CN105646697B - VEGF165b突变体及其制备方法和应用 - Google Patents
VEGF165b突变体及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105646697B CN105646697B CN201610216197.1A CN201610216197A CN105646697B CN 105646697 B CN105646697 B CN 105646697B CN 201610216197 A CN201610216197 A CN 201610216197A CN 105646697 B CN105646697 B CN 105646697B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- vegf165b
- mutant
- mvegf165b
- gene
- preparation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种VEGF165b突变体及其制备方法和应用,本发明所述的VEGF165b突变体具有序列表中SEQ ID No:1所示的氨基酸序列,其能够用于制备血管生成抑制药物。
Description
技术领域
本发明涉及一种细胞生长因子及其制备方法和应用,特别是涉及一种血管内皮生长因子及其制备方法和应用。
背景技术
肿瘤的生长依赖于血管新生提供营养供应,因此通过抑制血管生成理论上可以切断肿瘤的营养供应而达到抑制肿瘤的目的。血管生成的主要调节子为血管内皮生长因子家族A(Vascular endothelial growth factor,VEGF-A)。血管内皮生长因子(VEGF)自发现以来一直被认为是一类促血管生成因子,由于基因在转录时剪切方式的不同,可产生不同的亚型,根据氨基酸数目的多寡,可分为VEGF121、VEGF165、VEGF183、VEGF189与VEGF206等,其中VEGF165是促进血管活性最强的亚型。VEGF165特异地作用于血管内皮细胞,是血管生成作用的特异性刺激剂。Bates等人于2002年研究发现,VEGF还存在另外一类抑制血管生成的内源性变构体,例如VEGF121b、VEGF145b、VEGF165b、VEGF189b等,其中以VEGF165b为主。研究表明,VEGF165b与VEGF165在基因结构上非常相似,仅羧基末端的6个氨基酸不同(VEGF165的羧基末端为CDKPRR,而VEGF165b的羧基末端为SLTRKD),但其功能却截然不同,具有很强的抑制VEGF165介导的血管生成的作用。因此,VEGF165b已成为肿瘤及眼底黄斑变性等血管生成依赖性疾病的潜在治疗药物。
VEGF-A家族中的VEGF165在108Arg与109Ala位置存在纤溶酶酶切位点,可被纤溶酶酶切产生VEGF108片段,在111Gln与112Glu位置存在基质金属蛋白酶MMP-3、MMP-7和MMP-9的裂解位点,可裂解产生VEGF111片段。该VEGF108与VEGF111均为血管生成刺激因子。由于VEGF165b与VEGF165相比仅羧基末端(C端)的6个氨基酸不同,这意味着VEGF165b同样可被纤溶酶、基质金属蛋白酶裂解,产生VEGF108与VEGF111片段,不利于VEGF165b作为血管生成抑制药物的应用。此外,VEGF165b的半衰期仅为15分钟左右,其抑制血管生成的作用时效较短。
发明内容
基于此,本发明的目的在于,提供一种VEGF165b突变体,其不会被纤溶酶、基质金属蛋白酶裂解,具有更强的血管生成抑制作用。
本发明的另一个目的在于,提供所述VEGF165b突变体的制备方法。
本发明的再一个目的在于,提供所述VEGF165b突变体在制备血管生成抑制药物中的应用。
一种血管内皮生长因子165b突变体(VEGF165b突变体),其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No:1所示。
本发明所述的血管内皮生长因子165b突变体(VEGF165b突变体)的编码基因,其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No:2所示。
本发明所述的血管内皮生长因子165b突变体(VEGF165b突变体)的制备方法,包括以下步骤:
1)VEGF165b突变体编码基因的合成;
2)VEGF165b突变体表达载体的构建;
3)VEGF165b突变体表达工程菌的构建;
4)VEGF165b突变体的诱导表达和分离纯化。
