CN1318594C - 重组人VEGF与bFGF真核表达载体、融合蛋白及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及重组真核表达载体，其中在真核表达载体上插入了人血管内皮细胞生长因子(VEGF)与碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)基因。本发明还涉及融合蛋白，由人血管内皮生长因子与碱性成纤维细胞生长因子组成。所述重组载体和融合蛋白可以用来预防或者治疗缺血性疾病。

Description

重组人VEGF与bFGF真核表达载体、融合蛋白及其用途

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及重组人血管内皮细胞生长因子(VEGF)与碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)融合基因真核表达载体、融合蛋白及其用途。

背景技术

周围动脉狭窄或闭塞造成的肢体动脉缺血性疾病是血管外科领域最常见的疾病之一，目前常用的治疗方法包括手术，药物及近年来兴起的介入疗法，都各有其适应症和局限性。自从血管内皮细胞生长因子(VEGF)的基因序列及生物学活性研究报道以来，国内外学者进行了大量的研究，在90年代初提出了有别于传统的治疗心血管和肢体动脉缺血性疾病的新概念，即利用血管生长因子的促血管生长作用，刺激机体产生大量新生血管，建立丰富的侧枝循环，从而改善血供，达到治疗缺血性疾病的目的。现在VEGF基因治疗的临床研究已取得了明显的效果[1-4]，证明了VEGF治疗血管缺血性疾病的临床应用前景。

VEGF和bFGF同属于血管生成因子家族的成员，VEGF是有高度特异性的血管内皮细胞有丝分裂原，具有双重功能：既增加微血管通透性，促进血浆纤维素蛋白外渗，为血管形成过程中多种细胞迁移提供一个纤维网络；又通过内皮细胞上的受体直接刺激内皮细胞的增殖[5]。bFGF也是血管内皮细胞有丝分裂原，具有增加内皮细胞的化学趋向性，诱导蛋白溶解生成，有利于内皮细胞芽穿透基质等功能[6]，从而促进内皮细胞的迁移和血管的生成。在促进血管生成的过程中，VEGF与bFGF之间的作用既相互独立又相互调节。本发明利用基因工程技术将人VEGF和bFGF基因克隆到pcDNA3.1(+)真核表达载体上，将它们重组成融合基因，并在真核细胞中表达了两种细胞因子的融合蛋白，目的是利用两种细胞因子在促进血管生成过程中的协同作用，发挥更大的生物学作用，目前国内外还未见有相关的报道。

发明内容

本发明提供一种重组真核表达载体，其中在真核表达载体中含有SEQ IDNO：5所示的核苷酸序列组成的融合基因。该融合基因中含有重组人血管内皮细胞生长因子基因与碱性成纤维细胞生长因子基因。所述融合基因插入载体中。

本发明中使用的载体可以是本领域技术人员熟知的任何载体，只要其可以携带外源基因在体内表达。在优选的实施方案中，使用的载体是pcDNA3.1(+)。最优选的重组载体是本发明中构建的pcDNA/V+b。

本发明还提供了一种重组融合蛋白，具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。该融合蛋白由人血管内皮生长因子与碱性成纤维细胞生长因子组成。

