KR102142210B1

KR102142210B1 - 아제라린에 의한 필라그린 발현증가를 통한 아토피 치료 조성물

Info

Publication number: KR102142210B1
Application number: KR1020190021829A
Authority: KR
Inventors: 신순영; 이경희
Original assignee: 주식회사 아제라바이오텍
Priority date: 2019-02-25
Filing date: 2019-02-25
Publication date: 2020-08-06

Abstract

본 발명은 아제라린(Agerarin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 피부장벽 강화용 조성물에 관한 것으로서, 상기 아제라린은 염증성 사이토카인에 의해 감소된 필라그린(Filaggrin) 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현량을 증가시켜 피부장벽을 강화시키는 효과가 있다.

Description

아제라린에 의한 필라그린 발현증가를 통한 아토피 치료 조성물{Composition for treatment of atopic dermatitis by increasing the expression of filaggrin by azerarin}

본 발명은 아제라린을 포함하는 피부장벽 강화용 조성물에 관한 것이다.

사람의 피부는 표피층(epidermis)과 진피층(dermis) 및 피하지방 조직의 3개 층으로 이우어져 있으며, 유해미생물, 물리적 손상, 자외선 등과 같은 외부환경에 의한 물리적 자극 또는 화학적 자극으로부터 인체를 보호하는 일차적인 보호장벽의 역할을 한다. 또한, 피부는 인체에 필요한 각종 생리 활성 물질을 운반하는 역할을 할 뿐만 아니라, 감각을 인지하고, 인체의 65% ~ 70%를 차지하는 수분이 체외로 증발되는 것을 조절한다.

표피층은 외부로부터 각질층(stratum corneum), 과립층(stratum granulosum), 유극층(stratum spinosum) 및 기저층(stratum basale)의 순서로 구분된다. 피부각질층 세포들은 벽돌과 같은 역할을 하고, 각질세포 사이의 세포간 지질들은 세라마이드, 콜레스테롤, 지방산 등과 같은 지질혼합체로 세포 간 박판(Intercellular lamellae) 구조를 이루어 피부 장벽을 구성한다. 표피층을 구성하는 세포로는 각질형성세포(keratinocyte), 랑겔한스 세포, 머켈 세포 등의 다양한 세포들이 있으며, 이 중에서 대부분을 차지하는 세포가 각질형성세포(keratinocyte)이다. 각질형성세포는 기저층에서 세포 증식활동을 하고 분화되면서 각질층으로 올라오면서 각질세포(Corneocyte)가 되어 피부 각질을 구성함으로써 유해한 외부 환경으로부터 피부를 보호하는 역할을 수행한다.

필라그린은 과립층의 각질형성세포에서 ~400 kDa 크기의 거대 단백질 전구체(Profilaggrin) 형태로 발현되어 과립(keratohyalin granule)안에 존재하다가, 각질세포로 분화되는 과정에서 37 kDa 크기의 단량체(monomer) 형태로 단백 분해된다. 각질세포의 필라그린 단량체는 세포 외피에서 케라틴 필라멘트 다발과 결합하여 이를 응집시키고 정렬시켜서 단단하고 편평한 외피를 형성함으로써 피부장벽을 구성하는 역할을 한다 (J Allergy Clin Immunol 2013;131:280-291). 각질층 상부의 각질 세포에서는 일부 필라그린이 분해되어 UCA(Urocanic acid)와 Pyrroliodone-5-carboxylic acid(PCA)를 생성하여 피부의 pH 조절과 수분 손실 방지 등의 피부 항상성 유지에 중요하게 작용하는 천연보습인자(NMF; Natural Moisturizing Factor)로 작용한다 (Journal of Investigative Dermatology 2012;132:751-762). 따라서, 필라그린은 피부장벽을 구성하고 피부 보습을 유지하는 핵심 단백질로 간주되고 있다.

