KR20140118960A

KR20140118960A - 백미 추출물을 함유하는 피부노화 방지를 위한 화장료 조성물

Info

Publication number: KR20140118960A
Application number: KR1020140112845A
Authority: KR
Inventors: 박선기; 차영권; 안현철; 전봉주
Original assignee: 주식회사 코스메카코리아
Priority date: 2014-08-28
Filing date: 2014-08-28
Publication date: 2014-10-08

Abstract

본 발명은 백미 추출물로부터 정제된 화합물인 4-하이드록시아세토페논을 함유하는 피부노화 방지를 위한 화장료 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따르면 자외선으로부터 피부를 보호하고, 멜라닌으로 인한 피부 흑화 현상에 대처하기 위하여 티로시나제 활성을 억제하고, 피부 노화의 원인이 되는 각종 산화 요인에 대한 대처 및 외부 자극이나 다양한 스트레스 등의 손상 요인에 의해 저하된 피부수복기능을 원활하게 할 수 있으며 피부 흡수가 용이한 천연 유래 피부노화 방지를 위한 조성물을 제공할 수 있다.

Description

백미 추출물을 함유하는 피부노화 방지를 위한 화장료 조성물{A Cosmetic Composition for Whitening Skin Containing Cynanchum atratum Extracts}

본 발명은 백미 추출물을 함유하는 피부노화 방지를 위한 화장료 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 백미 추출물로부터 정제된 화합물인 4-하이드록시아세토페논을 함유하는 자외선으로부터 피부를 보호하고, 멜라닌으로 인한 피부 흑화 현상에 대처하기 위하여 티로시나제 활성을 억제하고, 피부 노화의 원인이 되는 각종 산화 요인에 대한 대처 및 외부 자극이나 다양한 스트레스 등의 손상 요인에 의해 저하된 피부수복기능을 원활하게 할 수 있으며 피부 흡수가 용이한 천연 유래 피부노화 방지를 위한 조성물에 관한 것이다.

현대사회는 산업화로 인해 생활여건은 매우 향상되었으나 대기오염으로 인한 오존층의 파괴, 폐수 등에 의한 수질오염, 각종 스트레스 등 피부 상태를 악화시키는 다양한 유해요인에 빈번히 노출되기 때문에 효능이 뛰어나며 피부에 대한 안전성이 높은 식물성분을 응용한 화장품이 21세기 세계 화장품 개발을 주도할 새로운 컨셉으로 각광 받고 있다.

또한 현재 화장품 시장의 트렌드도 단순 'Natural'에서 과학적 요소가 겸비된 ‘에코(Eco)'와 'Cosmeceutical', 새로운 블루오션으로 주목받고 있는 'Anti-aging'과 ’건강하고 환한 피부‘ 등으로 그 흐름이 변화하고 있다. 따라서 매년 꾸준한 성장을 하고 있는 ’자연주의와 친환경‘을 표방한 천연 식물 소재를 가지고 개발된 기능성 제품 역시 계속된 성장세를 이어갈 전망이다.

현대인들의 생활수준이 향상되면서 소비 성향에서도 경제성, 편리성, 실용성 등을 고려한 소비 패턴으로 변화함에 따라 화장품 선정에 있어서도 과거 유명 브랜드나 고가의 화장품에 대한 무조건적인 선호에서 벗어나 자신의 피부 타입에 맞고 경제적으로도 부담 없는 화장품을 찾는 추세로 인식이 변화하고 있으며, 단일 기능성 제품 보다 두 가지 이상의 기능이 어우러진 복합 기능성 화장품 쪽으로 소비자의 관심이 집중되고 있다. 이런 복합 기능성은 바쁜 현대사회에서 간단한 처치로 시간이 절약되는 측면과 확실하고 강력한 효능을 원하는 소비자의 니즈에 적합한 맞춤형 제품이라 할 수 있다. 예를 들어, 대한민국 특허출원 공개 제2008-0104672 호(2008.12.03)와 같이 항산화 효과와 미백 효과 및 항염 효과와 같은 복합 기능성을 가지는 화장료 조성물이 개발된 바 있다.

하지만 현재까지 개발된 제품들을 보면 화장품 시장의 빠른 트렌드 변화에 초점을 맞추어 제품을 개발하다보니 정작 소비자들의 다양한 피부 타입 및 생활 환경을 충분히 고려한 제품은 매우 드물며, 또한 각종 피부 유해요인으로부터 피부를 건강한 상태로 유지시키는 한편 피부에서 요구되는 각종 기능에 대한 다양한 메카니즘에 대처하여 기능성을 발현시킬 수 있는 제품은 아직까지 개발이 미미한 상태이기 때문에 관련 제품에 대한 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.

이에 본 발명에서는 전술한 바와 같은 문제점과 미비점을 극복하기 위하여 기 개발된 제품과 차별화된 기술을 적용시켜 보다 기능이 우수하고 피부에 안전한 화장품을 개발하여, 소비자에게 그 효능을 실감하게 할 수 있는 제품으로 개발하고자 한다.

따라서, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 자외선으로부터 피부를 보호하고, 멜라닌으로 인한 피부 흑화 현상에 대처하기 위하여 티로시나제 활성을 억제하고, 피부 노화의 원인이 되는 각종 산화 요인에 대한 대처 및 외부 자극이나 다양한 스트레스 등의 손상 요인에 의해 저하된 피부수복기능을 원활하게 할 수 있으며 피부 흡수가 용이한 천연 유래 피부노화 방지를 위한 화장료 조성물을 제공하기 위한 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 백미 추출물을 함유하는 피부노화 방지를 위한 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 화장료 조성물은 상기 백미 추출물로부터 정제된 화합물로부터 분리 정제된 하기 화학식 1의 화합물인 4-하이드록시아세토페논(4-Hydroxyacetophenone)을 포함하는 것을 특징으로 한다.

