CN112469819A - 包括神经干细胞培养肉汤作为活性成分的用于抗衰老或减少皱纹的化妆品组合物和其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种制备神经干细胞的培养肉汤的方法,肉汤具有极佳的减少皮肤皱纹或增加皮肤弹性的能力,培养肉汤包括能够抑制真皮中涉及胶原蛋白分解的MMPs(基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases))的表达以及活性的高浓度的TIMP‑1(金属蛋白酶组织抑制剂1)以及TIMP‑2(金属蛋白酶组织抑制剂2)。包括高浓度的TIMP‑1以及TIMP‑2以及低浓度的各种MMPs作为活性成分的根据本发明的神经干细胞的培养肉汤通过对抑制胶原蛋白形成的MMPs的表达以及活性进行遏制来恢复胶原蛋白以及弹性蛋白的合成,且因此适用作用于减少皮肤皱纹或增加皮肤弹性的组合物。
Description
技术领域
本发明涉及一种制备神经干细胞条件培养基的方法,所述神经干细胞条件培养基具有极佳的减少皮肤皱纹或增强皮肤弹性的能力且含有作为活性成分的高浓度的TIMP-1(金属蛋白酶组织抑制剂1(tissue inhibitor of metalloproteinase 1))和TIMP-1(金属蛋白酶组织抑制剂2(tissue inhibitor of metalloproteinase 2))以及低浓度的各种MMPs,且更具体地说,涉及一种制备含有高浓度的TIMP-1和TIMP-2的神经干细胞条件培养基的方法,所述神经干细胞条件培养基可减少在真皮中涉及胶原蛋白降解的各种类型的MMPs(基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase))的表达且抑制MMPs的活性。
背景技术
皮肤保护人体免受外部环境的影响且对各种生理功能负责。皮肤主要由三个层组成:表皮、真皮以及皮下脂肪。表皮主要由形成角蛋白的细胞(也就是角质细胞)和产生黑色素的细胞(也就是黑素细胞)组成,且真皮主要由含有胶原蛋白和弹性蛋白弹性纤维的结缔组织以及基质组成并且包含肌肉、毛囊、血管、神经以及类似者。
皮肤衰老的原因包含与年龄增长相关的内部原因和起源于外部环境的外部原因。与皮肤中皱纹的形成密切相关的胶原蛋白(collagen)在皮肤的成纤维细胞中产生,占真皮的90%,且已知随着年龄的增长和在施加外部刺激(例如紫外线)后而减少(S.D.夏皮罗(S.D.Shapiro.),细胞生物学新观点(Curr.Opin.Cell Biol.),10,1996;内勒EC等人(Naylor EC et al.),更年期(Maturitas),2011)。众所周知,衰老或持续暴露于外部紫外线增加MMPs(基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase))(其降解包含胶原蛋白的结缔组织)的表达和活性,且促进皮肤真皮组织中胶原蛋白的降解,使得胶原蛋白含量降低(A.莫维埃尔(A.Mauviel.),细胞生物化学期刊(J.Cell.Biochem.),1993;T全等人(T Quan etal.),皮肤病学研究期刊研讨会论文集(J.Investig.Dermatol.Symp.Proc.)2009)。此处,众所周知,MMPs的表达根据转录因子(transcription factors)AP-1和NFkB对MMPs的基因的启动子(promoter)的作用进行调节(G.J.费舍尔(G.J.Fisher)和J.J.沃里斯(J.J.Voorhees),皮肤病学研究期刊研讨会论文集(J.Investig.Dermatol.Symp.Proc.),1998;K.安倍山等人(K.Abeyama et al.),临床研究期刊(J.Clin.Invest.)2000)。另外,在维持组织中的胶原蛋白的稳态时抑制MMPs的活性的TIMP(基质金属蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase))的平衡至关重要。
TIMP(金属蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitor of matrixmetalloproteinase)包含TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3以及TIMP-4,且充当活体内中存在的MMPs的抑制剂。其中,已知TIMP-1与IV型胶原蛋白酶当中的92kDa MMP-9和MMP-1的前体形式(pro form)结合,且由此不可逆地抑制MMP,并且已知TIMP-2与IV型胶原蛋白酶当中的72kDa MMP-2的前体形式(pro form)和活性形式(active form)两者结合,并且尤其是抑制所有MMPs的活性形式(Y.A.德克莱克等人(Y.A.Declerck et al.),生物化学期刊(Biochem.J.)1993;W.博德等人(W.Bode et al.),纽约科学院年鉴(Ann.N.Y.Acad.Sci.)1999)。
另外,弹性蛋白(elastin)被认为是涉及皱纹形成的必需纤维组织,所述弹性蛋白与胶原蛋白一起涉及皮肤弹性,且已知弹性蛋白的降解由称为“弹性蛋白酶”的酶的效果进行调节(J.H.钟等人(J.H.Chung et al.),皮肤病学研究期刊(J.Investig.Dermatol.),117,2001)。
因此,由于研发能够减轻和防止皮肤皱纹且改善皮肤弹性的组合物的广泛努力,本发明人已发现神经干细胞条件培养基组合物可以通过培养神经干细胞(为成体干细胞)制备,所述神经干细胞条件培养基组合物含有高浓度的TIMP-1和TIMP-2并且含有低浓度的各种MMPs,所述TIMP-1和TIMP-2不可逆地抑制能够抑制皮肤中的胶原蛋白的合成并且促进胶原蛋白分解的各种MMPs的功能。基于这个发现,完成了本发明。
发明内容
本发明的一个目标是提供一种用于制备神经干细胞条件培养基的方法,所述神经干细胞条件培养基具有改善的减轻皮肤皱纹或增强皮肤弹性的能力,且含有低浓度的能够抑制胶原蛋白产生的MMPs以及含有高浓度的能够通过抑制MMPs的表达和活性来恢复胶原蛋白和弹性蛋白的合成的TIMP-1和TIMP-2,并且提供一种含有神经干细胞条件培养基的化妆品组合物。
为了实现上述目标,本发明提供一种用于制备神经干细胞条件培养基的方法,所述神经干细胞条件培养基具有改善的减轻皮肤皱纹或增强皮肤弹性的能力且含有TIMP-1(金属蛋白酶组织抑制剂1(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 1)和TIMP-2(金属蛋白酶组织抑制剂2(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 2)作为活性成分,方法包含(a)永生化(immortalized)从大脑的脑室区(ventricular zone)分离的成体神经干细胞(neural stem cell;NSC),以及(b)在非诱导培养基中培养永生化神经干细胞以获得神经干细胞条件培养基。
