ES2331252T3 - Inhibidor tisular de metaloproteinasas (timp) unido a anclajes de glucosilfosfatidilinositol (gpi) para el tratamiento del cancer. - Google Patents

Inhibidor tisular de metaloproteinasas (timp) unido a anclajes de glucosilfosfatidilinositol (gpi) para el tratamiento del cancer. Download PDF

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Abstract

El uso de una construcción de fusión que comprende una secuencia de aminoácidos de un inhibidor tisular de metaloproteinasas (TIMP) o un fragmento biológicamente activo del mismo, que inhibe las metaloproteínas de la matriz activas, en el que dicho TIMP o fragmento biológicamente activo del mismo está unido a un anclaje glucosilfosfatidilinositol (GPI) para la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer.

Description

Inhibidor tisular de metaloproteinasas (TIMP) unido a anclajes de glucosilfosfatidilinositol (GPI) para el tratamiento del cáncer.
La presente invención se refiere al uso de construcciones de fusión de inhibidores tisulares de metaloproteinasas (TIMP) anclados a glucosilfosfatidilinositol (GPI) para el tratamiento del cáncer. Mediante esta estrategia, las proteínas TIMP ancladas a GPI se incorporan a la membrana superficial de las células tumorales y hacen que las células tumorales sean sensibles a la apoptosis inducida por FAS. En una realización, el TIMP se une a una mucina, a lo que sigue un GPI para potenciar su integración en la superficie. El uso de GPI para unir el TIMP hace que la proteína de fusión resultante sea especialmente útil como fármaco anticanceroso para el tratamiento del cáncer y, en particular, del cáncer residual después de una resección quirúrgica incompleta de tumores primarios en un individuo.
Antecedentes de la invención
El tratamiento del cáncer sigue siendo una tarea exigente y emplea diferentes estrategias y técnicas, que son más o menos eficaces. Una técnica es aumentar la sensibilidad de las células cancerosas a la lisis mediada por el sistema inmunológico. La sensibilidad de los tumores a la lisis mediada por el sistema inmunológico se ha asociado a la biología de las metaloproteinasas de la matriz (MMP) y, específicamente, a la expresión en la superficie celular de MMP por la célula tumoral diana. Las metaloproteinasas de la matriz (MMP) degradan componentes de la matriz extracelular y se han relacionado con la remodelación del tejido, invasión tumoral y metástasis (Egeblad y Werb, 2002; Itoh y Nagase, 2002). La actividad MMP también se ha asociado con la eficacia de la apoptosis mediada por perforina/granzima y FAS (revisado en Egeblad y Werb, 2002). Se ha demostrado que la actividad MMP está regulada a muchos niveles, que incluyen cuatro inhibidores endógenos, el inhibidor tisular de las metaloproteinasas de la matriz (TIMP-1, 2, 3 y 4 (Brode y Maskos, 2003). In vivo, el equilibrio entre MMP y TIMP determina si se produce reabsorción o depósito de la matriz (Nagase y Woessner, 1999).
Los inhibidores tisulares de metaloproteínas (TIMP) endógenos muestran diversas funciones fisiológicas/bioló-
gicas, como la moderación del crecimiento tumoral, metástasis y apoptosis. Estas actividades biológicas diversas de los TIMP se han relacionado en parte con la estequiometría de las interacciones entre TIMP/MMP/proteínas de la superficie celular. El reclutamiento de linfocitos citotóxicos representa una posible ruta en la defensa frente a tumores. Aunque se han identificado linfocitos T citotóxicos (CTL) y linfocitos citolíticos naturales (células NK) que se infiltran y reconocen células tumorales, a menudo no se consigue desarrollar de forma eficaz una inmunidad antitumoral eficiente. Esta ineficacia es una de las razones que impiden la completa eliminación de las células tumorales residuales después de una recesión quirúrgica incompleta, debido a un estadio avanzado de la enfermedad o a una imposibilidad para operar a nivel local. Actualmente, la etiología de esta deficiencia funcional de los linfocitos citotóxicos sigue sin estar clara.
En general, los efectos antitumorales de los CTL y de las células NK están mediados por las rutas de apoptosis mediadas por perforina/granzima o FAS (CD95/CSD95L) (Kagi y col. 1994). La ruta de la perforina está mediada por citotoxinas secretadas durante el reconocimiento de los CTL o las células NK de las células diana (Kagi y col., 1994). El CD95, o receptor de muerte FAS, pertenece al regulador de la familia de proteínas de muerte celular y es de central importancia en la apoptosis mediada por el sistema inmunológico de células tumorales (Nagata, 1999). FAS/CD95/Apo-1 humano es un receptor glucoproteico transmembrana único (325 aminoácidos, 45-48 kDa). El ligando de FAS (ligando FAS, FASL, CD95L) es una proteína integral de membrana y es una glucoproteína transmembrana de tipo II. FASL es un miembro de la familia del TNF, que incluye TNF\alpha, cadenas \alpha y \beta de la linfotoxina (LT), ligando CD40 y ligando CD30. La acción de FAS está mediada a través de FADD (dominio de muerte asociado a FAS)/MORT1, una proteína adaptadora que tiene un dominio de muerte en su extremo C-terminal y se une al dominio de muerte citoplasmático de FAS. Se ha encontrado que muchos tumores son resistentes a la apoptosis medida a través de la ruta de FAS (Frost y col., 2003; revisado en Igney y Krammer, 2002).
Se han utilizado líneas celulares de carcinoma de células renales como ejemplo de un sistema modelo para probar las construcciones TIMP-GPI de la presente invención. El carcinoma de células renales (RCC) es la séptima causa principal de cáncer. Aproximadamente un tercio de los pacientes con RCC tienen enfermedad metastásica en su presentación y hasta el 50% recae después de la nefrectomía (Vogelzang y Stadler, 1998). El RCC es difícil de tratar y las terapias inmunológicas, como interferón alfa e interleucina 2, generalmente son más eficaces que la quimioterapia o la radiación (Vogelzang y Stadler, 1998).
Los linfocitos citotóxicos representan un posible componente de la defensa frente a tumores como el RCC.
Un miembro de la familia TIMP, TIMP-1, es un inhibidor de MMP con un amplio espectro de acción (Bode y Maskos, 2003). Es una proteína soluble que puede detectarse en la superficie celular sólo a través de su asociación con proteínas unidas a la superficie (Brew y col., 2000; Klier y col., 2001). El papel general de TIMP-1 en la biología del cáncer sigue siendo objeto de publicaciones contradictorias (Brand, 2002). Hasta la fecha, se acepta que TIMP-1 tiene una función en la angiogénesis, migración celular y proliferación (Brand, 2002). Recientemente, se demostró que una proteína TIMP-1 anclada a GPI mostraba una pronunciada supresión de la migración de células endoteliales en respuesta a bFGF (Djafarzadeh R y col., 2004).
Ahonen y col. (Oncogene, vol. 22, 2003, páginas 2121-2134) describen que TIMP-3 induce apoptosis en células de melanoma. Nagel y col. (Histopathology, vol. 44, 2004, páginas 222-231) describen la expresión de MMP-2 y MMP-9 y sus inhibidores tisulares TIMP-1, 2 y 3 en tumores benignos y malignos de las glándulas salivares. Hayakawa y col. (FEBS Letters, vol. 298, 1992, páginas 29-32) describen que el aumento de la expresión de TIMP-1 estimula el crecimiento celular en células normales y tumorales, mientras que Ikenaka y col. (Int. J. Cancer, vol. 105, 2003, páginas 340-346) describen que TIMP-1 inhibe el crecimiento tumoral. Bond y col. (J. Biol. Chem, vol. 277, 2002, páginas 13787-13795) describen que TIMP-3 induce apoptosis mediada por FAS en células HeLa. Moniaux y col. (British J. Cancer, vol. 91, 2004, páginas 1633-1638), el documento WO 01/57068 y Apostolopoulos y col. (Cancer Letters, vol. 90, 1995, páginas 21-26) describen que las células tumorales sobreexpresan mucina.
Las estrategias y técnicas convencionales para el tratamiento del cáncer siguen sufriendo el problema de que es difícil eliminar las células tumorales una vez que el tumor se ha desarrollado. Normalmente, los tumores primarios se eliminan del paciente mediante cirugía. Sin embargo, en algunos casos, no todas las regiones son accesibles para el cirujano y, por tanto, las células tumorales permanecen en el organismo donde pueden desarrollar tumores secundarios. Esto es un resultado de la resección quirúrgica incompleta del tumor primario.
Por tanto, la presente invención proporciona un fármaco anticanceroso eficaz y una estrategia para reducir o aliviar la proliferación de las células tumorales en un individuo, en particular, en un paciente que se ha sometido a una resección quirúrgica incompleta de un tumor primario. Los fármacos anticancerosos de la presente invención son útiles para matar las células tumorales tanto en líneas celulares in vitro como en tejidos in vivo.
Resumen de la invención
La presente invención proporciona fármacos antitumorales y procedimientos novedosos según se define en las reivindicaciones adjuntas.
La presente invención se basa en el sorprendente hallazgo de que TIMP anclado a GPI reduce o alivia de forma eficaz la proliferación de las células cancerosas y estimula la muerte de estas células tanto en líneas celulares in vitro como in vivo. Los determinantes estructurales y funcionales de TIMP se han combinado con un anclaje de glucosilfosfatidilinositol (GPI) para generar un fármaco quimioterapéutico muy eficaz. Esta técnica explota que las proteínas TIMP ancladas mediante glucosilfosfatidilinositol (GPI) se incorporan a las membranas superficiales cuando se purifican y se añaden a células cancerosas. La fusión de TIMP-GPI con un dominio mucina puede potenciar la presentación de las proteínas TIMP sobre la membrana superficial celular y hace que la construcción de fusión sea más eficaz para hacer que las células cancerosas sean sensibles a la destrucción mediada por el sistema inmunológico.
En los siguientes ejemplos, la presente invención demuestra que TIMP tiene el potencial para la inhibición del crecimiento de células tumorales y reducción del desarrollo del tumor tanto en líneas celulares in vitro como en tejidos in vivo. La unión de TIMP a un anclaje GPI y la administración exógena de TIMP anclado a GPI da lugar a una inserción eficaz de la proteína TIMP en las membranas celulares de las células cancerosas. La expresión en la superficie de TIMP-1 anclado a GPI inducía una diversidad de efectos biológicos en las líneas celulares cancerosas con posible relevancia terapéuticas, como la inducción de la ruta apoptótica mediada por FAS en las células cancerosas. Como se muestra en los ejemplos, se observó que la supresión de la proliferación de las células cancerosas dependía de la dosis.
