CN1338305A - 基质金属蛋白酶组织抑制剂预防和治疗血管损伤后再狭窄 - Google Patents

Abstract

动脉壁对球囊损伤的反应不完全被人所知,血管成形术后再狭窄的临床问题尚未解决。本发明提供了一种基质金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)在制备治疗或预防血管损伤后再狭窄的药物中的应用,通过给予TIMP－2或TIMP－4藉以抑制平滑肌细胞的迁移,以治疗或预防血管损伤后再狭窄以及血管损伤。而且TIMP可以通过肌内注射裸DNA然后进行电穿孔的方法有效地给予。

Description

基质金属蛋白酶组织抑制剂预防和治疗血管损伤后再狭窄

本发明涉及基质金属蛋白酶组织抑制剂预防和治疗血管损伤后再狭窄，更具体说是用基质金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP-2或TIMP-4)预防和治疗血管损伤后再狭窄。

关于细胞外基质稳定性对维持血管壁完整的重要性人们早有认识，目前的研究着重于细胞外基质在血管成形术后再狭窄中的作用，(Bendeck，et al.Circ Res 1994；75：539-545；Schwartz，et al.Ann N Y Acad Sci 1985；454：292-304；Bendeck，et al.Circ Res 1996；78：38-43；Strauss，et al.Circ Res1994；75：650-658；Zempo，et al.J Vasc Surg 1994；20：209-217：Southgate，etal.Circ Res 1996；79：1177-1187；Webb，et al.Arterioscler Thromb Vasc Biol1997；17：1837-1844)。血管损伤后再狭窄的过程是正常愈合的结果，但不是我们所希望的，会引起血管腔减小，25％的患者症状复发。

动脉损伤后血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells/VSMCs)迁移并增殖形成新的内膜，后者在再狭窄过程的晚期积聚细胞外基质。(Clowes，et al.Lab Invest 1983；49：208-215)我们知道，血管平滑肌细胞分泌蛋白酶，通过凝血酶原依赖或非依赖途径消化细胞外基质，由此有利于迁移。(Sperti，et al.Circ Res1992；71：385-392)。

许多研究表明血管损伤后(Bendeck，et al.Circ Res 1994；75：539-545；Zempo，et al. J Vasc Surg 1994；20：209-217；Southgate，et al.Circ Res1996；79：1177-1187；Webb，et al.Arterioscler Thromb Vasc Biol 1997；17：1837-1844)以及动脉粥样硬化症中(Henney，et al.Proc Natl Acad Sci USA1991；88：8154-8158；Vine and Powell Clin Sci Colch 1991；81：233-239；Galis，etal.Ann N Y Acad Sci 1995；748：501-507)有基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases/MMPs)的表达，但很少研究其内源抑制剂-基质金属蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitors of matrix metalloproteinases/TIMPs)。(Webb，et al.Arterioscler Thromb Vasc Biol 1997；17：1837-1844；Hasenstab，et al.Circ Res 1997；80：490-496)。对TIMP了解最深的功能是对MMP活性的抑制作用。用药理学或基因转导的方式抑制MMP活性，从而改变脉管系统中蛋白水解平衡，显示能抑制迁移和新内膜的形成。(Strauss，et al.Circ Res1996；79：541-550；Forough，et al.Circ Res 1996；79：812-820)。

本发明目的是采用基质金属蛋白酶组织抑制剂抑制细胞迁移来预防和治疗血管损伤后再狭窄，通过给予受治疗者一定量的TIMP-2或TIMP-4有效治疗或预防血管损伤后再狭窄。

本发明另一目的是提供一种对受治疗者系统给予TIMP的方法。

血管损伤后，在再狭窄的早期阶段，VSMCs首先释放蛋白酶降解细胞外基质并向受损的内皮细胞层迁移。迁移至受损血管区域后，VSMCs增殖、分泌基质蛋白如胶原，并在再狭窄后期形成新的损害。因此，TIMP抑制平滑肌细胞迁移的作用，在阻止再狭窄第一步中十分有用。

本发明描述了一种抑制平滑肌细胞如血管平滑肌细胞迁移的方法，通过细胞内导入能有效抑制细胞迁移的适量的TIMP-2或TIMP-4(J.Greene etal.，J.Biol.Chem.，271：30375-30380，1996)。

