KR101855733B1

KR101855733B1 - 고농도의 이산화탄소 및 고염 조건에서 지질 생산성 및 세포 생장률이 우수한 클로렐라 속 abc-001 균주 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101855733B1
Application number: KR1020170134365A
Authority: KR
Inventors: 장용근; 조준묵; 이봉수; 김은경; 문명훈
Original assignee: 재단법인 탄소순환형 차세대 바이오매스 생산전환 기술연구단
Priority date: 2017-10-17
Filing date: 2017-10-17
Publication date: 2018-05-09
Also published as: WO2019078398A2; WO2019078398A3

Abstract

본 발명은 내염성을 가지며 고농도 이산화탄소 조건에서 잘 자라고, 지질을 많이 축적하는 신규한 클로렐라 속 ABC-001 균주를 제공하는 것이다. 본 발명의 신규한 클로렐라 속 ABC-001 균주는 담수와 염도가 있는 기수 및 해수에서 거의 동일한 세포 생장과 지질 생산성을 보이며 특히, 해수에서 배양했을 시 자연침전으로 수확이 용이하다. 본 발명의 내염성을 가지며 고농도 이산화탄소 조건에서 높은 지질 생산성을 가진 클로렐라 속 ABC-001 균주는 해안에 인접한 발전소 배기가스 내 이산화탄소를 효과적으로 제거할 수 있으며, 바이오매스 생산 및 이를 원료로 사용하여 유용한 물질을 생산하는 공정에 큰 기여를 할 수 있어 관련 산업에 매우 유용하다.

Description

고농도의 이산화탄소 및 고염 조건에서 지질 생산성 및 세포 생장률이 우수한 클로렐라 속 ABC-001 균주 및 이의 용도{Chlorella sp. ABC-001 strain having excellent lipid productivity and cell growth rate under high carbon dioxide and salt concentration condition and uses thereof}

본 발명은 고농도의 이산화탄소 및 고염 조건에서 지질 생산성 및 세포 생장률이 우수한 클로렐라 속 ABC-001 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.

범지구적인 환경문제인 지구 온난화는 대기 중의 이산화탄소가 주원인으로 알려져 있다. 대기 중 이산화탄소 농도를 증가시키는데 가장 큰 기여를 한 것은 화력발전소이다. 화력발전소에서 배출되는 배기가스에는 5-15%의 고농도 이산화탄소가 포함되어 있는데 아직까지 이를 제거할 수 있는 상용화 기술이 없다. 전 세계적으로 대기 중의 이산화탄소를 제거하기 위해 많은 투자와 개발이 이뤄지고 있고 그러한 방법들 중 하나로 미세조류가 각광을 받고 있다. 이산화탄소와 빛을 이용하는 광합성을 통해 성장하는 미세조류는 육상식물에 비해 생장율이 월등히 높고 이산화탄소 이용률 또한 높다. 그러나 미세조류가 잘 자랄 수 있는 일반적인 이산화탄소의 농도는 2~5%이며 고농도의 이산화탄소 조건에서는 생장에 저해를 받는다. 하지만 효율적으로 화력발전소에서 배출되는 배기가스 내 이산화탄소를 제거하기 위해서는 고농도 이산화탄소 조건에서 높은 생장성을 보이는 미세조류 균주가 필요하다.