本发明还涉及本发明的重组载体和重组融合蛋白的新用途，它们可以被用作治病药物，从而预防或治疗缺血性疾病。

附图说明

图1为PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果。

Mr 100bP DNA Ladder IV

1-2  VEGF PCR产物

3-4  bFGF PCR产物

图2为重组质粒pGEM-T-V和pGEM-T-b酶切鉴定。

Mr1 Lamda DNA/HindIII

 Mr2 100bP DNA Ladder IV

 1、pGEM-T-V                        4、pGEM-T-b

 2、pGEM-T-V cut by HindIII         5、pGEM-T-b cut by EcoRI

 3、pGEM-T-V cut by HindIII/XbaI    6、pGEM-T-b cut by XbaI/EcoRI

图3为融合基因表达质粒pcDNA/V+b的构建。

图4为融合基因表达质粒pcDNA/V+b的酶切鉴定。

Mr1 Lamda DNA/HindIII

Mr2 100bP DNA Ladder IV

1、pcDNA/V+b

2、pcDNA/V+b cut by HindIII

3、pcDNA/V+b cut by HindIII/EcoRI

4、pcDNA/V+b cut by HindIII/XbaI

图5为目的基因VEGF/bFGF用T7引物测序的结果。

图6为目的基因VEGF/bFGF用BGH引物测序的结果。

图7为商品抗体VEGF与目的蛋白的Westren-blot分析。

1、293细胞培养上清样品

2、293细胞裂解液样品

3、293-pcDNA3.1(+)细胞培养上清样品

4、293-pcDNA3.1(+)细胞裂解液样品

5、293-hVEGF/bFGF细胞培养上清样品1#

6、293-hVEGF/bFGF细胞裂解液样品1#

7、293-hVEGF/bFGF细胞培养上清样品2#

8、293-hVEGF/bFGF细胞裂解液样品2#

图8为商品抗体bFGF与目的蛋白的Westren-blot分析。

1、293细胞培养上清样品

2、293细胞裂解液样品

3、293-pcDNA3.1(+)细胞培养上清样品

4、293-pcDNA3.1(+)细胞裂解液样品

5、293-hVEGF/bFGF细胞培养上清样品1#

6、293-hVEGF/bFGF细胞裂解液样品1#

7、293-hVEGF/bFGF细胞培养上清样品2#

8、293-hVEGF/bFGF细胞裂解液样品2#

图9为rhVEGF/bFGF诱导鸡胚绒毛尿囊膜血管新生示图。

A、生理盐水对照

B、293-pcDNA3.1(+)细胞培养上清

C、293-pcDNA3.1(+)细胞裂解液

D、293-hVEGF/bFGF细胞培养上清

E、293-hVEGF/bFGF细胞裂解液

具体实施方式

在本发明的具体实施方案中，应用基因工程技术将人血管内皮细胞生长因子与碱性成纤维细胞生长因子基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)上，重组成融合基因。融合基因中含有6个氨基酸的中间接头序列，同时对其5’端AUG侧翼序列进行翻译优化设计。重组质粒经酶切鉴定，证实有1.0kb的片段插入载体，其DNA序列经测序分析，结果与genebank的VEGF、bFGF基因序列和实验设计完全一致，成功构建了一种双因子融合基因的真核表达载体。

将融合基因表达载体转染人胚胎肾细胞(293细胞)，经G418筛选获得稳定表达的重组质粒细胞克隆。Western印迹结果表明表达产物为约40,000的蛋白，与预计的重组融合蛋白分子量相同，并同时具有对人VEGF和人bFGF两种抗体的免疫学活性。MTT检测证实重组融合蛋白能明显促进体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的分裂增殖。重组融合蛋白经鸡胚绒毛尿囊膜试验表明有促血管生成活性。

本发明所述构建携带人类VEGF165cDNA(hVEGF165)和人类bFGF(hbFGF)融合基因的真核表达质粒pcDNA/V+b的技术方法包括引物设计与合成、PCR反应、克隆载体的构建、融合基因表达载体的构建、感受态细胞的制备与重组质粒的转化、重组克隆的筛选及酶切鉴定、VEGF/bFGF融合基因序列的测定、进行质粒大量扩增、融合基因表达载体转染293细胞、重组质粒细胞克隆的筛选及表达等10个步骤。

以下通过实施例来进一步阐明本申请的内容。应当理解，实施例仅用于示例性说明申请的技术方案的具体实施方式，而不是以任何方式限定本申请的范围。

实施例1

步骤一、引物设计与合成(共设计2对4条引物)

引物1含有人VEGF信号肽序列及起始密码子ATG，ATG侧翼含有一段翻译优化序列5’CCACCATG 3’，优化序列上游引入HindIII酶切位点；

引物2去掉了VEGF的终止密码子TGA，加上中间6个氨基酸的接头序列及XbaI酶切位点：5’GGAGGCGGTGGT TCTAGA 3’；

引物3去掉了bFGF的起始密码子ATG，并加上XbaI酶切位点；

引物4中引入了EcoRI酶切位点。

引物由上海生物工程公司合成：

引物1：

5’CG  AAGCTT CCACC  ATG*AAC TTT CTG CTG TCT TGG 3’(SEQ ID NO：1)

      HindIII

引物2：

5’GC  TCTAGA  ACC ACC GCC TCC| CCG CCT CGG CTT GTC 3’(SEQ ID NO：2)

       XbaI

引物3：

5’CG  TCTAGA  CCC GCC TTG CCC GAG GAT GGC 3’(SEQ ID NO：3)

       XbaI

引物4：

5’GC  GAATTC  TCA*GCT CTT AGC AGA CAT TGG 3’(SEQ ID NO：4)

       EcoRI

步骤二、PCR反应

1、含人VEGFcDNA序列的质粒pcDNA/V和含人bFGFcDNA序列的质粒pcDNA/b均为本室构建保存，两个基因的克隆和质粒构建已发表论文[7][8]。表达载体pcDNA3.1(+)5428bp，购自Invitrogen公司，它含有CMV启动子，BGH多聚腺苷酸序列，多克隆位点位于CMV和BGH之间。

2、分别以pcDNA/V和pcDNA/b为模板，扩增VEGF、bFGF基因。

PCR反应体系：                      VEGF        bFGF

模板DNA(4μg/μl)：                1μl        1μl

dNTP(10mM)：                       1μl        1μl

引物1(10uM)：                      1μl

引物2(10uM)：                      lμl

引物3(10uM)：                                  1μl

引物4(10uM)：                                  1μl

TaqDNA聚合酶(1U/μl)：             1μl        1μl

10×反应缓冲液：                   5μl        5μl

加40μl无菌水补足反应体系至50μl，加入等体积50μl石蜡油，进行反应。

PCR扩增条件为：94℃预变性2分钟；94℃45秒，68℃3分钟，30个循环；末次反应于72℃延伸8分钟。

3、取5μlPCR产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，电泳结果(见图1)：分别在0.6kb和0.4kb处可见到特异性扩增条带，与预计的VEGF基因(原始序列576bp减去终止密码子再加连接肽和酶切位点共606bp)、bFGF基因(原始序列463bp减去信号肽序列加上酶切位点共459bp)的片段大小一致。