本发明还提供了治疗或预防受治疗者血管再狭窄的方法，以及治疗或预防受治疗者血管损伤的方法。所述血管损伤是由血管成形术、动脉瘤、动脉粥样硬化、动脉闭塞、损伤、移植、肺栓塞或心肌梗塞所引起。通过给予受治疗者一定量的能有效治疗或预防再狭窄的TIMP如TIMP-2或TIMP-4。发明者证实在球囊损伤后立即给予TIMP-4能抑制平滑肌细胞的迁移和再狭窄。

本发明还提供了一种对受治疗者系统给予TIMP的方法。发明者惊奇地发现通过肌内注射裸DNA然后电穿孔的方法给予TIMP-2或TIMP-4可以达到有效和持续的TIMP蛋白的血清水平。

本发明提供了一种用TIMP治疗和预防血管损伤后再狭窄的新方法。发现TIMP如TIMP-2或TIMP-4可以通过肌内注射脂质体配方的裸DNA的方法有效地给予。通过基因治疗方法肌内介导TIMP-4的一个实例如下，结果参见图1。

通过肌内给予TIMP-4表达质粒进行基因治疗。基于公开的DNA质粒肌内介导数据(Aiharaand Miyazaki，1998；Blezinger et al，1999)，我们选择了两个TIMP-4表达质粒剂量(50和150μg)用以肌内注射然后电穿孔。注射前，以及注射后4、8、13和21天收集血清。用Western blot方法确定TIMP蛋白水平。在50μg质粒剂量，TIMP-4血清水平在注射后4天比对照略高。但是，在150μg质粒剂量，TIMP-4血清水平明显增高。如图1所示，虽然在注射前血浆中有最小量的TIMP蛋白，当给予150μg质粒时，注射后4天TIMP的量增加3倍。第8和13天TIMP蛋白量明显增加，分别是对照的19和29倍。第21天，血浆TIMP回复正常水平。因此，裸DNA在因血管成形术所致血管损伤前3-7天注射为宜。

本发明还提供了一种抑制平滑肌细胞迁移的方法，包括对平滑肌细胞介导一个有效量TIMP以抑制迁移。具体实例之一为介导TIMP-2或TIMP-4的平滑肌细胞为血管平滑肌细胞。血管平滑肌细胞可以在静脉、动脉或毛细血管中发现。在本发明的最佳实施例中，为大动脉中的血管平滑肌细胞。TIMP可以以蛋白的形式如纯化的重组TIMP-2或TIMP-4蛋白(YiliangE.Liuet al.，J.Biol Chem.，272(30)：20479-20483，1997)介导入平滑肌细胞。TIMP还可以以编码TIMP蛋白的DNA序列(Damon A.et al.，J.ProteinChem.，16：237-255，1997)导入平滑肌细胞。代表性的，DNA序列包含于一个载体以表达TIMP蛋白。编码TIMP蛋白的DNA序列可以通过该领域技术人员所知的方法介导入平滑肌细胞，如利用电穿孔法或者阳离子脂质体融合法介导裸DNA。

这里所说的“裸DNA”定义为：包含于一个非病毒载体的DNA。正如本领域专业技术人员所知，任何以上DNA转导方法都可以结合起来。

图2中的数据显示重组TIMP-2或TIMP-4蛋白抑制VSMC的迁移。研究了纯化的重组TIMP-2或TIMP-4对血管平滑肌细胞迁移的作用。大鼠平滑肌细胞适度入侵。40小时孵育后，约2.5％的细胞已迁移穿过Matrigel屏障，分别加入使终浓度为10nmol/L的重组TIMP-2或重组TIMP-4，迁移分别下降72％和60％。通过细胞计数发现对照和TIMP处理过的细胞之间生长速率没有明显改变。因此对照细胞和TIMP处理过的细胞之间迁移的差异不是由TIMP对平滑肌细胞的增殖作用引起。