在其中一个实施例中,所述VEGF165b突变体编码基因的合成包括以下步骤:以VEGF165b全长基因为模板,设计含有突变位点的特异性引物进行PCR扩增,获取VEGF165b突变体编码基因。
在其中一个实施例中,所述VEGF165b突变体表达载体的构建包括以下步骤:使用限制性内切酶Not I和EcoR I,分别酶切pPIC9K载体及VEGF165b突变体基因片段,得到酶切后线性化的pPIC9K载体以及酶切后的VEGF165b突变体基因片段,采用T4DNA连接酶体系在16℃下孵育过夜;然后转化感受态细胞,筛选阳性菌落,提取阳性菌落的质粒,得到所述VEGF165b突变体表达载体。
在其中一个实施例中,所述VEGF165b突变体表达工程菌的构建包括以下步骤:使用限制性内切酶Sal I酶切所述VEGF165b突变体表达载体,得到线性化的VEGF165b突变体表达载体,转化毕赤酵母GS115感受态细胞,筛选阳性菌落,并培养高拷贝阳性克隆菌落。
本发明所述的血管内皮生长因子165b突变体(VEGF165b突变体),可应用于制备血管生成抑制药物。
一种血管生成抑制剂,其活性成分含有本发明所述的VEGF165b突变体。
本发明所述的VEGF165b突变体,其氨基酸序列的109位置由Ala突变为Pro,其112位置由Glu突变为Asp。通过上述位点的突变处理,能够避免被纤溶酶、基质金属蛋白酶裂解而生成血管生成刺激因子VEGF108与VEGF111;同时,能够延长VEGF165b的半衰期,从而延长其抑制血管生成的作用时效。与野生型VEGF165b相比,本发明所述的VEGF165b突变体具有更强的血管生成抑制作用。
MTT实验和细胞伤口愈合实验证实,VEGF165b突变体在体外具有与野生型VEGF165b相同的抑制脐带静脉内皮细胞增殖与迁移的活性;大鼠体内ELISA检测证明,相较野生型VEGF165b的半衰期为15分钟左右,VEGF165b突变体的半衰期长达2小时以上。实验证明,本发明所述的VEGF165b突变体具有良好的血管生成抑制作用,能够用于制备血管生成抑制剂以及用于抑制血管生成的抗肿瘤药物。
附图说明
图1a为VEGF165b突变体上半段编码基因的电泳检测结果;
图1b为VEGF165b突变体下半段编码基因的电泳检测结果;
图1c为VEGF165b突变体编码基因的电泳检测结果;
图2为VEGF165b突变体的电泳检测结果;
图3a为野生型VEGF165b抑制HUVEC增殖的测定结果;
图3b为VEGF165b突变体抑制HUVEC增殖的测定结果;
图4为VEGF165b突变体抑制血管内皮细胞迁移的测定结果;
图5a为野生型VEGF165b的半衰期测定结果;
图5b为VEGF165b突变体的半衰期测定结果。
具体实施方式
在以下实施例中,为便于描述,将本发明所述的血管内皮生长因子165b突变体(VEGF165b突变体,mutant VEGF165b)简写为“mVEGF165b”。
实施例一:mVEGF165b编码基因的合成
以VEGF165b全长基因为模板,设计含有突变位点的特异性引物进行PCR扩增,获取mVEGF165b基因片段,其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No:2所示。
1、合成mVEGF165b上半段基因
以VEGF165b全长基因为模板,采用下述的mVEGF165b上游引物和mVEGF165b半段下游引物进行PCR反应,获取mVEGF165b上半段基因。
mVEGF165b上游引物:
5’-GGAATTCATGGCTGAAGGAGGTGG-3’,
mVEGF165b半段下游引物(下划线标示部分为突变位点):
5’-GTCTTGTCTTGGTCTATCTTTCTTTGGTC-3’。
PCR反应体系如下(50μl):
PCR反应条件如下:95℃预变性5分钟;94℃变性45秒,56℃退火45秒,72℃延伸20秒,30循环;72℃终延伸5分钟。
PCR反应结束后采用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定,电泳结果如图1a所示。然后从凝胶中切下PCR产物,用SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒(购自生工生物工程(上海)股份有限公司,产品编号为B518141-0050)进行回收,并用Nanodrop超微量分光光度计测定该PCR产物的浓度,测得其浓度为157ng/μl。
2、合成mVEGF165b下半段基因
以VEGF165b全长基因为模板,采用下述的mVEGF165b半段上游引物和mVEGF165b下游引物进行PCR反应,获取mVEGF165b下半段基因。
mVEGF165b半段上游引物(下划线标示部分为突变位点):
5’-ATAGACCAAGACAAGACAATCCCTGTGGGC-3’;