La proteína TIMP-1 anclada a GPI también bloque la secreción de proMMP-2 y proMMP-9 y altera drásticamente la asociación con la superficie celular de diversas MMP. Más significativamente, las líneas de células tumorales que normalmente son resistentes a la apoptosis mediada por FAS se hacen sensibles a la muerte mediada por FAS/CD95. El tratamiento con GPI-TIMP da lugar a una regulación por disminución de la proteína antiapoptótica BCL2 y el aumento correspondiente de la proteína proapoptótica BAX. Este cambio hacia una concentración mayor de proteínas proapoptóticas puede ser una razón para el aumento de la sensibilidad a la apoptosis mediada por FAS de las células cancerosas cuya superficie ha sido manipula por ingeniería genética con TIMP.
Usando la técnica anterior, se ha comprobado que las proteínas o polipéptidos TIMP anclados a GPI de la presente invención son especialmente útiles en aplicaciones terapéuticas para el tratamiento del cáncer residual después de resección quirúrgica incompleta del tumor primario, como en el cáncer de mama avanzado, osteosarcoma, carcinoma de células renales o en tumores cerebrales malignos, p. ej., glioblastoma.
Además, puesto que las células tumorales, como las del carcinoma de células renales (RCC), son intrínsecamente resistentes a la muerte mediada por FAS, la presente invención proporciona una medio eficaz para hacer a las células tumorales susceptibles a la apoptosis mediada por FAS.
La presente invención describe una construcción de fusión (TIMP-mucina-GPI) que comprende una secuencia de aminoácidos de un inhibidor tisular de metaloproteinasas (TIMP) o un fragmento biológicamente activo del mismo, en la que dicho TIMP o fragmento biológicamente activo del mismo está unido a una secuencia de aminoácidos de un dominio de mucina seguido de una secuencia de aminoácidos de un anclaje glucosilfosfatidilinositol (GPI).
En una realización preferida, el extremo 3' de TIMP se fusiona directamente con una secuencia enlazadora GPI y no contiene un dominio de mucina (TIMP-GPI).
Preferiblemente, la mucina puede ser un domino de mucina unido a membrana y puede comprender una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo compuesto por MUC1, MUC3A, MUC3B, MUC4, MUC11, MUC12, MUC16 y MUC17, o variantes o porciones de las misma (las mucinas anteriores se revisan en Moniaux N y col., 2004). Además, puede usarse un tallo de mucina que se aísla de la quimiocina CXCL16 asociada a la superficie o fractalcina (CX3CL1).
El TIMP según se usa en el presente documento deriva, preferiblemente, de un mamífero, más preferiblemente de un humano (los cuatro TIMP se revisan en Mannello F y col., 2001). Ejemplos de proteínas TIMP que pueden usarse según la presente invención son TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3 o TIMP-4 y sus correspondientes variantes en otros organismos, como ratón, conejo, perro, gato, oveja, vaca, etc.
El anclaje GPI según se usa en la presente invención, deriva preferiblemente del antígeno asociado a la función del linfocito (LFA-3), o una porción del mismo, e incluye una secuencia señal de GPI que media en la asociación a la membrana.
La presente invención también describe una molécula de ácido nucleico, como ARN o ADN, que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la construcción TIMP-anclaje GPI de la invención.
La molécula de ácido nucleico de la invención puede estar contenida en un plásmido de expresión, un vector o una célula hospedadora para la expresión de la molécula de ácido nucleico de la invención.
La presente invención también describe el uso de las construcciones de fusión TIMP-GPI o TIMP-mucina-GPI de la invención para el tratamiento del cáncer, especialmente el cáncer residual tras la extirpación quirúrgica de un tumor primario.
La presente invención describe las construcciones de fusión TIMP-GPI o TIMP-mucina-GPI contenidas en una composición farmacéutica o medicamento. Las construcciones de fusión TIMP-GPI o TIMP-mucina-GPI de la invención pueden usarse como agentes o fármacos anticancerosos. En un modo de aplicación preferido, los fármacos anticancerosos de la invención se administrarán y aplicarán a nivel local en el lugar de la resección de la masa tumoral, en pacientes con tumores de alto riesgo con un alto riesgo de células cancerosas residuales y mayor incidencia de recaída local y en aquellos pacientes con un tumor residual obvio debido a una enfermedad en estadio avanzado o imposible de operar a nivel local. Preferiblemente, la construcción de fusión se administra mediante pulverización dentro de la herida y/o mediante inyección en las regiones no disponibles para la cirugía.
La presente invención describe un procedimiento in vitro para la inhibición de la proliferación de células cancerosas que comprende las etapas de someter una línea de células cancerosas a una cantidad eficaz de construcciones de fusión TIMP-mucina-GPI o TIMP-GPI.
Definiciones
El término "TIMP", según se utiliza en el presente documento, significa un inhibidor tisular endógeno de metaloproteinasas, que es conocido por estar implicado en funciones fisiológicas/biológicas como la inhibición de las metaloproteinasas activas de la matriz, regulación de la activación de proMMP, crecimiento celular y la modulación de la angiogénesis. La "familia de TIMP" humana contiene cuatro miembros, TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3 y TIMP-4. Un miembro preferido que se usa en la presente invención, TIMP-1, es una proteína secretada que puede detectarse en la superficie celular a través de su interacción con proteínas de la superficie (Bodes y Maskos, 2003).
El término "MMP" según se usa en el presente documento, significa una metaloproteinasa de la matriz que pertenece a la superfamilia de MMP representada por al menos 26 metaloendopeptidasas que degradan la matriz extracelular, que actúan durante el desarrollo y la diferenciación tisular, infiltración celular, cicatrización de heridas y como moderadores de la respuesta inmune.
El término "GPI" según se usa en el presente documento, significa fosfolípidos de glucoinositol, en especial, glucosilfosfatidilinositol como se describe en Medof y col., 1996. Estos anclajes similares a fosfolípidos tienen una estructura común de unión a la membrana independientemente de la función de la proteína. Las unidades de anclaje GPI están compuestas de un glucano lineal que contiene una fosfoetanolamina, tres restos de manosa y una glucosamina no acetilada unida a un fosfolípido del inositol. La secuencia de GPI contiene las señales que dirigen el anclaje de GPI.
El término "mucina" o "dominio de mucina" según se usa en el presente documento, significa componente glucoproteico unido o no a la membrana. Normalmente, las mucinas unidas a la membrana muestran secuencias hidrófobas o dominios transmembrana responsables de su anclaje en la bicapa lipídica y, opcionalmente, contienen uno o varios dominios similares al factor de von Villebrandt, que funciona en la oligomerización de monómeros de mucina y en el empaquetamiento dentro de vesículas secretoras. El término "mucina" o "dominio de mucina" según se usa en este documento, también abarca tallos de mucina y dominios similares a mucina, como los tallos de mucina que se encuentran en las quimiocinas CXCL16 o fractalcina (CX3CL1).
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Una construcción de fusión "TIMP-GPI" según se usa en el presente documento, se refiere a un TIMP que se fusiona directamente con una secuencia de unión a GPI. La construcción de fusión TIMP-GPI se diseña sustituyendo el extremo 3' de la secuencia de ARNm o ADNc de proteínas ancladas a GPI de forma natural (es decir, una secuencia que contiene las señales que dirigen el anclaje a GPI) por el extremo 3' de la secuencia de ARNm o ADNc del TIMP endógeno.
Una "TIMP-mucina-GPI" según se usa en el presente documento, se refiere a un TIMP que se fusiona directamente con un dominio de mucina seguido de una secuencia de anclaje GPI. La construcción de fusión TIMP-GPI se diseña como se describe para TIMP-GPI, aunque incluyendo la secuencia de aminoácidos de un dominio de mucina entre las secuencia de aminoácidos de TIMP y GPI.
El término "RCC" significa carcinoma de células renales, que se considera como un tumor progresivo con opciones terapéuticas limitadas debido a la resistencia al tumor a agentes quimioterapéuticos actuales y a la radiación. RCC sirve como sistema modelo en la presente invención para mostrar la actividad antitumoral de TIMP anclado a GPI. Las líneas celulares modelo utilizadas en la presente invención son las líneas celulares RCC-26 y RCC-53 que se establecieron a partir de pacientes con carcinomas de células en estadio I y estadio IV.
El término "FAS" significa un miembro de la familia del factor de necrosis tumoral/receptor del factor de crecimiento nervioso que induce apoptosis independiente de TNF-\alpha. Otras abreviaturas conocidas en la técnica para FAS son Apo1 (= proteína inductora de apoptosis 1) y CD95.
Descripción detallada de la invención
La ingeniería de proteínas de las superficies celulares es una tecnología potencialmente poderosa mediante la cual puede manipularse la composición proteica de la superficie de las células sin transferencia génica. Sustituyendo el ARNm derivado de la secuencia de ADNc de una proteína unida a GPI que contiene el dominio señal de GPI para la región carboxilo terminal de una proteína de interés, es posible generar una construcción de fusión que codifique una proteína unida a GPI.
Esta técnica ofrece múltiples ventajas sobre técnicas de transferencia génica más tradicionales. Por ejemplo, el procedimiento es aplicables a las células que son difíciles o imposibles de transfectar (p. ej., endotelio microvascular primario, células diana primarias, etc.). La cantidad de proteína añadida a la superficie de la célula puede controlarse y cuantificarse (mediante FACS o inmunofluorescencia). Además, pueden insertarse de forma secuencial o simultánea muchas proteínas ancladas a GPI en las mismas células. Mediante la ingeniería molecular es posible expresar un epítope etiqueta adicional que ayude a la purificación de la proteína, así como para controlar el reactivo durante los experimentos. El agente puede inyectarse directamente dentro del área tumoral o peritumoral y determinarse el efecto del reclutamiento selectivo de leucocitos sobre el crecimiento del tumor o la apoptosis inducida FAS.
El pronóstico de tumores malignos depende principalmente de sus estadios clínico y patológico. Mientras que la mayoría de los carcinomas (p. ej., tumores primarios y secundarios) puede extirparse completamente mediante cirugía en la mayoría de los casos, a menudo no es posible una nueva resección del cáncer en estadio avanzado y se relaciona con la recurrencia temprana de la enfermedad y un aumento de la mortalidad relacionada con la enfermedad.
Especialmente en el caso del cáncer de mama, la enfermedad en estadio avanzado con un tumor de gran tamaño (> 2 cm) se asocia con la aparición de metástasis distantes y supervivencia limitada. También se considera que un volumen de tumor grande es un parámetro crítico para la presencia de cáncer residual, lo que representa también un riesgo alto de recaída local y la propagación de metástasis distantes. Asimismo, tumores cerebrales como el glioblastoma (astrocitoma de grado IV) es otra posible diana para la vigilancia tumoral, ya que la extirpación quirúrgica completa es casi siempre imposible y la recaída local se produce en el 95% de los casos durante el año siguiente a la cirugía primaria.