미세조류는 이산화탄소를 직접적으로 이용하거나 이산화탄소를 이용하는 광합성을 통해 얻어진 환원당을 사용하여 지질, 탄수화물, 단백질과 같은 유용한 물질을 만들어낸다. 이러한 물질들은 바이오연료, 건강기능식품, 화장품, 사료 등의 원료로 활용 가능하며, 미세조류 바이오매스 자체로도 활용도가 매우 높다. 이 중에서도 미세조류의 지질을 이용하여 바이오연료를 생산하면 화석연료의 사용을 줄일 수 있기 때문에 대기 중 이산화탄소 증가를 줄이는데 기여할 수 있다. 또한 미세조류의 지질에는 건강에 좋다고 알려진 ω3와 ω6 지방산들이 포함되어 있어 영양학적으로도 가치가 있다. 이러한 장점들 때문에 미세조류의 지질 축적에 대한 많은 연구가 이뤄져왔다. 미세조류의 지질 축적을 촉진시키는데 다양한 방법이 있지만 그 중 잘 알려진 방법 중 하나가 염 스트레스를 주는 것이다. 높은 염 조건에서 배양을 하게 되면 미세조류가 스트레스를 받게 되고 이 과정에서 미세조류는 지질을 더 많이 축적한다. 하지만 이런 종류의 스트레스를 받게 되면 미세조류 내 지질축적은 높아지나 세포의 성장은 떨어지게 되고 결국에는 생산성에 악영향을 끼치게 된다. 이 때문에 높은 염 스트레스에서도 지질 축적률이 좋으며 생장을 유지하는 미세조류 균주를 찾는 것이 중요하다.

이렇게 높은 염도에서도 생장성을 유지하는 균주는 해수나 기수에서도 배양이 가능하다는 장점이 있다. 담수에 비해 해수는 절대적으로 양이 많고 식수나 생활수와 겹치지 않기 때문에 대량으로 공급되는데 큰 부담이 없다. 또한 대부분 화력발전소는 해안과 인접한 곳에 위치해 있어서, 화력발전소 배기가스 내 이산화탄소를 제거하기 위해 내염성을 가진 미세조를 배양할 때 해수의 공급이 수월하다. 그러므로 내염성을 가지며 고농도 이산화탄소 조건에서 높은 지질 생산성을 가진 균주는 발전소 배기가스 내 이산화탄소를 효과적으로 제거하며 바이오매스 생산 및 이를 원료로 사용하여 유용한 물질을 생산하는 공정에 큰 기여를 할 수 있다.

한편, 한국등록특허 제1743232호에서는 '염류 스트레스를 이용하여 지질함량을 증가시킨 미세조류 및 그의 제조방법'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2016-0143327호에서는 '미세조류의 배양방법 및 이를 이용한 미세조류의 세포 내에 축적되는 영양 성분의 함량을 조절하는 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이, 고농도의 이산화탄소 및 고염 조건에서 지질 생산성 및 세포 생장률이 우수한 클로렐라 속 ABC-001 균주 및 이의 용도에 대해서는 밝혀진 바가 전혀 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 내염성을 가지면서도 고농도 이산화탄소 조건에서 높은 생장성과 지질 생산성을 보이는 신규한 클로렐라 속 ABC-001 균주를 분리하였다. 구체적으로, 본 발명의 클로렐라 속 ABC-001 균주는 공기만 공급했을 때보다 이산화탄소를 10% 또는 15%로 혼합하였을 때 높은 성장률을 보였고, 해수와 같은 염도(35 g/L)에서도 세포의 생장성을 유지하며 담수배지(0 g/L) 대비 건조균체중량에서 큰 차이를 보이지 않은 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 내염성을 가지며 고농도 이산화탄소 조건에서 높은 지질 생산성을 가진 클로렐라 속 ABC-001 균주는 해안에 인접한 발전소 배기가스 내 이산화탄소를 효과적으로 제거할 수 있으며, 바이오매스 생산 및 이를 원료로 사용하여 유용한 물질을 생산하는 공정에 큰 기여를 할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 고농도의 이산화탄소 및 고염 조건에서 지질 생산성 및 세포 생장률이 우수한 클로렐라 속(Chlorella sp.) ABC-001 균주를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 지질 생산용 미생물제제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주를 배양하고, 그 배양액으로부터 지질을 분리하는 것을 특징으로 하는 지질의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주를 배양하는 단계;

상기 배양액으로부터 지질을 분리하는 단계;

상기 지질을 트랜스에스테르화시켜 지방산 에스테르를 생산하는 단계; 및

상기 생산된 지방산 에스테르를 바이오디젤로 전환하는 단계를 포함하는 바이오디젤의 생산 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액, 상기 배양액의 농축물 또는 상기 배양액의 건조물을 유효성분으로 함유하는 식품, 사료 조성물 또는 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주를 배양하는 단계;

상기 배양액으로부터 지질을 분리하는 단계; 및

상기 분리한 지질을 촉매전환시켜 항공유로 전환하는 단계를 포함하는 바이오항공유의 생산 방법을 제공한다.