TIMP有各种不同的生物学功能，除了其抗MMP活性以外，还包括细胞生长和凋亡的调节作用等。包括TIMP-2在内所有TIMP的抑制MMP的活性已证实由其N末端区域所介导，该末端区域与活化的MMP形成紧密复合物(Murphy et al.，Methods Enzymol.248：496-510，1995；Hutton et al.，Biochemistry，37：10094-8，1998)。由于TIMP-2和TIMP-4对VSMC迁移的抑制作用是由其抗MMP的活性介导，因此我们想研究仅有抗MMP区域的突变TIMP是否也能抑制VSMC的迁移。基于这点，我们构建了仅有TIMP-2N末端(氨基酸残基1-124)的TIMP-2cDNA突变体。将突变的TIMP-2转染入VSMC，并与没有转染TIMP-2的VSMC对照比较细胞迁移。如图3所示，与野生型TIMP-2一样，仅有TIMP-2 N末端区域的突变型也能有效抑制VSMC的迁移。

本发明还提供了一个治疗或预防受治疗者再狭窄的方法，包括对受治疗者给予一个有效量TIMP如TIMP-2或TIMP-4以治疗或预防再狭窄。TIMP可以作为一种蛋白质如纯化的重组TIMP蛋白或从天然物质分离的TIMP蛋白给予受治疗者。TIMP还可以以编码TIMP蛋白的DNA序列导入平滑肌细胞。代表性的，DNA序列包含于一个载体以表达TIMP蛋白。编码TIMP蛋白的DNA序列可以以许多不同的方式给予受治疗者。例如，可以用许多本领域技术人员所知的有效方法把包含编码TIMP蛋白的DNA序列的载体介导入受治疗者。诸如利用电穿孔法或者阳离子脂质体融合法介导裸DNA。这里所说的“裸DNA”定义为：包含于一个非病毒载体的DNA。正如本领域专业技术人员所知，任何以上DNA转导方法都可以结合起来。

为检验给予TIMP在血管损伤后是否可以抑制血管平滑肌细胞迁移防止再狭窄，我们进行体外动脉器官培养以检测血管损伤后的再狭窄。Wistar鼠球囊血管成形术损伤，球囊损伤后立即将颈动脉取出并在动脉器官培养物中培养。器官培养3周后，动脉被固定并做组织分析和TIMP-2免疫组化染色。如图4所示，被球囊损伤的血管处逐步显示有明显的血管重塑或再狭窄(图4中A)，而在对照的未损伤血管没有观察到损害(图4中B)。在再狭窄损伤部位TIMP-2表达明显升高(图4中C)。这些数据显示动脉器官培养模型对研究球囊损伤后的再狭窄反应是合适的。

然后在我们建立的动脉器官培养模型中检验了重组人TIMP-2蛋白(rTIMP-2)或重组人TIMP-4蛋白(rTIMP-4)抑制再狭窄的有效性。分离球囊损伤的颈动脉并在器官培养基质中培养，分别加或不加rTIMP-2或rTIMP-4。正如我们所期待的，在不加rTIMP-2或rTIMP-4的损伤动脉中很容易观察到再狭窄反应(图5中B、D)，而rTIMP-2或rTIMP-4的存在明显降低损伤动脉中的再狭窄反应(如图5中C、E)。与对VSMC迁移的抑制效应联系起来，这些数据明显证实TIMP在抑制VSMC迁移然后减轻再狭窄中的治疗价值。

为达到将TIMP基因介导入受治疗者的目的，可以将一个包含编码TIMP的核酸的重组载体与一种无菌水溶液组合，该溶液最好是与接受者的血液等渗。可以将重组载体悬浮于含有生理上可配伍的物质如氯化钠、甘氨酸等以及与生理条件相配的缓冲PH的水中，并将该溶液灭菌。本发明的较好例子，重组载体与20-25％蔗糖组合配制于生理盐水中用以介导入哺乳动物。所给予的编码TIMP的核酸的量或者载体中编码TIMP的核酸的量足以抑制受治疗者的再狭窄。但是，确切的剂量依赖于各种因素诸如给药的目的、给药方式、组合的有效性、以及受治疗者个体药代动力学参数。本领域专业人员可以按治疗的需要决定治疗的频率和时间。本发明优点：

血管损伤后再狭窄一直是临床上有待解决的问题，尤其是急性心肌梗塞、冠脉狭窄以及经皮冠状动脉腔内血管成形术后冠状动脉再狭窄是临床上的难题，目前除了用支架机械地预防再狭窄以外，没有什么方法。还没有应用基因疗法进行治疗。

