ES2342425T3

ES2342425T3 - Inhibidor tisular de metaloproteinasas (timp) unido a anclajes de glucosilfosfatidilinositol (gpi) para el tratamiento de lesiones de la piel.

Info

Publication number: ES2342425T3
Application number: ES06805780T
Authority: ES
Inventors: Ralf Huss; Peter Jon Nelson
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2005-09-20
Filing date: 2006-09-20
Publication date: 2010-07-06
Anticipated expiration: 2026-09-20
Also published as: JP2013240326A; ES2331252T3; DK1764372T3; DE602005015973D1; US9255139B2; DE602006012864D1; US20110105407A1; HK1112923A1; RU2008108940A; CA2860269A1; EP1764372A1; SG173367A1; RU2428479C2; EP1937725A1; RU2011118511A; IL189924A; CN101268102B; US20160271234A1; EP1764372B1; DK1937725T3

Abstract

El uso de una construcción de fusión, que comprende una secuencia de aminoácidos de un inhibidor tisular de metaloproteinasas (TIMP) o un fragmento biológicamente activo del mismo, que inhibe las metaloproteinasas de la matriz activas, en el que dicho TIMP o fragmento biológicamente activo del mismo está unido a un anclaje glucosilfosfatidilinositol (GPI) para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una lesión de piel de un sujeto para prevenir o inhibir la formación de una cicatriz.

Description

Inhibidor tisular de metaloproteinasas (TIMP) unido a anclajes de glucosilfosfatidilinositol (GPI) para el tratamiento de lesiones de la piel.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de construcciones de fusión y su uso en medicina regenerativa. Específicamente, la invención se refiere a construcciones que comprenden inhibidores de tejido anclados a glucosilfosfatidilinositol (GPI) de metaloproteinasas (TIMP). Adicionalmente, las construcciones de fusión de la presente invención son agentes regenerativos eficaces útiles en el campo de las aplicaciones de cicatrización de heridas.

Antecedentes de la invención TIMP en investigación de cáncer

El tratamiento del cáncer sigue siendo una tarea exigente y emplea diferentes estrategias y enfoques terapéuticos, que ofrecen grados variables de éxito. Una enfoque conocido es aumentar la sensibilidad de las células cancerosas a la lisis mediada por el sistema inmunológico. La sensibilidad de los tumores a la lisis mediada por el sistema inmunológico se ha asociado a la biología de las metaloproteinasas de la matriz (MMP) y, específicamente, a la expresión en la superficie celular de MMP por la célula tumoral diana. Las metaloproteinasas de la matriz (MMP) degradan componentes de la matriz extracelular y se han relacionado con la remodelación del tejido, invasión tumoral y metástasis (Egeblad ECM y Werb, 2002; Itoh y Nagase, 2002). La actividad MMP también se ha asociado con la eficacia de la apoptosis mediada por tanto perforina/granzima como FAS (revisado en Egeblad y Werb, 2002). Se ha demostrado que la actividad MMP está regulada a muchos niveles, que incluyen cuatro inhibidores endógenos, el inhibidor tisular de las metaloproteinasas de la matriz (TIMP-1, 2, 3 y 4 (Brode y Maskos, 2003). In vivo, el equilibrio entre MMP y TIMP determina si se produce reabsorción o depósito de la matriz (Nagase y Woessner, 1999).

Los inhibidores tisulares de metaloproteínas (TIMP) endógenos muestran diversas funciones fisiológicas/biológi-
cas, como la moderación del crecimiento tumoral, metástasis y apoptosis. Estas actividades biológicas diversas de los TIMP se han relacionado en parte con la estequiometría de las interacciones entre TIMP/MMP/proteínas de la superficie celular. El reclutamiento de linfocitos citotóxicos representa una posible ruta en la defensa frente a tumores. Aunque se han identificado linfocitos T citotóxicos (CTL) y linfocitos citolíticos naturales (células NK) que se infiltran y reconocen células tumorales, a menudo no se consigue desarrollar de forma eficaz una inmunidad antitumoral eficiente. Esta ineficacia es una de las razones que impiden la completa eliminación de las células tumorales residuales después de una recesión quirúrgica incompleta, debido a un estadio avanzado de la enfermedad o a una imposibilidad para operar a nivel local. Actualmente, la etiología de esta deficiencia funcional de los linfocitos citotóxicos sigue sin estar clara.

En general, los efectos antitumorales de los CTL y de las células NK están mediados por las rutas de apoptosis mediadas por perforina/granzima o FAS (CD95/CSD95L) (Kagi y col. 1994). La ruta de la perforina está mediada por citotoxinas secretadas durante el reconocimiento de los CTL o las células NK de las células diana (Kagi y col., 1994). El CD95, o receptor de muerte FAS, pertenece al regulador de la familia de proteínas de muerte celular y es de central importancia en la apoptosis mediada por el sistema inmunológico de células tumorales (Nagata, 1999). FAS/CD95/Apo-1 humano es un receptor glucoproteico transmembrana único (325 aminoácidos, 45-48 kDa). El ligando de FAS (ligando FAS, FASL, CD95L) es una proteína integral de membrana y es una glucoproteína transmembrana de tipo II. FASL es un miembro de la familia del TNF, que incluye TNF\alpha, cadenas \alpha y \beta de la linfotoxina (LT), ligando CD40 y ligando CD30. La acción de FAS está mediada a través de FADD (dominio de muerte asociado a FAS)/MORT1, una proteína adaptadora que tiene un dominio de muerte en su extremo C-terminal y se une al dominio de muerte citoplasmático de FAS. Se ha encontrado que muchos tumores son resistentes a la apoptosis medida a través de la ruta de FAS (Frost y col., 2003; revisado en Igney y Krammer, 2002).

Se han utilizado líneas celulares de carcinoma de células renales como ejemplo de un sistema modelo para probar las construcciones TIMP-GPI de la presente invención. El carcinoma de células renales (RCC) es la séptima causa principal de cáncer. Aproximadamente un tercio de los pacientes con RCC tienen enfermedad metastásica en su presentación y hasta el 50% recae después de la nefrectomía (Vogelzang y Stadler, 1998). El RCC es difícil de tratar y las terapias inmunológicas, como interferón alfa e interleucina 2, generalmente son más eficaces que la quimioterapia o la radiación (Vogelzang y Stadler, 1998).

Los linfocitos citotóxicos representan un posible componente de la defensa frente a tumores como el RCC.

Un miembro de la familia TIMP, TIMP-1, es un inhibidor de MMP con un amplio espectro de acción (Bode y Maskos, 2003). Es una proteína soluble que puede detectarse en la superficie celular sólo a través de su asociación con proteínas unidas a la superficie (Brew y col., 2000; Klier y col., 2001). El papel general de TIMP-1 en la biología del cáncer sigue siendo objeto de publicaciones contradictorias (Brand, 2002). Hasta la fecha, se acepta que TIMP-1 tiene una función en la angiogénesis, migración celular y proliferación (Brand, 2002). Recientemente, se demostró que una proteína TIMP-1 anclada a GPI mostraba una pronunciada supresión de la migración de células endoteliales en respuesta a bFGF (Djafarzadeh R y col., 2004).

Las estrategias y enfoques convencionales para el tratamiento del cáncer siguen sufriendo el problema de que es difícil eliminar las células tumorales una vez que el tumor se ha desarrollado. Normalmente, los tumores primarios se eliminan del paciente mediante cirugía. Sin embargo, en algunos casos, no todas las regiones son accesibles para el cirujano y, por tanto, las células tumorales permanecen en el organismo donde pueden desarrollar tumores secundarios. Esto es un resultado de la resección quirúrgica incompleta del tumor primario.

Por tanto, la presente invención proporciona un fármaco anticanceroso eficaz y una estrategia para reducir o aliviar la proliferación de las células tumorales en un individuo, en particular, en un paciente que se ha sometido a una resección quirúrgica incompleta de un tumor primario. Los fármacos anticancerosos de la presente invención son útiles para matar las células tumorales tanto en líneas celulares in vitro como en tejidos in vivo.

El papel de los TIMP en medicina regenerativa

La presente invención es además útil en el campo de la medicina regenerativa. Un área significativa en el campo de la medicina regenerativa es concerniente al proceso de cicatrización de heridas. La cicatrización de heridas se refiere a una respuesta restauradora natural a la lesión tisular e implica una cascada compleja de episodios celulares que por último genera el revestimiento, reconstitución, y restauración de la resistencia a la tensión del tejido lesionado. Este proceso en general emplea el reclutamiento y proliferación de diferentes tipos de células, una elaboración de la matriz celular, y un incremento en la vigilancia inmune.

La cicatrización de heridas procede de una manera oportuna, secuencial y se puede dividir en cuatro fases generales: inflamación, granulación, reepitelización y remodelación tisular. Cada fase del proceso de cicatrización de heridas se regula mediante rutas de transducción de señal especiales. Durante la cicatrización de heridas, se produce un incremento en la expresión de factores de crecimiento y citocina; en particular, se han descrito incrementos en los niveles de TNF, IL-1, e IL-6. Durante la fase inicial de inflamación, que implica las proteínas efectoras IL-1, TNF-\alpha y CSF, tanto los macrófagos como los neutrófilos se reclutan para formar un coágulo de fibrina. Durante la fase de granulación, los fibroblastos proliferan, migran a la herida, y secretan ECM. Las proteínas efectoras implicadas en esta última fase incluyen MMP, PDGF, FGF, EGF y VEGF. La tercera fase en la cicatrización de heridas, la reepitelización, se caracteriza por la proliferación de queratinocitos, que migran en la herida, y también por un incremento de miofibroblastos, que son responsables de la contracción de las heridas. El resultado de esta fase, que implica las proteínas efectoras MMP, KGF, TGF, GM-CSF, EGF y uPA y tPA, es la reepitelización de la superficie de la herida, la disección de la escara, y la formación de una barrera. Finalmente, durante la fase de remodelación tisular, los fibroblastos producen una matriz de colágeno que conduce a la formación de tejido de la cicatriz, apoptosis de fibroblastos, y un cambio de activación a diferenciación de los queratinocitos. Las proteínas efectoras conocidas implicadas en esta última fase de cicatrización de heridas incluyen TGF-b1, MMP y TIMP.

De este modo, las células efectoras responsables de la mayoría de los aspectos de cicatrización de heridas son los fibroblastos y los queratinocitos, y las MMP que juegan un papel importante tanto en la migración de fibroblastos (MMP-1, -2, -3 y -13) como queratinocitos (MMP-1, -2, -3, y -10) (Singer y Clark, 1999) además de la formación de la cicatriz. Cada una de las MMP tiene un sustrato diferente específicamente dentro de la ECM, y juega un papel importante en la degradación y recambio de la ECM. La familia de MMP incluye, entre otras, colagenasas (MMP-1, MMP-8, MMP-13, MMP-18), estromelisinas (MMP-3, MMP-1 O, MMP-11), gelatinasas (MMP2, MMP-9), matrilisina (MMP-7), metaloelastasa (MMP-12) y una serie de metaloproteinasas de matriz unidas a membrana (MT-MMPs). Ya que la función de las MMP es descomponer proteolíticamente la ECM circundante, un equilibrio entre esta actividad proteasa y la deposición de ECM durante cicatrización de heridas, es decir, la reconstrucción del tejido lesionado, necesita que se mantenga de manera óptima. El control de la actividad de MMP se modula mediante las proteínas TIMP, que son producidas por la mayoría de las células, y actúan para inhibir las MMP en una relación de 1:1. Cuando se altera este equilibrio delicado entre entre la descomposición proteolítica y deposición de ECM, se pueden producir trastornos tales como cicatrización de heridas anormal, por ejemplo, heridas crónicas, cicatrización excesiva o cicatrización queloide.

Por lo tanto, existe una necesidad para controlar o influenciar el equilibrio fisiológico entre la actividad proteasa y deposición de la ECM durante el proceso de la cicatrización de heridas.

En una realización adicional, las construcciones de fusión de la presente invención proporciona un agente regenerativo eficaz para el tratamiento de afecciones definidas por un equilibrio alterado entre la actividad proteasa de MMP y la deposición de ECM como, por ejemplo, en la cicatrización queloide o heridas crónicas, que están de manera común asociadas a niveles incrementados de MMP. De manera adicional, las construcciones de fusión de la presente invención proporciona un agente regenerativo eficaz que puede reducir, minimizar o inhibir la formación de cicatrices durante el proceso de cicatrización de heridas.

Sumario de la invención

La invención se refiere a usos como se define en las reivindicaciones adjuntas. Se desvela el sorprendente hallazgo que TIMP anclado a GPI reduce o alivia de forma eficaz la proliferación de las células cancerosas y estimula la muerte de estas células tanto en líneas celulares in vitro como in vivo. Los determinantes estructurales y funcionales de TIMP se han combinado con un anclaje de glucosilfosfatidilinositol (GPI), y opcionalmente, con mucina, con el fin de generar un agente de quimioterapia altamente eficaz. Esta técnica explota que las proteínas TIMP ancladas mediante glucosilfosfatidilinositol (GPI) se incorporan a las membranas superficiales cuando se purifican y se añaden a células cancerosas. La fusión de TIMP-GPI con un dominio mucina además potencia la presentación de las proteínas TIMP sobre la membrana superficial celular y hace que la construcción de fusión sea más eficaz para hacer que las células cancerosas sean sensibles a la destrucción mediada por el sistema inmunológico.

Se desvela que TIMP tiene el potencial para la inhibición del crecimiento de células tumorales y reducción del desarrollo del tumor tanto en líneas celulares in vitro como en tejidos in vivo. La unión de TIMP a un anclaje GPI y la administración exógena de TIMP anclado a GPI da lugar a una inserción eficaz de la proteína TIMP en las membranas celulares de las células cancerosas. La expresión en la superficie de TIMP-1 anclado a GPI inducía una diversidad de efectos biológicos en las líneas celulares cancerosas con posible relevancia terapéuticas, como la inducción de la ruta apoptótica mediada por FAS en las células cancerosas. Como se muestra en los ejemplos, se observó que la supresión de la proliferación de las células cancerosas dependía de la dosis.

La proteína TIMP-1 anclada a GPI también bloque la secreción de proMMP-2 y proMMP-9 y altera drásticamente la asociación con la superficie celular de diversas MMP. Más significativamente, las líneas de células tumorales que normalmente son resistentes a la apoptosis mediada por FAS se hacen sensibles a la muerte mediada por FAS/CD95. El tratamiento con GPI-TIMP da lugar a una regulación por disminución de la proteína antiapoptótica BCL2 y el aumento correspondiente de la proteína proapoptótica BAX. Este cambio hacia una concentración mayor de proteínas proapoptóticas puede ser una razón para el aumento de la sensibilidad a la apoptosis mediada por FAS de las células cancerosas cuya superficie ha sido manipula por ingeniería genética con TIMP.

Usando el enfoque anterior, se ha comprobado que las proteínas o polipéptidos TIMP anclados a GPI de la presente invención son especialmente útiles en aplicaciones terapéuticas para el tratamiento del cáncer residual después de resección quirúrgica incompleta del tumor primario, como en el cáncer de mama avanzado, osteosarcoma, carcinoma de células renales o en tumores cerebrales malignos, p. ej., glioblastoma.

Además, puesto que las células tumorales, como las del carcinoma de células renales (RCC), son intrínsecamente resistentes a la muerte mediada por FAS, la presente invención proporciona una medio eficaz para hacer a las células tumorales susceptibles a la apoptosis mediada por FAS.

Se desvela una construcción de fusión (TIMP-mucina-GPI) que comprende una secuencia de aminoácidos de un inhibidor tisular de metaloproteinasas (TIMP) o un fragmento biológicamente activo del mismo, en la que dicho TIMP o fragmento biológicamente activo del mismo está unido a una secuencia de aminoácidos de un dominio de mucina seguido de una secuencia de aminoácidos de un anclaje glucosilfosfatidilinositol (GPI).

Se desvela que el extremo 3' de TIMP se fusiona directamente con una secuencia enlazadora GPI y no contiene un dominio de mucina.

El término "mucina" se refiere a una familia de grandes proteínas altamente glucosiladas. Una clase de mucinas están unidas a membrana debido a la presencia de un dominio que se extiende sobre la membrana hidrófobo que favorece la retención en la membrana plasmática mientras otra clase de mucinas se secretan sobre las superficies mucosales. Los genes de mucina codifican monómeros de mucina que están típicamente sintetizados como núcleos de mucina en forma de bastón que se modifican después de la traducción mediante glucosilación excepcionalmente abundante. Se encuentran en las mucinas maduras dos regiones distintivamente diferentes. Una región incluye las regiones amino- y carboxi-terminal, que están ligeramente glucosiladas, pero rica en restos de cisteína que está probablemente implicada en el establecimiento de enlaces disulfuro dentro y entre los monómeros de mucina. La segunda región central está formada de múltiples repeticiones en tándem de 10 a 80 secuencias de restos, en las que la mitad de los restos de aminoácidos son serina o treonina.

