KR101107833B1

KR101107833B1 - 함초 캘러스 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR101107833B1
Application number: KR1020090056771A
Authority: KR
Inventors: 모상현; 정대현; 서효현; 이정훈; 안기웅; 조병기; 이보섭; 천종우
Original assignee: 주식회사 바이오에프디엔씨; (주)에이씨티; (주)더페이스샵
Priority date: 2009-06-23
Filing date: 2009-06-23
Publication date: 2012-01-31
Also published as: KR20100138307A

Abstract

본 발명은 함초 캘러스 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 함초 캘러스 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부개선용 피부 외용제 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 함초 캘러스 함유 피부 외용제 조성물은 항산화 활성이 뛰어난 함초 캘러스 추출물을 함유시켜 피부 세포의 성장이나 증식으로 인한 피부세포 활성화시킴으로써, 피부 재생 및 피부 미백 효과를 개선하는 탁월한 효과가 있다.

함초, 캘러스

Description

함초 캘러스 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물 및 그 제조방법{Skin Composition for External Application Containing Salicornia herbacea and Preparing the Same}

본 발명은 함초 캘러스 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.

식물은 오래 전부터 인류 복지에 도움을 주는 다양한 천연물질들의 공급원이 되어 왔다. 이들 물질들은 대부분 이차대사산물로서 의약품, 식품 첨가물, 화장품 원료, 향료, 색소 등의 용도로 사용되고 있다. 유기합성 분야의 발달에 의한 수많은 새로운 화합물들의 합성에도 불구하고 식물은 아직도 신물질의 근원으로 인정받고 있다. 매년 식물에서 발견되는 새로운 화학구조를 갖는 신물질이 수천 가지 이상이며 그 중 상당수는 생리활성을 갖고 있음을 고려한다면 식물은 중요한 원료가 된다고 할 수 있다.

식물은 식물을 구성하는 잎, 줄기, 뿌리 등 그 일부만을 이식하여도 전체 개체가 다시 형성되는 전형성능(totipotency)이 뛰어나다. 식물세포는 식물의 조직으로부터 유도된 캘러스를 말하는데, 캘러스는 정상적인 기관형성이나 조직분화를 일 으키는 능력을 잃은 무정형의 조직 또는 세포덩어리로서, 식물체에서 잘라낸 조직을 옥신(auxin)이나 싸이토키닌(cytokinins)을 함유한 배지에서 배양하거나 식물체에 상처를 내거나 또는 식물체의 상구를 옥신으로 처리하였을 때 생긴다. 캘러스는 식물세포 배양, 특히 조직배양을 통하여 잎, 줄기, 뿌리, 근경, 열매 등 식물의 어느 부분에서도 유도될 수 있으며, 계대배양에 의해 계속해서 만들어 낼 수 있다는 특징을 가지고 있다. 식물 세포의 배양의 기본 원칙은, 모든 식물 세포는 그 세포가 유래되는 전체 식물을 건설하는 능력을 갖는다는 생물학적 사실을 이용한다. 이 전형성능은 동물의 배아줄기세포의 다분화성과 비교가능하다. 그러므로, 식물 세포가 피부 줄기 세포의 보호 및 활성화에 대한 긍정적 영향을 준다는 것을 받아들일 수 있다. 따라서, 이러한 식물의 성질을 이용한 조직배양을 통한 미분화세포덩어리인 캘러스 배양을 이용한다면 우수한 생리활성 효능을 지닌 화장품 원료로서의 가치가 있다고 볼 수 있다.