도 1은 본 발명에서 선별한 미세조류로부터 얻은 18s rRNA 유전자 서열(서열번호 1) 정보를 토대로 작성된 계통수를 나타낸다.
도 2는 본 발명에서 선별한 미세조류를 공기 또는 공기와 10% 또는 15%의 농도로 이산화탄소를 혼합한 배양기에 300 mL/min를 넣어주면서 배양한 후 세포 성장률을 건조균체중량(Dry cell weight, DCW)으로 나타낸 결과이다.
도 3은 본 발명의 실시예 3에서 성장률이 가장 우수하였던 10% 이산화탄소 조건에서 천일염이 첨가된 해수 배지를 만들어 본 발명에서 선별한 미세조류의 내염성 테스트를 수행한 결과이다. 동일한 배양조건 아래 천일염을 0, 7, 21, 35 g/L 농도로 맞추어 배지에 첨가한 후 독립적인 배양을 2회씩 실시하였다.
도 4는 본 발명에서 선별한 미세조류를 공기 또는 공기와 10% 또는 15%의 농도로 이산화탄소를 혼합한 배양기에 300 mL/min를 넣어주면서 배양한 후 세포 성장률 및 지질생산성을 확인한 결과이다.
도 5는 본 발명의 실시예 3에서 성장률이 가장 우수하였던 10% 이산화탄소 조건에서 천일염이 첨가된 해수 배지를 만들어 내염성 테스트를 수행한 후 세포 성장률 및 지질생산성을 확인한 결과이다. 동일한 배양조건 아래 천일염을 0, 7, 21, 35 g/L 농도로 맞추어 배지에 첨가한 후 독립적인 배양을 2회씩 실시하였다.
도 6은 본 발명에서 선별한 미세조류를 10% 이산화탄소 조건에서 다양한 염 농도에서 배양 후 지방산 조성을 나타낸다.
도 7은 실시예 4에서 배양이 끝난 후 배양액 각각 약 12 mL를 15 mL 팔콘 튜브에 옮겨 담고 팔콘 튜브를 고정시킨 후 24시간 동안 세포가 가라앉는 자연침전을 관찰한 결과이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 고농도의 이산화탄소 및 고염 조건에서 지질 생산성 및 세포 생장률이 우수한 클로렐라 속(Chlorella sp.) ABC-001 균주를 제공한다.

상기 클로렐라 속(Chlorella sp.) ABC-001 균주는 영월지역의 하천에서 분리하여 동정하였으며, 공기만 공급했을 때보다 이산화탄소를 10% 또는 15%로 혼합하였을 때 높은 성장률을 보였고, 해수와 같은 염도(35 g/L)에서도 세포의 생장성을 유지하며 담수배지(0 g/L) 대비 건조균체중량에서 큰 차이를 보이지 않은 것을 확인하였으며, 상기 클로렐라 속(Chlorella sp.) ABC-001 균주는 한국생명공학연구원(KCTC)에 2017년 08월 29일자로 기탁하였다(기탁번호: KCTC18607P).