Las mucinas están en general secretadas en forma de agregados masivos de proteínas que tienen masas moleculares de aproximadamente 1 a 10 millones de Daltons. Dentro de estos agregados, los monómeros están unidos a otro la mayoría de las veces mediante interacciones no covalentes, aunque los enlaces disulfuro intermoleculares también pueden jugar un papel en este proceso. Se han distinguido al menos 19 genes de mucina humana incluyendo MUC1, 2, 3A, 3B, 4, 5AC, 5B, 6-9,11-13, y 15-19.

Preferiblemente, la mucina es un domino de mucina unido a membrana y comprende preferiblemente una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo compuesto por MUC1, MUC3A, MUC3B, MUC4, MUC11, MUC12, MUC16 y MUC17, o una variante o parte de la misma (las mucinas anteriores se revisan en Moniaux N y col., 2004). Se describe que se usarse un tallo de mucina que se aísla de la quimiocina CXCL16 asociada a la superficie o fractalcina (CX3CL1).

La fractalcina es un miembro de la gran superfamilia y compleja de genes de quemocina, que consta principalmente de moléculas proinflamatorias secretadas. La estructura central típica de las quemocinas se mantiene parcialmente mediante enlaces disulfuro entre restos de cisteína posicionalmente conservados. Para la mayoría de los péptidos de quemocina, una estructura familiar característica es la distribución de cuatro cisternas dentro de la molécula, es decir, un motivo de firma de cisteína: CXC, CC y C, donde C es una cisteína y X es un resto de aminoácido. Se han identificado cuatro familias de quemocina diferentes basándose en la observación de que los péptidos de quemocina se pueden distinguir por la organización de los restos de cisteína localizados cerca del extremo N de la molécula. La propia fractalcina define una de las familias de quemocina, y se distingue estructuralmente de otras familias de quemocina ya que las cisternas N-terminal de a fractalcina están separadas por tres restos (es decir un motivo CX3C) así como por estar además a la membrana celular mediante un anclaje transmembrana del extremo C extendido que incluye un dominio de tipo mucina, o un tallo de tipo mucina. De este modo, los dominios de mucina y fractalcina contenidos dentro de las construcciones de fusión de la presente invención son adecuados para lograr un anclaje mejorado de la proteína TIMP en la membrana celular.

El TIMP se deriva, preferiblemente de un mamífero; más preferiblemente de un ser humano (los cuatro TIMP se revisan en Mannello F y col., 2001). Ejemplos de proteínas TIMP que pueden usarse según la presente invención comprenden TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3 o TIMP-4 y sus correspondientes variantes en otros organismos, como ratón, conejo, perro, gato, oveja y vaca.

El anclaje GPI según se usa en la presente invención, deriva preferiblemente del antígeno asociado a la función del linfocito (LFA-3), o una porción del mismo, e incluye una secuencia señal de GPI que media en la asociación a la membrana.

Se desvela una molécula de ácido nucleico, como ARN o ADN, que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la construcción TIMP-anclaje GPI de la invención.

En un aspecto adicional la molécula de ácido nucleico está contenida en un plásmido de expresión, un vector o una célula huésped para la expresión de la molécula de ácido nucleico de la invención.

Se desvela el uso de las construcciones de fusión TIMP-GPI o TIMP-mucina-GPI de la invención para el tratamiento del cáncer, especialmente el cáncer residual tras la extirpación quirúrgica de un tumor primario.

En un aspecto adicional las construcciones de fusión TIMP-GPI o TIMP-mucina-GPI están contenidas en una composición farmacéutica o medicamento. Se desvela que las construcciones de fusión TIMP-GPI o TIMP-mucina-GPI de la invención se usan de manera adecuada como agentes o fármacos anticancerosos. Se desvela que los fármacos anticancerosos de la invención se administrarán y aplicarán a nivel local en el lugar de la resección de la masa tumoral, en pacientes con tumores de alto riesgo con un alto riesgo de células cancerosas residuales y mayor incidencia de recaída local y en aquellos pacientes con un tumor residual obvio debido a una enfermedad en estadio avanzado o imposible de operar a nivel local. Preferiblemente, la construcción de fusión se administra mediante pulverización dentro de la herida y/o mediante inyección en las regiones no disponibles para la cirugía.

Se desvela un procedimiento in vitro para la inhibición de la proliferación de células cancerosas que comprende las etapas de someter una línea de células cancerosas a una cantidad eficaz de construcciones de fusión TIMP-mucina-GPI o TIMP-GPI.

Se desvela agentes y procedimientos novedosos para el tratamiento de afecciones definidas por un equilibrio alterado entre la actividad proteasa de MMP fisiológica normal y deposición de ECM, que da como resultado cicatrización de heridas anormal. Se describen agentes y procedimientos adecuados para el tratamiento de cicatrización queloide o hipertrófica y heridas crónicas asociadas comúnmente a aumento en los niveles de MMP. Además, la presente invención también proporciona agentes eficaces y procedimientos para reducir, minimizar o inhibir la formación de cicatrices durante el proceso de cicatrización de heridas.

Definiciones

El término "TIMP", según se utiliza en el presente documento, significa un inhibidor tisular endógeno de metaloproteinasas, que es conocido por estar implicado en funciones fisiológicas/biológicas como la inhibición de las metaloproteinasas activas de la matriz, regulación de la activación de proMMP, crecimiento celular y la modulación de la angiogénesis. La "familia de TIMP" humana contiene cuatro miembros, TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3 y TIMP-4. Un miembro preferido que se usa en la presente invención, TIMP-1, es una proteína secretada que puede detectarse en la superficie celular a través de su interacción con proteínas de la superficie (Bodes y Maskos, 2003).

El término "construcción de fusión" o "construcción de fusión TIMP" según se usa en el presente documento, se refiere a tanto la molécula de ácido nucleico como a la molécula de ácido nucleico codificada de ese modo.

La invención específicamente se refiere a ácidos nucleicos que contienen una secuencia de nucleótidos que incluyen la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia definida por las SEQ ID NOS: 1-5, o su homólogo, o sus fragmentos únicos. En la presente invención, la secuencia de una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína resultante se considera homóloga a una segunda molécula de ácido nucleico si la secuencia de ácido nucleico de la primera molécula de ácido nucleico es al menos aproximadamente 70% homóloga, preferiblemente al menos aproximadamente 80% homóloga, y más preferiblemente al menos aproximadamente 90% homóloga a la secuencia de la segunda molécula de ácido nucleico. La homología de dos secuencias de ácido nucleico se pueden determinar fácilmente usando el algoritmo de BLASTN conocido (Altschul, et al., 1990) son las posiciones por defecto. Como un ejemplo adicional, otro ensayo conocido para la determinación de la homología de dos secuencias de ácido nucleico es si se hibridizan en condiciones de hibridación normales, preferiblemente en condiciones de hibridación rigurosas.

Dada la secuencia de ácido nucleico descrita en el presente documento, los expertos en la técnica pueden diseñar estructuras de ácido que tienen funciones particulares en diversos tipos de aplicaciones. Por ejemplo, el experto en la técnica puede construir oligonucleótidos o polinucleótidos para uso como cebadores en procedimientos de amplificación de ácido nucleico, tal como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), reacción en cadena de la ligasa (LCR), reacción en cadena de la reparación (RCR), PCR ensayo de ligamiento de oligonucleótido (PCR-OLA), y similares. Se pueden construir los oligonucleótidos útiles como sondas en los estudios de hibridación, tal como hibridación in situ. Se conocen numerosos procedimientos para marcar tales sondas con radioisótopos, etiquetas fluorescentes, enzimas, y restos de unión (por ejemplo, biotina), de este modo las sondas de la invención se pueden adaptar fácilmente para la fácil detectabilidad.

Los oligonucleótidos también se pueden diseñar y fabricar para otros propósitos. Por ejemplo, la invención permite el diseño de oligonucleótidos no codificantes, y oligonucleótidos que forman tríplex para uso en el estudio de las relaciones estructura/función. La recombinación homóloga se puede implementar mediante la adaptación del ácido nucleico descrito actualmente para uso como medios diana.

La proteína codificada por el ácido nucleico de la presente invención además incluye homólogos funcionales. Una proteína se considera un homólogo funcional de otra proteína para una función específica, como se describe más adelantes el homólogo tiene la misma función que la otra proteína. El homólogo puede ser, por ejemplo, un fragmento de la proteína, o una substitución, adición, o supresión mutante de la proteína.

La determinación de si dos secuencias de aminoácidos son sustancialmente homólogas es, para el propósito de la presente invención, basándose en investigaciones FASTA de acuerdo con Pearson y Lipman (1988). Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de una primera proteína se considera homóloga a la de la segunda proteína si la secuencia de aminoácidos de la primera proteína tiene al menos aproximadamente 70% de identidad de secuencia de aminoácidos, preferiblemente al menos aproximadamente 80% de identidad, y más preferiblemente al menos aproximadamente 95% de identidad, con la secuencia de la segunda proteína.

La posibilidad de sustitución de un aminoácido en una secuencia con un aminoácido equivalente es bien conocida. Grupos de aminoácidos conocidos que son equivalentes incluyen:

(a): Ala (A), Ser (S), Thr (T), Pro (P), Gly (G);

(b): Asn (N), Asp (O), Glu (E), Gln (Q);

(c): His (H), Arg (R), Lys (K);

(d): Met (M), Leu (L), Ile (I), Val (V); y

(e): Phe (F), Tyr (Y), Trp (W).

Substituciones, adiciones, y/o supresiones en las secuencias de aminoácidos se pueden hacer mientras que la proteína codificada por el ácido nucleico de la invención continúa para satisfacer los criterios descritos en el presente documento. Una secuencia de aminoácido que es sustancialmente la misma que otra secuencia, pero que difiere de la otra secuencia en una o más substituciones, adiciones, y/o supresiones, se considera que es una secuencia equivalente.

Preferiblemente, menos de 20%, más preferiblemente menos de 10%, y todavía más preferiblemente menos de 5%, del número de restos de aminoácido en una secuencia están sustituidos por, añadidos a, o suprimidos de la proteína codificada por el ácido nucleico de la invención.

El término "MMP" según se usa en el presente documento, significa una metaloproteinasa de la matriz que pertenece a la superfamilia de MMP representada por al menos 26 metaloendopeptidasas que degradan la matriz extracelular, que actúan durante el desarrollo y la diferenciación tisular, infiltración celular, cicatrización de heridas y como moderadores de la respuesta inmune.

El término "GPI" según se usa en el presente documento, significa fosfolípidos de glucoinositol, en especial, glucosilfosfatidilinositol como se describe en Medof y col., 1996. Estos anclajes similares a fosfolípidos tienen una estructura común de unión a la membrana independientemente de la función de la proteína. Las unidades de anclaje GPI están compuestas de un glucano lineal que contiene una fosfoetanolamina, tres restos de manosa y una glucosamina no acetilada unida a un fosfolípido del inositol. La secuencia de GPI contiene las señales que dirigen el anclaje de GPI.

El término "mucina" o "dominio de mucina" según se usa en el presente documento, significa componente glucoproteico unido o no a la membrana. Normalmente, las mucinas unidas a la membrana muestran secuencias hidrófobas o dominios transmembrana responsables de su anclaje en la bicapa lipídica y, opcionalmente, contienen uno o varios dominios similares al factor de von Villebrandt, que funciona en la oligomerización de monómeros de mucina y en el empaquetamiento dentro de vesículas secretoras. El término "mucina" o "dominio de mucina" según se usa en este documento, también abarca tallos de mucina y dominios similares a mucina, como los tallos de mucina que se encuentran en las quimiocinas CXCL16 o fractalcina (CX3CL1).

Una construcción de fusión "TIMP-GPI" según se usa en el presente documento, se refiere a un TIMP que se fusiona directamente con una secuencia de unión a GPI. La construcción de fusión TIMP-GPI se diseña sustituyendo el extremo 3' de la secuencia de ARNm o ADNc de proteínas ancladas a GPI de forma natural (es decir, una secuencia que contiene las señales que dirigen el anclaje a GPI) por el extremo 3' de la secuencia de ARNm o ADNc del TIMP endógeno.

Una "TIMP-mucina-GPI" o "TIMP-muc-GPI" según se usa en el presente documento, se refiere a un TIMP que se fusiona directamente con un dominio de mucina seguido de una secuencia de anclaje GPI. La construcción de fusión TIMP-GPI se diseña como se describe para TIMP-GPI, aunque incluyendo la secuencia de aminoácidos de un dominio de mucina entre las secuencia de aminoácidos de TIMP y GPI. Por analogía "TIMP-fractalcina-GPI" o "TIMP-frac-GPI" se refiere a un TIMP que está fusionado directamente a un dominio de fractalcina por una secuencia de unión a GPI.

El término "RCC" significa carcinoma de células renales, que se considera como un tumor progresivo con opciones terapéuticas limitadas debido a la resistencia al tumor a agentes quimioterapéuticos actuales y a la radiación. RCC sirve como sistema modelo en la presente invención para mostrar la actividad antitumoral de TIMP anclado a GPI. Las líneas celulares modelo utilizadas en la presente invención son las líneas celulares RCC-26 y RCC-53 que se establecieron a partir de pacientes con carcinomas de células en estadio I y estadio IV.

El término "FAS" significa un miembro de la familia del factor de necrosis tumoral/receptor del factor de crecimiento nervioso que induce apoptosis independiente de TNF-\alpha. Otras abreviaturas conocidas en la técnica para FAS son Apo1 (= proteína inductora de apoptosis 1) y CD95.

El término "regeneración" significa en general a la reparación de la integridad de tejido traumatizado o de otra manera lesionado. El término puede incluir los procesos de cicatrización de heridas, restauración de tejidos, y otros tipos de actividades de restauración que se producen en la localización cuando se produce un traumatismo fisiológico y daño del tejido consiguiente.

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Descripción detallada de la invención La modificación por ingeniería genética de la familia de TIMP y proteína de las superficies celulares

Los inhibidores titulares de las metaloproteinasas (TIMP) se conocen como los inhibidores celulares principales de la subfamilia de las metaloproteinasas de matriz (MMP), que muestran grados variables de eficacia contra miembros de MMP diferentes, sí como patrones de expresión de titulares diferentes y modos de regulación. Las TIMP típicamente modulan la actividad de las MMP solubles unidas a matriz y asociadas a célula. Las cuatro TIMP de mamífero tienen muchas amplias similitudes, pero muestran características estructurales características, propiedades bioquímicas y patrones de expresión, que sugieren que cada TIMP tiene una particular función in vivo.

La proteína TIMP-1 es el miembro más amplio expresado y estudiado de la familia de TIMP. Otros miembros de la familia TIMP incluyen TIMP-2, TIMP-3 y TIMP-4. La proteínas TIMP no solamente comparten características estructurales comunes, incluyendo una serie de restos de cisteína conservados que forman enlaces disulfuro esenciales para la conformación de la proteína nativa (Brew et al., 2000), pero también superponen ampliamente las actividades biológicas. La región N-terminal conservada de las proteínas TIMP es necesaria para las actividades inhibidoras funcionales, mientras que las regiones divergentes C-terminal se cree que modulan la selectividad de inhibición y eficacia de unión de los agentes a las MMP (Maskos y Bode, 2003). Sin embargo, aparte de sus capacidad para actuar como inhibidores de MMP, los diversos miembros de la familia de TIMP también pueden exhibir actividades biológicas adicionales, incluyendo la regulación de proliferación y apoptosis además de la modulación de respuestas angiogenicas e inflamatorias.

TIMP-1 se ha encontrado que inhibe la mayoría de las MMP (excepto MMP-2 y -14), y preferentemente inhibe MMP-8. TIMP-1 se produce y secreta en forma soluble mediante una diversidad de tipos de células se distribuye ampliamente a lo largo del cuerpo. Es una proteína extensivamente glucosilada con una masa molecular de 28,5 kDa. TIMP-1 inhibe las formas activas de MMP, y complejos con la proforma de MMP9. De modo similar a MMP9, la expresión de TIMP-1 es sensible a muchos factores. El aumento de la síntesis de TIMP-1 está provocado por una amplia diversidad de reactivos que incluyen: TGF beta, EGF, POGF, FGFb, PMA, ácido alltransrretinoico (RA), IL1 e IL11.

TIMP-2 es una glucoproteína de 21 kDa que se expresa mediante una diversidad de tipos de células. Forma un complejo no covalente, estequiométrico con MMP tanto latente como activo. TIMP-2 muestra una preferencia para la inhibición de MMP-2.

TIMP-3 se une típicamente a la ECM e inhibe la actividad de MMP-1, -2, -3, -9, y 13. TIMP-3 muestra un 30% de homología de aminoácidos con TIMP-1 y 38% de homología con TIMP-2. TIMP-3 se ha mostrado que promueve la separación de las células transformadas de ECM y para acelerar los cambios morfológicos asociados a a la transformación de células.