4、用Promega公司的WizardTM PCR Preps DNA Purification System回收目的条带。

1)从低熔点琼脂糖凝胶上切下PCR产物(体积不超过100μl)，放入1.5mlEppendorf管中。70℃水浴至胶完全融化。

2)配置2ml，80％异丙醇备用。

3)在融化的胶溶液中加入1ml树脂液体，均匀混合20秒。

4)取1只一次性注射器，与微型柱接口连接。

5)将树脂/DNA混合物加入注射器，用注射器推进器缓慢将混合物推入柱中。

6)取下注射器，拔出推进器，把注射器重新安到柱上，加入2ml 80％异丙醇。用注射器推进器缓慢将异丙醇推入柱中。

7)微型柱10,000g离心2分钟。

8)微型柱放入新1.5mlEppendorf管，加入50μl无菌水，室温放置10分钟，10,000g离心20秒。

9)-20℃保存纯化产物。

10)紫外分光广度法检测PCR纯化产物浓度，结果VEGF浓度为0.08μg/μl，bFGF浓度为0.05μg/μl。

步骤三、克隆载体的构建

1、pGEM-T载体试剂盒(包含T4DNA连接酶及2×反应缓冲液)购自Promega公司，将VEGF、bFGF的PCR纯化产物分别与pGEM-T载体连接，pGEM-T是一个高拷贝数的非表达载体，可以直接与PCR产物连接，重组克隆可直接通过蓝/白筛选检出。连接反应按Promega公司pGEM-T载体使用说明进行。VEGF、bFGF的PCR纯化产物与pGEM-T载体以3∶1的质量比进行DNA连接反应。

连接反应体系：                    VEGF      bFGF

载体DNA(50ng/μl)                 1μl      1μl

T4DNA连接酶                       1μl      1μl

PCR纯化产物                       2μl      3.5μl

2×反应缓冲液                     5μl      5μl

无菌水                            1μl

反应体系共10μl，混匀，离心，4℃水浴过夜连接。

2、取5μl连接产物转化高效感受态DH5α细菌细胞(购自博大泰克公司)。冰浴20分钟，室温放置10分钟，加入400μlLB培养基，37℃、200转/分培养1小时。LB培养基平板含氨苄青霉素70μg/ml，铺菌之前用200μl IPTG(100mg/ml)，20μl X-gal(90mg/ml)先涂板，室温放置30分钟，随后取100-200μl菌液铺平皿，37℃温箱培养12-16小时。

3、经氨苄青霉素及蓝白筛选，挑白色单菌落，液体培养后小量提取扩增。酶切鉴定分析。筛选出pGEM-T-V和pGEM-T-b重组质粒，进行酶切鉴定。

酶切反应体系：           pT/VEGF     pT/bFGF

质粒DNA                  5μl        5μl

HindIII                  1μl

XbaI                     1μl        1μl

EcoRI                                1μl

10×反应缓冲液           1μl        1μl

无菌水                   2μl        2μl

总体系10μl，混匀，37℃水浴2小时。

4、酶切反应产物经1.2％低熔点琼脂糖凝胶电泳后，电泳结果(见图2)表明PCR扩增的606bp的VEGF和459bp的bFGF片段已分别插入pGEM-T载体中。

步骤四、融合基因表达载体的构建(构建过程如图3所示)

1、用HindIII、XbaI酶切pGEM-T-V重组质粒，用XbaI、EcoRI酶切pGEM-T-b重组质粒，同时用HindIII、EcoRI酶切pcDNA3.1(+)载体。

酶切反应体系：          pT/VEGF     pT/bFGF       pcDNA3.1(+)

质粒DNA                   50μl        50μl         50μl

HindIII                   2μl                       2μl

XbaI                      2μl         2μl

EcoRI                                  2μl          2μl

10×反应缓冲液            6μl         6μl          6μl

总体系60μl，混匀，37℃水浴2小时。

2、酶切反应产物经1％低熔点琼脂糖凝胶电泳后，用Promega公司的WizardTM PCRPreps DNA Purification System回收目的条带，方法与前面相同。

3、紫外分光广度法检测酶切反应纯化产物浓度，结果VEGF浓度为0.155μg/μl，bFGF浓度为0.17μg/μl，pcDNA3.1(+)浓度为0.28μg/μl。