本发明还提供一种用于减轻皮肤皱纹或增强皮肤弹性的化妆品组合物,所述化妆品组合物含有作为活性成分的含有TIMP-1和TIMP-2的神经干细胞条件培养基。
本发明还提供一种用于使用含有TIMP-1和TIMP-2的神经干细胞条件培养基来减轻皮肤皱纹或增强皮肤弹性的方法。
本发明还提供一种含有TIMP-1和TIMP-2的神经干细胞条件培养基用于缓解皮肤皱纹和增强皮肤弹性的用途。
本发明还提供一种含有TIMP-1和TIMP-2的神经干细胞条件培养基用于制备用于减轻皮肤皱纹或增强皮肤弹性的化妆品组合物的用途。
附图说明
图1示出使用WST-1分析的结果,确认当使用神经干细胞条件培养基处理人类体细胞时没有细胞毒性(cytotoxicity)。
图2示出使用荧光微板读数仪(fluorescence microplate reader)测量的结果,确认在使用神经干细胞条件培养基处理暴露于UVB的人类体细胞后由于UVB而增加的活性氧物种(reactive oxygen species;ROS)的减少。
图3示出使用荧光显微镜(fluorescent microscope)分析的结果,确认在使用神经干细胞条件培养基处理暴露于UVB的人类体细胞后由于UVB而增加的活性氧物种(reactive oxygen species;ROS)的减少。
图4示出使用qPCR分析的结果,确认在使用神经干细胞条件培养基处理暴露于UVB的人类体细胞后促进由于UVB引起的胶原蛋白(前胶原蛋白(pro-collagen))的降解的MMPs的表达被抑制。
图5示出使用蛋白质印迹法分析的结果,确认在使用神经干细胞条件培养基处理暴露于UVB的人类体细胞后促进由于UVB引起的胶原蛋白(前胶原蛋白(pro-collagen))的降解的MMPs的表达被抑制。
图6示出使用酶谱法分析(zymography)的结果,确认在使用神经干细胞条件培养基处理暴露于UVB的人类体细胞后促进由于UVB引起的胶原蛋白(前胶原蛋白(pro-collagen))的降解的MMPs的表达被抑制。
图7示出由于UVB而减少的胶原蛋白(前胶原蛋白(pro-collagen))在使用神经干细胞条件培养基处理暴露于UVB的人类体细胞后再次增加。
图8示出TIMP-1和TIMP-2抑制神经干细胞条件培养基中的MMPs的活性。
图9示出在使用TIMP-1和TIMP-2抗体封闭(中和(neutralizing))重组蛋白、TIMP-1、TIMP-2以及神经干细胞条件培养基之后MMPs活性的抑制。
图10示出目视观察的结果,确认由于UVB而增加的皱纹在使用神经干细胞条件培养基处理暴露于UVB的雌性SKH-1小鼠后再次减少。
图11示出测量皱纹的面积的结果,确认由于UVB而增加的皱纹在使用神经干细胞条件培养基处理暴露于UVB的雌性SKH-1小鼠后再次减少。
图12示出由于UVB而增加的ROS(活性氧物种(reactive oxygen species))在使用神经干细胞条件培养基处理暴露于UVB的雌性SKH-1小鼠后减少。
图13示出由于UVB而减少的真皮中的胶原蛋白(collagen)和弹性蛋白(elastin)在使用神经干细胞条件培养基处理暴露于UVB的雌性SKH-1小鼠后再次增加。
图14示出免疫荧光染色的结果,确认在使用神经干细胞条件培养基处理暴露于UVB的雌性SKH-1小鼠后促进由于UVB引起的真皮中的胶原蛋白(collagen)的降解的MMPs的表达被减少。
图15示出在使用神经干细胞条件培养基处理暴露于UVB的雌性SKH-1小鼠后,抑制促进由于UVB引起的真皮中的胶原蛋白(collagen)的降解的MMPs的表达。
图16示出在使用神经干细胞条件培养基处理暴露于UVB的雌性SKH-1小鼠后,抑制促进由于UVB引起的真皮中的胶原蛋白(collagen)的降解的MMPs的活性。
图17示出神经干细胞条件培养基经由调节MMPs的表达的转录因子(transcription factors)当中的NFkB进行调节的确认结果。
图18示出在使用神经干细胞条件培养基处理暴露于UVB的雌性SKH-1小鼠后真皮中的胶原蛋白(collagen)的产生由于转录因子的减少而恢复的确认结果。
图19示出蛋白质印迹法的结果,确认在使用神经干细胞条件培养基处理暴露于UVB的雌性SKH-1小鼠后,经由Rad50(DNA修复酶(repair enzymes)中的一种)修复由UVB引起的DNA损伤(damage)。
图20示出在使用神经干细胞条件培养基处理暴露于UVB的雌性SKH-1小鼠后经由γH2AX对由UVB引起的DNA损伤(damage)的确认结果。
图21示出在神经干细胞条件培养基与脂肪源性干细胞条件培养基之间抑制衰老和皱纹形成的影响的比较结果,其中(a)示出细胞毒性的检测结果;以及(b)示出使用每种细胞条件培养基进行处理后的MMPs的基因的RNA表达水平。
图22的(a)示出在神经干细胞条件培养基和脂肪源性干细胞条件培养基中的每一者中释放的MMP-1的量的比较结果,以及(b)示出在使用每一细胞条件培养基处理暴露于UVB的人类体细胞之后的MMPs蛋白质的量。
图23示出在存在于神经干细胞条件培养基和脂肪源性干细胞条件培养基中的(a)总蛋白量和(b)TIMP-1和TIMP-2的量的比较结果。
图24示出在使用神经干细胞条件培养基和脂肪源性干细胞条件培养基中的每一者处理暴露于UVB的雌性SKH-1小鼠后的(a)对由于UVB而形成的皱纹的抑制程度的目视观察和(b)所测量的皱纹面积的结果。
图25示出(a)抑制促进由于UVB引起的真皮中的胶原蛋白(collagen)的降解的MMPs的表达的比较结果,和(b)在使用神经干细胞条件培养基和脂肪源性干细胞条件培养基处理暴露于UVB的雌性SKH-1小鼠后的真皮中的胶原蛋白(collagen)的产生和恢复的比较结果。
图26示出在使用神经干细胞条件培养基和脂肪源性干细胞条件培养基处理暴露于UVB的雌性SKH-1小鼠后的真皮中的由于施加UVB而减少的胶原蛋白(collagen)和弹性蛋白(elastin)的增加程度的比较结果。
图27示出免疫荧光染色的结果,确认在使用神经干细胞条件培养基和脂肪源性干细胞条件培养基处理暴露于UVB的雌性SKH-1小鼠后促进由于UVB引起的真皮中的胶原蛋白(collagen)的降解的MMsP的表达被减少。
图28示出(a)经由Rad50(DNA修复酶(repair enzymes)中的一种)修复由UVB引起的DNA损伤(damage)的蛋白质印迹法比较结果以及(b)和(c)基于γH2AX的DNA损伤(damage)水平的比较结果。
具体实施方式
除非另外定义,否则本文所使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的技术人员所了解的相同的含义。一般来说,本文所使用的命名法在所属领域中是众所周知的且是通常使用的。