Debido a su alta afinidad la unión a la ECM, TIMP-3 es única entre las TIMP. TIMP-3 se ha mostrado que promueve la separación de células transformadas de la ECM y para acelerar los cambios morfológicos asociados a la transformación de células. TIMP-3 contiene un dominio de unión de glucosaminoglicano (GAG) que comprende seis aminoácidos (Lys30, Lys26, Lys22, Lys42, Arg20, Lys45) que se cree que son responsables de una asociación con la superficie celular. TIMP-3 es la única TIMP que normalmente inhibe TACE (enzima conversora de TNF-\alpha), otra metaloproteasa que libera TNF soluble y es responsable del procesamiento del receptor IL-6 que de esta manera juega una parte central en el proceso de cicatrización de heridas.

TIMP-4 inhibe todas la MMP conocidas, y preferiblemente inhibe MMP-2 y -7. TlMP4 muestra 37% de identidad de aminoácidos con TlMP1 y 51% de homología con TlMP2 y TIMP3. TlMP4 se secreta extracelularmente, predominantemente en el tejido del corazón y del cerebro y parece funcionar de una manera específica de tejido con respecto a la homeostasis matriz extracelular (ECM).

La ingeniería de proteínas de las superficies celulares es una tecnología potencialmente poderosa mediante la cual puede manipularse la composición proteica de la superficie de las células sin transferencia génica. Sustituyendo el ARNm derivado de la secuencia de ADNc de una proteína unida a GPI que contiene el dominio señal de GPI para la región carboxilo terminal de una proteína de interés, es posible generar una construcción de fusión que codifique una proteína unida a GPI.

Este enfoque ofrece múltiples ventajas sobre técnicas de transferencia génica más tradicionales. Por ejemplo, el procedimiento es aplicables a las células que son difíciles o imposibles de transfectar (p. ej., endotelio microvascular primario, células diana primarias, etc.). La cantidad de proteína añadida a la superficie de la célula puede controlarse y cuantificarse (mediante FACS o inmunofluorescencia). Además, pueden insertarse de forma secuencial o simultánea muchas proteínas ancladas a GPI en las mismas células. Mediante la ingeniería molecular es posible expresar un epítope etiqueta adicional que ayude a la purificación de la proteína, así como para controlar el reactivo durante los experimentos. El agente puede inyectarse directamente dentro del área tumoral o peritumoral y determinarse el efecto del reclutamiento selectivo de leucocitos sobre el crecimiento del tumor o la apoptosis inducida FAS.

Construcciones de fusión de TIMP para el tratamiento de cáncer

El pronóstico de tumores malignos depende principalmente de sus estadios clínico y patológico. Mientras que la mayoría de los carcinomas (p. ej., tumores primarios y secundarios) puede extirparse completamente mediante cirugía en la mayoría de los casos, a menudo no es posible una nueva resección del cáncer en estadio avanzado y se relaciona con la recurrencia temprana de la enfermedad y un aumento de la mortalidad relacionada con la enfermedad.

Especialmente en el caso del cáncer de mama, la enfermedad en estadio avanzado con un tumor de gran tamaño (> 2 cm) se asocia con la aparición de metástasis distantes y supervivencia limitada. También se considera que un volumen de tumor grande es un parámetro crítico para la presencia de cáncer residual, lo que representa también un riesgo alto de recaída local y la propagación de metástasis distantes. Asimismo, tumores cerebrales como el glioblastoma (astrocitoma de grado IV) es otra posible diana para la vigilancia tumoral, ya que la extirpación quirúrgica completa es casi siempre imposible y la recaída local se produce en el 95% de los casos durante el año siguiente a la cirugía primaria.

Se desvela TIMP anclados a GPI, que pueden aplicarse a nivel local dentro de los márgenes de la recesión para atraer a las células inmunes y centrarse en el tumor residual supervisando las células cancerosas residuales.

Para este fin, las proteínas TIMP se anclan mediante GPI y, cuando se purifican y se añaden a las células cancerosas, se incorporan a sus membranas superficiales y son completamente funcionales. Sustituyendo el extremo 3' de secuencias del ARNm de proteínas ancladas a GPI de origen natural (es decir, una secuencia que contiene las señales que dirigen el anclaje a GPI) por la secuencia 3' terminal del ARNm endógeno, puede expresarse prácticamente cualquier proteína TIMP como derivado anclado a GPI.

Se desvela la incorporación de la proteína GPI-TIMP purificada en las membranas superficiales de las líneas de células tumorales se demuestra mediante la incubación de las líneas celulares con TIMP-1-GPI, TIMP-1-mucina-GPI o proteína control TIMP-1 (rh) recombinante humana purificada. Como se detalla a continuación, la expresión superficial de TIMP-1 anclado a GPI da lugar a una fuerte señal de superficie para TIMP-1.

Como se usa en el presente documento los términos "aislado y/o purificado" se refiere al aislamiento in vitro de una molécula de ADN o polipéptido a partir de su ambiente natural celular, y a partir de la asociación con otros componentes de la célula, tales como ácido nucleico o polipéptidos, de manera que se puedan secuenciar, replicar, y/o expresar. Por ejemplo, "secuencia de unión a GPl aislado" es ARN o AND que contiene más de 9, preferiblemente 36, y más preferiblemente 45 o más, bases de nucleótidos secuenciales que codifican al menos una parte de una secuencia de unión, o su variante, o un ARN o ADN complementarios a ella, que es complementaria o se hibridiza respectivamente, a ARN o ADN que codifica la secuencia de unión y permanece unida establemente en condiciones rigurosas como se define mediante los procedimientos bien conocidos en la técnica. De esta manera, el ARN o ADN se "aísla" de manera que está libre de al menos un ácido nucleico contamínate con el que está normalmente asociado en la fuente natural del ARN o ADN y está preferiblemente sustancialmente de cualquier otro ARN o ADN de mamíferos.

Como se usa en el presente documento, la expresión "ácido nucleico recombinante" por ejemplo "secuencia de ADN recombinante " se refiere a un ácido nucleico, por ejemplo, a ADN, que se ha derivado o aislado de cualquier fuente de tejido apropiada, que se puede alterar posteriormente de manera química in vitro, de manera que su secuencia no es de origen natural, o corresponde a secuencias de origen natural que no están posicionadas como deberían estar posicionadas en un genoma que no se ha transformado con ADN exógeno. Un ejemplo de ADN "derivado" a partir de una fuente, sería una secuencia de ADN que se identifica como un fragmento útil dentro de un organismo dado,, y que después se sintetiza químicamente en forma esencialmente pura. Un ejemplo de tal ADN "aislado" a partir de una fuente sería útil una secuencia de ADN que se escinde o elimina de dicha fuente mediante medios químicos, por ejemplo, mediante el uso de endonucleasas de restricción, de manera que se pueda además manipular, por ejemplo amplificar, para uso en la invención, mediante la metodología conocida de ingeniería genética.

A diferencia de los anclajes polipeptídicos convencionales, que tienen secuencias transmembrana diferentes y conectan con extensiones citoplasmáticas específicas, estos anclajes similares a fosfolípidos utilizan una estructura común como mecanismo general de unión a la membrana independientemente de la función de la proteína. Las unidades de anclaje GPI están compuestas de un glucano lineal que contiene una fosfoetanolamina, tres restos de manosa y una glucosamina no acetilada unida a un inositol fosfolípido. Su fabricación se inicia en el retículo endoplásmico (RE) y se añaden a productos primarios de traducción en el momento de su translocación a través de la membrana del RE. Los productos modificados con GPI se glucosilan a continuación en el RE y en el Golgi y, posteriormente, se transportan a la superficie de la célula.

Las secuencias unidas a GPI preferidas que pueden usarse en la presente invención derivan de anclajes GPI que se aíslan de, por ejemplo, enzimas como fosfatasa alcalina, acetilcolinesterasa, 5' nucleotidasa (CO73); moléculas de adhesión como el antígeno asociado a la función del linfocito (LFA-3, CD58), moléculas de adhesión de células neurales (NCAM), proteínas reguladoras de complemento como factor de aceleración de la degradación (DAF o CD55) u otros como el receptor Fc\gamma de tipo III B (Fc-\gamma-RIII o CD16b), Thy-1 (CD90), Qa-2, Ly-6A, inhibidor de membrana de lisis reactiva (MIRL o CD59). Para el fin de la presente invención, se prefiere el antígeno asociado a la función del linfocito (LFA-3). Los expertos reconocerían que también cualquier otro de los anclajes GPI conocidos pueden usarse para la práctica de la presente invención.

Para la construcción de TIMP-GPI, puede usarse la secuencia de longitud completa de TIMP en la construcción de fusión o una porción funcionalmente activa de la misma, que retenga la actividad de TIMP. Del mismo modo, también puede usarse una porción de la secuencia GPI, siempre que la porción permita la incorporación de la proteína TIMP en la superficie de la membrana celular de células cancerosas.

A continuación se describen una pluralidad de realizaciones que se refieren a las construcciones de fusión de TIMP, por lo cual las construcciones se produjeron y se proporcionaron para el tratamiento de cáncer y como agentes en el campo de la medicina regenerativa. En una primera realización, la molécula de TIMP se selecciona entre el grupo constituido por TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3 y TIMP-4, y está condensada preferiblemente a una secuencia de GPI.

En otra realización preferida, la secuencia de GPI es de 36 aminoácidos de longitud.

Se desvela que la molécula de TIMP se selecciona entre el grupo constituido por TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3 y TIMP-4, y está condensada a un dominio de mucina de fractalcina seguido de la secuencia de GPI.

Se desvela que la proteína de TIMP que se selecciona entre el grupo constituido por TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3 y TIMP-4 y está condensada a la secuencia de GPI, o condensada a un dominio de mucina o dominio de fractalcina seguido de la secuencia de GPI, se rompe en el extremo C-terminal. Se describe que dicha molécula TIMP está truncada hasta los primeros restos de aminoácidos 50, 50-100 ó 50-152 N-terminal. Más preferiblemente, la molécula de TIMP está truncada hasta los primeros restos de aminoácidos 152 N-terminal y es la molécula de TIMP-1. El término "roto" se refiere a un ácido nucleico de TIMP o una secuencia de aminoácidos que contiene menos del número total de bases de ácido nucleico o restos de aminoácido encontrados en la secuencia de ácido nucleico de TIM P nativa o proteína o a un ácido nucleico o secuencia de aminoácidos se ha suprimido de las secuencias no deseadas.

Se desvela que la construcción de fusión de TIMP se define por una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4 y 5.

La construcción obtenida se puede expresar en cualquier línea celular o célula huésped adecuada para obtener el polipéptido o proteína TIMP funcional. Con este fin, pueden usarse vectores o plásmidos conocidos apropiados para expresar las proteínas TIMP ancladas a GPI de la presente invención. Como se muestra con más detalle a continuación, las células cancerosas diana tratadas con proteína TIMP-GPI (y como control con proteína TIMP-1rh) eran reconocidas por las construcciones proteicas y, en consecuencia, se eliminaban debido a la apoptosis mediada por FAS.

A modo de ejemplo, un vector usado para la expresión de las construcciones de fusión de la presente invención contiene el promotor del factor de elongación 1 alfa humano seguido de un sitio de clonación múltiple y un sitio de unión a ribosomas interno que permite la expresión bicistrónica de la construcción y el uso de dihidrofolato reductasa (DHFR) como marcador de selección (Mack, y col., P.N.A.S. USA 92:7021, 1995). El extremo 3' (carboxilo terminal) de la proteína TIMP se fusiona directamente o bien con una secuencia de unión a GPI (p. ej., derivado del antígeno asociado a la función del linfocito (LFA-3)) o puede fusionarse con el dominio similar a mucina aislado de CXCL16 o fractalcina (CX3CL1) seguido de la señal GPI. Como se indica anteriormente, estas regiones de mucina están compuestas en gran medida por restos de serina/treonina/glicina/prolina que facilitan interacciones entre células. Las construcciones de fusión resultantes se transfieren a células de ovario de hámster chino (CHO) deficientes en dihidrofolato reductasa (DHFR) y se realiza la selección como se ha descrito (Mack y col., P.N.A.S. USA 92:7021-7025, 1995). En una realización preferida, los transfectantes pueden exponerse a metotrexato para aumentar la tasa de expresión mediante amplificación génica.

La TIMP-GPI puede además fusionarse con un dominio de mucina para aumentar la eficacia de la incorporación a la membrana de proteínas TIMP-GPI. Las mucinas son componentes glucoproteicos unidos o no a la membrana que se identificaron en primer lugar en el moco secretado que reviste las superficies del epitelio glandular. Las mucinas unidas a membrana muestran secuencias hidrófobas o dominios transmembrana responsables de su anclaje a la bicapa lipídica. Hasta el momento, un total de 21 genes han recibido la denominación MUC: MUC1-2, MUC3A, MUC3B, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC6-13, MUC15-20 (Moniaux N, y col., 2004). Las cinco características comunes de una mucina son: (1) secreción en la capa mucosa, (2) glucoproteína O de alto peso molecular, (3) presencia de una disposición de repetición en tándem codificado por un exón largo único y colocado en posición central, (4) presencia de un dominio peptídico predicho que contiene un alto porcentaje de restos de serina y treonina y (5) un patrón complejo de expresión de ARNm. Con una excepción (MUC7), las mucinas secretoras (MUC2, MUC5AC, MUC5B y MUC6) poseen uno o más dominios similares al factor von Willebrandt, péptidos ricos en cisteína, que actúan en la oligomerización de los monómeros de mucina y en el empaquetamiento de vesículas secretoras. Normalmente, las mucinas secretadas se expresan exclusivamente en células epiteliales especializadas, se secretan en el moco y muestran un patrón de expresión restringido dentro del cuerpo humano. Las cuatro mucinas secretoras, también denominadas mucinas formadoras de gel, tienen una arquitectura común con un alto nivel de similitud con el profactor von Willebrand. También se sabe que portan de cinco dominios D debido a su homología con los dominios D del factor von Willebrand.

Las mucinas unidas a membrana están compuestas de MUC1, MUC3A, MUC3B, MUC4, MUC11, MUC12, MUC16 y MUC17. Las mucinas ancladas a membrana contienen un módulo SEA (proteína de esperma de erizo de mar, enteroquinasa y agrina) con la excepción de MUC4. MUC3A-B, MUC4, MUC11-12 y MUC17 contienen de dos a tres dominios similares al factor de crecimiento epidérmico (EGF). Ejemplos de mucinas unidas a membrana que pueden usarse son MUC1, MUC3, MUC4 y MUC12. Además, pueden usarse los tallos de mucina de la quimiocina CXCL16 asociada a la superficie o fractalcina (CX3CL1). CXCL16 es un miembro de la subfamilia de quimiocinas CXC. A diferencia de otros miembros de este subgrupo, CXCL16 es estructuralmente diferente y tiene cuatro dominios diferentes: un dominio quimiocina atado a la superficie celular mediante un tallo similar a mucina que, a su vez, está unido a los dominios transmembrana y citoplásmico. Fractalcina (CX3CL1) tiene una estructura similar a la de CXCL16 y tanto CXCL16 como fractalcina actúan como moléculas de adhesión cuando se expresan sobre la superficie de la célula y tras su escisión de la superficie celular, las quimiocinas solubles actúan como quimiotácticos.

Preferiblemente, el domino mucina está fusionado entre el extremo 3' de la secuencia TIMP y el extremo 5' de la secuencia de anclaje GPI mediante cualquiera de los procedimientos de ingeniería genética convencionales conocidos. La construcción de fusión TIMP-mucina-GPI obtenida se puede, a continuación, transfectar y expresar en cualquier línea celular o célula huésped conocida adecuada. Los expertos reconocerán que es adecuada cualquier otra mucina o dominio de mucina.

Se desvela que la fractalcina condensada a una molécula de TIMP comprende los aminoácidos 100-342 de CX3CL1 seguido de la secuencia de GPI. Se desvela que la molécula de TIMP es la molécula de TIMP-1 truncada en los primeros 152 aminoácidos N-terminal (SEQ ID NO: 5).

Aunque el uso de TIMP-1 (Bode y Maskos, 2003) para la preparación de la proteína TIMP anclada a GPI, los expertos reconocerán que también pueden usarse otras proteínas TIMP para la práctica de la presente invención. Otros ejemplos de TIMP humanos que son útiles son TIMP-2, TIMP-3 y TIMP-4 (Mannello F, y col., 2001). Las TIMP utilizadas derivan de fuentes humanas y se administran para tratar células cancerosas humanas. Los expertos reconocerán, así mismo, que también homólogos o variantes de TIMP, en especial TIMP-1, de otros organismos distintos al ser humano, tendrán efectos similares para matar las células tumorales. Por ejemplo, en algunas realizaciones, puede usarse la secuencia de TIMP-1 derivaba de un animal como perro, gato, ratón, conejo, vaca u oveja, y de ave, para la construcción de una construcción de fusión TIMP-GPI de la presente invención. La quimera TIMP-GPI se aplicará posteriormente al sitio del tumor de forma similar a la descrita para un individuo humano.