本发明采用的是基因疗法，并且通过裸DNA肌内注射然后电穿孔的方法来转移基因，而没有用病毒做载体，因此操作简单，没有毒性。

附图说明：

图1是肌内注射TIMP-4表达质粒后血清中的TIMP-4蛋白水平。

图2是重组人TIMP-2或重组人TIMP-4对血管平滑肌细胞迁移的抑制作用示意图。

图3是转染仅有N末端区域的突变TIMP-2质粒对血管平滑肌细胞迁移的抑制作用示意图。

图4是鼠颈动脉损伤后的组织分析和TIMP-2免疫染色。

图5是重组人TIMP-2或重组人TIMP-4对损伤的颈动脉再狭窄的抑制作用示意图。

实施例1肌内注射TIMP-4表达质粒的试验

利用一次性胰岛素注射器以及一支25号针，将50μl(150μg)TIMP-4表达质粒DNA(TIMP-4 cDNA插入pCI-neo哺乳动物表达载体，PromegaCorporation，Madison，WI)或仅质粒DNA注射入6周大的雌性裸鼠的双侧胫骨前肌肉。然后进行电穿孔法：一对电极插入肌肉，在DNA注射部位相距5mm间隙，用一个电脉冲发生器Electro Square Porator ECM 830(Genetronics，Inc.San Diego，CA)给予电脉冲。三次脉冲，每秒一次，电压为200V，传导到注射部位，每个脉冲持续50ms。然后，给予三次反向的脉冲。

图1显示肌内注射TIMP-4表达质粒后血清中的TIMP-4蛋白水平。单次肌内注射150μg TIMP-4表达质粒前以及在4、8、13和21天后收集10μl的血清，用TIMP-4抗体进行western blot分析。图1表示一只鼠中血清TIMP-4水平在不同时间的变化。所有5只鼠在每个时间点上均观察到相似的TIMP-4水平。

实施例2重组人TIMP-2(或重组人TIMP-4)对血管平滑肌细胞迁移的抑制作用

用Matrigel侵入法检验纯化的重组人TIMP-2(或重组人TIMP-4)蛋白对鼠平滑肌细胞迁移的抑制作用。简言之，10μm孔聚碳酸酯膜用4mg/ml的生长因子减少的Matrigel被覆。鼠平滑肌细胞以35,000个细胞/ml/孔的密度在含5％FCS的DMEM中播种，每孔不加入或加入重组人TIMP-2或重组人TIMP-4蛋白达终浓度为10n mol/l。底室(Bottom chamber)中的培养基含10％FCS。在含5％CO2的潮湿的培养箱中37℃培养48小时后，将培养基和细胞从底室中转移出来离心，用Nikon显微镜计数。结果见图2。以未处理的对照组的细胞迁移作为100％。用重组人TIMP-2或重组人TIMP-4处理过的细胞的迁移以对照组的百分比表示。数字代表三组的平均值±SD。

实施例3转染仅有N末端区域的突变TIMP-2质粒对血管平滑肌细胞迁移的抑制作用

用我们以前报道过的方法(Wang and Shi et al，Oncogne 14：2767-2774，1997)将仅有N末端区域的突变TIMP-2质粒转染入VSMC。简言之，40μg对照pCI-neo质粒或pCI-TIMP2-N质粒用磷酸钙介导法转染入VSMC。用G-418选择，收集耐受的细胞。用前面描述的方法检验对平滑肌细胞迁移的抑制作用。结果见图3。以转染对照质粒的平滑肌细胞迁移作为100％。转染pCI-TIMP2-N质粒的平滑肌细胞的迁移以对照组的百分比表示。数字代表两组的平均值±SD。

实施例4体外动脉器官培养检测血管损伤后的再狭窄

对雄性Wistar鼠的颈动脉球囊损伤按shi等的方法进行(Shi，etal.，Circulation Research，84：498-504，1999)。分离损伤以及对照的动脉并在CCDM140器官培养基质中培养，该培养基中含5％小牛血清、20ng/ml的表皮生长因子(EGF)、2ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、10ng/ml的胰岛素以及2ng/ml的转化生长因子β1(TGF-β1)。每5天换一次培养基。器官培养3周后，固定动脉并进行组织分析和TIMP-2免疫组化染色，结果见图4。图4中A和B为H&E染色的部分。箭头指示再狭窄损害区域。图4中C和D为TIMP-2免疫染色。箭头指示TIMP-2蛋白表达。A和C为损伤的颈动脉，B和D为没有损伤的动脉对照。