在本发明中,暴露于紫外光(UVB)人类真皮成纤维细胞和小鼠使用通过培养从人类大脑的脑室区(ventricular zone)提取的神经干细胞(culturing neural stem cell;NCS)获得的外胚层源性神经干细胞条件培养基进行处理。然后,发现涉及暴露于紫外光(UVB)的人类真皮成纤维细胞(human dermal fibroblast)和小鼠皮肤组织中的真皮中的胶原蛋白分解的MMP-2(基质金属蛋白酶2(matrix metaloproteinase 2))、MMP-9(基质金属蛋白酶9(matrix metaloproteinase 9))以及MMP-1(基质金属蛋白酶1(matrixmetalloproteinase 1))的表达和活性由神经干细胞条件培养基抑制,且发现胶原蛋白的合成通过对这些MMPs的抑制来恢复或促进。另外,发现神经干细胞条件培养基中含有高浓度的TIMP-1和TIMP-2作为活性成分以用于经由复原和促进胶原蛋白合成来减轻皮肤皱纹或增强皮肤弹性。
因此,在一个方面,本发明涉及一种用于制备神经干细胞条件培养基的方法,所述神经干细胞条件培养基具有改善的减轻皮肤皱纹或增强皮肤弹性的能力,并且含有TIMP-1(金属蛋白酶组织抑制剂1(tissue inhibitor of metalloproteinase 1))和TIMP-2(金属蛋白酶组织抑制剂2(tissue inhibitor of metalloproteinase 2))作为活性成分,方法包含(a)永生化(immortalized)从大脑的脑室区(ventricular zone)分离的成体神经干细胞(neural stem cells,NSCs),和(b)在非诱导培养基中培养永生化神经干细胞以获得神经干细胞条件培养基。
在本发明中,对于用于制备细胞条件培养基的神经干细胞的类型没有特别限制。优选地,神经干细胞是来源于胚胎的成体干细胞,且在本发明的具体实施例中,使用从胚胎大脑的脑室区(ventricular zone)提取的神经干细胞制备神经干细胞条件培养基。
在本发明中,神经干细胞条件培养基是一种含有从通过传代培养神经干细胞(为外胚层干细胞)获得的细胞中释放的组分的物质。
在本发明中,神经干细胞条件培养基可进一步含有TIMP-3或TIMP-4。
在本发明中,神经干细胞条件培养基抑制MMP-1(基质金属蛋白酶-1(matrixmetalloproteinase-1))、MMP-2(基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2))、MMP-3(基质金属蛋白酶-3(matrix metalloproteinase-3))以及MMP-9(基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9))的表达或活性。
在本发明的具体实施例中,为了确定神经干细胞条件培养基中的TIMP-1和TIMP-2组分对减轻皮肤皱纹和预防或增强皮肤弹性的影响,通过抑制MMPs(基质金属蛋白酶(matrix metaloproteinases))的表达和活性,经由细胞因子阵列和蛋白质印迹法分析从神经干细胞条件培养基获得的上清液。
另外,在本发明的具体实施例中,经由明胶酶谱法(gelatin zymography)证实神经干细胞条件培养基中的组分TIMP-1和TIMP-2涉及通过抑制活性MMPs而减轻皱纹形成和增强皮肤弹性。
在本发明的具体实施例中,分别地或一起使用神经干细胞条件培养基、重组蛋白TIMP-1或TIMP-2进行处理,或经由抗体分别地或一起封闭神经干细胞条件培养基、重组蛋白TIMP-1或TIMP-2,并且然后与IV型胶原蛋白酶当中的92kDa MMP-9和72kDa MMP-2的前体形式(pro form)和活性形式(active form)结合以抑制MMPs的活性形式得以证实。
在本发明中,为了证实神经干细胞条件培养基中的TIMP-1和TIMP-2组分对减轻皱纹形成和增强皮肤弹性的影响,从1周到4周使用UVB(30毫焦/厘米(mJ/cm))对雌性SKH-1小鼠的背部一周处理三次,且然后200微升(μl)(v/v)的PBS(磷酸盐缓冲盐水(phosphatebuffered saline))和神经干细胞条件培养基以200微升(v/v)施加到雌性SKH-1小鼠的背部。从5周到12周,使用UVB(30毫焦/厘米(mJ/cm))处理雌性SKH-1小鼠的背部,且将PBS和神经干细胞条件培养基以200微升(v/v)施加到背部上。
在本发明中,神经干细胞条件培养基可恢复皮肤组织中的胶原蛋白或弹性蛋白。
在本发明中,神经干细胞条件培养基可抑制皮肤组织中的活性氧物种(reactiveoxygen species)的产生或修复DNA损伤。
如本文所使用,术语“皱纹减轻”意指维持或加强与皮肤的皱纹和弹性相关的能力。存在于皮肤结构的真皮层中的胶原蛋白纤维(胶原蛋白(collagen))和弹性纤维(弹性蛋白(elastin))为执行这些功能且对皮肤弹性负责的主要蛋白质。胶原蛋白的生物合成受皮肤的内部和外部影响。具体地说,作为皮肤的内部因素,自然衰老使得细胞的活性降低和胶原蛋白纤维减少,且作为皮肤的外部因素,由紫外线的过度照射和应力产生的活性氧物种与蛋白质的硫醇基(硫醇(thiol):-SH)反应以抑制酶的活性或增加胶原蛋白酶(一种酶,即基质金属蛋白酶-1(matrix metalloproteinases-1(MMP-1)),其分解胶原蛋白、弹性蛋白以及类似者)的表达,由此增加皮肤皱纹且减少皮肤弹性。
作为用于培养本发明的神经干细胞的培养基,可以无限制地使用所属领域中已知的任何基础培养基。基础培养基可以直接制备或可为可商购的。可商购的培养基的实例包含(但不限于):DMEM(达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(Dulbecco's Modified Eagle'sMedium))、MEM(最小必需培养基(Minimal Essential Medium))、BME(基础伊格尔培养基(Basal Medium Eagle))、RPMI 1640、F-10、F-12、α-MEM(α-最小必需培养基(α-Minimalessential Medium))、G-MEM(格拉斯哥最小必需培养基(Glasgow's Minimal EssentialMedium))以及伊思考夫改良达尔伯克式培养基(Iscove's Modified Dulbecco'smedium),且最优选的为DMEM培养基。
另外,基础培养基优选地含有5%到10%(v/v)的FBS,且在本发明的具体实施例中,培养在DMEM培养基中执行。
在本发明中,非诱导培养基可含有DMEM(达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium))、10%FBS(胎牛血清(fetal bovine serum))以及1%青霉素/链霉素(penicillin/streptomycin)。