Los tumores y las células cancerosas que pueden ser tratados con TIMP anclado a GPI incluyen los siguientes cánceres, pero sin limitaciones: cáncer de mama, cáncer renal, cáncer de próstata, seminomas, melanomas, teratomas, neuroblastomas, gliomas, cáncer rectal, cáncer endometrial, cáncer de riñón, cáncer suprarrenal, cáncer de tiroides, cáncer sanguíneo, cáncer de piel, cáncer cerebral, cáncer de cuello de útero, cáncer intestinal, cáncer hepático, cáncer de colon, cáncer de estómago, cáncer de intestino, cáncer gastrointestinal, cáncer de nódulos linfáticos, cáncer de esófago, cáncer colorrectal, cáncer de páncreas, cáncer de oído, nariz y garganta (ENT), cáncer de útero, cáncer de ovario y cáncer de pulmón y las metástasis de los mismos.

Para el tratamiento de cáncer residual, se administrará y aplicará TIMP1-GPI a nivel local en el lado de la resección de la masa tumoral en pacientes con tumores de alto riesgo con un alto riesgo de células cancerosos residuales y mayor incidencia de recaída local y en aquellos pacientes con un tumor residual obvio debido a una enfermedad en estadio avanzado o imposible de operar a nivel local. Preferiblemente, la construcción de fusión se administra a una concentración de 0,5 a 5 \mug/ml de proteínas, más preferible a 0,5 a 1 \mug/ml ó 1 a 2 \mug/ml. Es más preferible una concentración de aproximadamente 1 \mug/ml de TIMP-GPI o TIMP-mucina-GPI. La proteína puede administrarse al individuo mediante cualquier ruta de administración aplicable. Se prefiere que el tratamiento se lleve a cabo durante la cirugía, de modo que la construcción de fusión se pulverice en la herida o se inyecta en las regiones que no sean accesibles para la cirugía. Para este fin, la construcción de fusión TIMP anclado a GPI de la presente invención puede ser un componente de una composición farmacéutica o de un medicamento que además comprende uno o más de los vehículos, diluyentes y excipientes convencionalmente conocidos.

Como se deduce de los siguientes ejemplos, parece que TIMP anclado a GPI induce su actividad antitumoral, es decir, la muerte de las células tumorales, no mediante apoptosis inducida por CTL y células NK (ruta lítica mediada por perforina/granzima), sino más bien por la segunda ruta, que implica la apoptosis mediada por FAS/CD95 (para más detalles véanse los ejemplos 5 y 6; figuras 5 y 6). Adicionalmente, mientras que muchas células tumorales son resistentes a la apoptosis mediada por FAS, el tratamiento con TIMP-1-GPI, pero no con el control TIMP-1rh, hacía a las líneas celulares sensibles a la apoptosis mediara por FAS.

También se ha encontrado que el tratamiento con la proteína TIMP-1-GPI reduce la expresión de BCL2 y aumenta la de la proteína BAX. Las proteínas BCL2 representan una familia de proteínas implicada en el control de la apoptosis. Algunos miembros de esta familia (como BCL2 Y BCL-XL) son antiapoptóticos, mientras que otros (como Bad o BAX) son proapoptóticos. La sensibilidad de las células a los estímulos apoptóticos depende del equilibrio entre los miembros pro y antiapoptóticos de la familia BCL2. Además, se determinó el efecto del tratamiento con TIMP-1-GPI sobre la expresión de BCL2 y BAX y se demuestra que el tratamiento de las células cancerosas con TIMP-1-GPI aumentaba la expresión de BAX proapoptótico y disminuía la expresión de BCL2 antiapoptótico.

Se obtuvieron resultados similares para las construcciones de fusión de TIMP codificadas por las SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4 y 5, respectivamente

En resumen, la capacidad de la metodología para producir cantidades de microgramos a miligramos de proteínas TIMP ancladas a GPI junto con la capacidad de incorporación de estas moléculas a las superficies de las células cancerosas proporciona una herramienta eficaz para el tratamiento del cáncer.

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Construcciones de fusión de TIMP para uso en la medicina regenerativa

Además, las construcciones de fusión de la presente invención son adecuadas para uso en la medicina regenerativa, particularmente en el área de cicatrización de heridas. Como se ha descrito anteriormente, las proteínas de TIMP que están condensadas a GPI se incorporadas de manera eficaz en la membrana de la superficie celular, donde los dominios funcionales de foco sobre esas superficies de las células independientemente de las interacciones proteína - proteína. Las construcciones de fusión de TIMP de la presente invención son típicamente completamente estables y muestran bioactividades amplificadas y novedosas.

Como se ha descrito anteriormente, tanto MMP como TACE juega un papel crucial en el proceso de cicatrización de heridas. El aumento de los niveles de MMP está asociado a los diversos trastornos de cicatrización de heridas, entre otros aparición de heridas crónicas. Debido a que los TIMP son inhibidores naturales de las MMP, las construcciones de fusión de la presente invención también se pueden emplear como agentes terapéuticos eficaces para controlar el proceso de cicatrización de heridas, por ejemplo, en medicina regenerativa y son adecuadas para tratar los trastornos caracterizados por un incremento en los niveles de MMP.

De este modo, la presente invención proporciona agentes y procedimientos adecuados para uso en medicina regenerativa y/o para tratar trastornos caracterizados por un incremento en los niveles de MMP. En una realización preferida, las construcciones de fusión de la presente invención se usan para tratar o prevenir una cicatrización excesiva, y una cicatrización de heridas anormal incluyendo cicatrización queloide o hipertrófica y/o heridas crónicas. En una realización preferida adicional, las construcciones de fusión de la presente invención se usan para inhibir o prevenir la formación de tejido cicatrizado.

Una respuesta de cicatrización de heridas típica se caracteriza por el movimiento de células especializadas en el sitio de la herida. Las plaquetas y células inflamatorias en general son las primeras células que llegan al sitio de la lesión y estas moléculas proporcionan funciones importantes y señales químicas, incluyendo citocinas que son necesarias para el influjo de los tejidos conectivos y otros factores de cicatrización. El término "herida" significa una interrupción de la estructura y función fisiológica normal. De este modo, el proceso de la cicatrización de heridas se refiere a la secuencia compleja y dinámica de acontecimientos que por último dan como resultado el restablecimiento de la continuidad y función fisiológica.

Cuando una herida cicatriza, usualmente se desarrolla una cicatriz en su lugar. Durante el curso de la cicatrización de heridas, se regeneran los tejidos simples tales como grasa normal cicatrización de heridas, tales como grasa, tejido conectivo, y epitelio. Sin embargo, debido a que la piel es un órgano más complejo que se deriva de las capas germinales, se cicatriza mediante la formación de tejido predominantemente fibroso, es decir, una cicatriz.

En la cicatrización de heridas normal, la actividad proteolítica de MMP está controlada por diversos mecanismos que incluyen transcripción génica, producción de la enzima, y por la secreción local de inhibidores de TIMP endógenos. Durante la reparación de heridas, existe un equilibrio entre las actividades de las MMP y las TIMP. Sin embargo, las metaloproteasas de matriz se sabe que tienen niveles elevados de heridas crónicas y tales concentraciones de MMP se sabe que alteran la el proceso de cicatrización de heridas. Múltiples tipos de células, incluyendo macrófagos, fibroblastos, neutrófilos, células epiteliales, y células endoteliales, sintetizan las MMP en la presencia de señales bioquímicas específicas tales como citocinas inflamatorias. Las MMP son capaces de digerir casi todos los componentes de la matriz extracelular, que desafía el equilibro requerido entre la proteína que degrada las actividades de las MMP y otra actividad celular que sintetiza y deposita componentes de proteína de tejido.

La Figura 8 proporciona una visión general del proceso de remodelación de tejido, fibrosis y los factores implicados en la modulación de este proceso. Después de una reacción crónica e inflamatoria a una lesión particular, una infección parasitaria, o una respuesta autoinmune, factores fibrogénicos se expresan y se secretan de esta manera conduciendo a la activación de fibroblastos y queratinocitos. Estos factores fibrogénicos incluyen, entre otros, TGF-\beta, It-1 \beta, IL-1 \alpha, MOB, TGF-\alpha, IL-4, IL-13, bFGF, TNF-\alpha y PDGF-BB. Quizás las dos citocinas más importantes de estas son: TNF, que es mitogénico para los fibroblastos y promueve la angiogénesis y se secreta los macrófagos, masteocitos, y linfocitos T; y TGF-\alpha, que es mitogénico para los queratonicoticos y fibroblastos, estimula la migración de queratinocitos y se secreta por macrófagos, linfocitos T y queratonicoticos. La fase que implica TNF y secreción de TGF marca la transición de la fase inflamatoria del proceso de la cicatrización de heridas en el proceso de reconstrucción de tejidos, es decir la fase proliferativa.

Tras la activación, los fibroblastos secretan IL-6 que, en combinación con TGF-\beta, conduce a la proliferación de los fibroblastos. TNF-\beta también promueve la diferenciación de fibroblastos. El resultado de estos procesos de proliferación y diferenciación es un incremento global en colágeno, fibronectina, TIMP, MMP, así como otras proteínas de ECM, que en la producción de ECM y una disminución en el recambio de ECM.

La presente invención se basa en el hallazgo inesperado de que las construcciones de fusión, es decir, proteínas TIMP o sus mutantes, condensadas a un anclaje GPI, un anclaje mucina-GPI -o un anclaje fractalcina-GPI se puede usar como un agente potente para influenciar el nivel de expresión y/o actividad de citocinas y otras enzimas importantes implicadas en el proceso de cicatrización de heridas. De este modo, la presente invención ofrece agentes regenerativos eficaces y procedimientos para controlar el proceso de cicatrización de heridas (por ejemplo, para influenciar, inhibir, o prevenir la formación de tejido de cicatrización) y para tratar otras disfunciones conocidas asociadas al proceso de cicatrización de heridas.

Cicatrización anormal de heridas

La cicatrización queloide e hipertrófica se caracteriza por una acumulación de exceso de colágeno y se pueden distinguir de otra por su apariencia física. Tanto las cicatrices queloides como hipertróficas son heridas que cicatrizan de manera ardorosa externa a la superficie cutánea. Una cicatriz queloide típicamente continua aumentando más allá del tamaño y forma de la herida, mientras una cicatriz hipertrófica aumenta dentro de los confines físicos de la herida original. La cicatrización hipertrófica es en general observable pronto después de la lesión del tejido, mientras que las cicatrices queloides se pueden formar tan tarde como un año después del momento de la lesión. Sin embargo, casi todos los casos de cicatrización anormal están asociados a traumatismos fisiológicos que incluyen tatuajes, quemaduras, inyecciones, picaduras, vacunas, traumas, cirugía, o infección.

Las cicatrices hipertróficas y queloides se pueden describir ambas como variaciones del proceso de cicatrización de heridas típico. En una herida típica, los procesos anabólicos y catabólicos logran equilibrio aproximadamente 6-8 semanas después de la lesión original. Durante la maduración de la cicatriz, la resistencia a la tensión de la piel mejora a medida que las fibras de colágeno se reticulan de manera progresiva. En este momento, la cicatriz es usualmente hiperémica y puede ser más espeso. Sin embargo, el tejido de la cicatriz inicial tiende a hundirse gradualmente en durante un período de meses produciendo una cicatriz más madura que es típicamente plana, blanca, flexible, y posiblemente extendida en apariencia. Cuando existe un desequilibrio entre las fases anabólicas y catabólicas del proceso de cicatrización de heridas, se produce más colágeno que se degrada y la cicatriz puede por lo tanto crecer en todas las direcciones.

Un procedimiento individual, óptimo para el tratamiento de tejido hipertrófico y queloide no se ha desarrollado todavía, de este modo la velocidad de reaparición de estas cicatrices anormales es significativa.

En resumen, citocinas enzimas específicas, incluyendo las MMP y los TIMP, juegan un papel crucial en el proceso de cicatrización de heridas y en la formación de tejido de la cicatriz. Además, una expresión anormal en los niveles de MMP las y citocinas están a menudo asociados a la cicatrización de heridas anormal.

De este modo, la presente invención ofrece agentes regenerativos eficaces y procedimientos para controlar el proceso de cicatrización de heridas y/o para tratar disfunciones asociados comúnmente a la cicatrización de heridas. Específicamente, las construcciones de fusión de la presente invención se pueden utilizar para control de manera eficaz, alterar, inhibir o incluso prevenir estos procesos no deseables. Las construcciones de fusión de la presente invención se pueden formular en forma de un compuesto farmacéutico y administrar en el sitio de la lesión. En una realización, el sitio de la lesión se crea mediante cirugía, una quemadura, una inyección, una picadura, una vacuna, un trauma, cirugía, o infección. En otra realización, la construcción de fusión usada para la preparación del medicamento a aplicar al sitio de la lesión se selecciona entre el grupo constituido por TIMP-1-GPI, TIMP-2-GPI, TIMP-3-GPI, TIMP-4-GPI, TIMP-1-muc-GPI, TIMP-2-muc-GPI, TIMP-3-muc-GPI y TIMP-4-muc-GPI o sus mutantes.

Formulación de las construcciones de TIMP y modos de administración

Las composiciones farmacéuticas basadas en las construcciones de TIMP de la presente invención se pueden formular de una manera convencional usando uno o más vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables. Las técnicas y formulaciones en general se pueden encontrar en Remnington's Pharmaceutical Sciences, Meade Publishing Co., Easton, Pa. Para los propósitos de inyección, los compuestos de la invención se pueden formular en una solución líquida, preferiblemente en un tampón fisiológicamente compatible tal como solución de Hank o solución de Ringer. Además, los compuestos se pueden forma sólida y volver a disolver, o suspender inmediatamente antes de uso. Las formas liofilizadas son también adecuadas.

Además de estas formulaciones, los compuestos también se pueden preparar en forma de una preparación de liberación prolongada. Estas formulaciones de liberación prolongada de actuación prolongada se pueden administrar mediante implante (por ejemplo, por vía subcutánea y vía intramuscular) o mediante inyección. De este modo, los compuestos se pueden formular con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo, en forma de una emulsión en un aceite aceptable) o como una resina de intercambio iónico, o como un derivado moderadamente soluble, tal como una sal moderadamente soluble. Otros sistemas de administración adecuados incluyen microesferas, que ofrecen la posibilidad de una administración local y no invasiva de fármacos durante un período de tiempo prolongado. Esta tecnología particular utiliza microesferas que tienen un tamaño precapilar que se puede inyectar mediante un catéter coronario en cualquier parte seleccionada de un tejido, por ejemplo, el corazón u otros órganos, sin provocar una inflamación resultante o isquemia. El agente terapéutico administrado se libera lentamente de estas microesferas y se capta pronto por las células presentes en el tejido circundante (por ejemplo, células lesionadas o cancerosas).

Para la administración tópica, los oligómeros de la invención se pueden formular en ungüentos, pomadas, geles, o cremas conocidas en general en la técnica. Una solución de lavado que contiene el oligómero se puede usar de manera local para tratar una lesión o inflamación o para en general acelerar el proceso de cicatrización.

Las construcciones TIMP de la presente invención se pueden combinar cuando se prepara un medicamento, de manera que el medicamento resultante comprende más de una, preferiblemente dos, e incluso más preferiblemente tres construcciones de TlMP diferentes. Con esta técnica, las actividades amplificadas y novedosas de los diferentes miembros de la familia de TIMP se pueden preferentemente combinar y dirigir a la superficie celular, que puede conducir a un efecto sinérgico. Por ejemplo, las construcciones de fusión de TIMP-1 inhiben la mayoría de las MMP, excepto MMP-2 y MMP14. Por lo tanto, cualquiera de las construcciones TIMP-1 se puede combinar con cualquiera de las construcciones TIMP-2 o TIMP-4 que inhiben ambas preferentemente MMP-2. Por lo tanto, por medio de esta combinación, se puede lograr una inhibición más completa de la familia de MMP.

En una realización, las formulaciones de la presente invención por lo tanto comprenden una construcción de TIMP-1 o una construcción de TIMP-2 y/o una de TIP-4. En una realización preferida, la formulación comprende una construcción de TIMP-1 seleccionada entre el grupo constituido por una truncada. TIMP-1-GPI como codificada por la SEQ ID NO: 1, una TIMP-1-frac-GPI truncada como codificada por la SEQ ID NO: 5, y una TIMP-1-muc-GPI como codificada por SEQ ID NO:2, y una construcción TIMP-2 y/o una TIMP4. Preferiblemente, la construcción TIMP-2 está codificada por la SEQ ID NO:3.

En una realización adicional, la formulación comprende una construcción de TIM P-3 de la presente invención, preferiblemente que está codificada por la SEQ ID NO:4, que inhibe TACE conjuntamente con al menos una de las construcciones de TIMP seleccionadas entre el grupo constituido por una TIMP-1-GPI truncada como codificada por la SEQ ID NO:1, una construcción TIMP-1-frac-GPI truncada, una TIMP-1-muc-GPI truncada, una TIMP-2 y una TIMP-4. Preferiblemente, las construcciones TIMP-1 y TIMP-2 están codificadas por las SEQ ID NOs: 1, 2, 3 y 5, respectivamente.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Incorporación de TIMP-1-GPI a las membranas celulares de RCC.