mVEGF165b下游引物:
5’-ATAGTTTAGCGGCCGCTTAGTCCTTTCTAGTCAAAGATCTA-3’。
PCR反应体系如下(50μl):
PCR反应条件如下:95℃预变性5分钟;94℃变性45秒,54.8℃退火45秒,72℃延伸20秒,30循环;72℃终延伸5分钟。
PCR反应结束后采用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定,电泳结果如图1b所示。然后从凝胶中切下PCR产物,用SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒(购自生工生物工程(上海)股份有限公司,产品编号为B518141-0050)进行回收,并用Nanodrop超微量分光光度计测定该PCR产物的浓度,测得其浓度为181ng/μl。
3、合成mVEGF165b全长编码基因
以上述的mVEGF165b上半段基因和mVEGF165b下半段基因为模板,采用mVEGF165b上游引物和mVEGF165b下游引物进行PCR反应,获取mVEGF165b全长编码基因。
mVEGF165b上游引物:
5’-GGAATTCATGGCTGAAGGAGGTGG-3’,
mVEGF165b下游引物:
5’-ATAGTTTAGCGGCCGCTTAGTCCTTTCTAGTCAAAGATCTA-3’。
PCR反应体系如下(50μl):
PCR反应条件如下:95℃预变性5分钟;94℃变性45秒,56.5℃退火45秒,72℃延伸20秒,30循环;72℃终延伸5分钟。
PCR反应结束后采用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定,电泳结果如图1c所示。然后从凝胶中切下分子量在500bp处的PCR产物,用SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒(购自生工生物工程(上海)股份有限公司,产品编号为B518141-0050)进行回收,并用Nanodrop超微量分光光度计测定该PCR产物的浓度,测得其浓度为198ng/μl。将纯化后回收的PCR产物送至苏州金唯智生物科技有限公司进行测序,其核苷酸序列与序列表中SEQ ID No:2所示的序列一致。
实施例二:mVEGF165b表达载体的构建
使用限制性内切酶Not I和EcoR I,分别酶切pPIC9K载体及mVEGF165b基因片段,得到酶切后线性化的pPIC9K载体以及酶切后的mVEGF165b基因片段,采用T4DNA连接酶体系,在16℃下孵育过夜。然后转化感受态细胞,筛选阳性菌落,提取阳性菌落的质粒,得到pPIC9K-mVEGF165b表达载体。
1、双酶切pPIC9K载体
酶切反应体系如下(100μl):
酶切反应条件:在37℃下反应3小时。
2、双酶切mVEGF165b基因片段
酶切反应体系如下(100μl):
酶切反应条件:在37℃下反应3小时。
3、连接pPIC9K载体与mVEGF165b基因片段
连接反应体系如下(10μl):
连接反应条件:16℃孵育过夜。
4、转化感受态细胞
在100μl浓度为1.5×109个/ml的大肠杆菌TOP10感受态细胞中,加入10μl上述的连接体系,充分混匀,置于冰浴中冷却30分钟后,立即置于42℃水浴中热休克90秒,再置于冰浴中冷却2分钟;然后加入800μl的LB液体培养基(先置于37℃水浴中预热),在37℃、100rpm的条件下振荡培养45分钟;然后以4000rmp的转速离心1分钟后,弃去750μl的上清液,余下菌液充分混悬。
5、重组载体的鉴定
将上述菌液均匀涂布于含50μg/ml氨苄青霉素的LB平板培养基上,于37℃倒置培养12~16小时,挑取阳性菌落接种在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中,于37℃培养过夜。培养结束后将菌液保存备用,并取部分菌液按照实施例一所述的PCR反应进行鉴定,其PCR反应产物的电泳结果与目标产物一致;然后将PCR反应产物送至苏州金唯智生物科技有限公司进行测序,其核苷酸序列与目标产物一致。
6、重组载体的提取
取上述经测序验证的克隆菌液10μl,接种于5ml氨苄LB培养液(氨苄青霉素的浓度为50μg/ml)中,于37℃培养过夜;然后转接种于50ml氨苄LB培养液中,于37℃培养12小时,然后于7000rpm离心10分钟,收集菌体,采用OMEGA-midi质粒提取试剂盒(购自美国OmegaBio-Tek公司,产品编号为D6904-01)进行质粒提取,得到pPIC9K-mVEGF165b表达载体。
实施例三:mVEGF165b表达工程菌的构建