4、取回收的VEGF、bFGF片段与pcDNA3.1(+)片段以3∶1的质量比进行DNA连接反应。

连接反应体系：

载体DNA                     1μl

VEGF DNA                    5.4μl

bFGF DNA                    4.9μl

45℃水浴5分钟，0℃冰浴10分钟，再加入

T4DNA连接酶                 2μl

10×反应缓冲液              2μl

无菌水                      4.7μl

反应体系共20μl，混匀，离心，16℃水浴过夜连接。

步骤五、感受态细胞的制备及连接产物的转化

1、取出-80℃保存的DH5α菌株(购自博大泰克公司)，用无菌接种环蘸取少量菌液，在LB琼脂培养平板(无氨苄青霉素)上划线，37℃培养过夜。

2、挑取单个菌落接种于5mlLB培养基中，细菌培养于摇床中37℃、200转/分培养16小时。

3、取1ml该菌液接种于100ml LB培养基中，300转/分培养至OD600达到0.4。

4、将培养物置于冰上放置10分钟，在4℃离心机中4,000转/分离心10分钟。弃上清，加入10ml预冷的0.1mol/L的氯化钙(无菌)重悬沉淀。

5、冰浴30分钟后再次离心，沉淀以2ml冰预冷的氯化钙重悬，冰上放置1小时。分装备用，剩余的菌液加10％甘油储存于-80℃。

6、取8μl DNA连接产物加入200μl感受态细胞中，温和混匀，冰浴30分钟。

7、42℃水浴中热休克2分钟，再次冰浴2分钟后加入800μl LB培养基，于37℃、200转/分震荡培养1小时。

8、以200μl菌液铺LB琼脂培养平板(含氨苄青霉素70μg/ml)，37℃培养过夜。

步骤六、重组克隆的筛选及酶切鉴定

1、从转化后的LB培养基平板上挑取5个单菌落接种于5ml含氨苄青霉素70μg/ml LB培养基中，300转/分培养16小时。

2、以miniprep方法小量提取重组质粒，分别用HindIII、EcoRI两个酶和HindIII、XbaI两个酶对重组质粒进行双酶切鉴定。

酶切反应体系：               1              2

重组质粒DNA                  5μl           5μl

HindIII                      1μl           1μl

XbaI                                        1μl

EcoRI                        1μl

10×反应缓冲液               1μl           1μl

无菌水                       2μl           2μl

总体系10μl，混匀，37℃水浴2小时。

3、酶切产物经1.2％低熔点琼脂糖凝胶电泳后，电泳结果(见图4)HindIII、EcoRI双酶切得到两条带，一条是载体片段大约5.4kb，另一条1.0kb左右的条带，与VEGF+bFGF片段(含酶切位点)的大小1043bp一致。由于pcDNA3.1(+)载体的多克隆位点上，在EcoRI酶切位点后还有一个XbaI的酶切位点，用HindIII、XbaI双酶切重组质粒时得到三条带，一条是载体的片段大约5.4kb，VEGF+bFGF片段经XbaI酶切得到两条带：VEGF约596bp和bFGF约447bp(均含酶切位点)，且大小与插入片段一致，电泳结果(见图4)表明得到了融合基因表达载体pcDNA/V+b。

步骤七、VEGF/bFGF融合基因序列的测定

酶切鉴定正确的重组融合基因质粒pcDNA/V+b经上海生物工程公司ABIPRISMTM 377DNA Sequencer以T7 Promoter Primer和BGH Promoter Primer测序鉴定，进一步证实插入序列与genebanker和实验设计完全一致(见图5、6)。

基因序列(SEQ ID NO：5)

ATGAACTTTCTGCTGTCTTGGGTGCATTGGAGCCTTGCCTTGCTGCTCTACCTCCACCATGCCAAGTGGTCCCAGGCTGCACCCATGGCAGAAGGAGGAGGGCAGAATCATCACGAAGTGGTGAAGTTCATGGATGTCTATCAGCGCAGCTACTGCCATCCAATCGAGACCCTGGTGGACATCTTCCAGGAGTACCCTGATGAGATCGAGTACATCTTCAAGCCATCCTGTGTGCCCCTGATGCGATGCGGGGGCTGCTGCAATGACGAGGGCCTGGAGTGTGTGCCCACTGAGGAGTCCAACATCACCATGCAGATTATGCGGATCAAACCTCACCAAGGCCAGCACATAGGAGAGATGAGCTTCCTACAGCACAACAAATGTGAATGCAGACCAAAGAAAGATAGAGCAAGACAAGAAAATCCCTGTGGGCCTTGCTCAGAGCGGAGAAAGCATTTGTTTGTACAAGATCCGCAGACGTGTAAATGTTCCTGCAAAAACACAGACTCGCGTTGCAAGGCGAGGCAGCTTGAGTTAAACGAACGTACTTGCAGATGTGACAAGCCGAGGCGGGGAGGCGGTGGTTCTAGACCCGCCTTGCCCGAGGATGGCGGCAGCGGCGCCTTCCCGCCCGGCCACTTCAAGGACCCCAAGCGGCTGTACTGCAAAAACGGGGGCTTCTTCCTGCGCATCCACCCCGACGGCCGAGTTGACGGGGTCCGGGAGAAGAGCGACCCTCACATCAAGCTACAACTTCAAGCAGAAGAGAGAGGAGTTGTGTCTATCAAAGGAGTGTGTGCTAACCGTTACCTGGCTATGAAGGAAGATGGAAGATTACTGGCTTCTAAATGTGTTACGGATGAGTGTTTCTTTTTTGAACGATTGGAATCTAATAACTACAATACTTACCGGTCAAGGAAATACACCAGTTGGTATGTGGCACTGAAACGAACTGGGCAGTATAAACTTGGATCCAAAACAGGACCTGGGCAGAAAGCTATACTTTTTCTTCCAATGTCTGCTAAGAGCTGA