A. Para demostrar la reincorporación de la proteína GPI-TIMP-1 a las membranas celulares, se añadió TIMP-1-GPI o control TIMP-1rh a las células RCC-26, RCC-53 y A498 nativas. TIMP-1 se detectó en la superficie celular mediante análisis por FACS. Los histogramas en color gris son las tinciones control de isotipo, los histogramas de línea continua representan las tinciones con el anticuerpo anti TIMP-1.

B. Para demostrar la unión de GPI tras la incubación con 200 ng/ml o 700 ng/m l de TIMP-1-GPI o TIMP-1rh, las células se trataron con 60 ng/ml de PLC y, a continuación, se sometieron a análisis por FACS. Los histogramas en color gris representan el control de isotipo.

C. Se usó un ELISA para TIMP-1 humano para determinar la cantidad de proteína TIMP-1 liberada de células RCC tratadas con TIMP-1-GPI (como se muestra en B) tras la digestión con PLC.

Figura 2. TIMP-1-GPI inhibe la liberación de proMMP-2 y proMMP-9 a partir de las células RCC-53. Se usó la zimografía para estudiar la secreción de las proteínas MMP-2 y MMP-9 por parte de RCC-53. Las células se trataron con cantidades crecientes de TIMP-1-GPI o TIMP-1rh control, y después de 48 h se retiró el sobrenadante del cultivo sin suero y se analizó por zimografía de gelatinasa.

Figura 3. Expresión en superficie de MMP después del tratamiento con TIMP-1-GPI. Tras la incubación de las células RCC-53 con 700 ng/ml de proteína TIMP-1-GPI durante 24 h, se realizó un FACS usando anticuerpos específicos dirigidos frente a: (A) TIMP-1, MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-8 y MMP-9 o (B) MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-16, HLA-A2 (HB82), pan HLA de clase I (W6/32) e ICAM-1. Como control adicional, se escindió la proteína TIMP-1-GPI de la superficie después de una hora mediante tratamiento con PLC (véase la figura 1). Los histogramas de color gris son la tinción control de isótopo, los histogramas de línea continua representan las muestras tratadas con TIMP-1-GPI.

C. La secreción de una serie de MMP a partir de RCC-53 se comprobó usando inmunotransferencia y anticuerpos monoclonales dirigidos frente a MMP-1, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-12 y MMP-13. Los medios de cultivo (sin suero) se tomaron 24 h después del tratamiento de RCC-53 con 700 ng/ml de TIMP-1rh o TIMP-1-GPI y se compararon con células control sin tratar.

D. Se evaluó el efecto del secuestro de MMP en la superficie celular sobre la invasión de RCC-53 a través del modelo de membrana basal Matragel. La migración optima de las células RCC-3 hacia VEGF (4 ng/ml) se estableció como valor basal o "cero" y se estableció el valor de 100% de inhibición para el valor de migración observado para las células RCC-53 en ausencia de señal VEGF. Las células RCC-53 se trataron previamente con 350 ng/ml o 700 ng/ml de TIMP-1rh o TIMP-1-GPI. Después de una hora, las células se lavaron y aplicaron a la cámara de migración. A continuación, se evaluó el efecto sobre la migración. Los datos presentados representa la media de cuatro pocillos y dos experimentos.

Figura 4. Efecto de las proteínas TIMP-1rh y TIMP-1-GPI sobre la proliferación de las líneas RCC. El efecto del aumento de los niveles de proteínas TIMP-1-GPI o TIMP-1rh control sobre la proliferación de RCC-53 (A), A498 (B) y RCC-26 (C) se midió usando un ensayo MTT. Se añadió MTT después de 24 h, 48 h o 72 h como se indica.

Figura 5. TIMP-1-GPI no influye sobre la susceptibilidad de RCC a la apoptosis mediada por perforina. Las células RCC se dejaron sin tratar (\blacksquare), tratados con 700 ng/ml de TIMP-1-GPI (0) o proteína TIMP-1rh (o) durante 24 h y se incubaron con los CTL JB4 (A) o líneas NK (B) (NKL para RCC-53 y A498, o NK-92 para RCC-26). Se muestran ejemplos representativos de tres experimentos independientes con resultados similares.

Figura 6. TIMP-1-GPI no aumenta la expresión de FAS aunque convierte a las células en sensibles a la apoptosis inducida por FAS.

A. Células RCC-53, RCC-26 o A498 se trataron o no con 700 ng/ml de TIMP-1-GPI o TIMP-1 rh durante 24 h, y se tiñeron con anticuerpos anti-FAS humano (L-958) y se analizó la expresión en superficie de FAS mediante citometría de flujo. Las tinciones con el anticuerpo monoclonal control de isotipo se muestran como histogramas en color gris.

Las tres líneas celulares RCC se trataron con TIMP-1-GPI o TIMP-1rh seguido por la incubación con L-957. Se usó la unión de anexina V-fluoroisotiocianato (FITC) para detectar viabilidad y apoptosis temprana mediante citometría de flujo.

El bajo nivel de apoptosis en las células RCC-53 en (B) se verificó usando un ELISA para nucleosomas citoplásmicos más sensible. El aumento de los niveles de apoptosis se detectó después de la incubación con L-957 con niveles crecientes de TIMP-1-GPI pero no con TIMP-1rh.

Figura 7. Expresión de BCL-2 y BAX en RCC tras el tratamiento con TIMP-1-GPI o TIMP-1rh, analizada mediante tinción interna en FACS e inmunotransferencia.

Las células RCC-53 (A), RCC-26 (B) y A498 (C) se incubaron previamente con TIMP-1-GPI o TIMP-1 rh durante 24 h; a continuación, se trataron con el anticuerpo que activa FAS, L-957, durante 16 h más. Posteriormente, las células se analizaron con anticuerpos monoclonales anti-BCL-2 y anti-BAX usando citometría de flujo. En paralelo, las proteínas se extrajeron y midieron mediante inmunotransferencia. Las señales derivadas de BAX y BLC-2 se normalizaron hasta los niveles de \beta-actina tras la densitometría. Los resultados del FACS se presentan como histogramas con valores entre paréntesis que se corresponden con el MFI de BCL-2 o BAX o que se corresponden con los anticuerpos para isotipo.

Figura 8: Visión general de la remodelación de tejidos y fibrosis

Un diagrama específico que la compleja interacción de factores implicados en el equilibrio delicado de la producción y recambio de ECM durante el proceso de cicatrización de heridas.

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Figura 9: Efecto de las Construcciones de fusión de TIMP en la producción de fibronectina de fibroblastos en la presencia de TIMP-1 rh

Fibroblastos confluentes se cultivaron en la presencia o ausencia de TIMP-1 rh y TIMP-1-GPI; se cuantificó la fibronectina expresada y secretada mediante análisis de inmunotransferencia usando anticuerpos anti fibronectina (\beta-actina servía como control). TIM P-1 rh (a 700 ng/ml) no condujo a ninguna disminución significativa en la expresión de fibronectina, mientras TIMP-1-GPI (a 700 ng/ml) redujo fuertemente la fibronectina que se secretaba por la fibroblastos.

Figura 10. Efecto de Construcciones de fusión de TIMP en la producción de fibronectina de fibroblastos en la presencia de TNF-\alpha

Fibroblastos se cultivaron en la presencia (Figura 10A) o ausencia (Figura 10B) de 10 ng/ml de fibroblastos que activan TNF-\alpha conjuntamente con 350 ng/ml de TIMP-1-GPI o 700 ng/ml de TIMP-1-GPI, TIMP-1-GPI desnaturalizado y TIMP rh-1-GPI, respectivamente. A una concentración de 350 ng/ml de TIM P-1-GPI, el ARN transcrito de fibronectina se redujo de manera significativa, independientemente de si TNF-\alpha estaba presente en el medio.

Figura 11. Efecto de las construcciones de fusión de TIMP sobre la producción de IL-G de fibroblastos

ARN de Fibronectina transcrito por fibroblastos se determina mediante análisis de transferencia de Northern, usando una sonda para ARN de IL-6. De este modo, se cultivaron fibroblastos en la presencia (Figura 11 A) o ausencia (Figura 11 B) de 10 ng/ml de TNF-\alpha que activa fibroblastos conjuntamente con 350 ng/ml de TIMP-1-GPI ó 700 ng/ml de TIMP-1-GPI, TIMP-1-GPI desnaturalizado y TIMP1-GPI rh, respectivamente. A una concentración de 350 ng/ml de TIMP-1-GPI, el ARN de IL-6 transcrito se redujo notablemente, independientemente de si TN F-\alpha estaba presente en el medio.

Figura 12. Efecto de las construcciones de fusión de TIMP en la producción de colágeno de fibroblastos

ARN de fibronectina transcrito por fibroblastos se determine mediante Análisis de transferencia de Northern, usando sondas para colágeno 1A1 (Figura 12A y B), colágeno 4A2 (Figura 12C y D), y colágeno 16A1 (Figura 12E y F), respectivamente. De este modo, fibroblastos se cultivaron en la presencia (Figuras 12A, C, E) o ausencia (Figura 12B, D, F) de 10 ng/ml del TNF-\alpha que activa fibroblastos conjuntamente con 350 ng/ml de TIMP-1-GPI o 700 ng/ml de TIMP-1-GPI, TIMP-1GPI desnaturalizado y TIMP rh-1-GPI, respectivamente. A una concentración de 350 ng/ml de TIM P-1-GPI, los tres ARN de colágeno transcritos se redujeron de manera significativa, independientemente de si TNF-\alpha estaba presente en el medio.

Figura 13. Efecto de Construcciones de fusión de TIMP en la producción de TGF-\beta de fibroblastos

ARN de fibronectina transcrito por fibroblastos se determinó mediante análisis de transferencia de Northern, usando sondas para EGF-\beta. De este modo, fibroblastos se cultivaron en la presencia (Figura 13A) o ausencia (Figura 13B) de 10 ng/ml del TNF-\alpha que activa fibroblastos conjuntamente con 350 ng/ml de TIMP-1-GPI o ng/ml de TIMP-1-GPI, TIMP-1-GPI desnaturalizado y TIMP rh-1-GPI, respectivamente. A una concentración de 350 ng/ml de TIMP-1-GPI, no se puede detectar casi nada de ARN de TGF-\beta, independientemente de si TNF-\alpha estaba presente en el medio, e independientemente del contenido en FCS del medio.

Ejemplos

Los ejemplos que no están cubiertos por las reivindicaciones adjuntas se presentan solamente para propósitos ilustrativos.

En los ejemplos siguientes, se describen con más detalle los efectos antitumorales de TIMP anclado a GPI sobre células cancerosas. Aunque los experimentos descritos se realizan con TIMP-1 humano, la invención no debería limitarse a este tipo de TIMP.

En los ejemplos siguientes, un anclaje-GPI se fusiona con TIMP-1 para centrarse en las concentraciones definidas de esta proteína inhibidora sobre la superficie de tres líneas celulares de carcinoma de células renales (RCC) (RCC-26, RCC-53 y A498) independientemente de las interacciones entre proteínas de la superficie celular. Como se muestra a continuación, la proteína TIMP-1-GPI añadida exógenamente se insertó de forma eficaz dentro de la membrana de la célula RCC y alteraba de forma drástica la asociación de MMP con la superficie celular. El tratamiento TIMP-1-GPI inhibía la proliferación de RCC y convertía a las células RCC normalmente resistentes a FAS sensibles a la apoptosis inducida por FAS, aunque no alteraba la lisis mediada por perforina debida a células citotóxicas efectoras. El aumento de la sensibilidad a la apoptosis mediada por FAS se correlacionaba con una alteración del equilibrio en las proteínas pro y antiapoptóticas de la familia BCL-2.

Las líneas celulares RCC-26 (Schendel y col., 1993) y RCC-53 se establecieron a partir de pacientes locales con carcinomas de células claras en estadio I y estadio IV, respectivamente. De este modo, representan los dos extremos clínicos del RCC. Los CTL infiltrantes del tumor se aislaron del tumor de ambos pacientes. Aunque estas células efectoras naturales no eran capaces de controlar in vivo el crecimiento tumoral, la tinción con marcadores de superficie de RCC-26 y RCC-53 mostraron una buena expresión de superficie de MHC de clase I y se demostró que ambas líneas inducían in vitro CTL aloespecíficos y específicos antitumorales ((Schendel y col., 2000) y DJS, observación no publicada). A498 se aisló originalmente del tumor de un varón de 52 años y es un ejemplo bien estudiado de RCC (Giard y col., 1973).

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Ejemplo 1

Incorporación de TIMP-1-GPI añadido exógenamente a la superficie de RCC-53

La proteína TIM-1 anclada a GPI se generó y aisló como se ha describe previamente (Djafarzadeh y col., 2004). La incorporación de la proteína GPI-TIMP-1 purificada a las membranas de superficie de las líneas celulares RCC-53, RCC-26 o A498 se demostró mediante la incubación de las líneas celulares con 700 ng/ml de TIMP-1-GPI purificado o proteína TIMP1 recombinante humana (rh) control durante una hora. A continuación, la proteína TIMP-1 asociada a la superficie se detectó usando FACS (figura 1A). La adición de TIMP-1rh control no inducía cambios en el desplazamiento del FACS, sin embargo, TIMP-1 anclado a GPI inducía una fuerte señal en superficie para TIMP-1.

Para demostrar que la proteína añadida exógenamente estaba anclada a GPI, las células RCC-53 se incubaron primero con proteína TIMP-1-GPI (200 o 700 ng/ml) y, a continuación, se trataron con 60 ng/ml de fosfolipasa C (PLC). El análisis por FACS demostró la pérdida completa de la señal en la superficie celular de TIMP-1 tras la digestión con PLC (figura 1B). Para medir la eficacia de la integración de TIMP-1-GPI, se recogió el TIMP-1 liberado de la membrana en los tampones de lavado y se cuantificó usando un ELISA específico para TIMP-1 (figura 1C). Los resultados muestran que se recuperaba el 66% del antígeno TIMP-1 inicial de la muestra de 200 ng/ml, mientras que podía recuperarse el 31% de la incubación con 700 ng/ml.

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Ejemplo 2

La proteína TIMP-1-GPI bloquea la liberación de proMMP-2 y proMMP-9 a partir de RCC-53

El aumento de la expresión de MMP-2 y MMP-9 se correlaciona con un mal pronóstico del RCC (Hemmerlein y col., 2004). La línea celular de carcinoma de células claras en estadio IV RCC-53 secretar de forma constitutiva proMMP-2 y proMMP (figura 2).El efecto del aumento de los niveles de TIMP-2 en superficie sobre la liberación constitutiva de proteínas MMP-2 y MMP-9 se comprobó usando ensayos de zimografía de gelatinasa (Djafarzadeh y col., 2004; Klier y col., 2001). La proteína TIMP-1rh a 600 o 1.200 ng/ml no tenía efecto sobre la secreción de proMMP-2 o proMMP-9. Por el contrario, comenzando con 10 ng/ml, el tratamiento con TIMP-1-GPI mostraba una disminución dependiente de la concentración de la liberación de proMMP-2 y proMMP-9 a los medios de cultivo.

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Ejemplo 3

El tratamiento con TIMP-1-GPI induce un aumento en la expresión de superficie de metaloproteinasas de la matriz.

En base a los resultados de los experimentos de zimografía de gelatinasa, es posible que TIMP-1-GPI pueda actuar para secuestrar las MMP de la superficie celular. TIMP-1 se une a las formas más activas de MMP, siendo las excepciones MMP-14 y MMP-16 (Brew y col., 2000; Lang y col., 2004). Tras la incubación de RCC-53 con 700 ng/ml de proteína TIMP-1-GPI durante 24 horas, los análisis por FACS usando anticuerpos específicos para MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15 y MMP-16 mostraron, con la excepción de MMP-14, un aumento de la intensidad media del canal de fluorescencia (IMF) para cada una de las MMP. La proteína TIMP-1rh control no tenía un efecto claro sobre la señal de FACS (datos no mostrados). No se detectó la expresión en superficie de otras proteínas, como MHC de clase I (pan clase I y HLA-A2) e ICAM-1, por el tratamiento con TIMP-1-GPI. La digestión de RCC53 tratadas con TIMP-1-GPI con PLC durante una hora (como se realizó en la figura 1) no mostraba aumento de las MMP (figuras 3A y 3B). El acúmulo de MMP sobre la superficie celular reflejaba la reducción de la secreción de proMMP-2 y proMMP-9 mostrada en la figura 2. Para comprobar adicionalmente este bloqueo aparente de la liberación de MMP, se realizaron experimentos de inmunotransferencia usando anticuerpos monoclonales dirigidos frente a MMP-1, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-12 y MMP-13 en los medios (sin suero) derivados de células RCC-53 control o células tratadas durante 24 horas con 700 ng/ml de TIMP-1rh o TIMP-1-GPI (figura 3c). La presencia de cada una de las MPP se detectó en los medios de las células RCC-53 control. La incubación con TIMP-1rh no eliminaba la secreción de las MMP. Por el contrario, parecía que TIMP-1-GPI bloquea completamente la liberación de cada MMP estudiada.