使用限制性内切酶Sal I酶切pPIC9K-mVEGF165b表达载体,得到线性化pPIC9K-mVEGF165b表达载体,然后转化毕赤酵母GS115感受态细胞,筛选阳性菌落,并培养高拷贝阳性克隆菌落。
1、pPIC9K-mVEGF165b表达质粒的线性化
采用限制性内切酶Sal I对pPIC9K-mVEGF165b表达载体进行酶切,酶切产物加入20μl 3mol/L的NaAc溶液(pH=5.2)和400μl的无水乙醇进行沉淀,在4℃下以12000rpm的转速离心10分钟,沉淀物用70v/v%的酒精进行洗涤,再以12000rpm的转速离心10分钟,沉淀物晾干后溶于20μl的无菌去离子水中,取1μl作琼脂糖凝胶电泳鉴定,以判断pPIC9K-mVEGF165b表达载体是否完全线性化,其余置于-20℃保存备用。
酶切反应体系如下(200μl):
酶切反应条件:37℃下酶切反应3小时,65℃下灭活20分钟。
2、毕赤酵母GS115感受态细胞的制备
取单个毕赤酵母GS115菌落,接种于3ml YPD培养液中,于30℃振荡培养过夜,次日转接于100ml YPD培养液中,培养至OD值为1.3;菌液分装于两个50ml的离心管中,分别以4500rmp的转速离心5分钟,弃上清,分别加入100ml无菌预冷去离子水,吹打重悬;离心弃上清,加入50ml无菌去离子水,吹打重悬,再离心弃上清,加入20ml 1M山梨醇溶液,吹打重悬,然后再次离心弃上清,将毕赤酵母细胞重悬于500μl 1M山梨醇溶液中,置于冰上待用。
3、线性化pPIC9K-mVEGF165b表达载体转化毕赤酵母GS115感受态细胞
将BIO-RAD电转仪的参数设置为:电压1500v,电阻200Ω,电容25uF;并将电转杯烘干,置于冰上预冷。
将15μl线性化pPIC9K-mVEGF165b表达载体加入100μl毕赤酵母GS115感受态细胞(His氨基酸缺陷型酵母菌)溶液中混匀,置于冰上预冷5分钟,然后加到电转杯中,启动电转仪,脉冲为4.35ms,并迅速加入1ml预冷的1M山梨醇溶液混匀,吸取200μl细胞溶液涂布于MD平板培养基(His营养缺陷型培养基)上,于30℃培养2天,挑选长出的His阳性克隆菌落。His阳性克隆菌落总数在4000以上。
4、高拷贝G418抗性克隆菌落的筛选
用YPD培养液将MD平板培养基上长出的全部阳性菌落冲洗下来,测定酵母菌悬液的OD值;按照1OD约等于5×107cell/ml的量,将其稀释至每200μl中含有的细胞数量为2×106个;然后涂布于浓度为4mg/ml的G418-YPD平板培养基上,于30℃培养2天,挑选长出的高拷贝抗性克隆菌落。
研究发现,多个重组基因拷贝整合到毕赤酵母中可以增加目的基因的表达产量。pPIC9K载体可以在毕赤酵母中整合多个拷贝,pPIC9K载体上含有卡那霉素基因,卡那霉素基因赋予了毕赤酵母对遗传霉素(Geneticin,G418)的抗性,而G418的抗性水平依赖于卡那霉素基因整合在毕赤酵母中的数目。单个拷贝的pPIC9K载体整合在毕赤酵母基因组上,仅对浓度约为0.25mg/ml的G418有抗性。而多拷贝的pPIC9K载体整合在毕赤酵母基因组上,可使毕赤酵母对G418的抗性提高至4mg/ml(7~12各拷贝)。因此,采用浓度为4mg/ml的G418-YPD平板培养基,即能够筛选出高拷贝的G418抗性克隆菌落,由此获得目的产物mVEGF165b高表达的克隆菌落。
实施例四:mVEGF165b的诱导表达和分离纯化
1、mVEGF165b的诱导表达
将实施例三得到的高拷贝抗性克隆菌落接种于5ml YPD培养液中,于30℃振荡培养过夜,次日吸取100μl培养物接种于25ml BMGY培养液中,于28~30℃继续振荡培养至OD值为3.6时,以4500rmp的转速离心,收集菌体,重悬于200ml BMMY培养液中,加入2ml甲醇,继续于28~30℃振荡培养,诱导表达mVEGF165b,连续4天在固定时间补加2ml甲醇,发酵4天后,于8000rpm的转速离心10分钟,取上清液。
2、mVEGF165b的分离纯化
将离心后得到的上清液加入含有0.1M NaCl、浓度为20mmol/L的Tris-HCl溶液(PH=8.0)中,于4℃透析平衡过夜,经0.45μm滤器过滤后,上样于肝素琼脂糖亲和柱(Heparin-Sepharose CL6B亲和柱),用含有0.5M NaCl、浓度为20mmol/L的Tris-HCl溶液(PH=8.0)进行洗脱,流速为1ml/min,OD280nm检测出峰情况,收集最后一个出峰的组分,并采用非变性SDS-PAGE电泳进行检测,检测结果如图2所示,为目标产物——本发明所述的VEGF165b突变体(mVEGF165b)。
实施例五:mVEGF165b的活性鉴定