본 발명의 일 구현 예에 따른 균주에서, 상기 고농도의 이산화탄소 및 고염은 각각 1~18% 이산화탄소 및 33~40g/l 염일 수 있고, 바람직하게는, 1~15% 이산화탄소 및 33~37g/l 염일 수 있고, 가장 바람직하게는 10% 이산화탄소 및 35g/l 염일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 미생물 제제는 클로렐라 속(Chlorella sp.) ABC-001를 유효성분으로 포함할 수 있으며, 바이오오일의 대량 생산에 효과적으로 이용될 수 있다. 상기 대량 생산된 바이오오일은 트랜스에스테르화 과정을 통해 바이오디젤을 생산하는데 이용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 균주를 배양하고, 그 배양액으로부터 지질을 분리하는 것을 특징으로 하는 지질의 제조 방법을 제공한다. 상기 균주는 1~18% 이산화탄소 및 33~40g/l 염인 조건에서 지질을 고생산할 수 있으며, 바람직하게는, 1~15% 이산화탄소 및 33~37g/l 염일 수 있고, 가장 바람직하게는 10% 이산화탄소 및 35g/l 염일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 세포주 배양액으로부터 지질을 분리하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다. 본 발명의 세포주는 해수 배양 후 자연침전을 통해 균주를 수확할 수 있으므로, 세포 수확 후 지질 추출 및 추출 후 공정을 최소화할 수 있는 장점이 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 균주의 배양은 담수, 해수 또는 기수에서 배양하는 것일 수 있고, 바람직하게는 해수에서 배양하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법은 상기 해수 배양 후 자연침전을 통해 균주를 수확하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은

상기 균주를 배양하는 단계;

상기 배양액으로부터 지질을 분리하는 단계;

상기 균주의 배양 조건으로, 1~18% 이산화탄소 및 33~40g/l 염인 조건에서 배양된다. 균주 배양 배지는 당업계에서 일반적으로 통용되는 배지를 이용할 수 있다.

본 발명의 균주 배양액으로부터 지질을 추출하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다. 상기 추출용매는 펜탄, 헥산, 사이클로헥산, 톨루엔, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 아세톤, 클로로포름, 메탄올, 에탄올 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

또한, 본 발명은 클로렐라 속(Chlorella sp.) ABC-001 균주로부터 생산된 트라이글리세리드를 트랜스에스테르화시켜 지방산 에스테르와 글리세롤을 분리하여 바이오디젤을 제조할 수 있다. 상기 지방산 에스테르는 바람직하게는, 지방산 메틸 에스테르 또는 지방산 에틸 에스테르일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 바이오디젤은 바이오매스에 포함된 지방산의 트랜스에스테르화 과정에 의해 메틸 에스테르 또는 에틸 에스테르 형태로 생산될 수 있다. 상기 트랜스에스테르화 과정은 바이오매스에 포함된 지방의 크고 가지를 낸 분자 구조를 정규 디젤 엔진이 요구하는 작고 직선 사슬의 분자로 변형시키는 방법을 말한다. 상기 트랜스에스테르화 과정의 유화제로서 Triton X-100 또는 Tween 60 등을 첨가할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 유화제는 바이오오일의 계면 안정을 도모하고 잘 혼합되도록 하여 반응 수율을 높여서 바이오디젤의 회수 비용을 절약할 수 있게 한다. 또한, 상기 트랜스에스테르화 과정의 반응 촉매제로서 수산화나트륨 또는 수산화칼륨을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 상기 배양액의 건조물을 유효성분으로 함유하는 식품을 제공한다. 상기 클로렐라 속(Chlorella sp.) ABC-001 균주는 불포화 지방산을 포함한 지질함량이 높기 때문에, 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 식품은 영양학적으로 매우 가치가 높다. 상기 식품은 상기 균주를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있으며 가공식품 형태로 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 상기 가공식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 클로렐라 속(Chlorella sp.) ABC-001 균주 분말을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 가공식품을 모두 포함한다.

또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 상기 배양액의 건조물을 유효성분으로 함유하는 사료 조성물을 제공한다. 사료 조성물 중의 상기 클로렐라 속(Chlorella sp.) ABC-001 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 상기 배양액의 건조물의 함량은 급여 가축의 종, 주령, 체중, 및 사육 조건 등에 따라 적절히 선택될 수 있다. 본 발명의 사료 조성물은 기술분야에 공지된 사료 제조방법에 따라 제조될 수 있으며, 예를 들어, 각종 사료 원료 또는 배합사료와 본 발명의 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 상기 배양액의 건조물을 혼합한 후, 추가적인 가공 공정, 예를 들어 펠렛 형태로의 성형 또는 과립 등의 형태로의 절단 단계 등을 더 수행함으로써 제조될 수 있다. 본 발명의 사료 조성물의 구성성분, 조성, 제조방법, 급여방법 등은 기술분야에 공지된 통상의 기술로부터 적절히 선택될 수 있음이 통상의 기술자에게 명백하다.