Para valorar el efecto de esta acumulación en superficie de MMP sobre la capacidad de las células para invadir la matriz extracelular (MEC), se comprobó la capacidad de migración/invasión de las células usando una ensayo de cámara de Boyden modificada con membranas recubiertas de MEC. La capacidad global de las células RCC-53 para invadir la MEC no era muy pronunciada (datos no mostrados). Para potenciar la invasión, se aplicaron niveles crecientes de factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) a los pocillos inferiores y los experimentos se realizaron durante 48 horas. Se observó una respuesta de invasión óptima con 4 ng/ml de VEGF (datos no mostrados) y esta respuesta se estableció con invasión basal o 0% de inhibición (figura 3D). Las células RCC-53 tratada previamente durante 30 minutos con 350 o 700 ng/ml de TIMP-1rh o TIMP-1-GPI se lavaron a continuación y se aplicaron en el pocillo superior de la cámara de Boyden. A continuación, se determinó el aumento o disminución relativos de la migración/invasión (véase Materiales y procedimientos). Mientras que el tratamiento con TIMP-1rh bloqueaba parcialmente la invasión de las células, TIMP-GPI a 700 ng/ml bloqueaba por completo la invasión de las células RCC-53 (figura 3D).

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Ejemplo 4

Efectos de TIMP-1 anclado a GPI sobre la proliferación de RCC

Para valorar el efecto de la ingeniería en superficie de TIMP-1 sobre la proliferación de RCC, se realizaron ensayos de MTT. Se encontró que la proteína TIMP-1-GPI añadida exógenamente inducía una disminución dependiente de la dosis de la proliferación de RCC-53 y A498 a las 24, 48 y 72 horas (figura 4B). Las células RCC-26 proliferan con extremada lentitud (velocidad de duplicación de + 48 h) y la tendencia general sugería una supresión de la proliferación (figura 4C). Controles adicionales usando fosfatidilinositol a una concentración molar equivalente del reactivo TIMP-1-GPI (Sigma, Alemania, nº P6636) no inducía cambios significativos en la proliferación de las células (datos no mostrados).

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Ejemplo 5

Citotoxicidad mediada por células

La actividad MMP se ha asociado a la sensibilidad de las células diana a la apoptosis inducida por la actividad de las células T citotóxicas (apoptosis mediada por perforina/granzima y por FAS) (Egeblad y Werb, 2002). El efecto de TIMP-1-GPI sobre la muerte dependiente de células de RCC se comprobó usando apoptosis inducida por CTL y células NK alogénicas. En los ensayos mediados por CTL alogénicos, las células diana RCC-53, A498 y RCC-26 se trataron con 700 ng/ml de TIMP-1rh o TIMP-1-GPI; a continuación se marcaron con Cr^{51} y se incubaron con CTL CD8+ alogénicos JB4 (figura 5A) o líneas celulares NK (figura 5B). Las líneas celulares de tumores RCC fueron reconocidas y eliminadas de forma eficaz tanto por los CTL como por las células NK. El tratamiento con TIMP-1 o TIMP-1-GPI no alteraba la susceptibilidad de las tres líneas RCC a la apoptosis mediada por CTL o por células NK.

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Ejemplo 6

El tratamiento con TIMP-GPI hace que las células RCC sean sensibles a la muerte mediada por FAS

Los experimentos con CTL/NK mostraron que el tratamiento con TIMP-1-GPI no influía en la ruta lítica mediada por perforina/granzima medido en el ensayo de liberación de cromo. Esta ruta actúa rápidamente usando la secreción de citotoxinas acumuladas para iniciar la apoptosis y representa uno de los principales mecanismos de muerte celular iniciada por el sistema inmunológico (Trapani y col., 2000). La segunda ruta implica la unión de FAS/CD95. Entonces, se determinó el efecto del tratamiento del TIMP-1-GPl sobre la apoptosis mediada por FAS.

La expresión de FAS en las líneas de RCC se valoró en primer lugar mediante citometría de flujo usando un Acm anti-FAS de no activación (L-958) (H. Engelmann, resultados no publicados). Las células no tratadas y las células tratadas con 700 ng/ml de TIMP-1-GPI o proteína TIMP-1rh control durante 24 h se tiñeron con L-958 y se analizaron. La proteína FAS se expresaba con intensidad en las tres líneas de RCC. El tratamiento con TIMP-1-GPI o TIMP-1rh no afecta a la expresión en la superficie celular de FAS (figura 6A).

El Acm anti-FAS L-957 puede inducir apoptosis en las células que expresan FAS (H. Engelmann, resultados no publicados). Se usó la unión de anexina V-fluoroisotiocianato (FITC) y la incorporación de yoduro de propidio (PI) en las células RCC después del tratamiento con L-957 para detectar la apoptosis mediante citometría de flujo. Como se muestra en la figura 6B, RCC-26 y RCC-53 eran muy resistentes a la apoptosis mediada por FAS. La intensidad de fluorescencia (IMF) de las células no tratadas y tratadas con L-957 era similar. Se observó un ligero aumento de la IMF en la línea RCC-53 en respuesta al tratamiento con L-957. Estas observaciones están en la línea de previas publicaciones en las que se describe que RCC generalmente es resistente a la apoptosis mediada por FAS (Frost y col., 2003). El tratamiento con TIMP-1-GPI (L-957 + TIMP-1-GPI), pero no el control TIMP-1rh (L-957 + TIMP-1rh), hace a las líneas celulares sensibles a la apoptosis mediada por FAS (figura 6B). Se encontró que A498 era más sensible al Acm anti-FAS de activación (detectado por el aumento de anexina-IMF en las muestras tratadas con L-957), el tratamiento con TIMP-1-GPI, pero no con TIMP-1 rh, potenciaba significativamente la apoptosis de las células A498.

Mientras las células RCC-26 y A498 mostraban un aumento drástico en la apoptosis inducida por FAS tras el tratamiento con TIMP-1-GPI, la línea celular RCC-53 mostraba un aumento menos pronunciado en la sensibilidad (variación en IMF de 62 a 93). Para confirmar la apoptosis de RCC-53 inducida por TIMP-1-GPI/FAS, se empleó un segundo ensayo ELISA basado en la detección de cromatina citoplasmática. Las ventajas de este ensayo incluyen la falta de subjetividad en la interpretación de los resultados y su aumento de sensibilidad en relación con la tinción con anexina V. El ELISA para cromatina es capaz de detectar tan sólo 300 células apoptóticas y mide acontecimientos de apoptosis muy posteriores con respecto a la presencia temprana de anexina V sobre la superficie celular. Como se encontró en el análisis de la anexina V por FACS (figura 6B), el tratamiento de RCC-53 sólo con L-957 inducía un ligero aumento de la apoptosis (figura 6C). Sin embargo, el tratamiento de células RCC-53 con TIMP-1-GPI aumentaba drásticamente la sensibilidad de las células a la apoptosis inducida por FAS en forma dependiente de dosis.

Los resultados demuestran que el tratamiento de las células cancerosas con TIMP anclado a GPI tenía efecto matando las células cancerosas mediante apoptosis inducida por FAS. Por tanto, TIMP anclado a GPI es útil como agente antitumoral.

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Ejemplo 7

El tratamiento con TIMP-1-GPI de RCC reduce la expresión de la proteína BCL-2 y aumenta la de BAX

Las proteínas BLC-2 representan una familia de proteínas implicadas en el control de la apoptosis (revisado en Igney y Krammer, 2002). Algunos miembros de esta familia (como BCL2 Y BCL-XL) son antiapoptóticos mientras que otros (como Bad o BAX) son proapoptóticos. La sensibilidad de las células a los estímulos apoptóticos puede depender del equilibrio entre miembros pro y antiapoptóticos de la familia BCL2 (Igney y Krammer, 2002). Entonces, se determinó el efecto del tratamiento con TIMP-1-GPI sobre la expresión de BCL-2 y BAX Después de una incubación previa de 24 h con 700 ng/ml de TIMP-1-GPI o TIMP-1rh control, las células RCC se estimularon con 1 \mug/ml de L-957 (o Acm control) durante 16 h más. El nivel de proteínas BCL-2 y BAX se determinó a continuación usando FACS intracelular e inmunotransferencia. En las tres líneas celulares, el tratamiento con TIMP-1-GPI aumentaba la expresión de BAX proapoptótico y disminuía la expresión de BCL-2 antiapoptótico. Se observó un patrón similar en los ensayos de inmunotransferencia (figuras 7A, B y C).

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Ejemplo 8

Incorporación de TIMP-1-mucina-GPI añadida exógenamente sobre la membrana superficial de RCC-53

La proteína TIMP-1-mucina-GPI se generó y aisló como se describe en el ejemplo 1. La presentación de proteína GPI-TIMP-1 purificada sobre las membranas de la superficie de las líneas celulares RCC, RCC-53, RCC-26 o A498, se demostró mediante incubación de las líneas celulares con 700 ng/ml de TMP-1-mucina-GPI purificada, TIMP-1-GPI purificado o proteína TIMP-1 recombinante humana (rh) control durante una hora. A continuación, la proteína TIMP-1-mucina-GPI asociada con la superficie fue detectada mediante FACS. La construcción TIMP-1-mucina-GPI se incorporó de forma eficaz sobre la membrana de la superficie y promueve de manera eficaz actividad antitumoral.

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Ejemplo 9

TIMP-GPI para el tratamiento del cáncer residual en un individuo

Los reactivos TIMP-1-GPI o TIMP-mucina-GPI se aplican a una concentración de 1 \mug/ml a nivel local en el área de resección después de la escisión quirúrgica del tumor. Un tumor no operable, el glioblastoma (astrocitoma de grado IV según la OMS) se elimina quirúrgicamente y los reactivos se colocan antes del cierre de la herida.

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Ejemplo 10

TIMP-GPI para el tratamiento del cáncer residual en un individuo

Se aplica una cantidad de TIMP-1-GPI o TIMP-mucina-GPI a 1 \mug/ml a nivel local en el área de resección después de la escisión quirúrgica del tumor. El tumor, un cáncer de mama en estadio avanzado, se extirpa mediante cirugía y los reactivos se aplican antes del cierre de la herida, especialmente si existe un riesgo clínico de recaída local.

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Ejemplo 11

Evaluación de TIMP-GPI en modelos de metástasis tumoral

Se evaluó el efecto de TIMP-1-GPI sobre la metástasis tumoral se. Usando un modelo murino, se trató previamente un linfoma de células T que se metastatiza de manera eficaz al hígado con o bien TIM P-1-GPI o proteína de control TIMP-1 rh. El tumor resultante se administró después mediante la vena en la cola, y la distribución del tumor en el hígado se determinó tres y siete días después. Los resultados demuestran que las células tratadas con TlMP-1-GPI muestran un nivel significativamente reducido de micrometástasis con relación a las células tratadas con TIMP.

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Ejemplo 12

Ensayos de invasión de Matrigel

El efecto de TIMP-1-GPI sobre las líneas celulares del Ejemplo 11 se ensayó en una serie de experimentos de Matrigel. Los resultados confirmaron que TIMP-1-GPI tenía un efecto profundo sobre la capacidad de las líneas celulares de las células T para superar la invasión de Matrigel con relación a TIMP-1 rh.

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Ejemplo 13

Efecto de las construcciones de fusión de TIMP sobre la producción de fibronectina de fibroblastos

Se cultivaron fibroblastos confluentes en la presencia o ausencia de TIMP-1 rh y TIMP-1-GPI. La expresión y fibronectina secretada se cuantificó mediante análisis de inmunotransferencia usando anticuerpos anti fibronectina (\beta-actina servía como control): la Figura 9 muestra los resultados de este experimento y claramente demuestra que TIMP-1 rh (a 700 ng/ml) no condujo a cualquier disminución significativa en la expresión de fibronectina, mientras que TIMP-1-GPI (a 700 ng/ml) redujo fuertemente la fibronectina que se secretó por los fibroblastos.

De manera adicional, el ARN de fibronectina transcrito por fibroblastos se valoró mediante análisis de transferencia Northern. Fibroblastos se cultivaron en presencia (Figura 10A) o ausencia (Figura 10B) de 10 ng/ml del TNF-\alpha que activa fibroblastos conjuntamente con 350 ng/ml de TIMP-1-GPI o 700 ng/ml de TIMP-1-GPI, TIMP-1-GPI desnaturalizado y TIMP-1 rh-GPI, respectivamente. Además, o bien 0%, 1%, 5% ó 10% de FCS estaban presentes en el medio de cultivo.

Estos resultados demuestran claramente que a una concentración de 350 ng/ml de TIMP-1-GPI, el ARN de fibronectina transcrito se redujo significativamente, independientemente de si TNF-\alpha estaba presente en el medio o no, e independientemente del contenido de FCS del medio. A 700 ng/ml de TIMP-1-GPI, ARN de fibronectina era apenas detectable.

De este modo, la construcción de fusión de TIMP-GPI inhibe de manera eficaz tanto la síntesis como la secreción de la fibronectina del factor de crecimiento en fibroblastos.

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Ejemplo 14

Efecto de construcciones de fusión de TIMP sobre la producción de IL-6 de fibroblastos

El análisis de transferencia Northern del Ejemplo 13 se repitió usando una sonda para ARN de IL-6. De este modo, fibroblastos se cultivaron en la presencia (Figura 11 A) o ausencia (Figura 11 B) de 10 ng/ml del TNF-\alpha que activa fibroblastos conjuntamente con 350 ng/ml de TIMP-1-GPI o 700 ng/ml de TIMP-1-GPI, TIMP-1-GPI desnaturalizado y TIMP-1 rh-GPI, respectivamente. Además, o bien 0%, 1%, 5% o 10% FCS estaban presentes en el medio de cultivo (Figura 11).

Los resultados claramente demuestran que ya a una concentración de 350 ng/ml de TIM P-1-GPI, el ARN transcrito de IL-6 se redujo notablemente independientemente de si TNF-\alpha estaba presente en el medio, e independientemente del contenido en FCS del medio.

De este modo, la construcción de fusión de TIMP-GPI inhibe de manera eficaz la síntesis y secreción de otra citosina importante implicada en la cicatrización de heridas, a saber IL-6, en fibroblastos.

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Ejemplo 15

Efecto de las construcciones de fusión de TIMP sobre la producción de colágeno por fibroblastos

El análisis de transferencia Northern realizado en los Ejemplos 13 y 14 se repitió usando sondas para el Colágeno 1A1 (Figura 12A y B), Colágeno 4A2 (Figura 12E y D), y Colágeno 16A1 (Figura 12E y F), respectivamente. De este modo, los fibroblastos se cultivaron en la presencia (Figuras 12A, C, E) o ausencia (Figura 12B, D, F) de 10 ng/ml del TNF-\alpha que activa fibroblastos conjuntamente con 350 ng/ml de TIMP-1-GPI o 700 ng/ml de TIMP-1-GPI desnaturalizado, TIMP-1-GPI y TIMP1-PI rh respectivamente. Además, o bien 0%, 1%, 5% o 10% FCS estaban presentes en el medio de cultivo.

Los resultados claramente demuestran que ya a una concentración de 350 ng/ml de TIMP-1-G PI, los tres ARN de colágeno se redujeron significativamente, independientemente de si TNF-\alpha estaba presente en el medio, e independientemente del contenido del contenido de FCS del medio.

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De este modo, la construcción de fusión TIMP-GPI inhibe de manera eficaz la síntesis y secreción de colágeno, que es una proteína esencial en la producción de ECM y remodelación de tejidos.

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Ejemplo 16

Efecto de construcciones de fusión de TIMP en la producción de TGF-\beta por fibroblastos

El análisis de transferencia Northern de los Ejemplos 13-15 se repitieron usando las sondas para TG F-\beta. De este modo, fibroblastos se cultivaron en la presencia (Figura 13A) o ausencia (Figura 13B) de 10 ng/ml de TNF-\alpha que activa fibroblastos conjuntamente con 350 ng/ml de TIMP-1-GPI o 700 ng/ml de TIMP-1-GPI, TIMP-1-GPI desnaturalizado y TIMP-1 rh-GPI, respectivamente. Además, o bien 0%, 1%, 5% o 10% FCS estaba presente en el medio de cultivo.

Los resultados claramente demuestran que ya a una concentración de 350 ng/ml de TIMP-1-G PI, casi no se pudo detectar ARN de TGF-\beta independientemente de si TNF-\alpha estaba presente en el medio o no, e independientemente del contenido de FCS del medio.

Por lo tanto, como se ilustra en el ejemplo anterior, la construcción de fusión TIMP-GPI inhibe de manera eficaz la síntesis y secreción de incluso otra citocina importante implicada en la cicatrización de heridas, a saber TGF-\beta, en fibroblastos.