步骤八、质粒大量扩增

1、选鉴定正确克隆的菌液接种于2,500ml LB培养基中(含氨苄青霉素70μg/ml)进行质粒pcDNA/V+b的大量扩增，用QIAGEN公司的质粒大量提取试剂盒提取纯化。

2、纯化的重组质粒用紫外分光广度法检测浓度，结果pcDNA/V+b浓度为2.6μg/μl，pcDNA3.1(+)浓度为3.36μg/μl，A260/A280介于1.8-2.0，表明质粒纯化完全。

步骤九、融合基因表达载体转染293细胞

293细胞购自北京清源生物公司，细胞培养基DMEM、LipofectAMINE^TMReagent购自GIBCOBRL公司；胎牛血清购自HyClone公司；

1、293细胞(人胚胎肾细胞)按1×10⁴接种于6孔板，在CO₂培养箱中培养至50-80％的单层。

2、采用脂质体转染法，用LipofectAMINETM Reagent将融合基因表达质粒pcDNA/V+b转染293细胞，同时将pcDNA3.1(+)空质粒转染293细胞，按GIBCOBRL公司提供的操作程序进行。

1)取大量提质粒pcDNA/V+b，15.4μl和pcDNA3.1(+)，11.9μl稀释，稀释过程中用无水乙醇沉淀DNA，再溶解DNA至终浓度0.1μg/μl。

2)配置转染反应液(pcDNA/V+bl和pcDNA3.1(+)转染量及条件相同)

A液：36μl质粒溶液+1 64μl DMEM培养液(原液不含血清及双抗)

B液：24μl LipofectAMINETM Reagent+176μl DMEM培养液

3)A液加入B液管中，充分混匀，室温放置40分钟。

4)PBS洗涤细胞一遍，洗涤细胞一遍。

5)A、B混合液加1,600μl DMEM培养液(原液不含血清及双抗)至总体积2ml，每个样品两个孔，每个孔加1ml转染液。剩余两个孔各加1ml DMEM培养液(原液不含血清及双抗)作空细胞对照。37℃、5％CO2条件下培养4小时。

6)4小时后更换DMEM完全培养基(含血清及双抗)，继续培养。

步骤十、重组质粒细胞克隆的筛选及表达

1、重组质粒转染293细胞72小时后，用G418购自GIBCOBRL公司(800mg/ml)加压选择，同时用未转染的293细胞作阴性对照。4周后出现G418抗性细胞克隆，未转染质粒的293细胞基本死亡。挑选G418抗性细胞克隆，建立293-hVEGF/bFGF、293-pcDNA3.1(+)细胞株。

2、检测重组蛋白的表达，将293空细胞株，293-hVEGF/bFGF细胞株，和293-pcDNA3.1(+)细胞株，在细胞培养瓶中培养。

3、待细胞长满后，收集细胞培养上清和细胞裂解液。室温12,000转/分离心1分钟，取上清20μl加入6×SDS凝胶加样缓冲液4μl，混匀，100℃煮沸5分钟，然后以12,000转/分离心1分钟。

4、在12％SDS聚丙烯酰胺凝胶中各加入15μl悬液，相同样品加入两块凝胶中，同时进行电泳。

5、电泳后凝胶转膜，用兔抗人VEGF多克隆抗体和兔抗人bFGF多克隆抗体，以及山羊抗兔碱性磷酸酶标记的二抗分别对两块膜进行Westren-blot检测。

6、Westren-blot检测结果(见图7、8)，293空细胞、293-pcDNA3.1(+)细胞的对照细胞培养上清和细胞裂解液样品均没有特异条带出现。293-hVEGF/bFGF细胞培养上清样品在40KD位置有特异条带出现，表明重组融合基因在293细胞中得到表达，表达产物与预计的重组融合蛋白分子量(VEGF约23,000，bFGF约17,000)相符，而且重组融合蛋白同时具有对人VEGF和人bFGF两种抗体的免疫学活性。重组融合蛋白rhVEGF/bFGF的编码序列如下(SEQ ID NO：6)：