Para resolver el problema ligado al cáncer residual fue necesario encontrar una nueva opción de terapia contra el cáncer que es especialmente útil para el tratamiento del cáncer residual tras una resección quirúrgica incompleta.
Como solución, la presente invención proporciona TIMP anclados a GPI, que pueden aplicarse a nivel local dentro de los márgenes de la recesión para atraer a las células inmunes y centrarse en el tumor residual supervisando las células cancerosas residuales.
Para este fin, las proteínas TIMP se anclan mediante GPI y, cuando se purifican y se añaden a las células cancerosas, se incorporan a sus membranas superficiales y son completamente funcionales. Sustituyendo el extremo 3' de secuencias de del ARNm de proteínas ancladas a GPI de origen natural (es decir, una secuencia que contiene las señales que dirigen el anclaje a GPI) por la secuencia 3' terminal del ARNm endógeno, puede expresarse prácticamente cualquier proteína TIMP como derivado anclado a GPI.
En la presente invención, la incorporación de la proteína GPI-TIMP purificada en las membranas superficiales de las líneas de células tumorales se demuestra mediante la incubación de las líneas celulares con TIMP-1-GPI, TIMP-1-mucina-GPI o proteína control TIMP-1 (rh) recombinante humana purificada. Como se detalla a continuación, la expresión superficial de TIMP-1 anclado a GPI da lugar a una fuerte señal de superficie para TIMP-1.
A diferencia de los anclajes polipeptídicos convencionales, que tienen secuencias transmembrana diferentes y conectan con extensiones citoplasmáticas específicas, estos anclajes similares a fosfolípidos utilizan una estructura común como mecanismo general de unión a la membrana independientemente de la función de la proteína. Las unidades de anclaje GPI están compuestas de un glucano lineal que contiene una fosfoetanolamina, tres restos de manosa y una glucosamina no acetilada unida a un inositol fosfolípido. Su fabricación se inicia en el retículo endoplásmico (RE) y se añaden a productos primarios de traducción en el momento de su translocación a través de la membrana del RE. Los productos modificados con GPI se glucosilan a continuación en el RE y en el Golgi y, posteriormente, se transportan a la superficie de la célula.
Las secuencias unidas a GPI preferidas que pueden usarse en la presente invención derivan de anclajes GPI que se aíslan de, por ejemplo, enzimas como fosfatasa alcalina, acetilcolinesterasa, 5' nucleotidasa (CO73); moléculas de adhesión como el antígeno asociado a la función del linfocito (LFA-3, CD58), moléculas de adhesión de células neurales (NCAM), proteínas reguladoras de complemento como factor de aceleración de la degradación (DAF o CD55) u otros como el receptor Fc\gamma de tipo III B (Fc-\gamma-RIII o CD16b), Thy-1 (CD90), Qa-2, Ly-6A, inhibidor de membrana de lisis reactiva (MIRL o CD59). Para el fin de la presente invención, se prefiere el antígeno asociado a la función del linfocito (LFA-3). Los expertos reconocerían que también cualquier otro de los anclajes GPI conocidos pueden usarse para la práctica de la presente invención.
Para la construcción de TIMP-GPI, puede usarse la secuencia de longitud completa de TIMP en la construcción de fusión o una porción funcionalmente activa de la misma, que retenga la actividad de TIMP. Del mismo modo, también puede usarse una porción de la secuencia GPI, siempre que la porción permita la incorporación de la proteína TIMP en la superficie de la membrana celular de células cancerosas.
A continuación, la construcción obtenida puede expresarse en cualquier línea celular o célula hospedadora adecuada para obtener el polipéptido o proteína TIMP funcional. Con este fin, pueden usarse vectores o plásmidos conocidos apropiados para expresar las proteínas TIMP ancladas a GPI de la presente invención. Como se muestra con más detalle a continuación, las células cancerosas diana tratadas con proteína TIMP-GPI (y como control con proteína TIMP-1rh) eran reconocidas por las construcciones proteicas y, en consecuencia, se eliminaban debido a la apoptosis mediada por FAS.
En una realización preferida, y a modo de ejemplo, un vector usado para la expresión de las construcciones de fusión de la presente invención contiene el promotor del factor de elongación 1 alfa humano seguido de un sitio de clonación múltiple y un sitio de unión a ribosomas interno que permite la expresión bicistrónica de la construcción y el uso de dihidrofolato reductasa (DHFR) como marcador de selección (Mack, y col., P.N.A.S. USA 92:7021, 1995). El extremo 3' (carboxilo terminal) de la proteína TIMP se fusiona directamente con una secuencia de unión a GPI (p. ej., derivado del antígeno asociado a la función del linfocito (LFA-3)) o puede fusionarse con el dominio similar a mucina aislado de CXCL16 o fractalcina (CX3CL1) seguido de la señal GPI. Como se indica anteriormente, estas regiones de mucina están compuestas en gran medida por restos de serina/treonina/glicina/prolina que facilitan interacciones entre células. Las construcciones de fusión resultantes se transfieren a células de ovario de hámster chino (CHO) deficientes en dihidrofolato reductasa (DHFR) y se realiza la selección como se ha descrito (Mack y col., P.N.A.S. USA 92:7021-7025, 1995). En una realización preferida, los transfectantes pueden exponerse a metotrexato para aumentar la tasa de expresión mediante amplificación génica.
TIMP-GPI puede además fusionarse con un dominio de mucina para aumentar la eficacia de la incorporación a la membrana de proteínas TIMP-GPI. Las mucinas son componentes glucoproteicos unidos o no a la membrana que se identificaron en primer lugar en el moco secretado que reviste las superficies del epitelio glandular. Las mucinas unidas a membrana muestran secuencias hidrófobas o dominios transmembrana responsables de su anclaje a la bicapa lipídica. Hasta el momento, un total de 21 genes han recibido la denominación MUC: MUC1-2, MUC3A, MUC3B, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC6-13, MUC15-20 (Moniaux N, y col., 2004). Las cinco características comunes de una mucina son: (1) secreción en la capa mucosa, (2) glucoproteína O de alto peso molecular, (3) presencia de una disposición de repetición en tándem codificado por un exón largo único y colocado en posición central, (4) presencia de un dominio peptídico predicho que contiene un alto porcentaje de restos de serina y treonina y (5) un patrón complejo de expresión de ARNm. Con una excepción (MUC7), las mucinas secretoras (MUC2, MUC5AC, MUC5B y MUC6) poseen uno o más dominios similares al factor von Willebrandt, péptidos ricos en cisteína, que actúan en la oligomerización de los monómeros de mucina y en el empaquetamiento de vesículas secretoras. Normalmente, las mucinas secretadas se expresan exclusivamente en células epiteliales especializadas, se secretan en el moco y muestran un patrón de expresión restringido dentro del cuerpo humano. Las cuatro mucinas secretoras, también denominadas mucinas formadoras de gel, tienen una arquitectura común con un alto nivel de similitud con el profactor von Willebrand. También se sabe que portan de cinco dominios D debido a su homología con los dominios D del factor von Willebrand.
Las mucinas que se unen a membrana son MUC1, MUC3A, MUC3B, MUC4, MUC11, MUC12, MUC16 y MUC17. Las mucinas ancladas a membrana contienen un módulo SEA (proteína de esperma de erizo de mar, enteroquinasa y agrina) con la excepción de MUC4. MUC3A-B, MUC4, MUC11-12 y MUC17 contiene de dos a tres dominios similares al factor de crecimiento epidérmico (EGF). Ejemplos de mucinas unidas a membrana que pueden usarse son MUC1, MUC3, MUC4 y MUC12. Además, puede usarse los tallos de mucina de la quimiocina CXCL16 asociada a la superficie o fractalcina (CX3CL1). CXCL16 es un miembro de la subfamilia de quimiocinas CXC. A diferencia de otros miembros de este subgrupo, CXCL16 es estructuralmente diferente y tiene cuatro dominios diferentes: un dominio quimiocina atado a la superficie celular mediante un tallo similar a mucina que, a su vez, está unido a los dominios transmembrana y citoplásmico. Fractalcina (CX3CL1) tiene una estructura similar a la de CXCL16 y tanto CXCL16 como fractalcina actúan como moléculas de adhesión cuando se expresan sobre la superficie de la célula y tras su escisión de la superficie celular, las quimiocinas solubles actúan como quimiotácticos.
Preferiblemente, el domino mucina puede fusionarse entre el extremo 3' de la secuencia TIMP y el extremo 5' de la secuencia de anclaje GPI mediante cualquiera de los procedimientos de ingeniería genética convencionales conocidos. La construcción de fusión TIMP-mucina-GPI obtenida puede, a continuación, transfectarse y expresarse en cualquier línea celular o célula hospedadora conocida adecuada. Los expertos reconocerán que es adecuado cualquier otra mucina o dominio de mucina para el objetivo de la presente invención.
Aunque en la presente invención se prefiere el uso de TIMP-1 (Bode y Maslos, 2003) para la preparación de la proteína TIMP anclada a GPI, los expertos reconocerán que también pueden usarse otras proteínas TIMP para la práctica de la presente invención. Otros ejemplos de TIMP humanos que son útiles son TIMP-2, TIMP-3 y TIMP-4 (Mannello F, y col., 2001). Las TIMP utilizadas derivan de fuentes humanas y se administran para tratar células cancerosas humanas. Los expertos reconocerán, así mismo, que también homólogos o variantes de TIMP, en especial TIMP-1, de otros organismos distintos al ser humano, tendrán efectos similares para matar las células tumorales. Por ejemplo, en algunas realizaciones, puede usarse la secuencia de TIMP-1 derivaba de un animal como perro, gato, ratón, conejo, vaca u oveja, y de ave, para la construcción de una construcción de fusión TIMP-GPI de la presente invención. La quimera TIMP-GPI se aplicará posteriormente al sitio del tumor de forma similar a la descrita para un individuo humano.
Los tumores y las células cancerosas que pueden ser tratados con TIMP anclado a GPI incluyen los siguientes cánceres, pero sin limitaciones: cáncer de mama, cáncer renal, cáncer de próstata, seminomas, melanomas, teratomas, neuroblastomas, gliomas, cáncer rectal, cáncer endometrial, cáncer de riñón, cáncer suprarrenal, cáncer de tiroides, cáncer sanguíneo, cáncer de piel, cáncer cerebral, cáncer de cuello de útero, cáncer intestinal, cáncer hepático, cáncer de colon, cáncer de estómago, cáncer de intestino, cáncer gastrointestinal, cáncer de nódulos linfáticos, cáncer de esófago, cáncer colorrectal, cáncer de páncreas, cáncer de oído, nariz y garganta (ENT), cáncer de útero, cáncer de ovario y cáncer de pulmón y las metástasis de los mismos.