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Ejemplo 17

Generación de construcciones de fusión de TIMP adicionales

Además las construcciones de fusión de TIMP se generaron y se purificaron de acuerdo con la sección "Materiales y Procedimientos", proporcionados más adelante. Específicamente, una construcción de fusión TIMP-1-GPI (SEQ ID NO:1), una construcción de fusión TIMP-1-muc-GPI truncada (SEQ ID NO:2), una construcción TIMP-2-GPI (SEQ ID NO:3), una construcción TIMP-3-GPI y una forma mutada de la TIMP-3-GPI (SEQ ID NO:4), y una construcción de fusión TIMP-1-fractalcina-GPI truncada (SEQ ID NO:5), se construyeron se expresaron y se purificaron.

La construcción de fusión TIMP-1-GPI truncada (SEQ ID NO: 1) comprende los primeros 152 aminoácidos de la proteína TIMP-1 (es decir los aminoácidos C-terminal 126-207 se suprimieron) condensada a un anclaje de GPI -de 36 aminoácidos de longitud. La construcción de fusión TIMP-1-muc-GPI truncada (SEQ ID NO: 2) contiene los primeros 152 aminoácidos de la proteína TIMP1 humana condensada a los aminoácidos 256-380 de la CXCR16 (mucina) humana además condensada a un anclaje GPI de 36 aminoácidos de longitud. La construcción de fusión resultante contiene 295 aminoácidos y tiene un peso molecular de 32,111 kDa.

Por analogía a la TIMP-1-GPI de longitud completa la TIMP-2-GPI (SEQ ID NO.:3) y TIMP-3-GPI consta de la proteína TIMP-2 y TIM P-3 humana, respectivamente, condensada a un anclaje de GPI de 36 aminoácidos de longitud. Para producir la forma mutada de la construcción de fusión TIMP-3-GPI (SEQ ID NO:4), el dominio de unión de GAG de la TIMP-3 humana, se cree que es responsable de la asociación de la proteína con la superficie celular, se mutó por los seis cambios siguientes: R43A, K45A, K49A, K53A, K65A, y K68A. La construcción de fusión TIMP-1-fractalcina-GPI truncada (SEQ ID NO:5) contiene la parte N-terminal de la TIMP-1 humana (aminoácidos 1-152) condensada a los aminoácidos 100-342 de la CX3CL1 humana, además condensada al anclaje de GPI de 36 aminoácidos de longitud.

Examen detallado de las construcciones TlMP-1-GPI truncada (SEQ ID NO: 1), la TlMP-1-mucina-GPI truncada (SEQ ID NO: 2) y la TlMP-1-fractalcina-GPI truncada (SEQ ID NO: 5)

a) Incorporación de TIMP-1-GPI truncada añadida exógenamente, TIM P-1-mucina truncada: GPI y TIMP1-fractalcina-GPI truncada en la superficie celular

TIMP-1-GPI truncada, TIMP-1-mucina-GPI truncada y TIMP-1-fractalcina-GPI truncada se generaron y se aislaron de acuerdo con Djafarzadeh et al, 2004. La incorporación de construcciones de fusión purificadas en las membranas de la superficie celular de las líneas celulares RCC-53, RCC-26 o A498 RCC se demuestra mediante la incubación de las líneas celulares una hora con 700 ng/ml de TIMP-1-GPI purificada truncada, TIMP-1-mucina-GPI truncada y TIMP-1-fractalcina-GPI truncada, respectivamente, y se comparada con la TIMP-1 truncada proteína de TIMP-1 control que carece de dominios mucina, fractalcina y GPI. La proteína asociada a superficie se detectó después usando análisis FACS. Se esperaba que la adición de TIMP-1 de control no conduciría a ningún cambio en el desplazamiento FACS, sin embargo, la TIM P-1-GPI truncada, TIMP-1-mucina-GPI truncada y TIMP-1-fractalcina-GPI truncada, respectivamente, de hecho dio como resultado una fuerte señal en la superficie para TIMP-1.

Para demostrar que la proteína añadida exógenamente estaba anclada a GPI, se incubaron primero células RCC-53 con TIMP-1-GPI truncada, TIMP-1-mucina-GPI truncada y TIMP-1-fractalcina-GPI truncada, respectivamente (200 ó 700 ng/ml), y después se trató con 60 ng/ml de fosfolipasa C (PLC). El análisis FACS se esperaba que mostrara una pérdida completa de la señal de superficie celular de TIMP-1 seguido de la digestión de PLC. Para medir la eficiencia de la integración de las construcciones TIMP ancladas, las construcciones TIMP-1 sin la membrana se recogieron en los tampones de lavado, y se cuantificaron usando ELISA específico de TIMP-1. Se esperaba que la mayoría del antígeno TIMP-1 de partida se recuperaría de la muestra de 200 ng/ml.

b) Proteínas de TIMP-1-GPI truncada, TIM P-1-mucina-GPI truncada, y TIM P-1-fractalcina-GPI truncada bloquea la liberación de proMMP-2 y proMMP-9 a partir de RCC-53

Un aumento de la expresión de MMP-2 y MMP-9 se correlaciona típicamente con la prognosis de RCC (Hemmerlein et al, 2004). La línea celular pura de carcinoma de fase IV carcinoma RCC-53 consecutivamente secreta tanto proMMP-2 como proMMP-9 (Figura 2). El efecto de incremento de los niveles de TIMP-1 en la liberación consecutiva de las proteínas MMP-2 y MMP-9 se ensayó usando ensayos de zimografía (Djafarzadeh et al, 2004; Klier et al, 2001). La proteína TIMP-1 rh a 600 ó 1200 ng/ml no tenía efecto en la secreción de proMMP-2 o proMMP-9. Por el contrario, partiendo de 10 ng/ml, el tratamiento con TIMP-1GPI truncada, TIMP-1-mucina-GPI truncada y TIMP-1-fractalcina-GPI truncada, respectivamente, se esperaba que se mostrara una disminución dependiente de concentración de tanto la liberación de proMMP-2 como proMMP-9 en el medio de cultivo, comparable con el tratamiento de TIMP-1-GPI descrito en el Ejemplo 2.

c) Proteínas TIMP-1-GPI truncada, TIM P-1-mucina-G PI truncada, y TIM P-1-fractalcina-GPI truncada impactan en la proliferación de RCC

Para valorar el efecto de la modificación por ingeniería genética de la superficie de TIMP-1 en la proliferación de RCC, se realizaron ensayos de MTI. Las proteínas TIMP-1-GPI truncada añadida exógenamente, TIMP-1-mucina-GPI truncada y TIMP-1-fractalcina-GPI truncada, respectivamente, se esperaba que indujeran una disminución dependiente de la dosis en la proliferación de RCC-53 y A498 a 24, 48 y 72 horas comparable con el Ejemplo 4. Células RCC-26 se esperaba que proliferaran extremada y lentamente (velocidad de duplicación 48+ h); por supuesto la tendencia general sugirió una supresión de la proliferación.

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Ejemplo 18

Evaluación posterior de las construcciones de fusión adicionales del Ejemplo 17

Los experimentos de los Ejemplos 1-16 se repitieron usando las construcciones de fusión del Ejemplo 17; se esperaron resultados similares. En particular, las construcciones de fusión TIMP-2 inhibieron la mayoría de las MMP (excepto MMP-9) y de manera preferente inhibían MMP-2. Las construcciones de fusión TIMP-3 inhibían MMP-1, -2, -3, -9, y 13, así como TACE. El mutante de la construcción de fusión TIMP-3 (SEQ ID NO.:4) se examinó con respecto a sus propiedades de integración, que adicionalmente mostraron una mejora en la capacidad de integrarse en la membrana celular (estos experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con los procedimientos proporcionados en el Ejemplo 8). Las construcciones de fusión de TIMP-1 truncada (SEQ ID NOs: 1, 2, 5) mostraron funciones biológicas similares comparado con las construcciones de fusión de TIM P-1 de longitud completa, soportando de este modo la idea que la parte N-terminal de las TIMP es esencial para su función inhibitoria. La construcción de fusión de fractalcina (SEQ ID NO:5) además mostró una capacidad de integración en membrana comparable a la de la construcción de fusión de mucina (SEQ ID NO.:4).

Discusión de los resultados

La ingeniería de la superficie celular usando proteína ancladas a GPI según la presente invención ofrece varias ventajas sobre los enfoques de transferencia génica tradicionales. 1) El procedimiento se aplica a células que son difíciles de transfectar, p. ej., células RCC resistentes a la apoptosis mediada por FAS, y también a cultivos primarios, progenitores de médula ósea y células del sistema inmunológico. 2) El procedimiento puede usarse cuando se disponga sólo de un pequeño número de células o cuando las células no puedan propagarse fácilmente. 3) Puede modificarse la superficie celular independientemente del tipo de célula. 4) La cantidad de proteína expresada finalmente en la superficie celular puede ser controlada con precisión. 5) Pueden incorporarse secuencial o simultáneamente múltiples proteínas ancladas a GPI en la misma célula.

El RCC humano es un tumor progresivo con opciones terapéuticas limitadas debido a la resistencia del tumor a agentes quimioterapéuticos actuales y a la radiación. Las inmunoterapias son beneficiosas para algunos pacientes, lo que sugiere que el RCC puede ser diana de mecanismos inmunológicos efectores. A menudo se observan linfocitos infiltrantes del tumor, como CTL CD8+ o células NK en los tejidos cancerosos renales y, a menudo, reconocen células tumorales autólogas cuando se prueban in vitro (revisado por Schendel y col., 1997). A pesar de estas observaciones prometedoras, generalmente los tumores continúan creciendo, lo que indica que RCC podría haber adquirido resistencia a mecanismos citotóxicos. Para que tenga lugar una respuesta antitumoral productiva, el sistema inmunológico debe, no sólo reconocer el tumor, sino que las células cancerosas también deben ser susceptibles a los mecanismos de muerte utilizados por los CTL y las células NK. Las células cancerosas han desarrollado varios mecanismos para evadir las defensas inmunológicas, como la reducción de la sensibilidad a la apoptosis (revisado por Dunn y col., 2004).

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Los CTL y las células NK matan a sus células diana mediante apoptosis dependiente de perforina/granzima o FAS/FASL (Kagi y col., 1994). La importancia relativa de la exocitosis de gránulos frente a las actividades líticas mediada por FAS/FASL para el control tumoral in vivo es controvertida. Mientras que muchos estudios señalan una dominancia del mecanismo de exocitosis de gránulos, otros en los que se utilizan ratones que no expresan perforina (Seki y col., 2002) sugieren que la apoptosis dependiente de FAS puede constituir in vivo una ruta más destacada. La mayoría de las células tumorales, incluso RCC, son intrínsecamente resistentes a la muerte mediada por FAS (Frost y col., 2003). El uso de TIMP anclado a GPI representa una aproximación terapéutica prometedora para hacer que las células tumorales sean susceptibles a la apoptosis mediada por FAS.

Los inventores han mostrado en la presente invención que la ingeniería de células mediante la adición exógena de GPI-TIMP-1 puede provocar el aumento de las actividades biológicas de TIMP-1 así como inducir nuevas actividades. La TIMP-1-GPI administrada exógenamente se inserta de forma eficaz en las membranas celulares de las células RCC e induce una variedad de efectos biológicos en las líneas de RCC con posible importancia terapéutica.

Además, la proteína TIMP-1 anclada a GPI altera drásticamente la asociación en la superficie celular de diversas MMP expresadas en RCC. Esta se reflejaba en una reducción de la secreción de MMP, como proMMP-2 y proMMP-9, por las células RCC. Mientas que TIMP-1 bloqueará la actividad enzimática de MMP-2, no se cree que se una a la proforma de la enzima. Aun más, los datos que demuestran un bloqueo de la secreción de proMMP-2 tras el tratamiento con TIMP-1-GPI sugieren esta acción. Parece que la acción de un anclaje GPI a TIMP-1 induce una estequiometría de la superficie alterada que potencia la capacidad de la proteína TIMP-1 para unirse a MMP.

Este aumento aparente de la unión de TIMP-1-GPI también se demostró con las MMP de tipo membrana. Aunque no se sabe demasiado sobre la asociación de TIMP-1 con MMP-15, podría preverse que no se producirá la unión de la proteína TIMP-1-GPI a MMP-16 en base a la más que pobre avidez de TIMP-1 nativo por este proteína (Lang y col., 2004). El análisis mutacional de los lazos críticos de TIMP-1 para la unión con MMP16 muestra que cambios pequeños, aparentemente insignificantes en TIMP-1 pueden cambiar drásticamente sus características inhibidoras/de unión. En este caso, la estequiometría alterada de TIMP-1 sobre la superficie celular parece haber sido suficiente para cambiar su unión a MMP-16. El secuestro de MMP sobre la superficie celular también se asoció con una reducción de la capacidad de la línea celular RCC-53 para sufrir la invasión de la MEC.

Como se demuestra en la presente invención, el tratamiento con TIMP-1-GPI lleva a una reducción pronunciada dependiente de dosis en la proliferación de las líneas RCC. Quizás más significativamente, las líneas RCC normalmente resistentes a la apoptosis por FAS se convertían en sensibles a la muerte mediada por FAS/CD95 tras el tratamiento con la proteína TIMP-GPI de la invención. Sin embargo, el agente no afectaba a la sensibilidad a la ruta de la perforina. Esto sugiera que el efecto antitumoral de TIMP anclado a GPI está mediado por la ruta de apoptosis inducida por FAS en lugar de por la muerte mediada por perforina/granzima mediante CTL/células NK.

La ruta de apoptosis mediada por FAS está regulada por la activación de caspasas, mientras que el daño de la membrana celular por CTL/NK mediante la exocitosis de gránulos, según determina la prueba de liberación de cromo, ocurre independientemente de las caspasas (Sayers y col., 1998; Seki y col., 2002; Trapini y col., 2000). Los acontecimientos anteriores que llevan a la activación de la caspasa implican al equilibrio entre las proteínas pro y antiapoptóticas de la familia BLC-2. Como se demuestra en la presente invención, el tratamiento con GPI-TIMP-1 daba lugar a una regulación por disminución de la proteína antiapoptótica BCL2 y el aumento correspondiente de la proteína proapoptótica BAX. Este cambio hacia una concentración mayor de proteínas proapoptóticas puede ser una de las razones del aumento de la sensibilidad a la apoptosis mediada por FAS de las células RCC cuya superficie ha sido modificada por ingeniería con TIMP-1. Estas observaciones representan una nueva acción para TIMP-1. También se han observado acciones similares para TIMP-3 y otros TIMP (TIMP-2 y TIMP-4) (datos no mostrados).

Se encontró que la sobreexpresión de TIMP-1, 2 o 3 en células de músculo liso vascular usando vectores adenovirales inhibía su migración a través del modelo de membranas basales. La sobreexpresión de TIMP-1 no tenía efecto sobre la proliferación celular, mientras que TIMP-2 causaba una inhibición dependiente de dosis de la proliferación celular. La sobreexpresión de TIMP-3 también causa una inhibición dependiente de dosis de la proliferación y, además, conduce a apoptosis mediante la despolarización de la membrana mitocondrial y liberación de citocromo C (Baker y col., 1999; Baker y col., 1998; Smith y col., 1997). TIMP-3 es la única proteína TIMP que se une selectivamente a la superficie de las células, independiente de la asociación con otras proteínas de superficie (Majid y col., 2002; Smith y col., 1997). Dirigiendo TIMP-1 a las superficies celulares mediante un anclaje GPI se llega a nuevas acciones biológicas que parecen mimetizar los efectos descritos para TIMP-3.

Se ha mostrado que TIMP-3 sensibiliza a las células de melanoma a la apoptosis inducida mediante anticuerpo anti-FAS, TNF-alfa y TRAIL. El mecanismo de acción estaba relacionado con una estabilización general de FAS, TNF-RI y TRAIL-RI sobre la superficie de las células de melanoma tratadas con TIMP-3 (Ahonen y col., 2003). Este aumento de la expresión superficial de los receptores se relacionó con la activación de la caspasa-8 y la caspasa-3 (Ahonen y col., 2003).

En los experimentos detallados en la presente invención, las células RCC no mostraban cambios en la expresión en superficie de FAS tras el tratamiento con TIMP-1-GPI (figura 6A). Además, las células RCC seguían siendo resistentes a la apoptosis inducida por TNF-\alpha (probado para 100 a 10.000 unidades por ml) independientemente del tratamiento con TIMP-GPI (datos no mostrados). El análisis por FACS de las células RCC mostraba posteriormente niveles prácticamente indetectables de TNF-RI (p55) y TNF-RII (p75) en RCC-53 y ausencia de expresión en las líneas RCC-26 o A498 (datos no mostrados). La expresión en superficie no cambiaba con el tratamiento con TIMP-1-GPI. Por tanto, el aumento de la sensibilidad a la apoptosis mediada por FAS tras el tratamiento con TIMP-1-GPI no parecía estar mediado a través de una estabilización general de las proteínas receptoras de muerte de la superficie celular. Lo que está claro es que el tratamiento con TIMP-1-GPI altera el equilibrio de las proteínas Bcl-2 para provocar un perfil de expresión más "proapoptótico".