ATG AAC TTT CTG CTG TCT TGG GTG CAT TGG AGC CTT GCC TTG

Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu

M   N   F   L   L   S   W   V   H   W   S   L   A   L

CTG CTC TAC CTC CAC CAT GCC AAG TGG TCC CAG GCT GCA CCC

Leu Leu Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro

L   L   Y   L   H   H   A   K   W   S   Q   A   A   P

ATG GCA GAA GGA GGA GGG CAG AAT CAT CAC GAA GTG GTG AAG

Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys

M   A   E   G   G   G   Q   N   H   H   E   V   V   K

TTC ATG GAT GTC TAT CAG CGC AGC TAC TGC CAT CCA ATC GAG

Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu

F   M   D   V   Y   Q   R   S   Y   C   H   P   I   E

ACC CTG GTG GAC ATC TTC CAG GAG TAC CCT GAT GAG ATC GAG

Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu

T   L   V   D   I   F   Q   E   Y   P   D   E   I   E

TAC ATC TTC AAG CCA TCC TGT GTG CCC CTG ATG CGA TGC GGG

Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly

Y   I   F   K   P   S   C   V   P   L   M   R   C   G

GGC TGC TGC AAT GAC GAG GGC CTG GAG TGT GTG CCC ACT GAG

Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu

G   C   C   N   D   E   G   L   E   C   V   P   T   E

GAG TCC AAC ATC ACC ATG CAG ATT ATG CGG ATC AAA CCT CAC

Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His

E   S   N   I   T   M   Q   I   M   R   I   K   P   H

CAA GGC CAG CAC ATA GGA GAG ATG AGC TTC CTA CAG CAC AAC

Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn

Q   G   Q   H   I   G   E   M   S   F   L   Q   H   N

AAA TGT GAA TGC AGA CCA AAG AAA GAT AGA GCA AGA CAA GAA

Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu

K   C   E   C   R   P   K   K   D   R   A   R   Q   E

AAT CCC TGT GGG CCT TGC TCA GAG CGG AGA AAG CAT TTG TTT

Asn Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe

N   P   C   G   P   C   S   E   R   R   K   H   L   F

GTA CAA GAT CCG CAG ACG TGT AAA TGT TCC TGC AAA AAC ACA

Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr

V   Q   D   P   Q   T   C   K   C   S   C   K   N   T

GAC TCG CGT TGC AAG GCG AGG CAG CTT GAG TTA AAC GAA CGT

Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg

D   S   R   C   K   A   R   Q   L   E   L   N   E   R

ACT TGC AGA TGT GAC AAG CCG AGG CGG GGA GGC GGT GGT TCT

Thr Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg Gly Gly Gly Gly Ser

T   C   R   C   D   K   P   R   R   G   G   G   G   S

AGA CCC GCC TTG CCC GAG GAT GGC GGC AGC GGC GCC TTC CCG

Arg Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly Gly Ser Gly Ala Phe Pro

R   P   A   L   P   E   D   G   G   S   G   A   F   P

CCC GGC CAC TTC AAG GAC CCC AAG CGG CTG TAC TGC AAA AAC

Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn

P   G   H   F   K   D   P   K   R   L   Y   C   K   N

GGG GGC TTC TTC CTG CGC ATC CAC CCC GAC GGC CGA GTT GAC

Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg Val Asp

G   G   F   F   L   R   I   H   P   D   G   R   V   D

GGG GTC CGG GAG AAG AGC GAC CCT CAC ATC AAG CTA CAA CTT

Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu

G   V   R   E   K   S   D   P   H   I   K   L   Q   L

CAA GCA GAA GAG AGA GGA GTT GTG TCT ATC AAA GGA GTG TGT

Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys

Q   A   E   E   R   G   V   V   S  I   K   G   V   C

GCT AAC CGT TAC CTG GCT ATG AAG GAA GAT GGA AGA TTA CTG

Ala Asn Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu

A   N   R   Y   L   A   M   K   E   D   G   R   L   L

GCT TCT AAA TGT GTT ACG GAT GAG TGT TTC TTT TTT GAA CGA

Ala Ser Lys Cys Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg

A   S   K   C   V   T   D   E   C   F   F   F   E   R

TTG GAA TCT AAT AAC TAC AAT ACT TAC CGG TCA AGG AAA TAC

Leu Glu Ser Asn Asn Tyr Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr

L   E   S   N   N   Y   N   T   Y   R   S   R   K   Y

ACC AGT TGG TAT GTG GCA CTG AAA CGA ACT GGG CAG TAT AAA

Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys Arg Thr Gly Gln Tyr Lys

T   S   W   Y   V   A   L   K   R   T   G   Q   Y   K

CTT GGA TCC AAA ACA GGA CCT GGG CAG AAA GCT ATA CTT TTT

Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe

L   G   S   K   T   G   P   G   Q   K   A   I   L   F

CTT CCA ATG TCT GCT AAG AGC TGA

Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser

L   P   M   S   A   K   S

实施例2

MTT法检测重组蛋白刺激血管内皮细胞增殖活性

1、脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)、细胞培养基Medium-200购自北京清源生物公司，HUVEC为本实验室传代保存。HUVEC细胞按1×10⁴接种于12孔板，在CO₂培养箱中培养至50％-80％的单层。

2、采用脂质体转染法，用GIBCOBRL公司的LipofectAMINETM Reagent将融合基因表达质粒pcDNA/V+b转染HUVEC细胞，按GIBCOBRL公司提供的操作程序进行。

1)取大量提质粒pcDNA/V+b，15.4μl和pcDNA3.1(+)，11.9μl稀释，稀释过程中用无水乙醇沉淀DNA，再溶解DNA至终浓度0.1μg/μl。

2)配置转染反应液(pcDNA/V+bl和pcDNA3.1(+)转染量及条件相同)

A液：18μl质粒溶液+82μl Medium-200培养液(原液不含血清及双抗)

B液：12μlLipofectAMINETM Reagent+88μl Medium-200培养液

3)A液加入B液管中，充分混匀，室温放置40分钟。

4)PBS洗涤细胞一遍，洗涤细胞一遍。

5)A、B混合液加600μl Medium-200培养液(原液不含血清及双抗)至总体积800μl，每个样品4个孔，每个孔加200μl转染液。剩余4个孔各加200μl Medium-200培养液(原液不含血清及双抗)作空细胞对照。37℃、5％CO₂条件下培养4小时。

6)4小时后更换Medium-200完全培养基(含血清及双抗)，继续培养。

3、重组质粒pcDNA/V+b转染HUVEC细胞，于37℃、5％CO₂条件下培养72小时后，PBS清洗24孔板中的细胞。每孔加MTT反应液500μl，37℃孵育4小时，加二甲基亚砜(DMSO)500μl使沉淀溶解，24孔板中的样品每1孔取100μl，分别加入96孔酶标板中，每4个孔为1个重复，用酶标仪读取A₅₇₀的值。

4、统计学方法：数据用均值±标准差表示，用SPSS10.0做t检验，α＝0.05为显著性水平。

5、MTT检测根据酶标仪读取的各样品组的A₅₇₀值(表1)，计算促细胞生长活性，公式为：促生长率(％)＝(实验组-对照组)/对照组×100％，与pcDNA3.1(+)空质粒对照组相比，pcDNA/V+b转染HUVEC细胞后，表达产物能够刺激HUVEC细胞对MTT的摄取，促生长率为11.67％；用SPSS10.0做t检验，两组比较p＜0.05，差异有显著性，表明pcDNA/V+b组表达产物具有刺激HUVEC细胞增殖的生物学活性。

表1  rhVEGF/bFGF促HUVEC增殖作用(MTT法)A570值

组别	例数	A570值
			对照组pcDNA/V+b组	1616	0.120±0.014*0.134±0.015*

^*P＜0.05

实施例3

鸡胚绒毛尿囊膜血管生成实验

1、利用鸡胚绒毛尿囊膜法检测rhVEGF/bFGF在293细胞中表达产物的生物学活性，实验方法参照文献[9]进行。

2、9日龄的鸡胚在气室下方开0.5cm²的小洞露出尿囊膜，分别把沾有10μl293-hVEGF/bFGF细胞的培养上清、细胞裂解液样品的无菌滤纸小圆片(直径4mm)放于尿囊膜上，并以等量的生理盐水，293-pcDNA3.1(+)细胞的培养上清、细胞裂解液样品为对照。

3、用无菌透明胶封口，于37℃孵箱中继续培养3天，观察鸡胚血管生成情况。

4、实验结果(图8)显示：与生理盐水组和pcDNA3.1(+)空质粒对照组相比，pcDNA/V+b组的细胞培养上清样品和细胞裂解液样品，均有促进鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的作用，pcDNA/V+b组的细胞培养上清样品作用更明显。表明重组融合蛋白rhVEGF/bFGF具有促血管生成的生物学活性。

通过以上实验结果证明：我们成功构建了重组人血管内皮细胞生长因子与碱性成纤维细胞生长因子融合基因真核表达载体，并对其进行了表达，得到重组融合蛋白rhVEGF/bFGF。生物学活性研究证实重组融合基因质粒的表达产物具有刺激HUVEC增殖和促血管生成的作用，是治疗缺血性疾病的极具发展潜力的因子之一。

参考文献

[1]Isner JM，Walsh K，Symes J，et al.Aterial gene therapy for the therapeutic angiogenesispatients with peripheral artery disease [J].Cirulalicm，1995，91(11)：2687-2692.

[2]Ferrara N，Davis-Smyth T.The biology of vascul ar endothelial growth factor [J].EndocrRev，1997，18(1)：4-25.

[3]Symes JF，Losordo DW，Vale PR，et al.Gene therapy with vascular endothelial growthfactor for inoperable coronary artery disease.Ann Thorac Surg [J].1999，68(3)：830-836.

[4]Sarkar N，Ruck A，Kallner G，et al.Effects of intramyocardial injection of phVEGF-A165as sole therapy in patients with refractory coronary artery disease-12-month follow-up：angiogenic gene therapy [J].J Intern Med，2001，250(5)：373-381.