아토피 피부염(Atopic dermatitis)은 면역과민 반응으로 인한 알레르기 증상이 피부에 발생하여 피부장벽이 약화되고 피부가 건조해지면서 심한 가려움증이 동반되는 만성 재발성 피부 염증 질환이다 (J Clin Invest 2012;122:440-447). 염증 반응으로 인해 피부장벽이 손상되면 다른 항원에 대한 노출이 쉽게 만들어져서 만성 염증반응, 가려움증, 피부건조의 악순환이 반복된다 (N Engl J Med 2008;358:1483-1494). 아토피 피부염의 발병 원인은 유전적, 환경적, 면역학적, 피부 구조적 다양한 원인들이 복합적으로 작용하는 것으로 간주되고 있다 (J Clin Invest 2004;113:651-657). 이 중에서 가장 중요한 위험인자 중 하나는 필라그린 기능 감소이다 (J Invest Dermatol 2006;126:1200-1202). 필라그린 생성이 부족하면 피부장벽이 손상되어 아토피 피부염 발생이 증가된다고 알려졌다 (Nat Genet 2006;38:441-446, Curr Opin Immunol 2016;42:1-8). 실례로, 필라그린 유전자(FLG) 결손은 아토피 피부염 발생의 감수성을 높이며 치료 예후가 좋지 않은 지표로 밝혀졌으며 (J Invest Dermatol 2007;127:564-567), 필라그린이 과발현되는 형질전환 생쥐에서는 피부손상 후 회복속도가 빠르며, 경피에서의 수분손실량이 현저하게 감소하는 등 피부장벽의 개선효과가 크게 증가되는 현상이 관찰되었다 (J Invest Dermatol 2004;123:603-606). 따라서, 필라그린 발현이 감소되면 피부 장벽 기능이 약화되어 아토피 피부염이나 피부 건조증 등의 피부질환이 쉽게 유발된다 (J Cell Sci 122, 1285-1294).

급성 아토피 피부염 부위에는 Th2-임파구가 분비하는 사이토카인인 인터루킨-4와 인터루킨-13이 많이 증가되어 있으며, 만성 아토피 피부염 부위에는 Th1-임파구가 분비하는 사이토카인인 인터페론-감마( Interferon-gamma; IFNγ)와 종양괴사인자-알파(Tumor necrosis factor-alpha; TNFα)가 증가되어 있다 (J Allergy Clin Immunol 2000;105:860-876). 이들 염증성 사이토카인은 필라그린 유전자 발현을 감소시켜 피부장벽을 손상시킴으로써 아토피 피부염 증상을 더 악화시킨다 (J Allergy Clin Immunol 2007;120:150-155, ). 따라서, 아토피 피부염 치료 및 증상 개선에는 피부장벽 복구에 중요한 필라그린 피부 단백질 생성을 증강시켜주는 것이 중요하다.

한국등록특허 제10-1934976호

본 발명의 목적은 하기 화학식 1로 표시되는 아제라린(Agerarin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 피부장벽 강화용 조성물을 제공하는 것이다.

[화학식 1]

본 발명의 또 다른 목적은 시험관 내(in vitro)에서 하기 화학식 1로 표시되는 아제라린(Agerarin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 피부 세포에 처리하는 단계를 포함하는 필라그린(Filaggrin) 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현량을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.

[화학식 1]

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 아제라린(Agerarin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 피부장벽 강화용 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 6,7-디메톡시-2,2-디메틸-2H-크로멘인 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 아제라린은 필라그린(Filaggrin) 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현량을 증가시키는 것일 수 있다.

본 발명의 용어, "필라그린(Filaggrin)"은 과립층의 각질형성세포에서 ~400 kDa 크기의 거대 단백질 전구체(Profilaggrin) 형태로 발현되어 과립(keratohyalin granule)안에 존재하다가, 각질세포로 분화되는 과정에서 37 kDa 크기의 단량체(monomer) 형태로 단백 분해되는 단백질이다. 각질세포의 필라그린 단량체는 세포 외피에서 케라틴 필라멘트 다발과 결합하여 이를 응집시키고 정렬시켜서 단단하고 편평한 외피를 형성함으로써 피부장벽을 구성하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다(J Allergy Clin Immunol 2013;131:280-291).

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 아제라린은 1 내지 100 μM의 농도인 것일 수 있고, 바람직하게는 10 내지 50 μM의 농도인 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 40 μM의 농도인 것을 수 있다.