本发明的组合物可以使用任何常用的方法进行制备,且分离、培养以及分隔神经干细胞的过程不限于本发明的方法并且可以是任何通常进行的方法。
如上文所述,根据本发明的外胚层源性神经干细胞条件培养基能够抑制MMPs和活性MMPs的表达,这是因为所述外胚层源性神经干细胞条件培养基含有TIMP-1和TIMP-2作为活性成分且因此可用作用于减轻和预防皮肤皱纹并且改善皮肤弹性的组合物。
因此,在另一方面,本发明涉及一种用于减轻皮肤皱纹或增强皮肤弹性的化妆品组合物,所述化妆品组合物含有神经干细胞条件培养基,所述神经干细胞条件培养基含有TIMP-1(金属蛋白酶1的组织抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinase 1))和TIMP-2(金属蛋白酶组织抑制剂2(tissue inhibitor of metalloproteinase 2))作为活性成分。
在本发明中,神经干细胞条件培养基可进一步含有TIMP-3或TIMP-4。
另外,神经干细胞条件培养基含有低浓度的MMP-1(基质金属蛋白酶-1(matrixmetalloproteinase-1))、MMP-2(基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2))、MMP-3(基质金属蛋白酶-3(matrix metalloproteinase-3))、MMP-9(基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9))、MMP-7(基质溶解素(matrilysins))、MMP-10(基质分解素(stromelysins))以及MMP-13(胶原蛋白酶(collagenase))。
在本发明中,神经干细胞是通过永生化从大脑的脑室区(ventricular zone)提取的神经干细胞而获得的细胞。在本发明的具体实施例中,通过永生化从胚胎大脑的脑室区(ventricular zone)分离的神经干细胞(neural stem cells,NSC)来获得神经干细胞。细胞在含有DMEM(达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(Dulbecco's Modified Eagle'sMedium))、10%FBS(胎牛血清(fetal bovine serum))以及1%青霉素/链霉素(penicillin/streptomycin)的非诱导培养基中进行培养且去除非附着的细胞。在传代培养经由上述过程培养的神经干细胞(neural stem cells,NSC)的过程中,获得并离心神经干细胞条件培养基,且过滤上清液。
在本发明中,神经干细胞条件培养基抑制MMP-1(基质金属蛋白酶-1(matrixmetalloproteinase-1))、MMP-2(基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2))、MMP-3(基质金属蛋白酶-3(matrix metalloproteinase-3))以及MMP-9(基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9))的表达或活性。
在本发明中,神经干细胞条件培养基可恢复皮肤组织中的胶原蛋白或弹性蛋白。
另外,在本发明中,神经干细胞条件培养基可抑制皮肤组织中的活性氧物种(reactive oxygen species)的产生或修复DNA损伤。
DNA损伤修复通过神经干细胞条件培养基增加DNA修复酶Rad50、Rad51或XRCC4的活性来进行。另外,在神经干细胞条件培养基中,γH2AX(gammaH2AX)用作确定DNA损伤程度的标记物。
在本发明中,术语“化妆品组合物”是指含有神经干细胞条件培养基或神经干细胞提取物的组合物,且对于组合物的配制物没有特别的限制。举例来说,配制物可选自由以下组成的群组:皮肤乳液、柔肤水、爽肤水、收敛水、乳液、奶类乳液、保湿乳液、营养乳液、按摩霜、营养霜、保湿霜、护手霜、粉底、精华、营养精华、面膜、肥皂、洁面泡沫、洁面乳液、洁面霜、身体乳液、身体清洁剂、洗面奶、处理剂、美容液、美容面膜(beauty pack)、软膏、凝胶、擦剂、液体/溶液、贴剂以及喷雾。
为了实现本发明的目的,组合物可以这些配制物中的任一种的形式制备和商品化,并且不限于上文所描述的实例。
当配制成化妆品组合物时,神经干细胞条件培养基的含量为按化妆品组合物的总重量计的0.0001重量%到50重量%,优选地为0.01重量%到10重量%。为了实现最小化或减轻由紫外线引起的皮肤损伤的效果,考虑到施加到各种配制物的可能性和过量添加的感觉的减少,神经干细胞条件培养基的含量优选地大于上述最小值且不大于上述最大值。此时,神经细胞培养条件培养基的含量优选地根据配制物或化妆品组合物中所含有成分的含量在上述范围内进行适当调整。
本发明的化妆品组合物中所包含的成分包含除了活性成分以外的化妆品组合物中的常用成分,例如常规的佐剂(例如抗氧化剂、稳定剂、增溶剂、维生素、颜料以及香料)和载剂。
当本发明的配制物为膏体、乳霜或凝胶时,可使用动物油、植物油、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、有机硅、膨润土、二氧化硅、滑石或氧化锌作为载剂组分。
当本发明的配制物为粉剂或喷雾时,可使用乳糖、滑石、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙或聚酰胺粉末作为载剂组分。具体地说,当本发明的配制物为喷雾时,可进一步包含推进剂,例如氯氟烃、丙烷/丁烷或二甲醚。
当本发明的配制物为溶液或乳剂时,可使用溶剂、增溶剂或乳化剂,例如水、醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁基乙二醇油、甘油脂肪酯、聚乙二醇或脱水山梨糖醇的脂肪酸酯作为载剂组分。
当本发明的配制物为悬浮液时,适用载剂组分的实例包含液体稀释剂,例如水、醇或丙二醇;悬浮剂,例如乙氧基化异硬脂醇、聚氧化乙烯山梨糖醇酯和聚氧化乙烯脱水山梨糖醇酯,以及微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂、黄蓍胶以及类似者。
当本发明的配制物为含表面活性剂的清洁剂时,适用载剂组分的实例包含:脂肪醇硫酸酯、脂肪醇醚硫酸酯、磺基琥珀酸单酯、羟乙磺酸酯、咪唑啉衍生物、甲基牛磺酸酯、肌氨酸酯、脂肪酸酰胺醚硫酸酯、烷基酰胺甜菜碱、脂肪醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物油、羊毛脂衍生物、乙氧基化甘油脂肪酸酯以及类似者。
在另一方面,本发明涉及一种用于使用含有TIMP-1和TIMP-2的神经干细胞条件培养基来减轻皮肤皱纹或增强皮肤弹性的方法。
在另一方面,本发明涉及一种含有TIMP-1和TIMP-2的神经干细胞条件培养基用于缓解皮肤皱纹和增强皮肤弹性的用途。