取两个96孔培养板,分别加入人脐静脉内皮细胞(HUVEC),每孔约5000个,并加入100μl完全ECM培养基(含10%FBS及1%ECGS),于37℃、5%CO2的培养箱中培养6~8小时;吸出培养基,用1×PBS缓冲液洗涤两次,然后向每孔中加入适量不完全ECM培养基(含10%FBS和终浓度为50ng/ml的VEGF165,不含ECGS),其中一个培养板中分别加入0μl、2μl、5μl、10μl、15μl、20μl、30μl、40μl、60μl浓度为500ng/ml的VEGF165b溶液(采用不完全ECM培养基配制),另一个培养板中分别加入同样浓度梯度的mVEGF165b溶液(采用不完全ECM培养基配制),每种溶液的每个浓度梯度各设6个复孔,再分别加入不完全ECM培养基补足至100μl,使各溶液的终浓度分别为0ng/ml、10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、75ng/ml、100ng/ml、150ng/ml、200ng/ml、300ng/ml;然后于37℃、5%CO2的培养箱中培养3天;然后向各孔中加入10μl5mg/ml的MTT溶液,于37℃、5%CO2的培养箱中培养3小时,吸出培养基,加入100μl的DMSO,于37℃、100rpm震荡10分钟后,用酶标仪在570nm下测量各孔的吸光值,结果如图3a和图3b所示。
实验结果表明,与野生型VEGF165b相比,本发明的mVEGF165b同样能够抑制VEGF165刺激的HUVEC增殖。此外,相对于野生型VEGF165b在浓度达到100ng/ml以上时才能抑制VEGF165刺激的HUVEC增殖,本发明的mVEGF165b在浓度达到75ng/ml以上时,即能够明显抑制VEGF165刺激的HUVEC增殖。
表1
实施例六:mVEGF165b对HUVEC细胞迁移的抑制
取两个12孔培养板,分别加入500μl的HUVEC细胞溶液(含10%FBS的ECM培养基,细胞浓度为2×105个/ml),于37℃、5%CO2的培养箱中培养过夜,保证细胞生长覆盖每个培养孔;吸出培养基,每个培养孔中分别设1个划痕带,用1×PBS缓冲液冲洗3次后,分别取其中3个孔加入500μl不完全ECM培养基(含10%FBS,不含VEGF165和ECGS),作为空白对照组;其余9个孔加入适量的不完全ECM培养基(含10%FBS和终浓度为50ng/ml的VEGF165,不含ECGS)后,再分别加入100μl浓度为500ng/ml的野生型VEGF165b溶液和mVEGF165b溶液(均采用不完全ECM培养基配制),每种溶液各设3个复孔,并加入不完全ECM培养基补足至500μl,使各溶液的终浓度均为100ng/ml。取其中一个培养板,向各孔中加入4%多聚甲醛进行处理,并用0.1%结晶紫进行染色,然后置于倒置显微镜下拍照记录;另一个培养板于37℃、5%CO2的培养箱中培养24小时,然后向各孔中加入4%多聚甲醛进行处理,并用0.1%结晶紫进行染色,然后置于倒置显微镜下,观察细胞迁移情况,并拍照记录。结果如图4所示。
实验结果表明,与野生型VEGF165b相比,mVEGF165b同样能够抑制VEGF165刺激的HUVEC增殖。
实施例七:mVEGF165b半衰期的测定
通过酶联免疫吸附(ELISA)法测定VEGF165b突变体的半衰期。分别将20μg的野生型VEGF165b和mVEGF165b经尾静脉注射至大鼠体内,然后分别在5分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时进行取血,血液离心后取上清液,通过ELISA法分别测定上清液中的VEGF165b、mVEGF165b含量,结果如图5a和图5b所示。实验结果显示,VEGF165b突变体在大鼠体内的代谢速率远远慢于野生型VEGF165b的代谢速率,野生型VEGF165b的半衰期为15分钟左右,而VEGF165b突变体的半衰期长达2.5小时左右。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (9)
1.一种VEGF165b突变体,其特征在于:其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No:1所示。
2.权利要求1所述的VEGF165b突变体的编码基因,其特征在于:其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No:2所示。
3.权利要求1所述的VEGF165b突变体的制备方法,包括以下步骤:
1)VEGF165b突变体编码基因的合成;
2)VEGF165b突变体表达载体的构建;
3)VEGF165b突变体表达工程菌的构建;