또한, 본 발명은 시험관 내(in vitro)에서 하기 화학식 1로 표시되는 아제라린(Agerarin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 피부 세포에 처리하는 단계를 포함하는 필라그린(Filaggrin) 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현량을 증가시키는 방법을 제공한다.

[화학식 1]

본 발명에 따른 조성물은 염증성 사이토카인에 의해 감소된 필라그린(Filaggrin) 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현량을 증가시켜 피부장벽을 강화시키는 효과가 있다.

도 1A는 필라그린 유전자(FLG) 프로모터의 -1088 ~ +25 염기서열 분위를 중합효소 연쇄반응을 이용하여 증폭한 후, 루시퍼라제 프로모터 리포터인 pGL4 벡터에 삽입하여 제조된 pGL4/FLG-Luc(-1088/+25) 벡터를 도식화 한 것이다.
도 1B는 각질형성세포주인 HaCaT 세포에 pGL4/FLG-Luc(-1088/+25) 플라스미드를 주입한 후 아토피 피부염을 악화시키는 염증성 사이토카인인 IFNγ+TNFα 혼합액 처리 또는 IFNγ+TNFα 혼합액과 아제라린 화합물을 병행 처리한 후, 필라그린 유전자의 프로모터 활성을 리포터 측정법을 통해 측정한 결과이다.
도 2A는 HaCaT 세포에 아토피 피부염을 악화시키는 염증성 사이토카인 IFNγ+TNFα 혼합액을 처리한 후, 다양한 시간 후에 세포를 수확하여 필라그린 유전자의 mRNA 발현량을 역전사 중합효소 연쇄반응법을 통해 측정한 결과이다.
도 2B는 HaCaT 세포에 아제라린을 다양한 농도로 처리하고 30분 후에 IFNγ+TNFα 혼합액을 처리한 후, 6시간 후에 세포를 수확하여 필라그린 유전자의 mRNA 발현량을 역전사 중합효소 연쇄반응법을 통해 측정한 결과이다.
도 3A는 HaCaT 세포에 아토피 피부염을 악화시키는 염증성 사이토카인인 IFNγ+TNFα 혼합액을 처리한 후, 필라그린 전구체의 단백질 발현량을 면역블롯법을 통해 측정한 결과이다.
도 3B는 HaCaT 세포에 아제라린을 다양한 농도로 처리하고 30분 후에 IFNγ+TNFα 혼합액을 처리한 후, 필라그린 전구체의 단백질 발현량을 면역블롯법을 통해 측정한 결과이다.

본 발명의 용어, "아제라린(Agerarin)"은 6,7-디메톡시-2,2-디메틸-2H-크로멘(6,7-dimethoxy-2,2-dimethyl-2H-chromene)이라는 화학명을 가지고 있고, 구조는 상기 화학식 1로 표기할 수 있다.

[화학식 1]

본 발명에 따른 화장료 조성물에 있어서, 상기 피부장벽 강화용 화장료 조성물은 상기 화학식 1의 화합물을 상기 조성물 총 중량에 대하여 0.0001~30 중량%의 양으로 포함할 수 있으나, 바람직한 피부장벽 강화 효과를 제공할 수 있는 유효량을 포함한다면 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 피부장벽 강화용 화장료 조성물은 피부외용연고, 크림, 유연화장수, 영양화장수, 팩, 에센스, 헤어토닉, 샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 트리트먼트, 젤, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 마사지 크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드 크림, 파운데이션, 영양에센스, 선스크린, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디 로션 및 바디 클렌저로 이루어지는 군으로부터 선택된 제형을 가질 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 이들 각 제형의 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 당업자에 의해 용이하게 선정될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형은 형광물질, 살진균제, 굴수성 유발물질, 보습체, 방향제, 방향제 담체, 단백질, 용해화제, 당유도체, 일광차단제, 비타민, 식물 추출물 등을 포함하는 부형제를 추가로 함유할 수 있다.