전 세계적으로 약 30만종의 식물이 알려져 있으며, 다양한 생리활성을 나타내는 유용성분들이 식물에 함유되어 있음이 밝혀지고 있다. 그 유용성분들은 세포의 정상적인 대사과정에서 부차적으로 생산되어 세포 내 특수한 장소에 축적되는 2차 대사산물로서, 생화학적생태학적 관점에서 볼 때 미생물이나 외부 동물들로부터 식물체 자신을 방어하거나 생리활성 면에서 유리한 물질이라는 점에서 관심이 커지고 있다. 식물이 생산하는 2차 대사산물로는 알칼로이드(alkaloids), 플라보노이드(flavonoids), 카로티노이드(carotenoids), 글리코사이드(glycosides), 테르페노이드(terpenoids) 등이 있다. 이러한 2차 대사산물에는 보습, 피부진정 및 수렴, 자 외선 차단, 미백, 각질제거, 피부노화 방지, 항산화, 피부주름 개선, 항균, 항염, 항암 등의 효과를 나타내는 것들이 많다.

한편, 캘러스는 식물체에 상처가 났을 때, 상처의 세포가 분열 능력을 회복하여 상처를 막고 비대해지는 유상조직으로, 식물체에서 잘라낸 조직을 옥신을 함유한 배지에서 배양하는 방법 등에 의해 생기는 특수한 조직덩어리를 의미하며, 이러한 캘러스의 이용에 관해 최근 관심이 고조되고 있고, 다양한 방면에서 연구중에 있다. 또한, 캘러스와 관련된 공개특허로서, 제10-2008-0038068호 등이 있다.

이에 본 발명자들은 피부개선능이 있는 피부 외용제 조성물을 제조하기 위해 노력하던 중, 함초의 미분화세포, 즉 함초의 캘러스가 피부 세포의 성장 및 증식을 활성화시키고, 항산화능 및 미백효능이 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 함초 캘러스 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부개선용 피부 외용제 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 함초 캘러스 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부개선용 조성물의 제조방법을 제공하는데 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 함초 캘러스 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부개선용 피부 외용제 조성물을 제공한다.

구체적으로는, 상기 함초 캘러스 추출물은 조성물의 총 중량에 대하여 0.1 내지 10중량％로 함유하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는 함초 캘러스를 함유한 피부개선용 피부 외용제 조성물의 제조방법을 제공한다:

(a) 함초의 씨앗으로부터 캘러스를 유도하여 배양하는 단계; 및 (b) 상기 캘러스를 함유하는 조성물을 제조하는 단계.

본 발명은 함초 캘러스 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부개선용 피부 외용제 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.

본 발명은 일 관점에서, 함초 캘러스 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부개선용 피부 외용제 조성물에 관한 것이다. 구체적으로는, 상기 함초 캘러스 추출물은 조성물의 총 중량에 대하여 0.1 내지 10 중량％로 함유할 수 있다.

본 발명에 있어서, "추출물"은 상기 함초 캘러스 자체 또는 함초 캘러스를 분말화하거나, 열수추출법, 에탄올 추출법 등에 의해 수득한 추출물을 의미한다.

본 발명에 있어서, "유효성분으로 함유하는"의 의미는, 피부 외용제 조성물로써 피부 개선 효과를 나타낼 수 있는, 예컨대, 피부 세포의 증식활성을 개선시킬 수 있고, 활성화 시킬 수 있는 정도로 함유하는 것을 의미한다. 또한, 피부 외용제 조성물로써 미백효능과 관련된 멜라닌 합성 억제 또는 티로시나제 저해 활성을 나타낼 수 있는 정도, 또는 항산화능 효능, 또는 싸이토카인 발현능을 나타낼 수 있을 정도의 유효량을 함유하는 것을 의미한다.