Para el tratamiento de cáncer residual, se administrará y aplicará TIMP1-GPI a nivel local en el lado de la resección de la masa tumoral en pacientes con tumores de alto riesgo con un alto riesgo de células cancerosos residuales y mayor incidencia de recaída local y en aquellos pacientes con un tumor residual obvio debido a una enfermedad en estadio avanzado o imposible de operar a nivel local. Preferiblemente, la construcción de fusión se administra a una concentración de 0,5 a 5 \mug/ml de proteínas, más preferible a 0,5 a 1 \mug/ml ó 1 a 2 \mug/ml. Es más preferible una concentración de aproximadamente 1 \mug/ml de TIMP-GPI o TIMP-mucina-GPI. La proteína puede administrarse al individuo mediante cualquier ruta de administración aplicable. Se prefiere que el tratamiento se lleve a cabo durante la cirugía, de modo que la construcción de fusión se pulverice en la herida o se inyecta en las regiones que no sean accesibles para la cirugía. Para este fin, la construcción de fusión TIMP anclado a GPI de la presente invención puede ser un componente de una composición farmacéutica o de un medicamento que además comprende uno o más de los vehículos, diluyentes y excipientes convencionalmente conocidos.
Como se deduce de los siguientes ejemplos, parece que TIMP anclado a GPI induce su actividad antitumoral, es decir, la muerte de las células tumorales, no mediante apoptosis inducida por CTL y células NK (ruta lítica mediada por perforina/granzima), sino más bien por la segunda ruta, que implica la apoptosis mediada por FAS/CD95 (para más detalles véanse los ejemplos 5 y 6; figuras 5 y 6). Adicionalmente, mientras que muchas células tumorales son resistentes a la apoptosis mediada por FAS, el tratamiento con TIMP-1-GPI, pero no con el control TIMP-1rh, hacía a las líneas celulares sensibles a la apoptosis mediara por FAS.
También se ha encontrado que el tratamiento con la proteína TIMP-1-GPI reduce la expresión de BCL2 y aumenta la de la proteína BAX. Las proteínas BCL2 representan una familia de proteínas implicada en el control de la apoptosis. Algunos miembros de esta familia (como BCL2 Y BCL-XL) son antiapoptóticos, mientras que otros (como Bad o BAX) son proapoptóticos. La sensibilidad de las células a los estímulos apoptóticos depende del equilibrio entre los miembros pro y antiapoptóticos de la familia BCL2. Además, se determinó el efecto del tratamiento con TIMP-1-GPI sobre la expresión de BCL2 y BAX y se demuestra que el tratamiento de las células cancerosas con TIMP-1-GPI aumentaba la expresión de BAX proapoptótico y disminuía la expresión de BCL2 antiapoptótico.
En resumen, la capacidad de la metodología para producir cantidades de microgramos a miligramos de proteínas TIMP ancladas a GPI junto con la capacidad de incorporación de estas moléculas a las superficies de las células cancerosas proporciona una herramienta eficaz para el tratamiento del cáncer.
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Breve descripción de las figuras
Figura 1
Incorporación de TIMP-1-GPI a las membranas celulares de RCC
A. Para demostrar la reincorporación de la proteína GPI-TIMP-1 a las membranas celulares, se añadió TIMP-1-GPI o control TIMP-1rh a las células RCC-26, RCC-53 y A498 nativas. TIMP-1 se detectó en la superficie celular mediante análisis por FACS. Los histogramas en color gris son las tinciones control de isotipo, los histogramas de línea continua representan las tinciones con el anticuerpo anti TIMP-1.
B. Para demostrar la unión de GPI tras la incubación con 200 ng/ml o 700 ng/m l de TIMP-1-GPI o TIMP-1rh, las células se trataron con 60 ng/ml de PLC y, a continuación, se sometieron a análisis por FACS. Los histogramas en color gris representan el control de isotipo.
C. Se usó un ELISA para TIMP-1 humano para determinar la cantidad de proteína TIMP-1 liberada de células RCC tratadas con TIMP-1-GPI (como se muestra en B) tras la digestión con PLC.
Figura 2
TIMP-1-GPI inhibe la liberación de proMMP-2 y proMMP-9 a partir de las células RCC-53
Se usó la zimografía para estudiar la secreción de las proteínas MMP-2 y MMP-9 por parte de RCC-53. Las células se trataron con cantidades crecientes de TIMP-1-GPI o TIMP-1rh control, y después de 48 h se retiró el sobrenadante del cultivo sin suero y se analizó por zimografía de gelatinasa.
Figura 3
Expresión en superficie de MMP después del tratamiento con TIMP-1-GPI
Tras la incubación de las células RCC-53 con 700 ng/ml de proteína TIMP-1-GPI durante 24 h, se realizó un FACS usando anticuerpos específicos dirigidos frente a: (A) TIMP-1, MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-8 y MMP-9 o (B) MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-16, HLA-A2 (HB82), pan HLA de clase I (W6/32) e ICAM-1. Como control adicional, se escindió la proteína TIMP-1-GPI de la superficie después de una hora mediante tratamiento con PLC (véase la figura 1). Los histogramas de color gris son la tinción control de isótopo, los histogramas de línea continua representan las muestras tratadas con TIMP-1-GPI.
C. La secreción de una serie de MMP a partir de RCC-53 se comprobó usando inmunotransferencia y anticuerpos monoclonales dirigidos frente a MMP-1, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-12 y MMP-13. Los medios de cultivo (sin suero) se tomaron 24 h después del tratamiento de RCC-53 con 700 ng/ml de TIMP-1rh o TIMP-1-GPI y se compararon con células control sin tratar.
D. Se evaluó el efecto del secuestro de MMP en la superficie celular sobre la invasión de RCC-53 a través del modelo de membrana basal Matragel. La migración optima de las células RCC-3 hacia VEGF (4 ng/ml) se estableció como valor basal o "cero" y se estableció el valor de 100% de inhibición para el valor de migración observado para las células RCC-53 en ausencia de señal VEGF. Las células RCC-53 se trataron previamente con 350 ng/ml o 700 ng/ml de TIMP-1rh o TIMP-1-GPI. Después de una hora, las células se lavaron y aplicaron a la cámara de migración. A continuación, se evaluó el efecto sobre la migración. Los datos presentados representa la media de cuatro pocillos y dos experimentos.
Figura 4
Efecto de las proteínas TIMP-1rh y TIMP-1-GPI sobre la proliferación de las líneas RCC
El efecto del aumento de los niveles de proteínas TIMP-1-GPI o TIMP-1rh control sobre la proliferación de RCC-53 (A), A498 (B) y RCC-26 (C) se midió usando un ensayo MTT. Se añadió MTT después de 24 h, 48 h o 72 h como se indica.
Figura 5
TIMP-1-GPI no influye sobre la susceptibilidad de RCC a la apoptosis mediada por perforina
Las células RCC se dejaron sin tratar (+), tratados con 700 ng/ml de TIMP-1-GPI (0) o proteína TIMP-1rh (o) durante 24 h y se incubaron con los CTL JB4 (A) o líneas NK (B) (NKL para RCC-53 y A498, o NK-92 para RCC-26). Se muestran ejemplos representativos de tres experimentos independientes con resultados similares.
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Figura 6
TIMP-1-GPI no aumenta la expresión de FAS aunque convierte a las células en sensibles a la apoptosis inducida por FAS
A. Células RCC-53, RCC-26 o A498 se trataron o no con 700 ng/ml de TIMP-1-GPI o TIMP-1rh durante 24 h, y se tiñeron con anticuerpos anti-FAS humano (L-958) y se analizó la expresión en superficie de FAS mediante citometría de flujo. Las tinciones con el anticuerpo monoclonal control de isotipo se muestran como histogramas en color gris.
Las tres líneas celulares RCC se trataron con TIMP-1-GPI o TIMP-1rh seguido por la incubación con L-957. Se usó la unión de anexina V-fluoroisotiocianato (FITC) para detectar viabilidad y apoptosis temprana mediante citometría de flujo.
El bajo nivel de apoptosis en las células RCC-53 en (B) se verificó usando un ELISA para nucleosomas citoplásmicos más sensible. El aumento de los niveles de apoptosis se detectó después de la incubación con L-957 con niveles crecientes de TIMP-1-GPI pero no con TIMP-1rh.
Figura 7
Expresión de BCL-2 y BAX en RCC tras el tratamiento con TIMP-1-GPI o TIMP-1rh, analizada mediante tención interna en FACS e inmunotransferencia
Las células RCC-53 (A), RCC-26 (B) y A498 (C) se incubaron previamente con TIMP-1-GPI o TIMP-1rh durante 24 h; a continuación, se trataron con el anticuerpo que activa FAS, L-957, durante 16 h más. Posteriormente, las células se analizaron con anticuerpos monoclonales anti-BCL-2 y anti-BAX usando citometría de flujo. En paralelo, las proteínas se extrajeron y midieron mediante inmunotransferencia. Las señales derivadas de BAX y BLC-2 se normalizaron hasta los niveles de \beta-actina tras la densitometría. Los resultados del FACS se presentan como histogramas con valores entre paréntesis que se corresponden con el MFI de BCL-2 o BAX o que se corresponden con los anticuerpos para isotipo.
Ejemplos
En los ejemplos siguientes, se describen con más detalle los efectos antitumorales de TIMP anclado a GPI sobre células cancerosas. Aunque los experimentos descritos se realizan con TIMP-1 humano, la invención no debería limitarse a este tipo de TIMP.
En los ejemplos siguientes, un anclaje-GPI se fusiona con TIMP-1 para centrarse en las concentraciones definidas de esta proteína inhibidora sobre la superficie de tres líneas celulares de carcinoma de células renales (RCC) (RCC-26, RCC-53 y A498) independientemente de las interacciones entre proteínas de la superficie celular. Como se muestra a continuación, la proteína TIMP-1-GPI añadida exógenamente se insertó de forma eficaz dentro de la membrana de la célula RCC y alteraba de forma drástica la asociación de MMP con la superficie celular. El tratamiento TIMP-1-GPI inhibía la proliferación de RCC y convertía a las células RCC normalmente resistentes a FAS sensibles a la apoptosis inducida por FAS, aunque no alteraba la lisis mediada por perforina debida a células citotóxicas efectoras. El aumento de la sensibilidad a la apoptosis mediada por FAS se correlacionaba con una alteración del equilibrio en las proteínas pro y antiapoptóticas de la familia BCL-2.