상기와 같이 피부장벽 강화용 화장료 조성물을 의약품 또는 화장품으로 제형화할 경우, 활성 성분에 대한 담체로 작용하는 피부에 적용가능한 공지의 부형제를 포함할 수 있다. 의약품으로의 제형화시에는 [Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA]에 개시되어 있는 내용을 참조할 수 있으며, 화장품으로 제형화시에는 [International cosmetic ingredient dictionary, 6th ed., The cosmetic, Toiletry and Fragrance Association, Inc., Washington, 1995]에 개시되어 있는 내용을 참조할 수 있을 것이다. 상기 문헌들은 본 명세서의 일부로서 포함된다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 실험방법

1.1. 세포배양

본 발명에서는 사람 각질형성 세포주인 HaCaT 각질형성세포를 이용하여 실험을 수행하였다. HaCaT 세포(ATCC, American Type Culture Collection)는 10% FBS(fetal bovine serum, Thermo Fisher Scientific), 항생제-항균제 용액(Thermo Fisher Scientific)이 포함된 DMEM(Thermo Fisher Scientific) 세포 배양액을 사용하여 2일에 한 번씩 100-mm 세포배양접시에서 1 x 10⁶의 접종 밀도(seed density)로 계대하면서 37℃, 5% CO₂ 세포배양기에서 배양하였다.

1.2. 필라그린 유전자 프로모터 클로닝

사람 필라그린 유전자(FLG)의 프로모터 부위 (전사 시작 부위를 +1로 하였을 때 -1088 ~ +25 염기 서열 부위)에는 SRF, STAT3, AP1 등과 같이 다양한 전사인자 결합자리가 존재함을 확인하였다(도 1A). 인간 게놈 DNA (Promega)를 주형으로 사용하여 필라그린 유전자의 -1088 ~ +25 부위 단편을 중합효소 연쇄반응(PCR)으로 증폭하였다. 유전자 프로모터 부위 증폭을 위한 프라이머 염기 서열은 하기 표 1과 같다.

방향	프라이머 염기서열
Forward	5'- ACTGGAGGTAGAGAATAGGCC -3'
Reverse	5'- TCCTTCTTACCTTGTTCACCAA -3'

증폭된 PCR 산물을 T&A 벡터 (RBC Bioscience)에 삽입하고, KpnI 및 BglII 제한효소로 절단한 후, 루시퍼라제 리포터 벡터(Luciferase Reporter Vector, Promega, 미국)가 존재하는 pGL4 플라스미드에 삽입하여 최종 pGL4/FLG-Luc(-1088/+25) 벡터를 제작하였다(도 1A).

1.3. 필라그린 유전자의 프로모터 활성 측정

필라그린 유전자의 프로모터와 루시퍼라제 리포터가 클로닝된 pGL4/FLG-Luc(-1088/+25) 벡터 0.5 ㎍에 퓨진6 시약(Fugene6)을 이용하여 HaCaT 세포에 형질주입(transfection)하고, 48 시간 후에 아무처리도 하지 않은 대조군, 각 5 ng/mL의 IFNγ+TNFα 혼합액 처리, IFNγ+TNFα 혼합액과 10, 20, 또는 40 μM 농도의 아제라린을 각각 병행 처리하였다. 세포는 12시간 동안 더 배양하였고, 이후 수확하여 세포를 용해시킨 후, 세포 용해물에 포함된 단백질에 기질인 루시페린(luciferin)을 50 μL 첨가하여 발광되는 루시페린 형광을 측정하였다. 루시페린 형광은 Promega 회사에서 구입한 Dual-Glo Luciferase Assay System을 이용하여 측정하였다.

1.4. 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)

총 RNA는 TRIzol RNA Isolation Reagents(QIAGEN)를 이용하여 추출하였다. 총 RNA 0.5 μg은 iScript cDNA synthesis kit(Bio-Rad)를 사용하여 제조회사의 프로토콜에 따라 역전사반응을 이용한 이중나선 cDNA를 합성하였다. 이중나선 cDNA 0.0125μg 으로 PCR을 수행하였다. 유전자 증폭을 위한 프라이머 염기 서열은 하기 표 2와 같다. 대조군으로는 항존유전자(housekeeping gene)인 GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)를 사용하였다. PCR은 95℃, 5분에서 DNA를 변성시킨 후, 94℃, 1분; 65℃, 2분; 및 70℃, 1분간 반응시키는 사이클을 30회 반복하였다. PCR 최종 산물은 1% 아가로오스 겔에서 전기영동하였고, EtBr(ethidium bromide)로 염색하여 확인하였다. 각 시료의 필라그린의 PCR 산물은 GAPDH 양을 표준화하여 대조군을 100%로 하고 이에 대한 상대적인 양을 환산하였다. GAPDH와 필라그린의 PCR 밴드는 ImageJ 프로그램(National Institutes of Health, 미국)을 이용하여 정량하였다.