본 발명에 있어서, 함초는 우리나라 서해안이나 남해안, 제주도, 울릉도, 백령도 같은 섬지방의 바닷물이 닿는 해안이나 개펄, 염전 주위에 무리지어 자란다. 우리말로는 퉁퉁하고 마디마디 튀어나온 풀이라 하여 퉁퉁마디라고 부른다. 중국의 옛 의학책인 신농초본경에는 맛이 몹시 짜다고 하여 함초(鹹草), 염초(鹽草)라고 하였고, 몹시 희귀하고 신령스러운 풀로 여겨 신초(神草)라고도 적혔다. 함초가 건강식품으로서 효능이 뛰어나다는 것은 3천년 전인 중국 주나라 때부터 알려졌다. 주나라 임금이 함초를 하늘에 바쳐 제사를 지냈다는 기록이 주례(周禮)에 나온다. 일본의 의성(醫聖)이라고 부르는 가이바라의 ＜대화본초(大和本草)＞에는 함초가 불로장수하게 하는 귀한 풀이라고 적혀 있으며 함초 말고도 염초, 복초, 삼지 등의 여러 이름이 적혀 있다.

함초의 학명은 Salicornia herbacea 이고, 줄기는 마디가 많고 두드러지며 가지는 2～3번 갈라져서 마주난다. 가지는 다육질로 비대하고 진한 녹색이며 잎은 없다. 키는 10～40 cm 쯤 자라고 꽃은 6～8월 가지 끝에 녹색으로 보일 듯 말 듯 핀다. 열매는 10월에 납작하고 까맣게 익는다. 함초는 봄부터 여름까지는 줄기와 가지가 진한 녹색이다가 가을이 되면 진한 빨간색으로 물든다.

함초의 일반성분은 주로 탄수화물, 회분, 단백질, 지방으로 이루어져 있으며 회분중 중량 ％ 기준으로 소금이 13.5％를 차지한다. 또한, 함초에는 각종 미네랄 을 함유하고 있는데 함초 100g 에는 칼슘 670mg, 요오드 70mg 그리고 나트륨 6.5％, 소금기가 16％, 식물성 섬유질이 50％ 들어있다. 또한, 함초는 우리나라에서는 대중에게 널리 알려지거나 식용하고 있는 식물은 아니지만, 유럽에서는 어린 줄기를 샐러드로 만들어 먹기도 하고 일본에서는 천연기념물로 지정되기도 하였다. (Flowers, 1972; Green way ＆ Munns, 1980) 아울러, 함초는 미네랄 뿐만 아니라 발린(Val), 류신(Leu), 리신(Lys) 등 필수 아미노산과 다당체, 비테인, 콜린 등을 함유하고 있으며 최근 들어 인삼에 들어있는 사포닌 성분도 함유되어 있음이 밝혀졌다.

본 발명에 있어서, 캘러스는 식물체에서 잘라낸 조직을 옥신을 함유한 배지에서 배양하거나, 어떤 종류의 식물에 상처를 내거나, 상구를 옥신으로 처리하거나 할 때에 생기는 특수한 조직 또는 세포덩어리를 말한다. 보통 캘러스는 정상적인 기관형성이나 조직분화를 일으키는 능력을 잃은 무정형의 조직 또는 세포덩어리로 대부분 유세포로 되어 있다. 넓은 의미로는 아그로박테리움(Agrobacterium) 등의 감염에 의해서 생기는 식물종양조직도 포함시키기도 한다.

조직배양을 통한 미분화세포덩어리인 캘러스가 형성되면, 즉, 식물체내의 세포는 증식하면 즉시 방향이 정해져서 특정한 조직 더 나아가서는 기관으로 규칙적으로 조립되어 간다. 그러나, 다양한 식물 성장 호르몬 등을 외부로부터 주게 되면 그때까지 유지되어 왔던 통제가 해제되어 세포가 제멋대로 증식하는 것으로 해석된다. 이 탈분화에 의해 얻어진 캘러스를 같은 조성을 가진 액체배지에 넣어서 진탕 배양하면 세포는 따로 떨어져 현탁 상태로서 증식을 계속한다. 이 캘러스나 배양세 포는 새로운 배지에 계대 배양함으로써 영구적으로 분열 및 증식할 수 있게 되어 완전 식물체가 노화해서 죽어가는 분화세포와는 본질적으로 차이가 있다. 몇 세대 정도 계대 배양한 캘러스 또는 배양세포를 다양한 식물 성장 호르몬을 제거한 고형배지에 도포해두면 눈과 뿌리가 나와서 개체 식물이 복원된다. 이 재생식물은 한 개의 배양세포의 분열증식에서 유래한 것이며, 그 배양세포의 근원을 말하면 배축이나 수조직에서 유도한 것이다. 다시 말하면, 식물체를 구성하는 한 개의 체세포에서 식물이 복원한다는 것이다. 원래의 식물체는 몇 억 개의 체세포로 구성되어 있고, 그 모든 것이 생식세포와 같은 개체를 창조하는데 필요한 유전자를 모두 갖추고 있다는 것을 의미한다. 모식물체로부터 분리된 식물조직세포는 적정배양환경에서 배양하면 완전한 식물체로 재생될 수 있는 잠재력 즉, 전형성능을 가지고 있다. 이 전형성능은 식물 발생학 등의 학술적인 중요성은 물론이지만 화장품 원료 등의 실용화를 위해서도 활용가치가 크다.