[5]Connolly DT，Heuvelman DM，Nelson R，et al.Tumor vascular permeability factorstimulates endothelial cell growth and angiogenesis.J Clin Invest，1989，84：1470

[6]Gospodarowiez D.Fibroblast growth factor：from gene to clinical application.Cell BiolRev，1991，25：307

[7]祁雅慧，王雅梅，孙丽翠等.血管内皮生长因子基因的克隆、表达及生物活性分析解剖学报2004，35(4)：396

[8]祁雅慧，王雅梅，孙丽翠等.人碱性成纤维细胞生长因子基因的克隆、表达及生物活性分析中华中西医杂志  2004，5(13)：1217

[9]姜志钢，鄂征.鸡胚绒毛尿囊膜检测肿瘤促血管生长作用改良技术方法[J].解剖学杂志，1989，12(2)：143-145

序列表

<110>首都医科大学

<120>重组人VEGF与bFGF真核表达载体、融合蛋白及其用途

<130>CP1050020

<140>200510051165.2

<141>2005-03-02

<160>6

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>34

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>1

cgaagcttcc accatgaact ttctgctgtc ttgg     34

<210>2

<211>35

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>2

gctctagaac caccgcctcc ccgcctcggc ttgtc    35

<210>3

<211>29

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>3

cgtctagacc cgccttgccc gaggatggc     29

<210>4

<211>29

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>4

gcgaattctc agctcttagc agacattgg    29

<210>5

<211>1032

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>融合基因

<400>5

atgaactttc tgctgtcttg ggtgcattgg agccttgcct tgctgctcta cctccaccat     60

gccaagtggt cccaggctgc acccatggca gaaggaggag ggcagaatca tcacgaagtg    120

gtgaagttca tggatgtcta tcagcgcagc tactgccatc caatcgagac cctggtggac    180

atcttccagg agtaccctga tgagatcgag tacatcttca agccatcctg tgtgcccctg    240

atgcgatgcg ggggctgctg caatgacgag ggcctggagt gtgtgcccac tgaggagtcc    300

aacatcacca tgcagattat gcggatcaaa cctcaccaag gccagcacat aggagagatg    360

agcttcctac agcacaacaa atgtgaatgc agaccaaaga aagatagagc aagacaagaa    420

aatccctgtg ggccttgctc agagcggaga aagcatttgt ttgtacaaga tccgcagacg    480

tgtaaatgtt cctgcaaaaa cacagactcg cgttgcaagg cgaggcagct tgagttaaac    540

gaacgtactt gcagatgtga caagccgagg cggggaggcg gtggttctag acccgccttg    600

cccgaggatg gcggcagcgg cgccttcccg cccggccact tcaaggaccc caagcggctg    660

tactgcaaaa acgggggctt cttcctgcgc atccaccccg acggccgagt tgacggggtc    720

cgggagaaga gcgaccctca catcaagcta caacttcaag cagaagagag aggagttgtg    780

tctatcaaag gagtgtgtgc taaccgttac ctggctatga aggaagatgg aagattactg    840

gcttctaaat gtgttacgga tgagtgtttc ttttttgaac gattggaatc taataactac    900

aatacttacc ggtcaaggaa atacaccagt tggtatgtgg cactgaaacg aactgggcag    960

tataaacttg gatccaaaac aggacctggg cagaaagcta tactttttct tccaatgtct    1020

gctaagagct ga                                                        1032

<210>6

<211>343

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>融合蛋白

<400>6

 Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu

 1               5                   10                  15

 Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly

             20                  25                  30

 Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln

         35                  40                  45

Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu

    50                  55                  60

Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu

65                  70                  75                  80

Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro

                85                  90                  95

Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His

            100                 105                 110

Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys

        115                 120                 125

 Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Asn Pro Cys Gly

     130                 135                 140

 Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr

 145                 150                 155                 160

 Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln

                 165                 170                 175

 Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg Gly

             180                 185                 190

 Gly Gly Gly Ser Arg Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly Gly Ser Gly Ala

         195                 200                 205

 Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn

     210                 215                 220

Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val

225                 230                 235                 240

Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu

                245                 250                 255

Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn Arg Tyr Leu Ala

            260                 265                 270

Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Cys Val Thr Asp Glu

        275                 280                 285

Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr Asn Thr Tyr Arg

    290                 295                 300

Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys Arg Thr Gly Gln

305                 310                 315                 320

Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe

                325                 330                 335

Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser

            340

Claims (6)

1.一种重组真核表达载体，其中在真核表达载体中含有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列组成的融合基因。

2.权利要求1的重组载体，其中所述真核表达载体为pcDNA3.1(+)。

3.权利要求2的重组载体，所述载体是如图3所示的pcDNA/V+b载体。

4.一种融合蛋白，具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。

5.权利要求1-3之一的重组载体在制备预防或治疗缺血性疾病的药物中的用途。

6.权利要求4的重组蛋白在制备预防或治疗缺血性疾病的药物中的用途。

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