在另一方面,本发明涉及一种含有TIMP-1和TIMP-2的神经干细胞条件培养基用于制备用于减轻皮肤皱纹或增强皮肤弹性的化妆品组合物的用途。
实例
在下文中,将参考以下实例更详细地描述本发明。然而,对于本领域的技术人员显而易见的是,以下实例仅出于说明本发明的目的被提供,且不应被理解为基于本发明的主题而限制本发明的范围。
实例1:产生神经干细胞条件培养基和神经干细胞提取物
通过永生化(immortalized)从胚胎大脑的脑室区(ventrocular zone)分离的成体神经干细胞(neural stem cells,NSC)获得的细胞。
具体地说,14周大的胚胎神经细胞组织使用0.1%胶原蛋白酶和0.1%玻尿酸酶溶液在37℃下处理1小时,且然后使用0.05%胰蛋白酶-EDTA处理2分钟到3分钟以分离各个细胞。通过使用CD45-/CD133+/CD34-标记物的FACS将各个细胞分隔开。细胞在补充有N-2补充剂(supplements)、0.2毫克/毫升(mg/ml)的肝素(heparin)、20纳克/毫升(ng/ml)的bFGF(碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor))、20纳克/毫升的EGF(表皮生长因子(epidermal growth factor))以及10纳克/毫升的LIF的人类神经球(humanneurosphere)培养基中进行培养。在10天到14天之后,使用胶原蛋白酶处理形成的神经球(neurospheres)以将其分隔成各个细胞,且在非诱导培养基中培养通过使用逆转录病毒载体(retroviral vector)转导(transduction)v-myc基因并选择(selection)而获得的细胞,所述非诱导培养基含有DMEM(达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(Dulbecco's ModifiedEagle's Medium))、10%FBS(胎牛血清(fetal bovine serum))以及1%青霉素/链霉素(penicillin/streptomycin)(弗拉克斯JD等人(Flax JD.et al.),自然生物技术(NatureBiotechnology),16,1998;林H-C等人(Lim H-C et al.),神经科学快报(NeuroscienceLetters)435:175-180,2008)。5×105个细胞接种到150毫米(mm)的培养皿上,将15毫升(ml)的培养基添加到培养皿上,且细胞在37℃、5%CO2培养箱中培养以在细胞汇合(cellconfluence)达到80%时获得培养肉汤。本文所使用的培养基是一种含有DMEM(达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium))、10%FBS(胎牛血清(fetal bovine serum))以及1%青霉素链霉素(penicillin streptomycin)的非诱导培养基,且在培养之后去除非附着的细胞。在传代培养通过这种方式培养的神经干细胞(neuralstem cells,NSC)的过程中,获得并离心神经干细胞条件培养基,且过滤上清液。
实例2:证实神经干细胞条件培养基对人类体细胞的细胞毒性
5×103个人类体细胞接种到96孔板(96-well plate)上且在细胞汇合(cellconfluence)达到80%到90%时使用神经干细胞条件培养基处理24小时。将WST-1添加到板中,使用微板读数仪(microplate reader)在450纳米(nm)处测量吸收度,并且检测神经干细胞条件培养基的细胞毒性(cytotoxicity)。
结果显示,神经干细胞条件培养基对人类体细胞的增殖没有影响(图1)。
实例3:证实神经干细胞条件培养基对由于UVB而增加的细胞内活性氧物种的抑制
5×103个人类体细胞接种到黑色96孔板(96-well plate)上且在细胞汇合(cellconfluence)达到80%到90%时在无血清(serum free)DMEM中培养24小时。然后,人类体细胞使用神经干细胞条件培养基处理24小时且暴露于UVB(30毫焦/平方厘米(mJ/cm2)),并且然后在补充有10%血清的DMEM培养基中培养24小时。为了确定神经干细胞条件培养基是否抑制由于UVB而增加的细胞内活性氧物种(ROS),添加10微米的二氢乙锭(DHE)溶液并在37℃下执行处理30分钟,紧接着使用荧光微板读数仪进行测量。
结果显示,神经干细胞条件培养基有效地减少人类体细胞中由于UVB而增加的细胞内活性氧物种(图2)。
另外,人类体细胞使用盖玻片接种在24孔板上且在细胞汇合达到80%到90%时在无血清DMEM中培养24小时。然后,人类体细胞使用神经干细胞条件培养基处理24小时,暴露于UVB(30毫焦/平方厘米(mJ/cm2)),并且然后在补充有10%血清的DMEM中培养24小时。为了证实神经干细胞条件培养基对由于UVB而增加的细胞内活性氧物种(reactive oxygenspecies;ROS)的影响,将10微米(uM)的二氢乙锭(dihydroethidium(DHE))溶液添加到所述神经干细胞条件培养基中且使用荧光显微镜(fluorescent microscope)执行分析。
结果显示,神经干细胞条件培养基有效地减少人类体细胞中由于UVB而增加的细胞内活性氧物种(ROS)(图3)。
实例4:证实神经干细胞条件培养基对人类体细胞中的MMPs表达和活性的抑制
当人类体细胞暴露于UVB时,促进了胶原蛋白(前胶原蛋白(pro-collagen))的降解。因此,在这个实例中,证实了促进胶原蛋白(前胶原蛋白(pro-collagen))的降解的MMPs的表达和活性。
人类体细胞接种到100毫米的培养皿上且在细胞汇合(cell confluence)达到80%到90%时在无血清(serum free)DMEM中培养24小时。然后,人类体细胞使用神经干细胞条件培养基处理24小时,暴露于UVB(30毫焦/平方厘米),并且然后在补充有10%血清的DMEM培养基中培养24小时。经由qPCR(图4)、蛋白质印迹法(图5)以及酶谱法(zymography)(图6)确定了神经干细胞条件培养基对MMPs的表达和活性的影响,所述MMPs在暴露于UVB后促进胶原蛋白(前胶原蛋白(pro-collagen))的降解。
结果显示,神经干细胞条件培养基抑制用以促进由于UVB引起的胶原蛋白(前胶原蛋白(pro-collagen))的降解的MMPs的表达和活性(图4到图6)。
实例5:证实神经干细胞条件培养基对于由于UVB引起的胶原蛋白降解的抑制
从实例4看出,当人类体细胞暴露于UVB时,促进了胶原蛋白(前胶原蛋白(pro-collagen))的降解且MMPs涉及通过这种方式促进胶原蛋白(前胶原蛋白(pro-collagen))的降解。因此,从这个实例看出,胶原蛋白(前胶原蛋白(pro-collagen))的合成通过经由神经干细胞条件培养基抑制MMPs的表达和活性来促进。