또한, 본 발명은 다른 관점에서, (a) 함초의 씨앗으로부터 캘러스를 유도하여 배양하는 단계; 및 (b) 상기 캘러스를 함유하는 조성물을 제조하는 단계를 포함하는 함초 캘러스 추출물을 함유한 피부개선용 피부 외용제 조성물의 제조방법에 관한 것이다.

상기 (a)단계에서, 구체적으로는 함초의 씨앗을 발아시켜 캘러스를 유도하기 위해 적절한 배지를 선택할 수 있다. 기술분야에서 캘러스 배양에 일반적으로 사용되고 있는 배지가 있다면, 제한없이 사용가능하다. 식물에서는 일반적으로 MS배지, B5배지 등을 주로 사용하고, 일 예로, MS배지의 조성(1L기준시)은 NH₄NO₃ 1650 mg, KNO₃ 1900 mg, CaCl₂.2H₂O 440 mg, MgSO₄.7H₂O 370 mg, KH₂PO₄ 170 mg, KI 0.83 mg, H₃BO₃ 6.2 mg, MnSO₄.4H₂O 22.3 mg, ZnSO₄.7H₂O 8.6 mg, Na₂MoO₄.2H₂O 0.25 mg, CuSO₄,5H₂O 0.025 mg, CoCl₂.6H₂O 0.025 mg, FeSO₄.7H₂O 27.8 mg, Na₂EDTA.2H₂O 37.3 mg, Myoinositol 100 mg, Nicotinic acid 0.5 mg, Pyridoxine-HCl 0.5 mg, Thiamine-HCl 0.5 mg, Glycine 2 mg, Sucrose 30000 mg 이다.

캘러스를 유용물질을 함유하는 배지에서 배양하면, 캘러스가 배지에 첨가된 유용물질을 흡수하여 캘러스 내에 유용물질을 함유하게 되므로, 캘러스는 유래된 식물의 생리 활성 뿐만 아니라, 배지 내 첨가된 유용물질에 의한 생리활성을 나타낼 수 있다. 이러한 캘러스 내 유용물질의 도입은, 상기 유도된 캘러스를 유용물질을 포함하는 배지내에 치상하는 단계를 추가적으로 수행하여 배양된 캘러스에 유용물질을 도입시킬 수도 있다.

상기 (b)단계에서, (a)단계에서 얻어지는 캘러스를 분말화하여 조성물에 포함시켜 제조할 수 있다.

구체적으로, 본 발명에 따른 함초 캘러스 추출물 피부 외용제 조성물에서, 상기 수상성분, 유상성분 이외에 추가적으로, 첨가제 등이 포함될 수 있다. 상기 첨가제로는 알코올, 착색제, 방향제 등이 있다.