Las líneas celulares RCC-26 (Schendel y col., 1993) y RCC-53 se establecieron a partir de pacientes locales con carcinomas de células claras en estadio I y estadio IV, respectivamente. De este modo, representan los dos extremos clínicos del RCC. Los CTL infiltrantes del tumor se aislaron del tumor de ambos pacientes. Aunque estas células efectoras naturales no eran capaces de controlar in vivo el crecimiento tumoral, la tinción con marcadores de superficie de RCC-26 y RCC-53 mostraron una buena expresión de superficie de MHC de clase I y se demostró que ambas líneas inducían in vitro CTL aloespecíficos y específicos antitumorales ((Schendel y col., 2000) y DJS, observación no publicada). A498 se aisló originalmente del tumor de un varón de 52 años y es un ejemplo bien estudiado de RCC (Giard y col., 1973).
Ejemplo 1 Incorporación de TIMP-1-GPI añadido exógenamente a la superficie de RCC-53
La proteína TIM-1 anclada a GPI se generó y aisló como se ha describe previamente (Djafarzadeh y col., 2004). La incorporación de la proteína GPI-TIMP-1 purificada a las membranas de superficie de las líneas celulares RCC-53, RCC-26 o A498 se demostró mediante la incubación de las líneas celulares con 700 ng/ml de TIMP-1-GPI purificado o proteína TIMP1 recombinante humana (rh) control durante una hora. A continuación, la proteína TIMP-1 asociada a la superficie se detectó usando FACS (figura 1A). La adición de TIMP-1rh control no inducía cambios en el desplazamiento del FACS, sin embargo, TIMP-1 anclado a GPI inducía una fuerte señal en superficie para TIMP-1.
Para demostrar que la proteína añadida exógenamente estaba anclada a GPI, las células RCC-53 se incubaron primero con proteína TIMP-1-GPI (200 o 700 ng/ml) y, a continuación, se trataron con 60 ng/ml de fosfolipasa C (PLC). El análisis por FACS demostró la pérdida completa de la señal en la superficie celular de TIMP-1 tras la digestión con PLC (figura 1B). Para medir la eficacia de la integración de TIMP-1-GPI, se recogió el TIMP-1 liberado de la membrana en los tampones de lavado y se cuantificó usando un ELISA específico para TIMP-1 (figura 1C). Los resultados muestran que se recuperaba el 66% del antígeno TIMP-1 inicial de la muestra de 200 ng/ml, mientras que podía recuperarse el 31% de la incubación con 700 ng/ml.
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Ejemplo 2 La proteína TIMP-1-GPI bloquea la liberación de proMMP-2 y proMMP-9 a partir de RCC-53
El aumento de la expresión de MMP-2 y MMP-9 se correlaciona con un mal pronóstico del RCC (Hemmerlein y col., 2004). La línea celular de carcinoma de células claras en estadio IV RCC-53 secretar de forma constitutiva proMMP-2 y proMMP (figura 2).El efecto del aumento de los niveles de TIMP-2 en superficie sobre la liberación constitutiva de proteínas MMP-2 y MMP-9 se comprobó usando ensayos de zimografía de gelatinasa (Djafarzadeh y col., 2004; Klier y col., 2001). La proteína TIMP-1rh a 600 o 1.200 ng/ml no tenía efecto sobre la secreción de proMMP-2 o proMMP-9. Por el contrario, comenzando con 10 ng/ml, el tratamiento con TIMP-1-GPI mostraba una disminución dependiente de la concentración de la liberación de proMMP-2 y proMMP-9 a los medios de cultivo.
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Ejemplo 3 El tratamiento con TIMP-1-GPI induce un aumento en la expresión de superficie de metaloproteinasas de la matriz
En base a los resultados de los experimentos de zimografía de gelatinasa, es posible que TIMP-1-GPI pueda actuar para secuestrar las MMP de la superficie celular. TIMP-1 se une a las formas más activas de MMP, siendo las excepciones MMP-14 y MMP-16 (Brew y col., 2000; Lang y col., 2004). Tras la incubación de RCC-53 con 700 ng/ml de proteína TIMP-1-GPI durante 24 horas, los análisis por FACS usando anticuerpos específicos para MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15 y MMP-16 mostraron, con la excepción de MMP-14, un aumento de la intensidad media del canal de fluorescencia (IMF) para cada una de las MMP. La proteína TIMP-1rh control no tenía un efecto claro sobre la señal de FACS (datos no mostrados). No se detectó la expresión en superficie de otras proteínas, como MHC de clase I (pan clase I y HLA-A2) e ICAM-1, por el tratamiento con TIMP-1-GPI. La digestión de RCC53 tratadas con TIMP-1-GPI con PLC durante una hora (como se realizó en la figura 1) no mostraba aumento de las MMP (figuras 3A y 3B). El acúmulo de MMP sobre la superficie celular reflejaba la reducción de la secreción de proMMP-2 y proMMP-9 mostrada en la figura 2. Para comprobar adicionalmente este bloqueo aparente de la liberación de MMP, se realizaron experimentos de inmunotransferencia usando anticuerpos monoclonales dirigidos frente a MMP-1, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-12 y MMP-13 en los medios (sin suero) derivados de células RCC-53 control o células tratadas durante 24 horas con 700 ng/ml de TIMP-1rh o TIMP-1-GPI (figura 3c). La presencia de cada una de las MPP se detectó en los medios de las células RCC-53 control. La incubación con TIMP-1rh no eliminaba la secreción de las MMP. Por el contrario, parecía que TIMP-1-GPI bloquea completamente la liberación de cada MMP estudiada.
Para valorar el efecto de esta acumulación en superficie de MMP sobre la capacidad de las células para invadir la matriz extracelular (MEC), se comprobó la capacidad de migración/invasión de las células usando una ensayo de cámara de Boyden modificada con membranas recubiertas de MEC. La capacidad global de las células RCC-53 para invadir la MEC no era muy pronunciada (datos no mostrados). Para potenciar la invasión, se aplicaron niveles crecientes de factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) a los pocillos inferiores y los experimentos se realizaron durante 48 horas. Se observó una respuesta de invasión óptima con 4 ng/ml de VEGF (datos no mostrados) y esta respuesta se estableció con invasión basal o 0% de inhibición (figura 3D). Las células RCC-53 tratada previamente durante 30 minutos con 350 o 700 ng/ml de TIMP-1rh o TIMP-1-GPI se lavaron a continuación y se aplicaron en el pocillo superior de la cámara de Boyden. A continuación, se determinó el aumento o disminución relativos de la migración/invasión (véase Materiales y procedimientos). Mientras que el tratamiento con TIMP-1rh bloqueaba parcialmente la invasión de las células, TIMP-GPI a 700 ng/ml bloqueaba por completo la invasión de las células RCC-53 (figura 3D).
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Ejemplo 4 Efectos de TIMP-1 anclado a GPI sobre la proliferación de RCC
Para valorar el efecto de la ingeniería en superficie de TIMP-1 sobre la proliferación de RCC, se realizaron ensayos de MTT. Se encontró que la proteína TIMP-1-GPI añadida exógenamente inducía una disminución dependiente de la dosis de la proliferación de RCC-53 y A498 a las 24, 48 y 72 horas (figura 4B). Las células RCC-26 proliferan con extremada lentitud (velocidad de duplicación de + 48 h) y la tendencia general sugería una supresión de la proliferación (figura 4C). Controles adicionales usando fosfatidilinositol a una concentración molar equivalente del reactivo TIMP-1-GPI (Sigma, Alemania, nº P6636) no inducía cambios significativos en la proliferación de las células (datos no mostrados).
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Ejemplo 5 Citotoxicidad mediada por células
La actividad MMP se ha asociado a la sensibilidad de las células diana a la apoptosis inducida por la actividad de las células T citotóxicas (apoptosis mediada por perforina/granzima y por FAS) (Egeblad y Werb, 2002). El efecto de TIMP-1-GPI sobre la muerte dependiente de células de RCC se comprobó usando apoptosis inducida por CTL y células NK alogénicas. En los ensayos mediados por CTL alogénicos, las células diana RCC-53, A498 y RCC-26 se trataron con 700 ng/ml de TIMP-1rh o TIMP-1-GPI; a continuación se marcaron con Cr^{51} y se incubaron con CTL CD8+ alogénicos JB4 (figura 5A) o líneas celulares NK (figura 5B). Las líneas celulares de tumores RCC fueron reconocidas y eliminadas de forma eficaz tanto por los CTL como por las células NK. El tratamiento con TIMP-1 o TIMP-1-GPI no alteraba la susceptibilidad de las tres líneas RCC a la apoptosis mediada por CTL o por células NK.
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Ejemplo 6 El tratamiento con TIMP-GPI hace que las células RCC sean sensibles a la muerte mediada por FAS
Los experimentos con CTL/NK mostraron que el tratamiento con TIMP-1-GPI no influía en la ruta lítica mediada por perforina/granzima medido en el ensayo de liberación de cromo. Esta ruta actúa rápidamente usando la secreción de citotoxinas acumuladas para iniciar la apoptosis y representa uno de los principales mecanismos de muerte celular iniciada por el sistema inmunológico (Trapani y col., 2000). La segunda ruta implica la unión de FAS/CD95. Entonces, se determinó el efecto del tratamiento del TIMP-1-GPl sobre la apoptosis mediada por FAS.
La expresión de FAS en las líneas de RCC se valoró en primer lugar mediante citometría de flujo usando un Acm anti-FAS de no activación (L-958) (H. Engelmann, resultados no publicados). Las células no tratadas y las células tratadas con 700 ng/ml de TIMP-1-GPI o proteína TIMP-1rh control durante 24 h se tiñeron con L-958 y se analizaron. La proteína FAS se expresaba con intensidad en las tres líneas de RCC. El tratamiento con TIMP-1-GPI o TIMP-1rh no afecta a la expresión en la superficie celular de FAS (figura 6A).