[화학식 1]

본 발명에서는 자외선으로부터 피부를 보호하고, 멜라닌으로 인한 피부 흑화 현상에 대처하기 위하여 티로시나제 활성억제, 생성된 멜라닌의 환원 및 멜라닌 형성 정보 전달 물질의 생성억제, 각질층에 존재하는 멜라닌의 빠른 배출 촉진 등 피부에 노화 방지 효과를 발현시키게 하는 다양한 메카니즘에 대처하는 제품의 설계를 통해 효능을 실감하게 할 수 있는 제품을 개발하는 것을 기초로 한다.

본 발명에서는 또한 피부 노화의 원인이 되는 각종 산화 요인에 대한 대처 및 외부 자극이나 다양한 스트레스 등의 손상 요인에 의해 저하된 피부수복기능을 원활하게 할 수 있도록 하여 피부를 건강하게 유지함으로서, 피부 본래의 조절기능을 십분 발휘할 수 있도록 하는데 특징이 있다.

본 발명의 피부노화 방지를 위한 화장료 조성물은 피부 흡수가 용이하고, 효율적인 캡슐화, 리포좀화, 나노기술 등과 같은 제제화 기술 및 소재를 활용하여 효능과 지속성을 보강시켜 유효성분의 흡수를 용이하게 함으로서 피부에의 이용률을 극대화 할 수 있는 특징이 있다.

상기 4-하이드록시아세토페논이 백미 (CA) 추출물의 용매분획; 박주가리과 (Asclepiadaceae)에 속하는 식물인 백미(Cynanchum atratum)를 세절하여 실온에서 3일간씩 3회에 걸쳐 MeOH로 추출한 다음, n-hexane, methylene chloride (MC), ethylacetate (EtOAc) 및 H₂O로 용매 분획하여 수득된 것임을 특징으로 하며 하기 표 1에 나타낸 바와 같은 ¹H 및 ¹³C-NMR 데이터 특성을 갖는 것을 특징으로 한다.

Position	4-Hydroxyacetophenone
Position	δ_C	δ_H (J in Hz)
1	128.70	-
2	130.72	7.88 d (8.5)
3	114.85	6.83 d (8.5)
4	162.70	-
5	114.85	6.83 d (8.5)
6	130.72	7.88 d (8.5)
7	198.07	-
8	24.85	2.51 s

본 발명의 피부노화 방지를 위한 화장료 조성물에는 상기 4-하이드록시아세토페논이 화장료 조성물의 총 중량에 대하여 0.001-50 중량%의 양으로 포함되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 0.01-20 중량%의 양으로 포함되고, 더욱 더 바람직하게는 0.1-10 중량%로 포함된다. 4-하이드록시아세토페논의 함량이 일정 함량 미만일 경우에는 뚜렷한 효과를 기대할 수 없으며, 일정 함량을 초과일 경우에는 화장료의 안전성 또는 제형상의 제조에 어려움이 있다.

상기와 같은 본 발명의 피부노화 방지를 위한 화장료 조성물의 제형은 특별히 제한되지 않으며, 목적하는 바에 따라 적절히 선택할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 화장료 조성물은 피부외용연고, 유연화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 팩, 에멀젼, 오일젤 등의 제형으로 제조될 수 있다. 이때, 상기 피부외용연고는 본 발명의 4-하이드록시아세토페논 이외에 바셀린 50∼97 중량% 및 폴리옥시에틸렌올레일-에테르 포스페이트 0.1∼5중량%를 함유하도록 제조할 수 있으며, 유연화장수는 본 발명의 4-하이드록시아세토페논 이외에 다가알콜류(프로필렌글리콜, 글리세린 등) 1∼10 중량% 및 계면활성제(폴리에틸렌올레일에테르, 폴리옥시에틸렌 경화피마자유 등) 0.05∼2 중량%를 함유하도록 제조할 수 있다. 또한, 영양화장수 및 영양크림은 본 발명의 4-하이드록시아세토페논 이외에 오일류(스쿠알란, 바셀린, 옥틸도데칸올 등) 5∼20 중량% 및 왁스성분(세탄올, 스테아릴알콜, 밀납 등) 3∼15 중량%를 함유하도록 제조할 수 있으며, 에센스는 본 발명의 4-하이드록시아세토페논 이외에 글리세린, 프로필렌글리콜 등의 다가알콜류 5∼30 중량%를 함유하여 제조할 수 있다. 마사지 크림은 본 발명의 4-하이드록시아세토페논이외에 유동파라핀, 바셀린, 이소노닐이소노나노에이트 등의 오일 30∼70 중량%를 함유하여 제조되며, 팩은 본 발명의 4-하이드록시아세토페논 이외에 폴리비닐알콜 5∼20 중량%를 함유하는 필 오프(peel off) 팩 또는 일반유화형화장료에 본 발명의 4-하이드록시아세토페논 이외에 카올린, 탈크, 산화아연, 이산화티탄 등의 안료가 5∼30 중량% 함유된 워시오프(wash off) 팩으로 제조할 수 있다.

또한, 본 발명의 피부노화 방지를 위한 화장료 조성물은 유효 성분으로서 상기 4-하이드록시아세토페논 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명에 따르면 자외선으로부터 피부를 보호하고, 멜라닌으로 인한 피부 흑화 현상에 대처하기 위하여 티로시나제 활성을 억제하고, 피부 노화의 원인이 되는 각종 산화 요인에 대한 대처 및 외부 자극이나 다양한 스트레스 등의 손상 요인에 의해 저하된 피부수복기능을 원활하게 할 수 있으며 피부 흡수가 용이한 천연 유래 피부노화 방지를 위한 조성물을 제공할 수 있다.