추가적으로, 본 발명에 따른 피부 외용제 조성물은, 다양한 형태로 제조될 수 있는데, 예컨대, 에멀젼, 로션, 크림(수중유적형, 유중수적형, 다중상), 용액, 현탁액(무수 및 수계), 무수 생성물(오일 및 글리콜계), 젤, 마스크, 팩, 분말 등의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 함초 캘러스 추출물 함유 피부 외용제 조성물의 제조방법은 전술한 제조방법에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기 제조방법을 일부 변형시킨 방법으로도 본 발명에 따른 함초 캘러스 추출물 함유 피부 외용제 조성물을 제조할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 피부 외용제 조성물은 화장료 조성물 또는 약학적 조성물일 수 있다.

상기 피부외용제 조성물이 약학적 조성물일 경우, 이미 공지되어 사용되고 있는 약학적으로 허용가능한 담체를 추가적으로 포함할 수 있다.

상기 화장료 조성물에 있어서는, 화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체를 포함할 수 있다. 여기서, "화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체"란 화장품 제제에 포함될 수 있는 이미 공지되어 사용되고 있는 화합물 또는 조성물이거나 앞으로 개발될 화합물 또는 조성물로서 피부와의 접촉시 인체가 적응 가능한 이상의 독성, 불안정성 또는 자극성이 없는 것을 말한다.

상기 담체는 본 발명의 피부 외용제 조성물에 그것의 전체 중량에 대하여 약 1 중량 ％ 내지 약 99.99 중량 ％, 바람직하게는 조성물의 중량의 약 90 중량％ 내지 약 99.99 중량 ％로 포함될 수 있다. 그러나 상기 비율은 본 발명의 피부 외용제 조성물이 제조되는 전술한 바의 제형에 따라 또 그것의 구체적인 적용 부위(얼굴, 목 등)나 그것의 바람직한 적용량 등에 따라 달라지는 것이기 때문에, 상기 비 율은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.

한편, 상기 담체로서는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선 차단제, 발색제, 향료 등이 예시될 수 있다. 상기 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선 차단제, 발색제, 향료로 사용될 수 있는 화합물/조성물 등은 이미 당업계에 공지되어 있기 때문에 당업자라면 적절한 해당 물질/조성물을 선택하여 사용할 수 있다.

본 발명의 일 구현 예로써, 본 발명에 따른 피부 외용제 조성물은 상기 함초 추출물 이외에 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글키롤, 폴리옥시에틸렌 경화피마자유, 에탄올, 트리에탄올아민 등을 포함할 수 있으며, 방부제, 항료, 색소, 정제수 등을 필요에 따라 미량 포함할 수 있다.

특히, 상기 피부 외용제 조성물은 본 발명에 특별히 개시된 제조방법 이외에도, 통상적으로 알려진 제조방법을 이용하여, 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조될 수 있다.

화장료 조성물로 제조될 경우, 유화 제형의 화장품으로는 영양화장수, 크림, 에센스 등이 있으며, 가용화 제형의 화장품으로는 유연화장수가 있다. 또한, 피부과학적으로 허용가능한 매질 또는 기제를 함유함으로써 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 국소적용 또는 전신적용할 수 있는 보조제 형태로 제조될 수 있다.

또한, 적합한 화장품의 제형으로는, 예를 들면 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크 로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실스틱의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 피부 외용제 조성물은 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온 봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일,염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 그리고, 상기의 성분들은 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1 : 본 발명에 따른 함초 캘러스 함유 피부 외용제 조성물의 제조

1.1 함초(Salicornia herbacea) 종자 소독 및 발아

살리코르니아 헤르바세 (Salicornia herbacea)의 씨앗은 전라북도 부안군 진 서면에서 구입하였고, 멸균소독하였다. 멸균소독의 방법은 70％ 에탄올로 1분간 씻은 후, 0.05 ％ Triton X-100 와 25 ％ Rox가 포함된 Sterilization solution으로 3분간 볼텍싱(Vortexing) 해주었다. Distilled water로 5회 세척한 후, 이틀 동안 4℃에서 Cold 처리하였다. 소독된 함초 씨앗을 발아시키기 위해 MS(Murashige and Skoog 1962, Duchefa 사, Cat No. M0221) 배지를 사용하였다.

1.2 발아체로부터 캘러스(Callus)의 유도

발아된 함초의 캘러스는 1 cm의 크기의 절단하여 잘라서, 식물 생장 호르몬 0.5 mg/L IAA(indole-3-acetic acid), 0.2 mg/L Zeatin 이 포함된 MS 배지에 치상하여 유도(Induction) 되었다. 약 2주 ～ 4주 후에 무정형의 캘러스 조직이 유도되면, 이를 분리하여 신선한 고체 배지위에 치상하고, 일정기간 간격으로 계대 배양하였다. 이후, Agar를 제외한 동일한 조성의 액체 배지에서 25 ℃, 28일간 배양하여 대량 생산하였다. 건강한 캘러스를 액체질소에서 곱게 갈아 하기 실험예에 사용하였다.

실험예 1: 본 발명에 따른 함초 캘러스의 세포 성장 및 증식에 미치는 영향 시험

본 발명에 따른 함초 캘러스의 피부 세포의 증식 활성을 알아보기 위하여, 인간각질형성 세포(Human Skin Keratinocyte, HaCaT), 인간섬유아세포(Human Skin Fibroblast, CCD-986Sk)는 ATCC(American Type Culture Collection)에서 분주 받아서 배양하였다. 각 세포를 1×10⁴cells/ml의 농도로 하여 24 well 배양판에 접종하였다. 배지는 10 ％ FBS를 함유한 DMEM(Dubelcco'S Modified Eagle Medium, BRL,USA)을 사용하였다. 10％ FBS를 함유하는 DMEM에서 48시간 배양하여 배양용기 표면적의 25 ～ 30％만큼 배양되면, 실시예 1에서 제조된 조성물이 0.1 중량％～ 5 중량％ 함유된 FBS-free DMEM으로 교체하여 24시간 더 배양하였다. 배양 후 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라졸리움 브롬화물 (MTT, Sigma M5655, USA) 용액 (2.5mg/ml)을 50㎕ 첨가하고 3시간동안 추가로 배양한 후 상등액을 제거하고, 각 well 당 200 ㎕의 Dimethylsulfoxide (DMSO, Sigma D2650, USA)용액을 가한 후 20분간 교반하여 형성된 포르마잔(formazan) 결정을 녹인 다음, 100㎕ 씩을 96 well 로 취하여 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)로 570 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 피부 세포의 증식 활성 정도는 순수한 물을 사용한 대조군의 흡광 강도를 기준으로 하기 수학식에 따라 계산하여 백분율로 표시하였다.

세포증식효과(％) = (추출물 처리시의 흡광도/대조군의 흡광도) × 100

상기 인간각질형성 세포(keratinocyte)를 이용한 세포성장 및 증식에 미치는 영향시험 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 5중량％ 함초 캘러스가 함유된 경우에는 98±1.58％로 대조군과 통계적인 차이가 없었으나, 1중량％ 함초 캘러스가 함유된 경우 대조군에 비해서 115±1.6 ％의 높은 증식 정도를 보였고, 0.5중량％, 0.1 중량％의 함초 캘러스가 함유된 경우 대조군에 비해서 107±1.5％, 103±1.8％의 증식을 보였다. 따라서, 본 발명에 따른 함초 캘러스 함유 조성물은 피부 세포성장과 증식의 활성화에 영향을 나타내었다.

또한, 상기 인간섬유아세포(fibroblast)를 이용한 세포성장 및 증식에 미치는 영향시험 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 5중량％ 함초 캘러스가 함유된 경우에는 103±1.12％로 대조군과 통계적인 차이가 없었으나, 1중량％, 0.5중량％의 함초 캘러스가 함유된 경우 대조군에 비해서 121±1.3 ％, 115±0.9％의 높은 증식 정도를 보였고, 0.1 중량％의 함초 캘러스가 함유된 경우 대조군에 비해서 107±0.9％의 증식을 보였다. 따라서, 본 발명에 따른 함초 캘러스 함유 조성물은 피부 세포성장과 증식의 활성화에 영향을 나타내었다.