Los resultados presentados en la presente invención proporcionan una relación adicional entre la biología tumoral, la función de MMP/TIMP y las rutas de apoptosis. La unión de las proteínas TIMP a GPI, directamente o a través de dominios de mucina representa un potente agente antitumoral para hacer que las células tumorales normalmente resistentes a la apoptosis inducida por FAS, sean sensibles a la apoptosis inducida por FAS. Mediante este mecanismo las células tumorales se eliminarán de forma eficaz.

Con relación al uso de las construcciones de fusión - en particular, la construcción TIMP-1-GPI, la construcción TIMP-1-muc-GPI y las establecidas en las SEQ ID NOs:1, 2, 3, 4 y 5 - en el campo de la medicina regenerativa, por ejemplo, cicatrización de heridas, las construcciones TIMP-GPI de la presente invención se han mostrado en el presente documento que inhibe de manera eficaz la producción y secreción de importantes enzimas y citocinas (fibronectina, colágeno, IL-6, TGF-\beta) implicadas en el proceso de remodelación de tejidos y fibrosis que conduce a un incremento en la producción de ECM. De este modo, los miembros de la familia TIMP (TIMP-1, TIMP-2, TIMP3, TIMP-4), si están ancladas en la membrana celular por medio de un anclaje de GPI o una mucina o una fractalcina y una GPI, se pueden usar para modular de manera eficaz los procesos de cicatrización de heridas influenciando el equilibrio delicado entre la producción de ECM y la obtención de ECM.

Materiales y procedimientos Líneas celulares y cultivos celulares

Las líneas de RCC, RCC-53 y RCC-26, fueron obtenidas por D.J.S. (Munich, Alemania) a partir de muestras de pacientes. Las células RCC-53, RCC-26 y A498 (American Type Culture Collection) (Giard y col., 1973) se cultivaron en medio RPMI1640 (GIBCO BRL, Life Technologies GmbH, Eggenstein, Alemania) suplementado con L-glutamina 2 mM (Biochrom KG, Berlín), piruvato sódico 1 mM (GIBCO BRL, Life Technologies GmbH, Eggenstein, Alemania), 12% de SFT inactivado por calor (Biochrom KG, Berlín, Nº S0115). Se proporcionó medio recién preparado cada tres días y los cultivos se dividieron cuando las células entraban en confluencia.

Células citotóxicas efectoras: JB4 es una clon de células T citotóxicas efectoras alloreactivo HLA-A2 obtenido en nuestras instalaciones (E.N.) y se expande mediante estimulación quincenal como se ha descrito (Milani y col., 2005). Se usa en ensayos de citotoxicidad los días 7 u 8 después de la estimulación. Las líneas NK leucémicas humanas, NKL (Robertson y col., 1996) y NK-92 (Gong y col., 1994) fueron proporcionadas amablemente por C. S. Falk (GSF-Institute of Molecular Inmunology, Munich, Alemania) y se cultivaron en medio que contenía SFT inactivado por calor al 15% y 100 U/ml de IL-2 recombinante. El día antes de su uso en los ensayos de citotoxicidad, el cultivo se ajustó a 0,3 x 10^{6} células/ml en medio recién preparado.

Análisis por separación de células activadas por fluorescencia (FACS)

Las células se despegaron con EDTA 1,5 mM (Biochrom A, Berlín, Alemania, Nº L2113) en PBSx1 y se incubaron durante 60 min en hielo con anticuerpos específico para proteínas humanas; TIMP-1 (IM32L), MMP-1 (IM35L-100), MMP-3 (IM36L-100), MMP-8 (IM38L) (CALBIOCHEM, Merck Darmstadt, Alemania); MMP-9 (IM 61-100), MMP-2 (IM 51L) (ONCOGENE, Bad Soden, Alemania); MMP-7 (MAB907), MMP-12 (MAB917), MMP-14 (MAB9181) (R&D Systems, Minneapolis, EE.UU.); MMP-13 (IM44L), MMP-15 (IM48L), MMP-16 (IM50L) (CALBIOCHEM, Merck Darmstadt, Alemania) e IgG1_{\kappa} (SIGMA-ALDRICH, Taufkirchen, Alemania, Nº M9269) Los anticuerpos frente a ICAM-1 y HLA (W6/32 y HB82) se han descrito previamente (Johnson y col., 1988; Barnstable y col., 1978; Parham y Brodsky, 1981). Los anticuerpos anti-FAS (H. Engelmann, datos no publicados), anti-TNF-RI, anti-TNF-RII y control de isotipo se usaron como se ha descrito (Bigda y col., 1994). Las células se lavaron tres veces con PBSx1, se incubaron con Acm de burro anti-ratón conjugado con FITC (DAKO A/S, Glostrup, Dinamarca, Nº F0313) durante 45 min en hielo, a continuación se lavó tres veces con PBSx1 y se analizó usando un citómetro de flujo (FACSCalibur, Becton Dickinson and Company, San José, CA, EE.UU.) y el software Cell Quest. Los anticuerpos Anti-BCL-2 (ALX-804-225) y anti-BAX (ANC-357-040) se obtuvieron de ALEXIS (Grunberg, Alemania).

Purificación de la proteínas TIMP-1-GPI

La proteína TIMP-1-GPI se obtuvo y purificó como se ha describo previamente (Djafarzadeh y col. 2004). Brevemente, TIMP-1 humano se clonó a partir del ADNc usando cebadores específicos de TIMP-1h, se fusionó sin codón de parada de la traducción a la secuencia señal de GPI clonada de LFA-3 (Kirby y col., 1995; Medof y col., 1996) y se subclonó en pEF-DHFR, se introdujo de forma estable en células de ovario de hámster chino (CHO) deficientes en DHFR y se seleccionó como se ha descrito (Mack y col., 1995). La proteína de fusión TIMP-1-GPI se purificó a partir de las células CHO mediante extracción con detergente Triton X-100 seguido de purificación en columna usando DEAE, heparina-sefarosa y exclusión molecular (Djafarzadeh y col., 2004).

ELISA para TIMP-1

Se usó un ELISA específico de TIMP-1 humano usando el protocolo aplicado según las indicaciones del fabricante (MAB970, R&D Systems) para controlar los niveles de TIMP-1 en solución. El Acm anti-TIMP-1 humano de recubrimiento (MAB970), Acm anti-TIMP-1 humana biotinilado de detección (BAF970) y la proteína TIMP-1rh (970-TM) se obtuvieron de R&D Systems GmbH (Wiesbaden, Alemania).

Incorporación de TIMP-1-GPI a las membranas celulares

Las células RCC-53 (5-10 x 10^{6} células/ml) se incubaron con 200 a 700 ng/ml de TIMP-1-GPIh purificada a 37ºC/CO_{2} al 5%. A continuación, las células se lavaron tres veces con PBS frío y se analizaron mediante FACS usando anticuerpos monoclonales específicos de TMP-1 (véase anteriormente)

Escisión del anclaje GPI mediante fosfolipasa C

Las células (5-10 x 10^{6} células/ml) se incubaron con 200 o 700 ng de TIMP-1-GPI o proteína TIMP-1rh en medio sin suero durante 1 h a 37ºC en CO_{2} al 5%. Las células se lavaron tres veces con PBS frío y se trataron con 60 ng/ml de fosfolipasa C específica de fosfatidilinositol (SIGMA-ALDRICH, Taufkirchen, Alemania, Nº 661-9) en medio sin suero durante 30 min a 37ºC/CO_{2} al 5%. Las células se lavaron tres veces y se recogieron todos los sobrenadantes.

Proliferación

Las células RCC-53, A498 o RCC-26 (30 x 10^{3}/100 \mul de medio) se cultivaron en placas de microvaloración de 96 pocillos durante 24 h en condiciones estándar para obtener células firmemente adheridas y creciendo de forma estable. Después de descartar los sobrenadantes, se añadieron a las células 50 \mul de medio que contenían TIMP-1-GPI, tampón o TIMP-1rh y se incubaron durante 24 a 72 h. A continuación, se añadieron 50 \mul de una solución de MTT (bromuro de 3,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenil-tetrazolio) (SIGMA-ALDRICH Taufkirchen, Alemania, Nº M2128). Después de 3 h de incubación, los cristales de formazán se disolvieron añadiendo 100 \mul de isopropanol y HCl 0,04 M. A continuación, se midió la absorbancia a 550 nm usando un lector de ELISA GENios plus TEC AN. Para cada experimento, se analizaron al menos 6 pocillos por condición experimental y punto temporal.

Zimografía

Las células RCC-53 se cultivaron en placas de 24 pocillos (5 x 10^{4} células/pocillo). El medio se cambió a las 24 h por medio sin suero que contenía TIMP-1rh o cantidades crecientes de TIMP-1-GPI y se incubaron durante 24 h, 48 h y 72 h. Los sobrenadantes celulares se analizaron mediante zimografía de gelatina usando geles de poliacrilamida-SDS al 10% (Invitrogen, Groningen, Holanda, Nº EC61755BOX) como se ha descrito (Djafarzadeh y col., 2004). Como control positivo se usó la enzima MMP-9 recombinante (Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia, Nº RPN2634).

Ensayo de invasión extracelular

El efecto del tratamiento con TIMP-1-GPI frente a TIMP-1rh sobre la capacidad de las células para invadir la matriz extracelular (MEC) se evaluó usando un ensayo comercial de invasión celular (Chemicon International Inc., Temecula, CA, Nº ECM 555). Se analizó en primer lugar la capacidad de las células RCC-53 para invadir la MEC. Las células invadidas en el fondo de la inserción se separaron, lisaron y detectaron mediante colorante CyQuant como se describe en el protocolo adjunto. Para potenciar la invasión se usaron niveles crecientes de factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF), de 2 ng/ml a 8 ng/ml. La migración óptima se observó con VEGF a 4 ng/ml (datos no mostrados). A continuación, se determinó el efecto del tratamiento con 350 ng/ml y 700 ng/ml de TIMP-1rh control o TIMP-1-GPI sobre la migración. Para cuantificar los posibles efectos de los agentes, la migración basal de las células RCC-53 con VEGF a 4 ng/ml se fijó como 0. El valor 100% de "inhibición" de la migración inducida por VEGF se estableció como la migración/invasión de las células RCC-53 en ausencia de VEGF. Los efectos resultantes del tratamiento con TIMPrh o TIMP-1-GPI sobre la invasión RCC-53 se calcularon como la variación en el porcentaje (negativo o positivo) con respecto al valor "máximo".

Detección de apoptosis por anexina V

La detección y cuantificación de células apoptóticas frente a necróticas a nivel de una única célula se realizaron usando un kit de tinción de anexinA-V-FLUOS (Becton, Dickinson and Company, Heidelberg, Alemania, Nº 556547). Las células RCC-53 se sembraron en placas de 24 pocillos a 1 x 10^{6} células/pocillo y se permitió que se pegaran durante una noche. A continuación, los pocillos se lavaron 3 veces con PBSx1 y se añadió 1 ml de medio RPMI 1640 sin suero, seguido de 700 ng/ml de TIMP-1-GPI o TIMP-1rh. Las células se incubaron durante 24 h a 37ºC/CO_{2} al 5%. Después de 24 h, se añadió el Acm L-957 anti-FAS de activación (H. Engelmann, datos no publicados) o control de isotipo y las células se incubaron otras 16 h a 37ºC/CO_{2} al 5%. Las células se lavaron con PBS, se centrifugaron y resuspendieron en solución de tinción (reactivo de marcaje anexina-V-fluoresceína y yoduro de propidio (PI) en tampón Hepes) durante 15 min a temperatura ambiente. A continuación, las células se analizaron mediante citometría de flujo. Un estudio de evolución temporal mostraba que la unión de anexina V en células RCC precedía a la reactividad de PI.

Medida de la apoptosis mediante ELISA específico de cromatina

La apoptosis se midió usando el kit de ELISA Plus para detección de muerte celular de Roche (Pensberg, Alemania, Nº 1774425). Las células RCC-53 se sembraron en placas de 96 pocillos a una concentración de 4 x 10^{4} células/pocillo y se dejó que se pegaran durante una noche. Los pocillos se lavaron 3 veces con PBSx1 y se añadieron 200 \mul de medio RPMI 1640 sin suero a cada pocillo, seguido de 700 ng/ml de TIMP-1-GPI o TIMP-1rh. Las células se incubaron durante 24 h a 37ºC/CO_{2} al 5%. Después de 24 h de incubación con TIMP-1-GPI o TIMP-1rh, se añadió 1 \mug/ml de Acm L957 anti-FAS de activación o Acm control de isotipo, y se incubaron durante 16 h a 37ºC/CO_{2} al 5%. A continuación, la placa se centrifugó y el sobrenadante se retiró con cuidado. El sedimento de células se colocó en 200 ml de tampón de lisis proporcionado por el fabricante durante 30 min y se centrifugó. Las alícuotas del sobrenadante (20 \mul) se usaron en un ELISA con anticuerpos anti-ADN y anti-histonas para detectar la presencia de nucleosomas citoplasmáticos.

Inmunotransferencia

La inmunotransferencia se usó para la detección de MMP en medios de crecimiento sin suero. Los anticuerpos anti-MMP usados se describen anteriormente (análisis por FACS). Los patrones MMP humanos recombinantes para inmunotransferencia se obtuvieron de R&D Systems (Minneapolis, EE.UU.) e incluyen: MMP-1 (WBC024), MMP-2 (WBC025), MMP-3 (WBC015), MMP-8 (WBC017), MMP-12 (WBC019) y MMP-13 (WBC020). También se utilizó inmunotransferencia para la detección de BCL-2, BAX (véanse anteriormente los Acm) y \beta-actina (Acris Hidenhausen, Alemania, Nº ab8227). Todas las proteínas se detectaron usando un kit comercial de análisis por inmunofluorescencia, el Sistema de Inmunodetección de quimioluminiscencia (Invitrogen, Groningen, Países Bajos).

Citotoxicidad mediada por células

Las células diana se marcaron con Cr^{51} durante 1-2 h, se lavaron e incubaron conjuntamente con células efectoras a un número constante de células de 2.000 células por pocillo en placas de 96 pocillos de fondo en V. En todos los experimentos se usaron medidas duplicada de las valoraciones en cuatro etapas de células efectoras. Las liberaciones espontáneas y máximas se determinaron incubando las células diana solas y contando directamente las células marcadas, respectivamente. Después de 4 h de incubación a 37ºC en una atmósfera de CO_{2} al 5% humidificada, se recogieron los sobrenadantes, se transfirieron a placas de microvaloración de centelleo sólido Lumaplate, se secador durante una noche y se contaron en un contador de centelleo de microplacas TopCount (Packard, Meriden, CT). Para cada proporción E:T, el porcentaje de lisis se calculó como sigue: % de lisis específica = (cpm experimental - cpm espontáneas/cpm máximas - cpm espontáneas) x 100. La liberación espontánea de células diana era siempre <15% de la liberación máxima total.

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<110> Huss, Ralf

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Nelson, Peter

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<120> Inhibidor tisular de metaloproteinasas (TIMP) unido a anclajes de glucosilfosfatidilinositol (GPI) para el tratamiento de cáncer

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<130> 109-002P

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<150> Documento EP 05 020 462.7

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<151> 2005-09-20

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<160> 5

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<170> PatentIn version 3.1

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<210> 1

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<211> 582

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> TIMP-1 humano truncado condensado a la secuencia de GPI

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<400> 1

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1

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<210> 2

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<211> 900

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> TIMP-1 humano truncado condensado a dominio de mucina y Secuencia de GPI

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<400> 2

2

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<210> 3

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<211> 599

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> TIMP-2 humano condensado a Secuencia de GPI

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<400> 3

3

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<210> 4

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<211> 758

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> TIMP-3 mutado humano condensado a la Secuencia de GPI

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<400> 4

4

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<210> 5

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<211> 1314

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> TIMP-1 humano truncado condensado al dominio fractalcina y secuencia de GPI

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<400> 5

5

Claims

1. El uso de una construcción de fusión, que comprende una secuencia de aminoácidos de un inhibidor tisular de metaloproteinasas (TIMP) o un fragmento biológicamente activo del mismo, que inhibe las metaloproteinasas de la matriz activas, en el que dicho TIMP o fragmento biológicamente activo del mismo está unido a un anclaje glucosilfosfatidilinositol (GPI) para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una lesión de piel de un sujeto para prevenir o inhibir la formación de una cicatriz.

2. El uso según la reivindicación 1, en el que dicho TIMP se selecciona entre el grupo compuesto por TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3 o TIMP-4.

3. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que dicho TIMP es el TIMP-1 humano.

4. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que dicha construcción de fusión contiene una o más secuencias señales de GPI para dirigir el anclaje de GPI.

5. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que dicho anclaje GPI deriva del antígeno asociado a la función del linfocito (LFA-3) o una porción del mismo.

6. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que dicha construcción de fusión se administra a una concentración de 0,5 a 5 \mug/ml, preferentemente a 1 \mug/ml.

7. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que la cicatriz es una cicatriz hipertrófica o una formación queloide.

8. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que la composición farmacéutica se usa conjuntamente con un detergente, sellador, o sustancia vehículo.