细胞以与实例4中相同的方式制备且使用神经干细胞条件培养基处理24小时以抑制涉及促进由UVB引起的胶原蛋白降解的MMPs的表达和活性。然后,使用蛋白质印迹法观察在神经干细胞条件培养基抑制MMPs的表达和活性后的前胶原蛋白(pro-collagen)的合成。
结果显示,当神经干细胞条件培养基抑制涉及由UVB推进的胶原蛋白降解的MMPs的表达和活性时,促进了胶原蛋白(前胶原蛋白(pro-collagen))的合成(图7)。
实例6:确认涉及MMPs活性的抑制的神经干细胞条件培养基中的活性成分(细胞因子(cytokines))TIMP-1/TIMP-2
人类体细胞接种到150毫米的培养皿上且在细胞汇合达(cell confluence)到80%到90%时使用无血清(serum free)DMEM进行培养。培养细胞48小时以获得细胞条件培养基,制备样本以使得蛋白质的量为200微克,且然后使用细胞因子阵列(array)(具体地为来自瑞博奥(RayBio)的人类细胞因子抗体阵列(human cytokine antibody array))检测神经干细胞条件培养基中的成分。
TIMP-1和TIMP-2存在于神经干细胞条件培养基中经由人类细胞因子抗体阵列(human cytokine antibody array)证实且然后通过蛋白质印迹法(Western-blot)分析(图8)再次证实。
然后,人类体细胞接种到100毫米的培养皿上且在细胞汇合(cell confluence)达到80%到90%时在无血清(serum free)DMEM中培养24小时。然后,使用重组蛋白TIMP-1和重组蛋白TIMP-2中的每一者或其组合将神经干细胞条件培养基处理24小时,且将人类体细胞暴露于UVB(30毫焦/平方厘米)并且在补充有10%血清的DMEM培养基中培养24小时。确定神经干细胞条件培养基是否抑制由于UVB而促进的MMPs的活性。
结果显示,含有TIMP-1和TIMP-2的神经干细胞条件培养基抑制了可归因于UVB而增加的MMPs活性(图9)。
实例7:确认神经干细胞条件培养基对SKH-1小鼠的皱纹形成的抑制
7-1:抑制皱纹形成的效果
雌性SKH-1小鼠暴露于UVB(30毫焦/平方厘米/1次暴露)12周,用神经干细胞条件培养基进行处理且然后在12周时处死(sacrifice)。经由有机硅复制品(siliconereplica)分析使用神经干细胞条件培养基处理的群组(group)对抑制皱纹形成和减轻皱纹的影响。
结果显示,使用神经干细胞条件培养基处理的小鼠展现抑制和预防皱纹形成以及减轻皱纹的效果(图10和图11)。
7-2:减少ROS(活性氧物种(reactive oxygen species))的效果
以与实例7-1中相同的方式制备组织且通过DHE染色来分析神经干细胞条件培养基对由UVB产生的ROS(活性氧物种(reactive oxygen species))的影响。
结果显示,获得了减少在使用神经干细胞条件培养基处理的小鼠中由UVB而促进的ROS(活性氧物种(reactive oxygen species))的效果(图12)。
7-3:复原胶原蛋白和弹性蛋白的效果
以与实例7-1中相同的方式制备组织,将小鼠皮肤组织固定在4%甲醛中,组织包埋石蜡产生并被切割到3微米的厚度,并且将切割的组织附着到载玻片。然后,经由马森氏三色(Masson's Trichrome)染色和维尔赫夫氏弹性蛋白(Verhoeff's elastin)染色检测由于UVB辐射而减少的胶原蛋白和弹性蛋白的行为。
结果显示,由于UVB辐射而减少的胶原蛋白和弹性蛋白在使用神经干细胞条件培养基处理的小鼠中复原(图13)。
实例8:证实神经干细胞条件培养基对SKH-1小鼠中的MMP-2和MMP-9的减少。
8-1:减少由于UVB而增加的MMP-2和MMP-9
以与实例7-1中相同的方式制备组织,将小鼠皮肤组织固定在4%甲醛中,组织包埋石蜡产生并被切割到3微米的厚度,将切割组织附着到载玻片,并且进行脱蜡和再水合(deparaffinize and rehydrate)。然后,顺序地进行抗原修复(antigen retrieval)(柠檬酸盐缓冲液(citrate buffer),pH6.0)、使用0.1%曲拉通(Triton)X-100进行处理、使用正常驴血清(normal donkey serum)封闭(blocking)以及使用一级抗体(1:100)处理24小时。然后,组织使用二级抗体处理1小时并经历5分钟的DAPI染色。组织使用维克塔希尔德封片剂(vectashield mounting medium)固定到载玻片并使用共焦显微镜(confocalmicroscope)进行观察。
结果显示,由于UVB而增加的MMP-2和MMP-9在使用神经干细胞条件培养基处理的小鼠中减少(图14)。
8-2:调节由于UVB而增加的MMPs的转录因子NFkB
以与实例7-1中相同的方式制备组织,并且通过蛋白质印迹法检测涉及小鼠皮肤组织中的由UVB促进的皮内胶原蛋白(collagen)的降解的MMPs的表达和活性以及调节MMPs的转录因子(transcription factors)的表达(图15到图17)。另外,研究了神经干细胞条件培养基经由MMPs和调节MMPs的转录因子对胶原蛋白产生的影响(图18)。
结果显示,由于UVB而增加的MMP-1、MMP-2以及MMP-9的表达(图15)和活性(图16)在使用神经干细胞条件培养基处理的小鼠中减少。另外,发现NFkB(调节这些MMPs的转录因子)也减少了(图17)且因此真皮中的胶原蛋白再次复原(图18)。
实例9:证实神经干细胞条件培养基对DNA损伤的抑制和复原
组织以与实例7-1中相同的方式制备,且以与实例8-1中相同的方式进行染色,并且使用γH2AX确定由UVB引起的DNA损伤(damage)程度。另外,为了确定神经干细胞条件培养基对DNA损伤的影响,经由蛋白质印迹法检测了Rad50(DNA修复酶(repair enzymes)中的一种)。
结果显示,由UVB引起的DNA损伤(damage)在使用神经干细胞条件培养基处理的小鼠中进行修复并且损伤的DNA经由Rad50(DNA修复酶(repair enzymes)中的一种)进行修复(图19和图20)。
实例10:产生神经干细胞条件培养基和脂肪源性干细胞条件培养基