또한, 도 3에 나타난 바와 같이, 인간각질형성세포(keratinocyte)와 인간섬유아세포(fibroblast)에서 1중량％ 함초 캘러스 추출물을 처리한 경우, 대조군에 비해, 피부세포 증식이 활발하게 일어나는 것으로 나타났다.

실험예 2 : 본 발명에 따른 피부 외용제 조성물의 미백효능 관련 B16 멜라노마 세포에서의 멜라닌 합성 억제 시험

멜라노마(Melanoma) B16 세포(1.5 × 10⁴ cells/well)는 α-MSH(a melanocyte-stimulating hormone)로 자극(stimulation) 되었고, 다양한 농도의 함초 캘러스를 72시간동안 처리하였다. PBS로 세척 후, 세포들은 80 ℃에서 1N NaOH 100 ㎕로 녹여졌다. ELISA reader를 이용하여 450 nm에서 흡광도 측정하였다.

함초 캘러스 추출물의 B16 Melanoma 세포에서 멜라닌 합성에 대한 저해 정도를 확인하기 위하여 살아있는 세포당 멜라닌 함량을 측정한 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 함초 캘러스 추출물의 처리는 멜라노마 세포에서 멜라닌 함량을 눈에 띠게 감소하였다. 72시간 배양시간동안 대조군에 0.1중량％～ 5중량％ 함초 캘러스 추출물이 처리된 시험군에서 20％의 멜라닌 합성감소를 확인하였다.

실험예 3 : 본 발명에 따른 피부 외용제 조성물의 미백효능 관련 머쉬룸 티로시나제 활성 측정 시험

티로시나제(tyrosinase)의 L-도파 산화활성(oxidation activity)은 ELISA reader로 측정되었다. 머쉬룸 티로시나제(mushroom tyrosinase)는 Sigma-Aldrich에서 구입하였다. 5 mM L-dopa 10 ㎕, 90 ㎕ 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 6.8), 다양한 농도의 함초 캘러스를 96-well plate에 넣었다. 마지막으로 40 ㎕의 티로시나제 효소를 넣고 mix한 후, 37 ℃에서 15분간 반응하였다. 반응물로부터 Dopachrome 형성의 초기 비율은 ELISA reader를 이용하여 490nm에서 흡광도의 증가로 측정한다.

티로시나제는 멜라닌 합성에서 중요한 티로신을 L-dopa로 전환하고, 도파퀴논(dopaquinone)을 형성하도록 L-dopa를 산화시킨다. 도파 옥시다제 활성(dopa oxidase activity)는 머쉬룸 티로시나제로 측정되었고, 다양한 농도의 함초 캘러스를 넣어줌으로써 억제되었다.

In vitro 티로시나제 DOPA 산화 저해 연구법을 통하여 최대 5％ 까지의 함초 캘러스 추출물의 티로시나제 저해활성을 조사한 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 대조군에 비해서 68％의 저해 활성을 보였다. 0.1 중량％～ 1 중량％ 의 함초 캘러스 추출물의 처리에 의해서는 대조군에 비해서 20％ 정도로 티로시나제 활성이 억제되었다.

실험예 4 : 본 발명에 따른 피부 외용제 조성물의 항산화능 효능 시험

본 발명에 따른 함초 캘러스의 항산화능은 Antioxidant Assay Kit (Cayman, Ann Arbor, Mich.)를 사용하였고, 제조자의 지시 에 따라 실험하였다. 함초 캘러스 추출물의 항산화능 활성(antioxidative activity)는 Antioxidant Assay Kit(Cayman, Ann Arbor, Mich.)로 테스트되었다.