4)VEGF165b突变体的诱导表达和分离纯化。
4.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,所述VEGF165b突变体编码基因的合成包括以下步骤:以VEGF165b全长基因为模板,设计特异性引物进行PCR扩增,获取VEGF165b突变体编码基因。
5.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,所述的特异性引物为:
mVEGF165b上游引物:
5’-GGAATTCATGGCTGAAGGAGGTGG-3’,
mVEGF165b半段下游引物:
5’-GTCTTGTCTTGGTCTATCTTTCTTTGGTC-3’;
mVEGF165b半段上游引物:
5’-ATAGACCAAGACAAGACAATCCCTGTGGGC-3’,
mVEGF165b下游引物:
5’-ATAGTTTAGCGGCCGCTTAGTCCTTTCTAGTCAAAGATCTA-3’。
6.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,所述VEGF165b突变体表达载体的构建包括以下步骤:使用限制性内切酶Not I和EcoR I,分别酶切pPIC9K载体及VEGF165b突变体基因片段,得到酶切后线性化的pPIC9K载体以及酶切后的VEGF165b突变体基因片段,采用T4DNA连接酶体系在16℃下孵育过夜;然后转化感受态细胞,筛选阳性菌落,提取阳性菌落的质粒,得到所述VEGF165b突变体表达载体。
7.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,所述VEGF165b突变体表达工程菌的构建包括以下步骤:使用限制性内切酶Sal I酶切所述VEGF165b突变体表达载体,得到线性化的VEGF165b突变体表达载体,转化毕赤酵母GS115感受态细胞,筛选阳性菌落,并培养高拷贝阳性克隆菌落。
8.权利要求1所述的VEGF165b突变体在制备血管生成抑制药物中的应用。
9.一种血管生成抑制剂,其特征在于:其活性成分含有权利要求1所述的VEGF165b突变体。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201610216197.1A CN105646697B (zh) | 2016-04-08 | 2016-04-08 | VEGF165b突变体及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201610216197.1A CN105646697B (zh) | 2016-04-08 | 2016-04-08 | VEGF165b突变体及其制备方法和应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN105646697A CN105646697A (zh) | 2016-06-08 |
CN105646697B true CN105646697B (zh) | 2019-03-19 |
Family
ID=56497151
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201610216197.1A Active CN105646697B (zh) | 2016-04-08 | 2016-04-08 | VEGF165b突变体及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN105646697B (zh) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106279435B (zh) * | 2016-08-16 | 2019-06-07 | 新乡医学院 | 靶向VEGF与mucin1的抗肿瘤疫苗、编码基因、表达载体、表达工程菌及应用 |
CN113354738B (zh) * | 2020-03-05 | 2022-09-09 | 绍兴德方华生物技术有限公司 | 融合毒素VEGF165b/mGEL及其编码基因与应用 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1342783A1 (de) * | 2002-03-08 | 2003-09-10 | Eming, Sabine, A.,Dr. med. | Proteolyseresistenter aktiver VEGF |
-
2016