도 1은 본 발명의 백미 추출물로부터 4-하이드록시아세토페논(4-Hydroxyacetophenone)의 분리정제 과정을 도식화하여 나타낸 것이다.
도 2는 4-하이드록시아세토페논의 ¹³C-NMR 스펙트럼(125 MHz, CD₃OD)을 나타낸 것이다.
도 3은 4-하이드록시아세토페논의 ¹H-NMR 스펙트럼(500 MHz, CD₃OD)을 나타낸 것이다.
도 4는 4-하이드록시아세토페논의 검량선을 이용한 분석결과를 나타낸 것이다.
도 5는 4-하이드록시아세토페논의 검량선을 이용한 분석결과 정보를 나타낸 것이다.
도 6은 4-하이드록시아세토페논의 HPLS 크로마토그램 결과이다.
도 7은 백미 추출물과 4-하이드록시아세토페논의 미백효과를 비교하여 나타낸 것이다.
도 8은 4-하이드록시아세토페논이 tyrosinase 효소활성에 미치는 효과를 나타낸 것이다.
도 9는 4-하이드록시아세토페논이 tyrosinase 단백 발현에 미치는 효과를 나타낸 것이다.
도 10은 4-하이드록시아세토페논이 tyrosinase 유전자 발현에 미치는 효과를 나타낸 것이다.
도 11은 4-하이드록시아세토페논이 MITF 단백 발현에 미치는 효과를 나타낸 것이다.
도 12는 4-하이드록시아세토페논이 MITF 유전자 발현에 미치는 효과를 나타낸 것이다.
도 13은 4-하이드록시아세토페논이 CREB 인산화에 미치는 효과를 나타낸 것이다.
도 14는 4-하이드록시아세토페논이 Protein kinase A 효소활성에 미치는 효과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

실시예 1: 백미( Cynanchum atratum ) 추출물로부터 4-하이드록시아세토페논(4-Hydroxyacetophenone)의 분리정제 및 화학구조 규명

백미 (CA) 추출물의 용매분획; 박주가리과 (Asclepiadaceae)에 속하는 식물인 백미(Cynanchum atratum) 3 kg을 경동시장으로부터 구입한 후, 세절하여 실온에서 3일간씩 3회에 걸쳐 MeOH 15 L로 추출하였다. MeOH 추출액 (75 g)을 n-hexane, methylene chloride (MC), ethylacetate (EtOAc) 및 H₂O로 용매 분획하였다.

활성분획 (MC)에 대한 컬럼 분획; 활성분석 연구팀과의 연계를 통하여 미백활성을 검색한 결과 MC층으로 이행하였다. 따라서, MC분획 (25 g)을 MC-MeOH 용매로 silica gel column chromatography하여 10개의 분획 (CAC-1부터 CAC-10까지)으로 분리하였다.

백미 CAC-3에 대한 column 분획; CAC-3 분획을 MC-MeOH 용매로 MPLC로 silica gel column chromatography를 실시하였고, 총 6개의 소분획 (CAC-3-1부터 CAC-3-6까지)으로 분리하여, 4-hydroxyacetophenone (CAC-3-3) 80 mg를 분리정제 하였다.

4-Hydroxyacetophenone 의 NMR 스펙트럼에서는 ¹H-NMR에서 1개의 methyl group을 관찰할 수 있었고, δ 7.88 및 6.83에서 각각 2개의 1, 4 치환 벤젠에 기인하는 proton과, δ 2.51에서 1개의 methyl에 기인하는 3개의 proton을 관찰할 수 있었다. 또한, ¹³C-NMR 스펙트럼에서는 총 8개의 carbon signal을 확인할 수 있었고, δ 198.07에서 1개의 ketone을, δ 162.70, 130.72, 130.72, 128.70, 114.85, 114.85에서 1개의 벤젠에 기인하는 6개의 carbon을 관찰할 수 있었으며, δ 24.85에서 1개의 methyl기에 기인하는 carbon이 확인되었다. 4-Hydroxyacetophenone 의 화학식은 하기 화학식 1과 같다. 또한, 이의 ¹H 및 ¹³C-NMR 데이터를 하기 표 1 및 도 2 및 3에 나타내었다.

화학식 1

[표 1]

지표성분의 정량분석

백미로부터 분리된 4-hydroxyacetophenone에 대하여 함량분석을 HPLC를 활용하여 진행하였다. 정량분석에 사용된 HPLC는 2996 PDA detector가 포함된 2696 Waters HPLC system을 사용하였으며, 다음과 같이 검량선을 이용한 분석법을 통하여, 그 함량을 분석하였다.

표준품의 조제 - 표준품 4-hydroxyacetophenone에 대하여 500 μg을 정확하게 취하여 HPLC 용 MeOH 500 μl에 녹여, 이것을 stock solution으로 500, 250, 100, 20, 10 ug/ml을 단계적으로 희석하여 검량용 표준용액으로 하였다. 표준용액 10 μl를 HPLC로 분석하여 chromatogram의 면적을 구하고 이들의 면적과 표준용액의 농도를 변수로 한 검량선을 작성하였다 (도 4). 이에 따른 표준품 (4-hydroxyacetophenone)의 r²값은 0.9999으로 나타났으며, 각각의 수치를 구하였다 (도 5).

검액의 조제 및 함량 분석 - 백미 추출물을 진공 오븐에서 완전히 건조시킨 후, 10 mg으로 정확히 취하고, HPLC 용 MeOH 1 ml을 가하여 완전히 용해시킨 후 이를 0.45 μm membrane filter로 여과한 여액을 검액으로 사용하였다. 검액 10 ul를 HPLC로 분석하여 얻은 chromatogram의 면적을 구하여 회귀직선 방정식으로부터 4-hydroxyacetophenone의 함량을 구하였고, 시료에 대해 3회 반복 (도 6) 하여 함량(%)을 산출하였다 (표 3).

분석조건

A) 검출기 : 자외부 흡광광도계 (측정파장 T : 254 nm)

B) 칼 럼 : YMC J’sphere ODS-H80 (150 X 4.6 mm)

C) 이동상 : ACN (Acetonitrile) : H₂O

Time (min)	H₂O	ACN
0	80 %	20 %
40	0 %	100 %

D) 유 속 : 1 ml/min

E) injection volume : 10 μl

시험예 1: 백미 추출물과 4-Hydroxyacetophenone의 미백효과 측정

마우스 melanoma B16 세포를 96-well culture plate에 2.5 × 10³cells/well로 분주하여, 5% CO₂가 공급되는 37℃ 배양기에서 24시간 배양하였다. 24시간 뒤, 각 well의 배지를 제거하고 새로운 10% fetal bovine serum (FBS)를 함유한 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)으로 갈아준 뒤, 계열 희석된 4-hydroxyacetophenone와 alpha-melanocyte stimulating hormone (alpha-MSH)를 각각 처리하였다. 72시간 후, 배지로 방출된 melanin의 양을 microplate reader를 이용하여 405 nm에서의 흡광도를 측정하였다. synthetic melanin을 standard로써 사용하기 위하여, 계열 희석한 다음 96-well culture plate에 분주하고 405 nm에서 흡광도를 측정하여 표준곡선을 작성하였다. 실험결과는 3회 이상 반복하였으며, 멜라닌 생성에 대한 영향은 alpha-MSH 단독 처리한 control 그룹을 100%로 두고, control과 대비하여 계산된 percentage로 나타내었다.

alpha-MSH 자극 없이 B16 세포에 배지만 가한 그룹에서 생성된 melanin 농도는 9 ㎍/㎖ 이었으며, alpha-MSH만 단독으로 처리하였을 때는 melanin 생성이 50 ㎍/㎖의 농도로 10배 가량 증가하였다. 시료의 멜라닌 생성에 대한 영향은 alpha-MSH 단독 처리한 그룹을 대조군으로 하여 control %로 나타내었다. alpha-MSH와 시료 백미 추출물 (농도 0.3 ㎍/㎖)를 처리하였을 때 대조군 대비 93%의 melanin을 생성하였고, 시료농도 1 ㎍/㎖에서는 83%, 3 ㎍/㎖에서 1%, 10 ㎍/㎖에서 0.3%로 멜라닌 생성을 농도 의존적으로 억제 하였고, IC₅₀값은 1.8 ㎍/㎖ 이었다(도 7-A). alpha-MSH와 시료 4-hydroxyacetophenone (농도 50 ㎍/㎖)를 처리하였을 때 대조군 대비 89%의 melanin을 생성하였고, 시료농도 100 ㎍/㎖에서는 78%, 200 ㎍/㎖에서 44%, 300 ㎍/㎖에서 18%로 멜라닌 생성을 농도 의존적으로 억제 하였고, IC₅₀값은 183 ㎍/㎖ 이었다(도 7-B). 미백물질인 arbutin의 melanin 생성에 미치는 효과도 병행하여 측정하였다. alpha-MSH와 arbutin (농도 10 ㎍/㎖)을 처리하였을 때 대조군 대비 89%의 melanin을 생성하였고, arbutin 농도 30 ㎍/㎖에서 72%, 100 ㎍/㎖에서 47%, 300 ㎍/㎖에서 17%로 농도 의존적으로 melanin 생성을 억제 하였고, IC₅₀값은 92 ㎍/㎖이었다(도 7-C).

시험예 2: 세포 생존율에 미치는 효과측정

마우스 melanoma B16 세포를 96-well culture plate에 2.5 × 10³cells/well로 분주하여, 5% CO₂가 공급되는 37℃ 배양기에서 24시간 배양하였다. 24시간 뒤, 각 well의 배지를 제거하고 새로운 10% fetal bovine serum (FBS)를 함유한 DMEM 배지로 갈아준 뒤, 계열 희석된 4-hydroxyacetophenone와 alpha-MSH를 각각 처리하였다. 72시간 후, 새로운 10% FBS가 포함된 DMEM으로 갈아준 뒤, 2시간 동안 안정화 시켰다. 2시간 후, 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)를 well 당 100 μg/ml의 농도로 처리하여 5% CO₂가 공급되는 37℃ 배양기에서 2시간 동안 반응시켰다. MTT 용액을 제거한 후, dimethyl sulfoxide (DMSO)을 well 당 200 ㎕ 첨가하여 세포를 용해시켰다. microplate reader를 이용하여 590 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

백미 추출물은 시료농도 0.3-3 ㎍/㎖에서는 세포독성을 나타내지 않았으나 시료농도 10 ㎍/㎖에서는 30%의 세포 독성을 나타내었다(도 7-A). 4-hydroxyacetophenone는 시료농도 50 ㎍/㎖-100 ㎍/㎖에서는 세포독성을 나타내지 않았으나 시료농도 200 ㎍/㎖에서는 39% 그리고 농도 300 ㎍/㎖에서는 58%의 세포 독성을 나타내었다(eg 7-B). 미백물질 arbutin은 농도 (10 ㎍/㎖-300 ㎍/㎖)에서 세포 독성을 나타내지 않았다(도 7-C).

시험예 3: Tyrosinase 효소활성에 미치는 효과측정

효소원으로 mushroom tyrosinase, 기질로 L-tyrosine을 사용하였다. 효소반응 버퍼로 sodium phosphate buffer를 사용하였고, mushroom tyrosinase500 L-tyrosine, 계열 희석된 백미 추출물, 4-hydroxyacetophenone를 각각 첨가하였다. 37°C로 셋팅 된 분광 광도계를 이용하여 475 nm에서 2분 간격으로 흡광도를 측정하였다. 효소의 활성도는 분당 1 nM의 L-Tyrosine을 dopachrome으로 변환시킨 효소의 양을 1 unit으로 정의하였다.

Tyrosinase는 멜라닌 생합성의 초기 단계인 L-tyrosine, L-DOPA의 산화반응을 촉매 한다.

백미 추출물, 4-hydroxyacetophenone의 미백효과가 tyrosinase의 효소활성을 직접적으로 억제하여 나타나는 것인지 알아보기 위하여, mushroom tyrosinase를 이용하여 실험을 진행하였다. 효소의 활성도는 분당 1 nM의 L-Tyrosine을 dopachrome으로 변환시킨 효소의 양을 1 unit으로 정의하였다. 백미 추출물 시료농도 1-10 ㎍/㎖까지 처리해 본 결과, tyrosinase의 효소활성을 억제하지 않았다. 또한 4-hydroxyacetophenone 시료농도 100-400 ㎍/㎖까지 처리해 본 결과, tyrosinase의 효소활성을 억제하지 않았다. mushroom tyrosinase와 기질인 L-Tyrosine을 처리한 그룹을 대조군으로 하여 inhibition %를 계산한 결과, 양성대조군으로 사용한 arbutin 시료농도 10 ㎍/㎖에서 6%, 30 ㎍/㎖에서 20%, 100 ㎍/㎖에서 49%, 10 ㎍/㎖에서 75%의 억제효과를 나타내었고, IC₅₀값은 109 ㎍/㎖이었다(도 8).

시험예 4: Tyrosinase 단백 발현에 미치는 효과

마우스 melanoma B16 세포를 6-well culture plate에 3.5 × 10⁵cells/well로 분주하여, 5% CO₂가 공급되는 37℃ 배양기에서 24시간 배양하였다. 24시간 뒤, 각 well의 배지를 제거하고 새로운 DMEM으로 갈아준 뒤, 계열 희석된 백미 추출물, 4-hydroxyacetophenone를 처리하고 2시간 뒤 alpha-MSH를 처리하였다. tyrosinase 단백 발현은 48시간, MITF 단백 발현은 4시간, CREB 인산화를 위해서는 15분간 alpha-MSH를 처리하였다. 차가운 PBS를 이용하여 세포를 모인 후, RIPA 버퍼를 이용하여 세포를 용해 시켰다. 단계적으로 단백 정량과 SDS-PAGE를 수행하고, 전기영동 후 gel을 polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane에 transfer시킨 후 5% nonfat dry milk가 들어있는 TBS/T (Tris-buffered saline with tween-20) buffer 상에서 1시간 동안 흔들어 blocking하였다. anti-tyrosinase, anti-MITF, anti-GAPDH, anti-phospho-CREB, anti-CREB 1차 antibody를 넣고 4℃에서 membrane을 밤새 반응시킨 다음 TBS/T buffer로 3회 세척한다. HRP (Horseradish peroxidase)-conjugated secondary antibody가 dilution된 buffer를 넣은 뒤, 실온에서 2시간 반응시킨다. TBS/T buffer로 3회 세척한 뒤, PVDF membrane을 ECL (enhanced chemiluminescence) 용액으로 반응시키고, Chemi Doc^TM XRS⁺machine (chemiluminescence imaging system)를 이용하여 chemiluminescence를 발광하는 각각의 band를 동정한다.

멜라닌 생합성을 매개하는 tyrosinase의 단백 발현에 미치는 효과를 알아보기 위하여 western blot analysis를 실시하였다. B16 세포에 alpha-MSH와 계열 희석한 백미 추출물, 4-hydroxyacetophenone를 48시간 동안 처리하였다. alpha-MSH 자극 없이 B16 세포에 배지만 가한 그룹에 비해 alpha-MSH를 처리하였을 때, tyrosinase 단백 발현이 증가하였다. alpha-MSH를 처리한 군을 대조군으로 하여 백미 추출물, 4-hydroxyacetophenone 처리 시 변화한 tyrosinase 단백발현 양상을 관찰하였다. 백미 추출물을 1-10 ㎍/㎖ 농도로 처리한 그룹에서 대조군에 비해 tyrosinase 단백 발현이 농도 의존적으로 억제함을 볼 수 있었다. 4-hydroxyacetophenone 100-200 ㎍/㎖ 농도로 처리한 그룹에서 대조군에 비해 tyrosinase 단백 발현이 농도 의존적으로 억제함을 볼 수 있었다(도 9).

시험예 5: Tyrosinase 유전자 발현에 미치는 효과

tyrosinase의 유전자 발현에 미치는 효과를 알아보기 위하여 RT-PCR을 실시하였다.