为了制备神经干细胞条件培养基(neural stem cell conditioned medium;NSC-CM)和脂肪源性干细胞条件培养基(adipose-derived stem cell conditioned medium;ASC-CM),在150毫米的培养皿(culture dishs)上接种5X105个细胞,将15毫升的培养基添加到培养皿中,并在37℃和5%CO2下在培养箱中培养细胞以在细胞汇合(cellconfluence)达到80%时获得培养肉汤。本文所使用的神经干细胞的培养基是补充有10%FBS(胎牛血清(fetal bovine serum))和1%青霉素链霉素(penicillin streptomycin)的DMEM(达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)),且本文所使用的脂肪源性干细胞的培养基是含有DMEM/F12(达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基:营养混合物F-12(Dulbecco's Modified Eagle's Medium:Nutrient Mixture F-12)、10%FBS(胎牛血清(fetal bovine serum))以及1%青霉素链霉素(penicillin streptomycin)的非诱导培养基。在培养之后,去除非附着的细胞。在传代培养经由这种过程培养的神经干细胞(neural stem cells,NSC)和脂肪源性干细胞(adipose-derived stem cells,ASC)的过程中,获得并离心细胞条件培养基,且过滤所得上清液。另外,经由WST-1发现每一细胞条件培养基都没有细胞毒性(cytotoxicity)(图21a)。
实例11:比较神经干细胞条件培养基和脂肪源性干细胞条件培养基对活体外(invitro)的MMPs的表达的抑制。
11-1:确认MMPs的表达
当人类体细胞暴露于UVB时,促进了胶原蛋白(前胶原蛋白(pro-collagen))的降解。因此,在这个实例中,确认促进胶原蛋白(前胶原蛋白(pro-collagen))的降解的MMPs的表达,并且确认存在于每一干细胞条件培养基中的MMP-1。
人类体细胞接种到100毫米的培养皿上,当细胞汇合(cell confluence)达到80%到90%时使用无血清(serum free)DMEM进行培养,并且使用无血清DMEM进一步培养24小时。然后,使用神经干细胞条件培养基和脂肪源性细胞条件培养基将细胞处理24小时,且人类体细胞暴露于UVB(30毫焦/平方厘米)并且在补充有10%血清的DMEM培养基中培养24小时。使用qPCR(图21b)和蛋白质印迹法(图22b)确定了神经干细胞条件培养基和脂肪源性干细胞条件培养基对MMPs的表达的影响,所述MMPs在暴露于UVB后促进胶原蛋白(前胶原蛋白(pro-collagen))的降解。
结果显示,在神经干细胞条件培养基中更大程度地抑制在UVB辐射后用以促进胶原蛋白(前胶原蛋白(pro-collagen))的降解的MMPs的表达。
11-2:与抑制皱纹形成相关的因素之间的比较
在这个实例中,确认促进胶原蛋白(前胶原蛋白(pro-collagen))的降解的MMPs和抑制MMPs的活性的因素(TIMP-1和TIMP-2)是否存在于神经干细胞条件培养基和脂肪源性干细胞条件培养基中。经由布拉德-福特检定(Brad-ford assay)检测每一条件培养基中的总蛋白量(图23a),且然后经由人类细胞因子抗体阵列(human cytokineantibody array)检测MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-9、MMP-10以及MMP-13的浓度(图22a)。另外,在使用每一条件培养基进行处理之后,经由蛋白质印迹法分析MMPs的表达(图23b)。
结果显示,与脂肪源性干细胞条件培养基的促进胶原蛋白降解的MMP-1、MMP-2、MMP-3以及MMP-9以及抑制MMPs活性的TIMP-1和TIMP-2相比,神经干细胞条件培养基具有更低含量的MMP-1、MMP-2、MMP-3以及MMP-9,以及更高含量的TIMP-1和TIMP-2。此外,结果显示,其他MMPs(即MMP-7、MMP-10以及MMP-13)的含量在对应的条件培养基之间相似。因此,可以预测神经干细胞条件培养基由于其中的主要MMPs含量较低而具有更好的保护胶原蛋白的能力。
实例12:活体内(in vivo)比较神经干细胞条件培养基和脂肪源性干细胞条件培养基的影响
12-1:确认神经干细胞条件培养基和脂肪源性干细胞条件培养基对SKH-1小鼠的皱纹形成的抑制
雌性SKH-1小鼠暴露于UVB 12周(30毫焦/平方厘米,1周到4周内每周3次;30毫焦/平方厘米,5周到12周内每周一次),使用神经干细胞条件培养基处理,并在12周时处死(sacrifice)。经由有机硅复制品(silicone replica)分析使用神经干细胞条件培养基和脂肪干细胞培养基处理的群组(group)对抑制皱纹形成和减轻皱纹的影响。
结果显示,与脂肪源性干细胞条件培养基的情况相比,使用神经干细胞条件培养基处理的小鼠的抑制皱纹形成和减轻皱纹的效果显著地改善(图25a和图25b)。
12-2:神经干细胞条件培养基和脂肪源性干细胞条件培养基对复原SKH-1小鼠的胶原蛋白和弹性蛋白的影响
以与实例7中相同的方式制备组织,将小鼠皮肤组织固定在4%甲醛中,组织包埋石蜡产生并被切割到3微米的厚度,并且将切割的组织附着到载玻片。然后,经由马森氏三色(Masson's Trichrome)染色和维尔赫夫氏弹性蛋白(Verhoeff's elastin)染色分析由于UVB辐射而减少的胶原蛋白和弹性蛋白。
结果显示,由于UVB辐射而减少的胶原蛋白和弹性蛋白在使用神经干细胞条件培养基处理的小鼠中比在使用脂肪源性干细胞条件培养基处理的小鼠中复原更多(图26)
实例13:活体内(in vivo)比较神经干细胞条件培养基和脂肪源性干细胞条件培养基对MMPs的表达的抑制
以与实例7-1中相同的方式制备组织,将小鼠皮肤组织固定在4%甲醛中,组织包埋石蜡产生并被切割到3微米的厚度,将切割的组织附着到载玻片,并且进行脱蜡和再水合(deparaffinize and rehydrate)。然后,顺序地进行抗原修复(antigen retrieval)(柠檬酸盐缓冲液(citrate buffer),pH6.0)、使用0.1%曲拉通(Triton)X-100进行处理、使用正常驴血清(normal donkey serum)封闭(blocking)以及使用一级抗体(1:100)处理24小时。然后,组织使用二级抗体处理1小时并经历5分钟的DAPI染色。组织使用维克塔希尔德封片剂(vectashield mounting medium)固定到载玻片并使用共焦显微镜(confocalmicroscope)进行观察。
结果显示,由于UVB而增加的MMP-2和MMP-9在使用神经干细胞条件培养基处理的小鼠中比在使用脂肪源性干细胞条件培养基处理的小鼠中减少更多(图27)。
实例14:证实神经干细胞条件培养基和脂肪源性干细胞条件培养基对DNA损伤的抑制和复原
组织以与实例7-1中相同的方式制备并以与实例8-1中相同的方式进行染色,并且通过γH2AX确定由UVB引起的DNA损伤(damage)程度。另外,为了确定神经干细胞条件培养基和脂肪源性干细胞条件培养基对DNA损伤的影响,经由蛋白质印迹法检测了Rad50(DNA修复酶(repair enzymes)中的一种)。
结果显示,由UVB引起的DNA损伤(damage)在使用神经干细胞条件培养基处理的小鼠中比在使用脂肪源性干细胞条件培养基处理的小鼠中修复得更多,且损伤的DNA经由Rad50(DNA修复酶(repair enzymes)中的一种)修复得更多(图28)。
工业适用性
根据本发明的含有低浓度的各种MMPs以及高浓度的TIMP-1和TIMP-2作为活性成分的神经干细胞条件培养基抑制了抑制胶原蛋白产生的MMPs的表达和活性,由此恢复胶原蛋白和弹性蛋白的合成,且因此适用作用于减轻皮肤皱纹和改善皮肤弹性的组合物。
尽管已详细地描述本发明的具体配置,但本领域的技术人员应了解,提供此描述是为了出于说明性目的来阐述优选实施例且所述描述不应被理解为限制本发明的范围。因此,本发明的实质范围由随附权利要求和其等效物限定。
Claims (17)
1.一种用于制备神经干细胞条件培养基的方法,所述神经干细胞条件培养基具有改善的减轻皮肤皱纹或增强皮肤弹性的能力,且包括TIMP-1(金属蛋白酶组织抑制剂1(tissueinhibitor of metalloproteinase 1))以及TIMP-2(金属蛋白酶组织抑制剂2(tissueinhibitor of metalloproteinase 2))作为活性成分,所述方法包括:
(a)永生化(immortalized)从大脑的脑室区(ventricular zone)分离的成体神经干细胞(neural stem cells,NSC);以及
(b)在非诱导培养基中培养永生化神经干细胞以获得神经干细胞条件培养基。
2.根据权利要求1所述的用于制备神经干细胞条件培养基的方法,其中所述神经干细胞条件培养基进一步包括TIMP-3或TIMP-4。
3.根据权利要求1所述的用于制备神经干细胞条件培养基的方法,其中所述神经干细胞条件培养基抑制MMP1(基质金属蛋白酶-1(matrix metalloproteinases-1))、MMP-2(基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinases-2))、MMP-3(基质金属蛋白酶-3(matrixmetalloproteinases-3))以及MMP-9(基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9))的表达或活性。
4.根据权利要求1所述的用于制备神经干细胞条件培养基的方法,其中所述神经干细胞条件培养基恢复皮肤组织中的胶原蛋白或弹性蛋白。
5.根据权利要求1所述的用于制备神经干细胞条件培养基的方法,其中所述神经干细胞条件培养基抑制皮肤组织中活性氧物种(reactive oxygen species)的产生或修复DNA(脱氧核糖核酸)损伤。
6.根据权利要求5所述的用于制备神经干细胞条件培养基的方法,其中通过增加Rad50、Rad51或XRCC4的活性来进行所述DNA(脱氧核糖核酸)损伤修复。
7.根据权利要求1所述的用于制备神经干细胞条件培养基的方法,其中所述非诱导培养基包括DMEM(达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(Dulbecco's Modified Eagle'sMedium))、10%FBS(胎牛血清(fetal bovine serum))以及1%青霉素/链霉素(penicillin/streptomycin)。
8.一种用于减轻皮肤皱纹或增强皮肤弹性的化妆品组合物,包括作为活性成分的神经干细胞条件培养基,所述神经干细胞条件培养基包括TIMP-1(金属蛋白酶组织抑制剂1(tissue inhibitor of metalloproteinase 1))以及TIMP-2(金属蛋白酶组织抑制剂2(tissue inhibitor of metalloproteinase 1))。
9.根据权利要求8所述的用于减轻皮肤皱纹或增强皮肤弹性的化妆品组合物,其中所述神经干细胞条件培养基进一步包括TIMP-3或TIMP-4。
10.根据权利要求8所述的用于减轻皮肤皱纹或增强皮肤弹性的化妆品组合物,其中所述神经干细胞条件培养基包括低浓度的MMP-1(基质金属蛋白酶-1(matrixmetalloproteinases-1))、MMP-2(基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinases-2))、MMP-3(基质金属蛋白酶-3(matrix metalloproteinases-3))、MMP-9(基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9))、MMP-7(基质溶解素(Matrilysins))、MMP-10(基质分解素(Stromelysins))以及MMP-13(胶原蛋白酶(Collagenase))。
11.根据权利要求8所述的用于减轻皮肤皱纹或增强皮肤弹性的化妆品组合物,其中所述神经干细胞来源于大脑的脑室区(ventricular zone)。
12.根据权利要求8所述的用于减轻皮肤皱纹或增强皮肤弹性的化妆品组合物,其中所述神经干细胞条件培养基抑制MMP-1(基质金属蛋白酶-1(matrix metalloproteinases-1))、MMP-2(基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinases-2))、MMP-3(基质金属蛋白酶-3(matrix metalloproteinases-3))以及MMP-9(基质金属蛋白酶-9(matrixmetalloproteinases-9))的表达或活性。
13.根据权利要求8所述的用于减轻皮肤皱纹或增强皮肤弹性的化妆品组合物,其中所述神经干细胞条件培养基恢复皮肤组织中的胶原蛋白或弹性蛋白。
14.根据权利要求8所述的用于减轻皮肤皱纹或增强皮肤弹性的化妆品组合物,其中所述神经干细胞条件培养基抑制皮肤组织中活性氧物种(reactive oxygen species)的产生或修复DNA(脱氧核糖核酸)损伤。
15.根据权利要求14所述的用于减轻皮肤皱纹或增强皮肤弹性的化妆品组合物,其中通过增加Rad50、Rad51或XRCC4的活性来进行所述DNA(脱氧核糖核酸)损伤修复。
16.根据权利要求8所述的用于减轻皮肤皱纹或增强皮肤弹性的化妆品组合物,其中在所述神经干细胞条件培养基中,γH2AX(gammaH2AX)用作确定DNA(脱氧核糖核酸)损伤程度的标记物。
17.根据权利要求8所述的用于减轻皮肤皱纹或增强皮肤弹性的化妆品组合物,其中所述化妆品以选自由以下组成的群组的配制物形式提供:皮肤乳液、柔肤水、爽肤水、收敛水、乳液、奶类乳液、保湿乳液、营养乳液、按摩霜、营养霜、保湿霜、护手霜、粉底、精华、营养精华、面膜、肥皂、洁面泡沫、洁面乳液、洁面霜、身体乳液、身体清洁剂、洗面奶、处理剂、美容液、美容面膜、软膏、凝胶、擦剂、液体/溶液、贴剂以及喷雾。
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