- 2016-04-08 CN CN201610216197.1A patent/CN105646697B/zh active Active
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
VEGF111b, a new member of VEGFxxxb isoforms and induced by mitomycin C, inhibits angiogenesis;Fang Gu等;《Biochemical and Biophysical Research Communications》;20131011;第441卷(第1期);第23页左栏第3段 |
VEGF165与VEGF165b的类似物表达及其功能初步评价;戴惠云;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技I辑》;20140215(第(2014)2期);摘要,第1页最后一段,第5页1.3.4 VEGF165 稳定性研究,第8-9页1.4.4 定点突变,第二章 VEGF165、VEGF165b及类似物的构建与表达 |
抑制性剪接变构体VEGF165b的研究进展;关云艳等;《国际遗传学杂志》;20081215;第31卷(第6期);第436-438、487页 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN105646697A (zh) | 2016-06-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN102121023B (zh) | 突变型人纤溶酶原kringle5及其制备方法及应用 | |
CN104910278B (zh) | 一种用于制备cart细胞的具有高效转染能力和生物学活性的慢病毒 | |
CN105646697B (zh) | VEGF165b突变体及其制备方法和应用 | |
CN107955067B (zh) | 参与桃黄酮醇生物合成调控的两个myb转录因子及其应用 | |
CN110960687A (zh) | 转甲状腺素蛋白转运融合蛋白进入眼内的应用 | |
CN106279435B (zh) | 靶向VEGF与mucin1的抗肿瘤疫苗、编码基因、表达载体、表达工程菌及应用 | |
CN109666074A (zh) | 一种趋化因子受体cxcr5的用途 | |
CN109438567B (zh) | 一种鲟鱼抗病免疫蛋白及其制备方法和应用 | |
CN105384828B (zh) | 长效干扰素-α及其改造方法 | |
CN103333915B (zh) | 一种含有碱性成纤维细胞生长因子活性多肽的植物油体护肤乳液 | |
CN109331171A (zh) | 一种疟原虫蛋白的制备方法及其在抗肿瘤方面的应用 | |
CN101897953B (zh) | 无创性高穿透性表皮生长因子及其应用 | |
KR101466875B1 (ko) | 항종양괴사인자 수용체 2를 발현하도록 설계된 미니서클 벡터를 이용한 자가면역질환 치료 | |
CN103980366B (zh) | 一种白介素融合蛋白及其制备方法和应用 | |
CN1318594C (zh) | 重组人VEGF与bFGF真核表达载体、融合蛋白及其用途 | |
CN112029730A (zh) | 一种基因修饰的间充质干细胞及其应用 | |
CN110343164A (zh) | 一种高活性7位点突变的猪干扰素α突变体及其制备方法和应用 | |
CN105199000B (zh) | 一种靶向抗肿瘤活性蛋白及其制备与纯化 | |
CN108794644A (zh) | 一种由牛白细胞介素2、牛干扰素γ和牛干扰素α组成的融合蛋白及其制备方法 | |
RU2737487C1 (ru) | Генно-инженерная конструкция для стимуляции ангиогенеза | |
CN112457391B (zh) | 猪干扰素α、β、λ1在酿酒酵母中共分泌表达的方法及其应用 | |
CN107353348A (zh) | 一种重组羊长效干扰素τ及制备此长效干扰素的融合蛋白及其制备方法 | |
CN110656128B (zh) | 含人角质细胞生长因子基因表达的重组构建体及其应用 | |
US20220088139A1 (en) | Nerve growth factor mutant | |
CN108794645A (zh) | 一种由牛白蛋白、牛干扰素γ和牛干扰素α组成的融合蛋白及其制备方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |