티디움 BS-001은 6종의 카로티노이드가 확인되었으며, 파라클로렐라를 제외하고 모두 β-carotene을 확인할 수 있었다(도 12). 또한 이미지분석 프로그램을 통해서 카로티노이드의 양을 측정한 결과 아크난티디움은 오돈텔라와 클로렐라에 비해 20%, 파라클로렐라에 비해 약 200%가 많은 높은 함량으로 카로티노이드를 함유하는 것으로 확인되었다(도 13). 이러한 결과는 아크난티디움 BS-001이 바이오디젤 이외에 카로티노이드를 이용한 식품 및 화장품 산업에 이용될 수 있음을 의미한다.
한국생명공학연구원 KCTC12679BP 20140916
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> NOVEL MICROALGAE OF ACHNANTHIDIUM SP. AND ITS USE <130> P14R16D1234 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 394 <212> DNA <213> Achnanthidium <400> 1 gaaatgtatc taatcatctt cgatccccta actttcgttc ttgattaatg aaaacatcct 60 tggtaaatgc tttcgcagta gttcgtcttc cagaaatcca agaatttcac ctctgacaat 120 ggaatacgaa tacccccaac tgtccctgtt aatcatttcc aaggcccgca aaccaacaaa 180 ataggaccaa agacctatct tattattcca tgctaatata ttcaacggca taagcctgct 240 ttgaacactc taattttttc acagtaaacg atgggcatcc tctgcacgac aacctaatgc 300 cacacaaaat ccacccaagg atggcacgat cgcagcaaaa ccaaatcaat ggacgccaca 360 accaatgcca caaatccaac tacgagctta cgca 394 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D512F forward primer <400> 2 attccagctc caatagcg 18 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> D978R reverse primer <400> 3 attccagctc caatagcg 18

Claims (10)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 1) 미세조류 Achnanthidium sp. BS-001(KCTC12679BP) 균주를 60 내지 70 g/L의 Na2SiO39H2O를 포함하는 배지에서 배양하는 단계; 및
    2) 상기 단계 1)에서 배양한 균주로부터 카로티노이드를 추출하는 단계;
    를 포함하는, 미세조류 Achnanthidium sp. BS-001(KCTC12679BP) 균주로부터 카로티노이드(carotenoide)를 생산하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 단계 2)의 추출은 용매 추출(solvent extraction) 방법에 의해 행하는 것을 특징으로 하는, 미세조류 Achnanthidium sp. BS-001(KCTC12679BP) 균주로부터 카로티노이드(carotenoide)를 생산하는 방법.
  9. 미세조류 Achnanthidium sp. BS-001(KCTC12679BP) 균주 또는 상기 균주의 추출액을 함유하는, 카로티노이드(carotenoide) 물질 생산용 조성물.
  10. 삭제
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