유전자	프라이머 염기서열
Filaggrin	Forward	5'- CAAATCCTGAAGAATCCAGATGAC -3'
Filaggrin	Reverse	5'- TGCTTGAGCCAACTTGAATACC -3'
GAPDH	Forward	5'- ACCCACTCCTCCACCTTTG -3'
GAPDH	Reverse	5'- CTCTTGTGCTCTTGCTGGG -3'

1.5. 면역블롯법

HaCaT 세포를 수확하여 lysis buffer [20mM HEPES(N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid), 1% Triton X-100, 10% 글리세롤, 150mM NaCl, 10㎍/㎕ Leupeptin 및 1mM PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride)]를 처리하여 세포를 용해시킨 후, 탁상용 원심분리기를 이용하여 세포 용해액만을 수확하였다. 세포 용해액의 단백질의 양은 Pierce BCA Protein Assay Reagent (Thermo Scientific)를 사용하여 분석하였다. 동량의 단백질(10~20 μg)이 포함되도록 제조된 시료를 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel) 전기영동을 실시하여 세포에 존재하는 단백질들을 분리하였다. 전기영동으로 분리된 단백질을 폴리스틸렌 막(polystyrene membrane)으로 옮긴 후, 필라그린 및 GAPDH를 인지하는 일차항체를 각각 5시간 반응시킨 후, 상기 일차항체를 인지하는 이차항체(Cell Signaling Technology)를 1시간 동안 반응시켰다. 일차항체가 인지하는 단백질 밴드 양은 화학형광감지 시스템(Enhanced Chemiluminescence System; Amersham Pharmacia Biotechnology)을 이용하여 단백질 변화량을 분석하였다. 각 시료의 필라그린 전구체 단백질양은 GAPDH양을 표준화하여 대조군을 100%로 하고 이에 대한 상대적인 양을 환산하였다. GAPDH와 필라그린 전구체의 단백질 밴드는 ImageJ 프로그램(미국 National Institutes of Health에서 제공)을 이용하여 정량하였다.

실시예 2. 아제라린(Agerarin)에 의한 필라그린 유전자의 프로모터 활성 효과

아토피 피부염 부위에서 많이 생성되는 염증성 사이토카인인 IFNγ와 TNFα는 필라그린 유전자(FLG) 발현을 억제시켜 아토피 증상을 악화 시킨다고 보고되고 있다 (Exp Dermatol 2011;20:633~636 및 J Invest Dermatol 2011;131:1272-1279). 또한, 유전자 프로모터 활성이 억제되면 전사 수준(transcriptional level)에서 유전자의 mRNA 발현이 감소된다. 이에 본 발명자들은 필라그린 유전자(FLG) 프로모터를 클로닝하고 유전자 프로모터 활성을 측정하는 루시퍼라아제 리포터 실험법(luciferase reporter assay)을 이용하여 아제라린이 필라그린 유전자의 프로모터 활성에 영향을 주는지 조사하기 위한 실험을 수행하였다.

그 결과, HaCaT 세포에 필라그린 유전자의 프로모터가 클로닝된 pGL4/FLG-Luc(-1088/+25) 플라스미드를 주입한 후, IFNγ+TNFα 혼합액을 처리한 경우, 필라그린 유전자의 프로모터의 활성은 아무것도 처리하지 않은 대조군에 비해 약 46.3% 정도로 감소됨을 확인하였다 (도 1B). 이로써, 염증성 사이토카인인 IFNγ 및 TNFα을 처리한 경우 필라그린 유전자의 프로모터 활성이 저해되어 전사능(transcriptional activity)이 억제되고, 이로써 필라그린 유전자의 발현이 감소될 수 있음을 확인하였다.