实施例5在动脉器官培养中重组人TIMP-2或重组人TIMP-4对损伤的颈动脉再狭窄的抑制作用

分离球囊损伤的颈动脉并在实施例4所描述的器官培养基质中培养，分别加或不加rTIMP2或rTIMP-4。加入的rTIMP-2或rTIMP-4的终浓度为100nmol/l。每3天换一次培养基并重新加入rTIMP-2或rTIMP-4。培养3周后固定动脉并进行H和E染色用于组织分析，结果见图5。图5中A为没有损伤的动脉对照，图5中B、D为没有加入rTIMP-2和rTIMP-4的受损动脉，图5中C为加入rTIMP-2的受损动脉，图5中E为加入rTIMP-4的受损动脉。如图5中B、D，在不加rTIMP-2或rTIMP-4的损伤动脉中可以很容易观察到再狭窄反应，而rTIMP-2或rTIMP-4的存在明显降低损伤动脉中的再狭窄反应(如图5中C、E)。说明rTIMP-2和rTIMP-4可以抑制血管再狭窄。也就是抑制血管损伤后再狭窄。结合实施例2，rTIMP-2和rTIMP-4抑制再狭窄很可能是通过抑制平滑肌细胞的迁移而实现的。

Claims (9)

1、一种基质金属蛋白酶组织抑制剂在制备治疗或预防血管损伤后再狭窄的药物中的应用，其特征在于所述药物中含有有效量基质金属蛋白酶组织抑制剂TIMP-2或TIMP-4藉以抑制平滑肌细胞的迁移，以治疗或预防再狭窄。

2、一种基质金属蛋白酶组织抑制剂在制备治疗或预防血管损伤的药物中的应用，其特征在于所述药物中含有有效量TIMP-2或TIMP-4藉以抑制平滑肌细胞的迁移，以治疗或预防血管损伤。

3、如权利要求2所述的一种基质金属蛋白酶组织抑制剂在制备治疗或预防血管损伤的药物中的应用，其特征在于所述血管损伤是由血管成形术、动脉瘤、动脉粥样硬化、动脉闭塞、损伤、移植、肺栓塞或心肌梗塞所引起。

4、如权利要求1所述的一种基质金属蛋白酶组织抑制剂在制备治疗或预防血管损伤后再狭窄的药物中的应用，其特征在于所述治疗或预防血管损伤后再狭窄包括介导和表达一个编码TIMP-2或TIMP-4蛋白的DNA序列进入受治疗者足够数量的细胞内以治疗或预防受治疗者的再狭窄。

5、如权利要求4所述的一种基质金属蛋白酶组织抑制剂在制备治疗或预防血管损伤后再狭窄的药物中的应用，其特征在于所述的TIMP DNA序列可以是全长序列，或仅编码多肽N末端1-124位氨基酸残基的N末端序列。

6、如权利要求4所述的一种基质金属蛋白酶组织抑制剂在制备治疗或预防血管损伤后再狭窄的药物中的应用，其特征在于所述的细胞为平滑肌细胞。

7、如权利要求4所述的一种基质金属蛋白酶组织抑制剂在制备治疗或预防血管损伤后再狭窄的药物中的应用，其特征在于所述的编码TIMP-2或TIMP-4蛋白的DNA序列是通过一个包括肌内注射裸DNA然后进行电穿孔的方法介导的。

8、如权利要求4所述的一种基质金属蛋白酶组织抑制剂在制备治疗或预防血管损伤后再狭窄的药物中的应用，其特征在于所述的编码TIMP-2或TIMP-4蛋白的DNA序列是通过一个包括肌内注射脂质体配方的裸DNA的方法介导的。

9、如权利要求4所述的一种基质金属蛋白酶组织抑制剂在制备治疗或预防血管损伤后再狭窄的药物中的应用，其特征在于所述的裸DNA是在因血管成形术所致血管损伤前3-7天注射。

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