El Acm anti-FAS L-957 puede inducir apoptosis en las células que expresan FAS (H. Engelmann, resultados no publicados). Se usó la unión de anexina V-fluoroisotiocianato (FITC) y la incorporación de yoduro de propidio (PI) en las células RCC después del tratamiento con L-957 para detectar la apoptosis mediante citometría de flujo. Como se muestra en la figura 6B, RCC-26 y RCC-53 eran muy resistentes a la apoptosis mediada por FAS. La intensidad de fluorescencia (IMF) de las células no tratadas y tratadas con L-957 era similar. Se observó un ligero aumento de la IMF en la línea RCC-53 en respuesta al tratamiento con L-957. Estas observaciones están en la línea de previas publicaciones en las que se describe que RCC generalmente es resistente a la apoptosis mediada por FAS (Frost y col., 2003). El tratamiento con TIMP-1-GPI (L-957 + TIMP-1-GPI), pero no el control TIMP-1rh (L-957 + TIMP-1rh), hace a las líneas celulares sensibles a la apoptosis mediada por FAS (figura 6B). Se encontró que A498 era más sensible al Acm anti-FAS de activación (detectado por el aumento de anexina-IMF en las muestras tratadas con L-957), el tratamiento con TIMP-1-GPI, pero no con TIMP-1rh, potenciaba significativamente la apoptosis de las células A498.
Mientras las células RCC-26 y A498 mostraban un aumento drástico en la apoptosis inducida por FAS tras el tratamiento con TIMP-1-GPI, la línea celular RCC-53 mostraba un aumento menos pronunciado en la sensibilidad (variación en IMF de 62 a 93). Para confirmar la apoptosis de RCC-53 inducida por TIMP-1-GPI/FAS, se empleó un segundo ensayo ELISA basado en la detección de cromatina citoplasmática. Las ventajas de este ensayo incluyen la falta de subjetividad en la interpretación de los resultados y su aumento de sensibilidad en relación con la tinción con anexina V. El ELISA para cromatina es capaz de detectar tan sólo 300 células apoptóticas y mide acontecimientos de apoptosis muy posteriores con respecto a la presencia temprana de anexina V sobre la superficie celular. Como se encontró en el análisis de la anexina V por FACS (figura 6B), el tratamiento de RCC-53 sólo con L-957 inducía un ligero aumento de la apoptosis (figura 6C). Sin embargo, el tratamiento de células RCC-53 con TIMP-1-GPI aumentaba drásticamente la sensibilidad de las células a la apoptosis inducida por FAS en forma dependiente de dosis.
Los resultados demuestran que el tratamiento de las células cancerosas con TIMP anclado a GPI tenía efecto matando las células cancerosas mediante apoptosis inducida por FAS. Por tanto, TIMP anclado a GPI es útil como agente antitumoral.
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Ejemplo 7 El tratamiento con TIMP-1-GPI de RCC reduce la expresión de la proteína BCL-2 y aumenta la de BAX
Las proteínas BLC-2 representan una familia de proteínas implicadas en el control de la apoptosis (revisado en Igney y Krammer, 2002). Algunos miembros de esta familia (como BCL2 Y BCL-XL) son antiapoptóticos mientras que otros (como Bad o BAX) son proapoptóticos. La sensibilidad de las células a los estímulos apoptóticos puede depender del equilibrio entre miembros pro y antiapoptóticos de la familia BCL2 (Igney y Krammer, 2002). Entonces, se determinó el efecto del tratamiento con TIMP-1-GPI sobre la expresión de BCL-2 y BAX Después de una incubación previa de 24 h con 700 ng/ml de TIMP-1-GPI o TIMP-1rh control, las células RCC se estimularon con 1 \mug/ml de L-957 (o Acm control) durante 16 h más. El nivel de proteínas BCL-2 y BAX se determinó a continuación usando FACS intracelular e inmunotransferencia. En las tres líneas celulares, el tratamiento con TIMP-1-GPI aumentaba la expresión de BAX proapoptótico y disminuía la expresión de BCL-2 antiapoptótico. Se observó un patrón similar en los ensayos de inmunotransferencia (figuras 7A, B y C).
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Ejemplo 8 Presentación de TIMP-1-mucina-GPI añadida exógenamente sobre la membrana superficial de RCC-53
La proteína TIMP-1-mucina-GPI se generó y aisló como se describe en el ejemplo 1. La presentación de proteína GPI-TIMP-1 purificada sobre las membranas de la superficie de las líneas celulares RCC, RCC-53, RCC-26 o A498, se demostró mediante incubación de las líneas celulares con 700 ng/ml de TMP-1-mucina-GPI purificada, TIMP-1-GPI purificado o proteína TIMP-1 recombinante humana (rh) control durante una hora. A continuación, la proteína TIMP-1-mucina-GPI asociada con la superficie fue detectada mediante FACS. La construcción TIMP-1-mucina-GPI se presentaba de forma eficaz sobre la membrana de la superficie de células RCC, lo que indicaba que esta construcción es especialmente útil para el tratamiento del cáncer.
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Ejemplo 9 TIMP-GPI para el tratamiento del cáncer residual en un individuo
Los reactivos TIMP-1-GPI o TIMP-mucina-GPI se aplican a una concentración de 1 \mug/ml a nivel local en el área de resección después de la escisión quirúrgica del tumor. Un tumor no operable, el glioblastoma (astrocitoma de grado IV según la OMS) se elimina quirúrgicamente y los reactivos se colocan antes del cierre de la herida. La aplicación de las proteínas TIMP ancladas a GPI daba lugar a una destrucción mediada por el sistema inmunológico, haciendo que las construcciones de la invención sean útiles para el tratamiento del cáncer in vivo.
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Ejemplo 10 TIMP-GPI para el tratamiento del cáncer residual en un individuo
Se aplica una cantidad de TIMP-1-GPI o TIMP-mucina-GPI a 1 \mug/ml a nivel local en el área de resección después de la escisión quirúrgica del tumor. El tumor, un cancer de mama en estadio avanzado, se extirpa mediante cirugía y los reactivos se aplican antes del cierre de la herida, especialmente si existe un riesgo clínico de recaída local. Como se muestra en el ejemplo 9, las proteínas TIMP ancladas a GPI eran capaces de hacer a las células sensibles a la destrucción mediada por el sistema inmunológico y, por tanto, eficaces para eliminar el cáncer residual en un paciente.
Discusión de los resultados
La ingeniería de la superficie celular usando proteína ancladas a GPI según la presente invención ofrece varias ventajas sobre las técnicas de transferencia génica tradicionales. 1) El procedimiento se aplica a células que son difíciles de transfectar, p. ej., células RCC resistentes a la apoptosis mediada por FAS, y también a cultivos primarios, progenitores de médula ósea y células del sistema inmunológico. 2) El procedimiento puede usarse cuando se disponga sólo de un pequeño número de células o cuando las células no puedan propagarse fácilmente. 3) Puede modificarse la superficie celular independientemente del tipo de célula. 4) La cantidad de proteína expresada finalmente en la superficie celular puede ser controlada con precisión. 5) Pueden incorporarse secuencial o simultáneamente múltiples proteínas ancladas a GPI en la misma célula.
Las líneas celulares humanas de carcinoma de células renales (RCC) se han usado como sistema modelo para probar el potencial de la proteínas TIMP ancladas a GPI para el tratamiento del cáncer. El RCC humano es un tumor progresivo con opciones terapéuticas limitadas debido a la resistencia del tumor a agentes quimioterapéuticos actuales y a la radiación. Las inmunoterapias son beneficiosas para algunos pacientes, lo que sugiere que el RCC puede ser diana de mecanismos inmunológicos efectores. A menudo se observan linfocitos infiltrantes del tumor, como CTL CD8+ o células NK en los tejidos cancerosos renales y, a menudo, reconocen células tumorales autólogas cuando se prueban in vitro (revisado por Schendel y col., 1997). A pesar de estas observaciones prometedoras, generalmente los tumores continúan creciendo, lo que indica que RCC podría haber adquirido resistencia a mecanismos citotóxicos. Para que tenga lugar una respuesta antitumoral productiva, el sistema inmunológico debe, no sólo reconocer el tumor, sino que las células cancerosas también deben ser susceptibles a los mecanismos de muerte utilizados por los CTL y las células NK. Las células cancerosas han desarrollado varios mecanismos para evadir las defensas inmunológicas, como la reducción de la sensibilidad a la apoptosis (revisado por Dunn y col., 2004).
Los CTL y las células NK matan a sus células diana mediante apoptosis dependiente de perforina/granzima o FAS/FASL (Kagi y col., 1994). La importancia relativa de la exocitosis de gránulos frente a las actividades líticas mediada por FAS/FASL para el control tumoral in vivo es controvertida. Mientras que muchos estudios señalan una dominancia del mecanismo de exocitosis de gránulos, otros en los que se utilizan ratones que no expresan perforina (Seki y col., 2002) sugieren que la apoptosis dependiente de FAS puede constituir in vivo una ruta más destacada. La mayoría de las células tumorales, incluso RCC, son intrínsecamente resistentes a la muerte mediada por FAS (Frost y col., 2003). El uso de TIMP anclado a GPI representa una aproximación terapéutica prometedora para hacer que las células tumorales sean susceptibles a la apoptosis mediada por FAS.
Hemos mostrado en la presente invención que la ingeniería de células mediante la adición exógena de GPI-TIMP-1 puede provocar el aumento de las actividades biológicas de TIMP-1 así como inducir nuevas actividades. La TIMP-1-GPI administrada exógenamente se inserta de forma eficaz en las membranas celulares de las células RCC e induce una variedad de efectos biológicos en las líneas de RCC con posible importancia terapéutica.
Además, la proteína TIMP-1 anclada a GPI altera drásticamente la asociación en la superficie celular de diversas MMP expresadas en RCC. Esta se reflejaba en una reducción de la secreción de MMP, como proMMP-2 y proMMP-9, por las células RCC. Mientas que TIMP-1 bloqueará la actividad enzimática de MMP-2, no se cree que se una a la proforma de la enzima. Aun más, los datos que demuestran un bloqueo de la secreción de proMMP-2 tras el tratamiento con TIMP-1-GPI sugieren esta acción. Parece que la acción de un anclaje GPI a TIMP-1 induce una estequiometría de la superficie alterada que potencia la capacidad de la proteína TIMP-1 para unirse a MMP.
Este aumento aparente de la unión de TIMP-1-GPI también se demostró con las MMP de tipo membrana. Aunque no se sabe demasiado sobre la asociación de TIMP-1 con MMP-15, podría preverse que no se producirá la unión de la proteína TIMP-1-GPI a MMP-16 en base a la más que pobre avidez de TIMP-1 nativo por este proteína (Lang y col., 2004). El análisis mutacional de los lazos críticos de TIMP-1 para la unión con MMP16 muestra que cambios pequeños, aparentemente insignificantes en TIMP-1 pueden cambiar drásticamente sus características inhibidoras/de unión. En este caso, la estequiometría alterada de TIMP-1 sobre la superficie celular parece haber sido suficiente para cambiar su unión a MMP-16. El secuestro de MMP sobre la superficie celular también se asoció con una reducción de la capacidad de la línea celular RCC-53 para sufrir la invasión de la MEC.