그런데, 본 발명의 화합물인 아제라린을 처리한 경우에는 농도-의존적으로 IFNγ+TNFα 혼합액의 처리에 의해 감소되었던 필라그린 유전자의 프로모터 활성이 증가됨을 확인하였다 (도 1B). 구체적으로, 아제라린을 10, 20 및 40 μM 농도로 처리한 경우 프로모터 활성은 대조군에 비해 62.7%, 71.3% 및 113% 로 나타났다 (도 1B).

따라서, 본 발명의 화합물인 아제라린은 염증반응에 의하여 억제된 필라그린 유전자의 발현을 프로모터 수준에서 회복시킬 수 있음을 확인하였다.

실시예 3. 아제라린(Agerarin)에 의한 필라그린 유전자의 mRNA 발현 증가 효과

본 발명자들은 유전자의 프로모터 활성이 증가되면 유전자의 mRNA 발현이 증가된다는 점으로부터, 염증성 사이토카인에 의애 감소된 필라그린 유전자의 mRNA 발현이 아제라린에 의하여 회복될 수 있는지 RT-PCR을 통해 확인하는 실험을 수행하였다.

그 결과, HaCaT 세포에 각 5 ng/mL의 IFNγ+TNFα 혼합액을 처리한 경우, 처리 3시간 후부터 필라그린 유전자의 mRNA 발현량이 감소되기 시작하였고, 6시간 후에는 대조군에 비해 약 50.5% 정도로 감소되었으며, 12시간 이후에는 약 6.8% 정도만이 발현됨을 확인하였다 (도 2A). 이로써 IFNγ+TNFα 혼합액은 HaCaT 세포에서 필라그린 유전자의 mRNA 발현을 억제하였음을 확인하였다.

그런데, HaCaT 세포에 10, 20 및 40 μM의 아제라린을 30분 동안 전처리(pre-treatment)하고, IFNγ+TNFα 혼합액을 처리한 후, 6시간 후에 필라그린 유전자의 mRNA 발현량을 측정한 경우, 농도-의존적으로 필라그린 유전자의 mRNA 발현량이 증가됨을 확인하였다 (도 2B). 특히, 40 μM 농도의 아제라린을 처리한 실험군에서는 아무것도 처리하지 않은 대조군에 비해 약 168% 더 많은 필라그린 유전자의 mRNA가 발현되었음을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 화합물인 아제라린은 염증성 사이토카인에 의해 감소된 필라그린 유전자의 mRNA 발현량을 증가시켜 피부장벽을 강화시키는 효과가 있음을 확인하였다.

실시예 4. 아제라린(Agerarin)에 의한 필라그린 단백질의 발현 증가 효과

본 발명자들은 아제라린에 의한 필라그린의 단백질 수준에서의 변화를 조사하기 위한 실험을 수행하였다. 간단히, HaCaT 세포에 각각 5 ng/mL 농도의 IFNγ+TNFα 혼합액을 처리한 후, 12, 24, 36, 48 시간 후에 세포를 수확하여 면역블롯법을 수행하였다.

그 결과, IFNγ+TNFα 혼합액을 처리한 후 24시간 후부터 필라그린 전구체(profilaggrin)의 단백질 발현량이 감소됨을 확인하였다 (도 3A). 구체적으로, 24시간 후에는 대조군에 비해 약 36.6% 정도로 감소되었고, 36시간 후에는 약 14% 정도로 감소되었으며, 48시간 후에는 약 3% 정도만이 발현되었다 (도 3A). 이로써 IFNγ+TNFα 혼합액은 HaCaT 세포에서 필라그린 전구체의 단백질 발현을 억제하였음을 확인하였다.

그런데, 10, 20, 40 μM의 아제라린을 30분 동안 전처리하고, IFNγ+TNFα 혼합액을 처리한 경우에는 필라그린 전구체의 단백질 발현량이 농도-의존적으로 증가됨을 확인하였다 (도 3B).

따라서, 본 발명의 화합물인 아제라린은 염증성 사이토카인에 의해 감소된 필라그린 단백질의 발현량을 증가시켜 피부장벽을 강화시키는 효과가 있음을 확인하였다.

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시험관 내(in vitro)에서 하기 화학식 1로 표시되는 아제라린(Agerarin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 피부 세포에 처리하는 단계를 포함하는 필라그린(Filaggrin) 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현량을 증가시키는 방법:
[화학식 1]

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