또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 상기 배양액의 건조물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공한다. 본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 상기 클로렐라 속(Chlorella sp.) ABC-001 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 상기 배양액의 건조물 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다. 본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수(스킨), 영양 화장수(밀크로션), 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 균주를 배양하는 단계;

상기 배양액으로부터 지질을 분리하는 단계; 및

본 발명의 상기 균주 배양 배지는 당업계에서 일반적으로 통용되는 배지를 이용할 수 있으며, 본 발명의 균주 배양액으로부터 지질을 분리하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.

본 발명에 따른 바이오항공유 제조방법은 통상적으로 수소를 첨가하지 않고 촉매의 존재 하에서 지질로부터 탈산소(deoxygenation), 이성화(isomerization) 및 탈산소(deoxygenation), 이성화(isomerization) 및 크래킹(cracking) 반응을 통해 파라핀계 탄화수소를 형성시키고, 상기 반응생성물을 증류시켜 항공유분을 추출하는 단계를 포함하여 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 상기 촉매반응을 위해 사용되는 촉매로는 NiMo, CoMo, Pt, Pd가 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 미세조류 채취 및 선별

영월지역의 하천에서 시료를 채취한 뒤, 이산화탄소 혼합가스(CO₂ 10%, 공기 90%)를 공급하며 N8 액체배지에서 형광등을 광원으로 3주간 정치 배양한 후 100 ㎍/mL의 앰피실린을 포함한 동일 고체배지 위에 100 ㎕ 만큼 떨어뜨려 넓게 퍼뜨려 주었다. 그 후, 형성된 콜로니들 중 단일 콜로니들을 선별하여 계대하였다. 실험에서 사용된 N8 배양액의 조성은 다음과 같다; 5 mM KNO₃, 5.44 mM KH₂PO₄, 1.83 mM Na₂HPO₄, 0.2 mM MgSO₄·7H₂O, 0.12 mM CaCl₂·2H₂O, FeNaEDTA·3H₂O 및 1 ml micronutrient (0.01 mM ZnSO₄·7H₂O, 0.07 mM MnCl₂·4H₂O, 0.07 mM CuSO₄·5H₂O, 0.01 mM Al₂(SO₄)₃·18H₂O)

실시예 2. 분류학적 분석

선별한 미세조류의 신규성을 확인하고, 미세조류가 속한 종을 확인하기 위해 18s rRNA 유전자 서열을 분석하였다. 상기 균주의 DNA는 DNeasy Plant Mini kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 추출하였으며, 서열 분석을 위해 클로렐라 18s rRNA 유전자 분석용으로 사용되는 프라이머 18SF(5'-CCT GGT TGA TCC TGC CAG-3': 서열번호 2)와 18SR(5'-TTG ATC CTT CTG CAG GTT CA-3': 서열번호 3)를 사용하여 염기서열 정보를 읽었다. 얻은 염기서열(서열번호 1)에 대하여 NCBI 데이터베이스를 기반으로 Blast한 결과, 현재까지 보고되지 않은 신규 종임을 확인할 수 있었고, 클로렐라 종과 유연관계가 깊은 것으로 판단되었다. 따라서 관련된 종들의 18s rRNA 유전자 정보와 함께 계통수를 그려 조사하였으며, 이를 근거로 신규 미세조류 종이 클로렐라(Chlorella)에 속하는 균주임을 밝혔다(도 1). 따라서 상기 균주를 KCTC 생물자원센터에 기탁하였다.(기탁번호 KCTC18607P)

실시예 3. 이산화탄소 농도에 따른 생장량 측정

신규 클로렐라 속 ABC-001의 이산화탄소 농도별 생장속도를 보기 위하여, 다양한 이산화탄소 농도에서 배양을 실시하였다. 배양액 부피를 500 mL로 하는 Pyrex 유리재질의 기포탑 광생물반응기에 초기 세포농도를 660 nm 파장대의 흡광도를 기준으로 0.2에 맞추었다. 이산화탄소 공급은 공기 또는 공기와 이산화탄소를 혼합한 10% 또는 15%의 농도로 배양기에 300 mL/min를 넣어주었다. 배양액으로는 N8 배지를 사용했으며, 170 μmol photons/m²/s의 빛 세기에서 30℃의 조건을 각각 유지하며 독립적인 배양을 2회씩 실시하였다. 7일간 건조균체중량(Dry cell weight, DCW)을 매일 측정하여 미세조류의 생장성을 확인하였다. 건조균체중량은 3-5 mL의 배양액을 GF/C 여과지를 통과시켜 세포만 분리한 후 증류수로 2번 이상 세척하고 70℃에서 24시간 건조 후 무게를 측정하여 계산하였다. 그 결과 공기만 공급했을 때보다 이산화탄소를 10%, 15%로 혼합하였을 때 높은 성장률을 보였고 10%일 때 가장 높은 2.9 g/L까지 도달하였다(도 2). 이를 통해 본 균주가 이산화탄소 고농도에서도 높은 생장성을 보인다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4. 천일염 농도에 따른 생장량 측정

실시예 3에서 성장률이 가장 우수하였던 10% 이산화탄소 조건에서 천일염이 첨가된 해수 배지를 만들어 내염성 테스트를 수행하였다. 동일한 배양조건 아래 천일염을 0, 7, 21, 35 g/L 농도로 맞추어 배지에 첨가한 후 독립적인 배양을 2회씩 실시하였다. 7일간 배양한 결과 본 균주가 해수와 같은 염도(35 g/L)에서도 세포의 생장성을 유지하며 담수배지(0 g/L) 대비 건조균체중량에서 큰 차이를 보이지 않은 것을 확인하였다(도 3). 또한 천일염뿐만 아니라 NaCl을 첨가한 염수 그리고 실제 해수를 사용하여 동일한 염도에서 배양했을 시에도 높은 생장성을 보이며 이를 통해 본 균주의 내염성을 검증하였다.

실시예 5. 지질 추출 및 성분 분석

배양이 끝난 후 배양액을 4000 RPM에서 1분간 원심분리하여 세포들을 분리하였다. 분리한 세포들은 증류수로 2번 씻어준 후 최종적으로 얻어진 바이오매스는 3일간 동결건조를 진행하여 추출이 용이하게 하였다. 건조된 세포를 유리 튜브에 10 mg씩 무게를 재어 지방산 (Fatty Acid Methyl Ester, FAME) 분석에 사용하였고 50 mg씩은 총지방량 (Total lipid content)을 측정하는데 사용하였다.

지방산 분석을 위에 건조된 세포에 클로로포름-메탄올 (2:1 v/v) 혼합액 2 mL을 주입 후 섞어준 후에 내부표준물질 (100 mg heptadecanoic acid/200 mL chloroform) 1 mL, 메탄올 1 mL와 황산 0.3 mL를 추가하고 섞어주었다. 그리고 100℃에서 10분간 반응시키고 상온까지 식힌 후 증류수 1 mL를 첨가한 후 섞어주었다. 층 분리를 위하여 4000 RPM에서 10분간 원심분리를 한 후 주사기를 이용하여 하층액의 유기상 약 1 mL를 뽑아 여과 후 GC (Gas Chromatograph) 분석용 바이알에 담았다. 추출한 지방산 분석은 Flame ionized detector (FID)가 장착된 GC (HP 6890 Agilent, USA)을 이용하여 분석하였다.

총지방량 분석을 위해 건조된 세포에 클로로포름-메탄올 (2:1 v/v) 혼합액 10 mL을 주입 후 4시간 동안 Bath sonicator를 사용하여 음파처리(sonication)를 하였다. 그리고 증류수 2.5 mL를 넣고 섞어준 후 층 분리를 위하여 4000 RPM에서 10분간 원심분리를 하였다. 그 후 주사기를 이용하여 하층액의 유기상 5 mL를 뽑아 미리 무게를 잰 유리튜브에 옮겨 담았다. 튜브에 질소를 불어주며 용매를 모두 증발시킨 후 지질만 남아있는 유리튜브의 무게를 재어 총지질량을 계산하였다.

고농도 이산화탄소 조건에서 배양한 세포들과 공기만 불어 넣어 배양한 세포들의 총 지질함량을 비교해보았을 때 고농도 이산화탄소 조건에서 지질 함유량이 더 높은 것을 확인할 수 있다 (도 4). 또한 바이오매스 농도 또한 고농도 이산화탄소 조건에서 더 높기 때문에 공기 조건에 비해 총 지방 생산성 (g/L/d)이 10% 이산화탄소 조건에서 약 8배, 15% 조건에서 4.5배 높았다.

또한 해수에서 배양한 세포들로 총 지방량 및 지방산 조성 분석을 하였다. 그 결과 총 지질함량은 천일염 농도 변화에 영향을 받지 않는 것을 볼 수 있었다 (도 5). 이 결과를 통해 본 균주가 담수와 해수 그리고 담수와 해수의 중간인 기수에서도 지질 생산성을 거의 동일하게 유지시킬 수 있는 것을 확인하였다. 지방산 조성도 크게 달라지지 않았으며 팔미트산 (C16:0), 스테아르산 (C18:0), 올레산 (C18:1n9c), 리놀레산 (C18:2n6c), 리놀렌산 (C18:3n3c) 이 공통적으로 지질의 주 성분을 이루었다 (도 6). 이들은 모두 바이오연로로 전환이 가능하기 때문에 본 균주의 배양을 통해서 얻어진 지질의 가치를 검증할 수 있다.

실시예 6. 천일염 농도에 따른 침전율

실시예 4에서 배양이 끝난 후 배양액 각각 약 12 mL를 15 mL 팔콘 튜브에 옮겨 담고 팔콘 튜브를 고정시킨 후 24시간 동안 세포가 가라앉는 것을 관찰하였다 (도 7). 약 2시간이 지난 후 천일염 35 g/L 조건에서 배양한 세포들이 눈에 띄게 가라앉는 것을 확인할 수 있었고 24시간 후에는 대부분의 세포들이 튜브의 바닥에 뭉쳐있는 것을 관찰하였다. 그 외의 조건들에서는 약 6시간이 지난 후 세포들이 침전하는 속도에서 차이를 확인할 수 있었다. 24시간이 지난 후 천일염의 농도가 높은 농도에서 배양한 세포들이 빨리 자연침전되는 것을 검증할 수 있었다. 이를 통해 본 균주를 해수에서 배양했을 시 담수에서 배양했을 때에 비해 비슷한 생장과 지질 함량을 유지하면서도 수확이 용이하다는 것을 보였다.

한국생명공학연구원

KCTC18607P

20170829

<110> ADVANCED BIOMASS R＆D CENTER <120> Chlorella sp. ABC-001 strain having excellent lipid productivity and cell growth rate under high carbon dioxide and salt concentration condition and uses thereof <130> PN17345 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1795 <212> DNA <213> Chlorella sp. <400> 1 cctggttgat cctgccagta gtcatatgct tgtctcaaag attaagccat gcatgtctaa 60 gtataaactg ctttatactg tgaaactgcg aatggctcat taaatcagtt atagtttatt 120 tgatggtacc tactactcgg atacccgtag taaatctaga gctaatacgt gcgtaaatcc 180 cgacttctgg aagggacgta tttattagat aaaaggccga ccgggctctg cccgactcgc 240 ggtgaatcat gataacttca cgaatcgcat ggccttgtgc cggcgatgtt tcattcaaat 300 ttctgcccta tcaactttcg atggtaggat agaggcctac catggtggta acgggtgacg 360 gaggattagg gttcgattcc ggagagggag cctgagaaac ggctaccaca tccaaggaag 420 gcagcaggcg cgcaaattac ccaatcctga cacagggagg tagtgacaat aaataacaat 480 actgggcctt ttcaggtctg gtaattggaa tgagtacaat ctaaacccct taacgaggat 540 caattggagg gcaagtctgg tgccagcagc cgcggtaatt ccagctccaa tagcgtatat 600 ttaagttgct gcagttaaaa agctcgtagt tggatttcgg gtggggcctg ccggtccgcc 660 gtttcggtgt gcactggcag ggcccacctt gttgccgggg acgggctcct gggcttcact 720 gtccgggact cggagtcggc gctgttactt tgagtaaatt agagtgttca aagcaggcct 780 acgctctgaa tacattagca tggaataaca cgataggact ctggcctatc ctgttggtct 840 gtaggaccgg agtaatgatt aagagggaca gtcgggggca ttcgtatttc attgtcagag 900 gtgaaattct tggatttatg aaagacgaac tactgcgaaa gcatttgcca aggatgtttt 960 cattaatcaa gaacgaaagt tgggggctcg aagacgatta gataccgtcc tagtctcaac 1020 cataaacgat gccgactagg gatcggcgga tgtttcttcg atgactccgc cggcacctta 1080 tgagaaatca aagtttttgg gttccggggg gagtatggtc gcaaggctga aacttaaagg 1140 aattgacgga agggcaccac caggcgtgga gcctgcggct taatttgact caacacggga 1200 aaacttacca ggtccagaca tagtgaggat tgacagattg agagctcttt cttgattcta 1260 tgggtggtgg tgcatggccg ttcttagttg gtgggttgcc ttgtcaggtt gattccggta 1320 acgaacgaga cctcagcctg ctaaatagtc acggttggtt ctccagccgg cggacttctt 1380 agagggacta ttggcgacta gccaatggaa gcatgaggca ataacaggtc tgtgatgccc 1440 ttagatgttc tgggccgcac gcgcgctaca ctgatgcatt caacgagcct agccttggcc 1500 gagaggcccg ggtaatcttt gaaactgcat cgtgatgggg atagattatt gcaattatta 1560 atcttcaacg aggaatgcct agtaagcgca agtcatcagc ttgcgttgat tacgtccctg 1620 ccctttgtac acaccgcccg tcgctcctac cgattgggtg tgctggtgaa gtgttcggat 1680 tggcgaccgg gtgcggtctc cgctctcggc cgccgagaag ttcattaaac cctcccacct 1740 agaggaagga gaagtcgtaa caaggtttcc gtaggtgaac ctgcagaagg atcaa 1795 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 cctggttgat cctgccag 18 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ttgatccttc tgcaggttca 20

Claims

기탁번호가 KCTC18607P이며, 1~18% 이산화탄소 및 33~40g/l 염 조건에서 지질 생산성 및 세포 생장률이 우수한 클로렐라 속(Chlorella sp.) ABC-001 균주.
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제1항의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 지질 생산용 미생물제제.
제1항의 균주를 배양하고, 그 배양액으로부터 지질을 분리하는 것을 특징으로 하는 지질의 제조 방법.
제5항에 있어서, 상기 균주의 배양은 담수, 해수 또는 기수에서 배양하는 특징으로 하는 방법.
제6항에 있어서, 상기 해수 배양 후 자연침전을 통해 균주를 수확하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항의 균주를 배양하는 단계;
상기 배양액으로부터 지질을 분리하는 단계;
상기 지질을 트랜스에스테르화시켜 지방산 에스테르를 생산하는 단계; 및
상기 생산된 지방산 에스테르를 바이오디젤로 전환하는 단계를 포함하는 바이오디젤의 생산 방법.
제1항의 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 상기 배양액의 건조물을 유효성분으로 함유하는 식품.
제1항의 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 상기 배양액의 건조물을 유효성분으로 함유하는 사료 조성물.
제1항의 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 상기 배양액의 건조물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물.
제1항의 균주를 배양하는 단계;
상기 배양액으로부터 지질을 분리하는 단계; 및
상기 분리한 지질을 촉매전환시켜 항공유로 전환하는 단계를 포함하는 바이오항공유의 생산 방법.