함초 캘러스 추출물(extract)의 항산화능(antioxidative capacity)은 키트(Cayman사, Cat No. 709001, Antioxidant Kit)를 이용하여, Trolox의 항산화능(antioxidative capacity)을 다양한 농도의 기준(standard)으로 하여, Trolox 농도로 전환시켜 분석한 결과, Dose-Dependent하게 증가하였다. 도 6에 나타난 바와 같이, 1중량％ 의 함초 캘러스 추출물(extract)는 양성대조군인 100 μM 비타민 C와 유사한 항산화능을 보임으로써, 높은 항산화능을 가지는 것으로 나타났다.

실험예 5 : 본 발명에 따른 피부 외용제 조성물의 싸이토카인의 발현 분석 실험

본 발명에 따른 상기 조성물에 대한 싸이토카인의 발현율을 알아보기 위하여, 인간섬유아세포인 Fibroblast (Cell Lines Service, Germany)를 1×10⁵cells/ml의 농도로 하여 24 well 배양판에 접종하였다. 10％ FBS를 함유하는 DMEM(Dubelcco'S Modified Eagle Medium, BRL,USA)에서 배양하여 배양용기 표면적의 25 ～ 30％만큼 배양되면, 실시예 1에서 제조된 조성물이 1％ 함유된 FBS-free DMEM, 대조군으로 사용된 FBS-free DMEM 으로 교체하여 48시간 더 배양하였다. HUMAN CYTOKINE ASSAY KIT(Millipore)을 사용하여 VEGF, EGF, FGF, TGF-β1, IL-1 α, IL-6, IL-8 및 TNF-α 의 싸이토카인의 발현율을 조사하였다. 실험방법은 HUMAN CYTOKINE ASSAY KIT의 지시에 따라 수행하였다.

도 7에 나타난 바와 같이, 싸이토카인의 발현율은 무처리한 대조군에 비해 1％ 함초 캘러스 추출물(extract)를 처리하였을 경우, EGF, TGF-β1이 유의적이였고, 다른 싸이토카인의 발현은 미미하였다.

도 1은 본 발명 따른 함초 캘러스 추출물의 인간각질형성 세포(keratinocyte)를 이용한 세포성장 및 증식에 미치는 영향시험을 나타낸 그래프이다.

도 2는 본 발명에 따른 함초 캘러스 추출물의 인간섬유아세포(fibroblast)를 이용한 세포성장 및 증식에 미치는 영향시험이다.

도 3은 인간각질형성세포(keratinocyte)와 인간섬유아세포(fibroblast)에서 1％ 함초 캘러스 추출물의 처리했을 경우의 세포성장 및 증식의 피부세포 활성화 사진이다.

도 4는 B16 멜라노마 세포에서 본 발명에 따른 함초 캘러스 추출물의 멜라노제닉 활성을 나타낸 결과이다.

도 5는 본 발명에 따른 함초 캘러스 추출물의 티로시나제 활성을 실험한 결과이다.

도 6은 본 발명에 따른 함초 캘러스 추출물의 항산화능 실험 결과를 나타낸 결과이다.

도 7은 본 발명에 따른 함초 캘러스 추출물의 싸이토카인 발현 분석을 실험한 결과이다.

Claims

함초 캘러스 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 함초 캘러스 추출물은 조성물의 총 중량에 대하여 0.1 내지 10중량％를 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
조성물의 총 중량에 대하여 함초 캘러스 추출물을 0.1 내지 1 중량%로 함유하는 피부 재생용 화장료 조성물.
다음의 단계를 포함하는 함초 캘러스 추출물을 함유한 피부 미백용 화장료 조성물의 제조방법:

(a) 함초의 씨앗으로부터 캘러스를 유도하여 배양하는 단계; 및

(b) 상기 캘러스를 함유하는 조성물을 제조하는 단계.
제4항에 있어서, 상기 캘러스는 분말화하여 조성물에 함유시키는 것을 특징으로 하는 제조방법.