마우스 melanoma B16 세포를 6-well culture plate에 3.5 × 10⁵cells/well로 분주하여, 5% CO₂가 공급되는 37℃ 배양기에서 24시간 배양하였다. 24시간 뒤, 각 well의 배지를 제거하고 새로운 DMEM으로 갈아준 뒤, 계열 희석된 백미 추출물, 4-hydroxyacetophenone를 처리하고 2시간 뒤 alpha-MSH를 처리하였다. tyrosinase 발현은 18시간, MITF 발현을 위해서는 2시간동안 alpha-MSH를 처리하였다. 차가운 PBS를 이용하여 세포를 모인 후, TRIZOL 시약을 이용하여 RNA를 분리 하였다. RNA 1 ug을 이용하여 42 ℃에서 60 분간 cDNA를 합성하고, 만들어진 cDNA를 주형으로 polymerase chain reaction (PCR)을 수행하였다. PCR의 반응 조건은 94℃ 30초, 54℃ 30초, 72℃ 60초이며, tyrosianse는 27 cycles, MITF는 31 cycles, housekeeping gene인 beta-actin은 27 cycles로 PCR을 수행하였다. 만들어진 PCR 생성물은 1 % agarose gel에 8 씩 loading 후 100 V로 전기 영동하였다. 실험에 사용된 각각의 프라이머 서열은 는 다음과 같다.

- Tyrosinase primer seq. (size : 1,191 bp)

센스 프라이머 : 5’-CATTTTTGATTTGAGTGTCT-3’(서열번호 1)

안티센스 프라이머 : 5’-TGTGGTAGTCGTCTTTGTCC-3’(서열번호 2)

- MITF primer seq. (size : 397 bp)

센스 프라이머 : 5’-TACAGTCACTACCAGGTGCAG-3’(서열번호 3)

안티센스 프라이머 : 5’-CCATCAAGCCCAAAATTTCTT-3’(서열번호 4)

- beta-actin primer seq. (size : 349 bp)

센스 프라이머 : 5’-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3’(서열번호 5)

안티센스 프라이머 : 5’-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3’(서열번호 6)

B16 세포에 alpha-MSH와 계열 희석한 백미 추출물, 4-hydroxyacetophenone를 18시간 동안 처리한 후 유전자 발현양의 변화를 측정하였다. alpha-MSH 자극 없이 B16 세포에 배지만 가한 그룹에 비해 alpha-MSH를 처리하였을 때, tyrosinase 유전자 발현이 증가하였다. alpha-MSH를 처리한 군을 대조군으로 하여 백미 추출물, 4-hydroxyacetophenone 처리 시 변화한 tyrosinase 발현 양상을 관찰하였다. 백미 추출물을 1-10 ㎍/㎖ 농도로 처리한 그룹에서 대조군에 비해 tyrosinase 유전자 발현이 농도 의존적으로 억제함을 볼 수 있었다. 4-hydroxyacetophenone 200 ㎍/㎖ 농도로 처리한 그룹에서 대조군에 비해 tyrosinase 단백 발현이 억제함을 볼 수 있었다. PKA 억제제인 H-89 시료를 양성대조군으로 사용하였고, H-89 10 ㎍/㎖ 농도로 처리한 그룹에서 대조군에 비해 tyrosinase 단백 발현이 억제함을 볼 수 있었다(도 10).

시험예 6: MITF 단백 발현에 미치는 효과

tyrosianse의 발현을 조절하는 전사인자인 MITF의 단백 발현에 미치는 효과를 알아보기 위하여 western blot analysis를 실시하였다. B16 세포에 계열 희석한 백미 추출물을 처리하고 2시간 뒤 alpha-MSH를 4시간 동안 처리하였다. alpha-MSH 자극 없이 B16 세포에 배지만 가한 그룹에 비해 alpha-MSH를 처리하였을 때, MITF 단백 발현이 증가하였다. alpha-MSH를 처리한 군을 대조군으로 하여 백미 추출물 처리 시 변화한 MITF 단백 발현 양상을 관찰하였다. 백미 추출물을 1-10 ㎍/㎖ 농도로 처리한 그룹에서 대조군에 비해 MITF 단백 발현이 농도 의존적으로 억제함을 볼 수 있었다. PKA 억제제인 H-89 시료를 양성대조군으로 사용하였고, H-89 10 ㎍/㎖ 농도로 처리한 그룹에서 대조군에 비해 MITF 단백 발현이 억제함을 볼 수 있었다(도 11).

시험예 7: MITF 유전자 발현에 미치는 효과

MITF의 유전자 발현에 미치는 효과를 알아보기 위하여 RT-PCR을 실시하였다. B16 세포에 alpha-MSH와 계열 희석한 백미 추출물, 4-hydroxyacetophenone를 2시간 동안 처리한 후 유전자 발현양의 변화를 측정하였다. alpha-MSH 자극 없이 B16 세포에 배지만 가한 그룹에 비해 alpha-MSH를 처리하였을 때, MITF 유전자 발현이 증가하였다. alpha-MSH를 처리한 군을 대조군으로 하여 백미 추출물, 4-hydroxyacetophenone 처리 시 변화한 MITF 발현 양상을 관찰하였다. 백미 추출물을 1-10 ㎍/㎖ 농도로 처리한 그룹에서 대조군에 비해 MITF 유전자 발현이 농도 의존적으로 억제함을 볼 수 있었다. 4-hydroxyacetophenone 200 ㎍/㎖ 농도로 처리한 그룹에서 대조군에 비해 MITF 단백 발현이 억제함을 볼 수 있었다. PKA 억제제인 H-89 시료를 양성대조군으로 사용하였고, H-89 10 ㎍/㎖ 농도로 처리한 그룹에서 대조군에 비해 MITF 단백 발현이 억제함을 볼 수 있었다(도 12).