Como se demuestra en la presente invención, el tratamiento con TIMP-1-GPI lleva a una reducción pronunciada dependiente de dosis en la proliferación de las líneas RCC. Quizás más significativamente, las líneas RCC normalmente resistentes a la apoptosis por FAS se convertían en sensibles a la muerte mediada por FAS/CD95 tras el tratamiento con la proteína TIMP-GPI de la invención. Sin embargo, el agente no afectaba a la sensibilidad a la ruta de la perforina. Esto sugiera que el efecto antitumoral de TIMP anclado a GPI está mediado por la ruta de apoptosis inducida por FAS en lugar de por la muerte mediada por perforina/granzima mediante CTL/células NK.
La ruta de apoptosis mediada por FAS está regulada por la activación de caspasas, mientras que el daño de la membrana celular por CTL/NK mediante la exocitosis de gránulos, según determina la prueba de liberación de cromo, ocurre independientemente de las caspasas (Sayers y col., 1998; Seki y col., 2002; Trapini y col., 2000). Los acontecimientos anteriores que llevan a la activación de la caspasa implican al equilibrio entre las proteínas pro y antiapoptóticas de la familia BLC-2. Como se demuestra en la presente invención, el tratamiento con GPI-TIMP-1 daba lugar a una regulación por disminución de la proteína antiapoptótica BCL2 y el aumento correspondiente de la proteína proapoptótica BAX. Este cambio hacia una concentración mayor de proteínas proapoptóticas puede ser una de las razones del aumento de la sensibilidad a la apoptosis mediada por FAS de las células RCC cuya superficie ha sido modificada por ingeniería con TIMP-1. Estas observaciones representan una nueva acción para TIMP-1. También se han observado acciones similares para TIMP-3 y otros TIMP (TIMP-2 y TIMP-4) (datos no mostrados).
Se encontró que la sobreexpresión de TIMP-1, 2 o 3 en células de músculo liso vascular usando vectores adenovirales inhibía su migración a través del modelo de membranas basales. La sobreexpresión de TIMP-1 no tenía efecto sobre la proliferación celular, mientras que TIMP-2 causaba una inhibición dependiente de dosis de la proliferación celular. La sobreexpresión de TIMP-3 también causa una inhibición dependiente de dosis de la proliferación y, además, conduce a apoptosis mediante la despolarización de la membrana mitocondrial y liberación de citocromo C (Baker y col., 1999; Baker y col., 1998; Smith y col., 1997). TIMP-3 es la única proteína TIMP que se une selectivamente a la superficie de las células, independiente de la asociación con otras proteínas de superficie (Majid y col., 2002; Smith y col., 1997). Dirigiendo TIMP-1 a las superficies celulares mediante un anclaje GPI se llega a nuevas acciones biológicas que parecen mimetizar los efectos descritos para TIMP-3.
Se ha encontrado que TIMP-3 sensibiliza a las células de melanoma a la apoptosis inducida mediante anticuerpo anti-FAS, TNF-alfa y TRAIL. El mecanismo de acción estaba relacionado con una estabilización general de FAS, TNF-RI y TRAIL-RI sobre la superficie de las células de melanoma tratadas con TIMP-3 (Ahonen y col., 2003). Este aumento de la expresión superficial de los receptores se relacionó con la activación de la caspasa-8 y la caspasa-3 (Ahonen y col., 2003).
En los experimentos detallados en la presente invención, las células RCC no mostraban cambios en la expresión en superficie de FAS tras el tratamiento con TIMP-1-GPI (figura 6A). Además, las células RCC seguían siendo resistentes a la apoptosis inducida por TNF-\alpha (probado para 100 a 10.000 unidades por ml) independientemente del tratamiento con TIMP-GPI (datos no mostrados). El análisis por FACS de las células RCC mostraba posteriormente niveles prácticamente indetectables de TNF-RI (p55) y TNF-RII (p75) en RCC-53 y ausencia de expresión en las líneas RCC-26 o A498 (datos no mostrados). La expresión en superficie no cambiaba con el tratamiento con TIMP-1-GPI. Por tanto, el aumento de la sensibilidad a la apoptosis mediada por FAS tras el tratamiento con TIMP-1-GPI no parecía estar mediado a través de una estabilización general de las proteínas receptoras de muerte de la superficie celular. Lo que está claro es que el tratamiento con TIMP-1-GPI altera el equilibrio de las proteínas Bcl-2 para provocar un perfil de expresión más "proapoptótico".
Los resultados presentados en la presente invención proporcionan una relación adicional entre la biología tumoral, la función de MMP/TIMP y las rutas de apoptosis. La unión de las proteínas TIMP a GPI, directamente o a través de dominios de mucina representa un potente agente antitumoral para hacer que las células tumorales normalmente resistentes a la apoptosis inducida por FAS, sean sensibles a la apoptosis inducida por FAS. Mediante este mecanismo las células tumorales se eliminarán de forma eficaz.
Materiales y procedimientos Líneas celulares y cultivos celulares
Las líneas de RCC, RCC-53 y RCC-26, fueron obtenidas por D.J.S. (Munich, Alemania) a partir de muestras de pacientes. Las células RCC-53, RCC-26 y A498 (American Type Culture Collection) (Giard y col., 1973) se cultivaron en medio RPMI1640 (GIBCO BRL, Life Technologies GmbH, Eggenstein, Alemania) suplementado con L-glutamina 2 mM (Biochrom KG, Berlín), piruvato sódico 1 mM (GIBCO BRL, Life Technologies GmbH, Eggenstein, Alemania), 12% de SFT inactivado por calor (Biochrom KG, Berlín, Nº S0115). Se proporcionó medio recién preparado cada tres días y los cultivos se dividieron cuando las células entraban en confluencia.
Células citotóxicas efectoras: JB4 es una clon de células T citotóxicas efectoras alloreactivo HLA-A2 obtenido en nuestras instalaciones (E.N.) y se expande mediante estimulación quincenal como se ha descrito (Milani y col., 2005). Se usa en ensayos de citotoxicidad los días 7 u 8 después de la estimulación. Las líneas NK leucémicas humanas, NKL (Robertson y col., 1996) y NK-92 (Gong y col., 1994) fueron proporcionadas amablemente por C. S. Falk (GSF-Institute of Molecular Inmunology, Munich, Alemania) y se cultivaron en medio que contenía SFT inactivado por calor al 15% y 100 U/ml de IL-2 recombinante.
El día antes de su uso en los ensayos de citotoxicidad, el cultivo se ajustó a 0,3 x 10^{6} células/ml en medio recién preparado.
Análisis por separación de células activadas por fluorescencia (FACS)
Las células se despegaron con EDTA 1,5 mM (Biochrom A, Berlín, Alemania, Nº L2113) en PBSx1 y se incubaron durante 60 min en hielo con anticuerpos específico para proteínas humanas; TIMP-1 (IM32L), MMP-1 (IM35L-100), MMP-3 (IM36L-100), MMP-8 (IM38L) (CALBIOCHEM, Merck Darmstadt, Alemania); MMP-9 (IM 61-100), MMP-2 (IM 51L) (ONCOGENE, Bad Soden, Alemania); MMP-7 (MAB907), MMP-12 (MAB917), MMP-14 (MAB9181) (R&D Systems, Minneapolis, EE.UU.); MMP-13 (IM44L), MMP-15 (IM48L), MMP-16 (IM50L) (CALBIOCHEM, Merck Darmstadt, Alemania) e IgG1_{\kappa} (SIGMA-ALDRICH, Taufkirchen, Alemania, Nº M9269) Los anticuerpos frente a ICAM-1 y HLA (W6/32 y HB82) se han descrito previamente (Johnson y col., 1988; Barnstable y col., 1978; Parham y Brodsky, 1981). Los anticuerpos anti-FAS (H. Engelmann, datos no publicados), anti-TNF-RI, anti-TNF-RII y control de isotipo se usaron como se ha descrito (Bigda y col., 1994). Las células se lavaron tres veces con PBSx1, se incubaron con Acm de burro anti-ratón conjugado con FITC (DAKO A/S, Glostrup, Dinamarca, Nº F0313) durante 45 min en hielo, a continuación se lavó tres veces con PBSx1 y se analizó usando un citómetro de flujo (FACSCalibur, Becton Dickinson and Company, San José, CA, EE.UU.) y el software Cell Quest. Los anticuerpos Anti-BCL-2 (ALX-804-225) y anti-BAX (ANC-357-040) se obtuvieron de ALEXIS (Grunberg, Alemania).
Purificación de la proteínas TIMP-1-GPI
La proteína TIMP-1-GPI se obtuvo y purificó como se ha describo previamente (Djafarzadeh y col. 2004). Brevemente, TIMP-1 humano se clonó a partir del ADNc usando cebadores específicos de TIMP-1h, se fusionó sin codon de parada de la traducción a la secuencia señal de GPI clonada de LFA-3 (Kirby y col., 1995; Medof y col., 1996) y se subclonó en pEF-DHFR, se introdujo de forma estable en células de ovario de hámster chino (CHO) deficientes en DHFR y se seleccionó como se ha descrito (Mack y col., 1995). La proteína de fusión TIMP-1-GPI se purificó a partir de las células CHO mediante extracción con detergente Triton X-100 seguido de purificación en columna usando DEAE, heparina-sefarosa y exclusión molecular (Djafarzadeh y col., 2004).
ELISA para TIMP-1
Se usó un ELISA específico de TIMP-1 humano usando el protocolo aplicado según las indicaciones del fabricante (MAB970, R&D Systems) para controlar los niveles de TIMP-1 en solución. El Acm anti-TIMP-1 humano de recubrimiento (MAB970), Acm anti-TIMP-1 humana biotinilado de detección (BAF970) y la proteína TIMP-1rh (970-TM) se obtuvieron de R&D Systems GmbH (Wiesbaden, Alemania).
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Incorporación de TIMP-1-GPI a las membranas celulares
Las células RCC-53 (5-10 x 10^{6} células/ml) se incubaron con 200 a 700 ng/ml de TIMP-1-GPIh purificada a 37ºC/CO_{2} al 5%. A continuación, las células se lavaron tres veces con PBS frío y se analizaron mediante FACS usando anticuerpos monoclonales específicos de TMP-1 (véase anteriormente)
Escisión del anclaje GPI mediante fosfolipasa C
Las células (5-10 x 10^{6} células/ml) se incubaron con 200 o 700 ng de TIMP-1-GPI o proteína TIMP-1rh en medio sin suero durante 1 h a 37ºC en CO_{2} al 5%. Las células se lavaron tres veces con PBS frío y se trataron con 60 ng/ml de fosfolipasa C específica de fosfatidilinositol (SIGMA-ALDRICH, Taufkirchen, Alemania, Nº 661-9) en medio sin suero durante 30 min a 37ºC/CO_{2} al 5%. Las células se lavaron tres veces y se recogieron todos los sobrenadantes.