시험예 8: CREB 인산화에 미치는 효과

CREB는 PKA에 의해 인산화 되어 MITF의 promoter의 CRE 부분에 결합하여 MITF의 발현을 조절하는 전사인자이다. CREB의 인산화에 미치는 효과를 알아보기 위하여 western blot analysis를 실시하였다. B16 세포에 계열 희석한 백미 추출물, 4-hydroxyacetophenone을 처리하고 2시간 뒤 alpha-MSH를 15분 동안 처리하였다. alpha-MSH 자극 없이 B16 세포에 배지만 가한 그룹에 비해 alpha-MSH를 처리하였을 때, CREB의 인산화가 유도되었다. alpha-MSH를 처리한 군을 대조군으로 하여 백미 추출물, 4-hydroxyacetophenone 처리 시 변화한 CREB 인산화 정도를 관찰하였다. 백미 추출물을 3-10 ㎍/㎖ 농도로 처리한 그룹에서 대조군에 비해 CREB 인산화가 농도 의존적으로 억제함을 볼 수 있었다. 4-hydroxyacetophenone 200 ㎍/㎖ 농도로 처리한 그룹에서 대조군에 비해 CREB 인산화가 농도 의존적으로 억제함을 볼 수 있었다. PKA 억제제인 H-89 시료를 양성대조군으로 사용하였고, H-89 10 ㎍/㎖ 농도로 처리한 그룹에서 대조군에 비해 CREB 인산화가 억제함을 볼 수 있었다(도 13).

시험에 9: Protein kinase A (PKA) 효소활성에 미치는 효과

효소원으로 recombinant human PKA, 기질로 kemptide를 사용하였다. PKA 효소, 계열 희석된 백미 추출물과 4-hydroxyacetophenone, kemptide, [γ-³²P]ATP를 첨가하여 30℃에서 15분 동안 반응시켰다. 반응액을 P81 phosphocellulose paper에 떨어뜨리고 air-dry 시킨다. 0.75% phosphoric acid 40㎖를 첨가하여 3회 세척한 뒤, acetone으로 1회 세척한다. scintillation cockail을 첨가하고 scintillation counter를 이용하여 radioactivity를 측정하였다.

PKA의 효소 활성에 직접적으로 영향을 미치는지 알아보기 위하여 cell-free system에서 kinase assay를 실시하였다. 효소원으로 recombinant human PKA, 기질로 kemptide를 사용하였다. PKA 효소, 기질, [γ-³²P]ATP를 첨가하여 30℃에서 15분 동안 반응을 시키고 기질의 인산화 정도는 scintillation counter를 이용하여 radioactivity를 측정하였다. PKA 효소와 기질인 kemptide를 처리한 그룹을 대조군으로 하여 inhibition %를 계산 하였다. 백미 추출물 시료 1 ㎍/㎖에서 21%, 3 ㎍/㎖에서 51%, 10 ㎍/㎖에서 71%의 억제효과를 나타내었고, IC₅₀값은 3 ㎍/㎖이었다. 4-hydroxyacetophenone 시료 50 ㎍/㎖에서 30%, 100 ㎍/㎖에서 47%, 200 ㎍/㎖에서 69%, 400 ㎍/㎖에서 92%의 억제효과를 나타내었고, IC₅₀값은 113 ㎍/㎖이었다. PKA의 catalytic subunit에 작용하는 ATP-경쟁적 저해제인 H-89 시료를 양성대조군으로 사용하였고, H-89 10 ㎍/㎖에서 93%의 억제효과를 나타내었다(도 14).

제제예

기능성 소재와 화장품 제형과의 상용성 및 기능성, 사용성, 안정성, 안전성 등을 고려해 기능성이 가장 잘 발현되며, 소비자의 선호도가 높을 수 있는 기초제형인 스킨, 로션, 크림, 에센스 제형으로 선정하였고 다양한 실험을 진행하였다.

제제예 1: 스킨 제조

하기 표 4에 나타낸 바와 같은 조성으로 스킨을 제조한다. 구체적으로, 보존제 및 보습제를 수상 용해부에 넣고 45~50℃ 온도로 가열 용해하여 미리 용해시켜둔 후 가용화상을 수상 용해부에 투입하여 Agi Mixer 를 이용하여 천천히 가용화 한 후 나머지 첨가물을 넣고 혼합 교반 냉각한다.

제제예 2: 로션 제조

하기 표 5에 나타낸 바와 같은 조성으로 스킨을 제조한다. 구체적으로, 유화제, 오일, 항산화제, 보존제를 유상 용해부에서 80~82℃로 가열 용해하여, 일부 첨가물과 용제를 78~80℃로 가열 용해되어진 제조부에 투입하여 HOMO MIXER를 이용하여 유화 후 40℃까지 냉각, 나머지 첨가제를 넣고 혼합 교반, 냉각한다.

제제예 3: 크림 제조

하기 표 6에 나타낸 바와 같은 조성으로 스킨을 제조한다. 구체적으로, 유화제, 오일, 항산화제, 보존제를 유상 용해부에서 80~82℃로 가열 용해하여, 일부 첨가물과 용제를 78~80℃로 가열 용해되어진 제조부에 투입하여 HOMO MIXER를 이용하여 유화 후 40℃까지 냉각, 나머지 첨가제를 넣고 혼합 교반, 냉각한다.

제제예 4: 에센스 제조

하기 표 7에 나타낸 바와 같은 조성으로 스킨을 제조한다. 구체적으로, 유화제, 오일, 항산화제, 보존제를 유상 용해부에서 80~82℃로 가열 용해하여, 일부 첨가물과 용제를 78~80℃로 가열 용해되어진 제조부에 투입하여 HOMO MIXER를 이용하여 유화 후 40℃까지 냉각, 나머지 첨가제를 넣고 혼합 교반, 냉각한다.