Proliferación
Las células RCC-53, A498 o RCC-26 (30 x 10^{3}/100 \mul de medio) se cultivaron en placas de microvaloración de 96 pocillos durante 24 h en condiciones estándar para obtener células firmemente adheridas y creciendo de forma estable. Después de descartar los sobrenadantes, se añadieron a las células 50 \mul de medio que contenían TIMP-1-GPI, tampón o TIMP-1rh y se incubaron durante 24 a 72 h. A continuación, se añadieron 50 \mul de una solución de MTT (bromuro de 3,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenil-tetrazolio) (SIGMA-ALDRICH Taufkirchen, Alemania, Nº M2128). Después de 3 h de incubación, los cristales de formazán se disolvieron añadiendo 100 \mul de isopropanol y HCl 0,04 M. A continuación, se midió la absorbancia a 550 nm usando un lector de ELISA GENios plus TEC AN. Para cada experimento, se analizaron al menos 6 pocillos por condición experimental y punto temporal.
Zimografía
Las células RCC-53 se cultivaron en placas de 24 pocillos (5 x 10^{4} células/pocillo). El medio se cambió a las 24 h por medio sin suero que contenía TIMP-1rh o cantidades crecientes de TIMP-1-GPI y se incubaron durante 24 h, 48 h y 72 h. Los sobrenadantes celulares se analizaron mediante zimografía de gelatina usando geles de poliacrilamida-SDS al 10% (Invitrogen, Groningen, Holanda, Nº EC61755BOX) como se ha descrito (Djafarzadeh y col., 2004). Como control positivo se usó la enzima MMP-9 recombinante (Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia, Nº RPN2634).
Ensayo de invasión extracelular
El efecto del tratamiento con TIMP-1-GPI frente a TIMP-1rh sobre la capacidad de las células para invadir la matriz extracelular (MEC) se evaluó usando un ensayo comercial de invasión celular (Chemicon International Inc., Temecula, CA, Nº ECM 555). Se analizó en primer lugar la capacidad de las células RCC-53 para invadir la MEC. Las células invadidas en el fondo de la inserción se separaron, lisaron y detectaron mediante colorante CyQuant como se describe en el protocolo adjunto. Para potenciar la invasión se usaron niveles crecientes de factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF), de 2 ng/ml a 8 ng/ml. La migración óptima se observó con VEGF a 4 ng/ml (datos no mostrados). A continuación, se determinó el efecto del tratamiento con 350 ng/ml y 700 ng/ml de TIMP-1rh control o TIMP-1-GPI sobre la migración. Para cuantificar los posibles efectos de los agentes, la migración basal de las células RCC-53 con VEGF a 4 ng/ml se fijó como 0. El valor 100% de "inhibición" de la migración inducida por VEGF se estableció como la migración/invasión de las células RCC-53 en ausencia de VEGF. Los efectos resultantes del tratamiento con TIMPrh o TIMP-1-GPI sobre la invasión RCC-53 se calcularon como la variación en el porcentaje (negativo o positivo) con respecto al valor "máximo".
Detección de apoptosis por anexina V
La detección y cuantificación de células apoptóticas frente a necróticas a nivel de una única célula se realizaron usando un kit de tinción de anexinA-V-FLUOS (Becton, Dickinson and Company, Heidelberg, Alemania, Nº 556547). Las células RCC-53 se sembraron en placas de 24 pocillos a 1 x 10^{6} células/pocillo y se permitió que se pegaran durante una noche. A continuación, los pocillos se lavaron 3 veces con PBSx1 y se añadió 1 ml de medio RPMI 1640 sin suero, seguido de 700 ng/ml de TIMP-1-GPI o TIMP-1rh. Las células se incubaron durante 24 h a 37ºC/CO_{2} al 5%. Después de 24 h, se añadió el Acm L-957 anti-FAS de activación (H. Engelmann, datos no publicados) o control de isotipo y las células se incubaron otras 16 h a 37ºC/CO_{2} al 5%. Las células se lavaron con PBS, se centrifugaron y resuspendieron en solución de tinción (reactivo de marcaje anexina-V-fluoresceína y yoduro de propidio (PI) en tampón Hepes) durante 15 min a temperatura ambiente. A continuación, las células se analizaron mediante citometría de flujo. Un estudio de evolución temporal mostraba que la unión de anexina V en células RCC precedía a la reactividad de PI.
Medida de la apoptosis mediante ELISA específico de cromatina
La apoptosis se midió usando el kit de ELISA Plus para detección de muerte celular de Roche (Pensberg, Alemania, Nº 1774425). Las células RCC-53 se sembraron en placas de 96 pocillos a una concentración de 4 x 10^{4} células/pocillo y se dejó que se pegaran durante una noche. Los pocillos se lavaron 3 veces con PBSx1 y se añadieron 200 \mul de medio RPMI 1640 sin suero a cada pocillo, seguido de 700 ng/ml de TIMP-1-GPI o TIMP-1rh. Las células se incubaron durante 24 h a 37ºC/CO_{2} al 5%. Después de 24 h de incubación con TIMP-1-GPI o TIMP-1rh, se añadió 1 \mug/ml de Acm L957 anti-FAS de activación o Acm control de isotipo, y se incubaron durante 16 h a 37ºC/CO_{2} al 5%. A continuación, la placa se centrifugó y el sobrenadante se retiró con cuidado. El sedimento de células se colocó en 200 ml de tampón de lisis proporcionado por el fabricante durante 30 min y se centrifugó. Las alícuotas del sobrenadante (20 \mul) se usaron en un ELISA con anticuerpos anti-ADN y anti-histonas para detectar la presencia de nucleosomas citoplasmáticos.
Inmunotransferencia
La inmunotransferencia se usó para la detección de MMP en medios de crecimiento sin suero. Los anticuerpos anti-MMP usados se describen anteriormente (análisis por FACS). Los patrones MMP humanos recombinantes para inmunotransferencia se obtuvieron de R&D Systems (Minneapolis, EE.UU.) e incluyen: MMP-1 (WBC024), MMP-2 (WBC025), MMP-3 (WBC015), MMP-8 (WBC017), MMP-12 (WBC019) y MMP-13 (WBC020). También se utilizó inmunotransferencia para la detección de BCL-2, BAX (véanse anteriormente los Acm) y \beta-actina (Acris Hidenhausen, Alemania, Nº ab8227). Todas las proteínas se detectaron usando un kit comercial de análisis por inmunofluorescencia, el Sistema de Inmunodetección de quimioluminiscencia (Invitrogen, Groningen, Países Bajos).
Citotoxicidad mediada por células
Las células diana se marcaron con Cr^{51} durante 1-2 h, se lavaron e incubaron conjuntamente con células efectoras a un número constante de células de 2.000 células por pocillo en placas de 96 pocillos de fondo en V. En todos los experimentos se usaron medidas duplicada de las valoraciones en cuatro etapas de células efectoras. Las liberaciones espontáneas y máximas se determinaron incubando las células diana solas y contando directamente las células marcadas, respectivamente. Después de 4 h de incubación a 37ºC en una atmósfera de CO_{2} al 5% humidificada, se recogieron los sobrenadantes, se transfirieron a placas de microvaloración de centelleo sólido Lumaplate, se secador durante una noche y se contaron en un contador de centelleo de microplacas TopCount (Packard, Meriden, CT). Para cada proporción E:T, el porcentaje de lisis se calculó como sigue: % de lisis específica = (cpm experimental - cpm espontáneas/cpm máximas - cpm espontáneas) x 100. La liberación espontánea de células diana era siempre <15% de la liberación máxima total.
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Claims (14)

1. El uso de una construcción de fusión que comprende una secuencia de aminoácidos de un inhibidor tisular de metaloproteinasas (TIMP) o un fragmento biológicamente activo del mismo, que inhibe las metaloproteínas de la matriz activas, en el que dicho TIMP o fragmento biológicamente activo del mismo está unido a un anclaje glucosilfosfatidilinositol (GPI) para la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer.
2. El uso según la reivindicación 1, en el que dicho TIMP se selecciona entre el grupo compuesto por TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3 o TIMP-4.
3. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que dicho TIMP es el TIMP-1 humano.
4. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que dicha construcción de fusión contiene una o más secuencias señales de GPI para dirigir el anclaje de GPI.
5. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que dicho anclaje GPI deriva del antígeno asociado a la función del linfocito (LFA-3) o una porción del mismo.
6. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 en el que dicha construcción TIMP-GPI se inserta en las membranas celulares de células tumorales.
7. El uso según una cualquier de las reivindicaciones 1-6, en el que dicho cáncer se selecciona de entre el grupo compuesto por cáncer de mama, cáncer renal, cáncer de próstata, seminomas, melanomas, teratomas, neuroblastomas, gliomas, cáncer rectal, cáncer endometrial, cáncer de riñón, cáncer suprarrenal, cáncer de tiroides, cáncer sanguíneo, cáncer de piel, cáncer de cerebro, cáncer de cuello de útero, cáncer intestinal, cáncer hepático, cáncer de colon, cáncer de estómago, cáncer de intestino, cáncer gastrointestinal, cáncer de nódulos linfáticos, cáncer de esófago, cáncer colorrectal, cáncer de páncreas, cáncer de oído, nariz y garganta, cáncer de útero, cáncer de ovario o cáncer de pulmón y las metástasis de los mismos.
8. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que dicho cáncer es un cáncer residual después de una eliminación quirúrgica.
9. El uso de la reivindicación 8, en el que dicha construcción de fusión se administra localmente como tratamiento postoperatorio antitumoral para el tratamiento del cáncer residual en pacientes con cáncer de mama y pacientes con glioblastoma (astrocitoma de grupo IV).
10. El uso de la reivindicación 8 ó 9, en el que dicha construcción de fusión se administra a una concentración de 0,5 a 5 \mug/ml, preferentemente a 1 \mug/ml.
11. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que dicha construcción de fusión se administra mediante pulverización dentro de la herida y/o inyección en regiones que no son accesibles para la cirugía.
12. Un procedimiento in vitro para la inhibición de la proliferación de células cancerosas que comprende la etapa de:
(1) someter a una línea celular cancerosa a una cantidad eficaz de construcción de fusión TIMP-GPI.
13. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que dicha línea celular es una línea celular de carcinoma de células renales (RCC).
14. El uso de TIMP-GPI para hacer que líneas de células tumorales resistentes a la apoptosis por FAS, sean sensibles a la apoptosis inducida por FAS.
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