시험예 10: 화장품에 대한 안정성 평가

경시 안정성 실험

기능성소재를 스킨, 로션 제형에 유효량 넣고 접목 실험 후 온도별(4℃, 25℃, 44℃)로 일정기간 동안 안정도를 측정하였으며, 안정도를 확인한 결과 스킨에서 고온으로 갈수록 변색현상이 약간 나타남을 확인할 수 있었다. 제형 내 안정화제를 첨가하는 실험을 추가적으로 진행하였으며, 각 온도별(4℃, 25℃, 44℃)로 성상 변화를 관찰한 결과 일정기간 동안 안정한 제형을 확보할 수 있었다. 하기 표 8 및 9에는 각각 스킨 및 로션 화장료의 조건별 성상을 관찰한 결과를 나타낸 것이다.

1) 성상 : 양호-G, 약간 변색-SC, 변색-C

1) 성상 : 양호-G, 약간 변색-SC, 변색-C

2) 점도 : 4 Spindle 12rpm at 25℃

시험예 11: 화장품에 대한 안정성 평가

피험자 30명을 대상으로 IQ Chamber를 이용하여 상박에 피부 첩포시험 (Patch Test)을 실시하였다. 단 건선(Psoriasis), 습진(Eczema), 기타 피부병변 보유자나 임신, 수유부 또는 피임제, 항히스타민제 등을 복용하고 있는 사람은 본 실험에서 제외 하였다. 시험부위를 70% 에탄올로 닦아낸 뒤 건조시킨 다음 준비된 피험자 30명의 상박에 (주)코스메카코리아 Skin, Lotion, Cream , Essence 제형을 각각 25㎕씩 IQ Chamber에 적하 시킨 후 시험 부위인 상박 부위에 얹어 고정시켰다. 첩포는 24시간 동안 도포하여 첩포를 제거한 후에는 Marking Pen으로 시험부위를 표시하여 각각 30분 경과 후, 24시간 경과 후, 48시간 경과 후에 시험부위를 관찰하였다.

판정은 첩포 제거 30분 경과 후, 24시간 경과 후, 48시간 경과 후에 행하며 피부반응은 하기 표 10의 국제접촉피부염연구회 (International Contact Dermatitis Research Group: ICDRG)의 판정기준에 따라 자극정도를 분류하였다. 하기 표 11의 평균피부반응도 계산공식에 따라 Mean score를 산정한 후 피부첩포시험 (Patch Test) 결과 판정표에 따라 자극유무를 판정하였다.

※ 피부반응 판정기준

1) Negative (-) : 무자극

2) Doubtful or slight reaction and erythema (±) : 미자극 희미한 또는 가까스로 감지할 수 있는 가벼운 홍반

3) Erythema + Induration (＋) : 경자극 경계가 뚜렷하나 약한 홍반, 부종 및 구진 4) Erythema + Induration + Vesicle (＋＋) : 중자극 뚜렷한 홍반, 구진 및 소수포 5) Erythema + Induration + Bullae (＋＋＋) : 강자극 심한 홍반 및 대수포, 가피형성

하기 수학식 1에는 평균 피부반응도 (Mean score) 계산공식을 나타내었다.

i = 패치 제거 후 30분 경과 후 피험자 번호

j = 패치 제거 후 24시간 경과 후 피험자 번호

k = 패치 제거 후 48시간 경과 후 피험자 번호

Score i, j, k = 첩포제거 후 30분 경과 후, 24시간 경과 후, 48시간 경과 후 각각의 평가결과를 ICDRG 판정기준에 따라 score로 표기된 점수, erythema 와 edema 두 가지 반응에 대하여 모두 적용

본 인체시험에 참가한 피험자의 정보는 하기 표 12에 정리하였다.

본 인체 시험에 참가한 피험자의 연령을 세분하면 하기 표 13과 같다. 참가자들의 평균연령은 40.4세이었다. 성별분류는 여성이 26명, 남성이 4명이었다.

피험자 30명의 상박에 Skin, Lotion, Cream , Essence 제형을 각각 25㎕씩 IQ Chamber에 적하 시킨 후 피부 첩포시험 (Patch Test)을 실시하였다. 24시간 동안 첩포하여 첩포를 제거한 후 30분 경과 후, 24시간 경과 후, 48시간 경과 후에 시험부위에서 나타난 피부반응을 국제접촉피부염연구회 (International Contact Dermatitis Research Group: ICDRG)의 판정기준에 따라 자극정도를 분류하고 피부첩포시험 (Patch Test) 결과 판정표에 따라 판정하여 하기 표 14 내지 17에 정리하였다.

Claims

백미 추출물로부터 추출된 하기 화학식 1의 화합물인 4-하이드록시아세토페논(4-Hydroxyacetophenone)을 함유하는 것을 특징으로 하는 피부노화 방지를 위한 화장료 조성물.
화학식 1
제 1 항에 있어서,
상기 4-하이드록시아세토페논이 백미 (CA) 추출물의 용매분획; 박주가리과 (Asclepiadaceae)에 속하는 식물인 백미(Cynanchum atratum)를 세절하여 실온에서 3일간씩 3회에 걸쳐 MeOH로 추출한 다음, n-hexane, methylene chloride (MC), ethylacetate (EtOAc) 및 H₂O로 용매 분획하여 수득된 것임을 특징으로 하는 피부노화 방지를 위한 화장료 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 4-하이드록시아세토페논이 하기 표 18에 나타낸 바와 같은 ¹H 및 ¹³C-NMR 데이터 특성을 갖는 것을 특징으로 하는 피부노화 방지를 위한 화장료 조성물.
[표 18]
제 1 항에 있어서,
상기 4-하이드록시아세토페논이 화장료 조성물의 총 중량에 대하여 0.001-50 중량%의 양으로 포함되는 것을 특징으로 하는 피부노화 방지를 위한 화장료 조성물.