CN105601733B - 抗CAV的多肽类似物和对应的cDNA及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗心脏移植物血管病变的多肽类似物和对应的cDNA及应用。本发明基于CAV中TIMP‑1与MMP‑14相互作用结构域的确立，提供了一种利用基因工程方法生产的重组多肽类似物myc HisA‑TIMP‑1△102‑217aa的方法。该多肽类似物高效表达，纯化工艺简单，有利于进一步大规模制备。本发明所获得的多肽类似物能够促进TIMP‑1与MMP‑14相互作用，抑制心脏移植后VSMC的迁移，抑制CAV发生发展。可为寻找CAV有效的干预靶点并开发新的治疗药物提供理论依据。对于应用于CAV的临床治疗实现心脏移植者的远期生存具有十分重要的开发前景。

Description

抗CAV的多肽类似物和对应的cDNA及应用
技术领域
本发明涉及多肽类似物，特别涉及一种抗CAV的多肽类似物和对应的cDNA及应用。
背景技术
自1967年世界上首例心脏移植手术成功开展以来，全世界已有超过11万例心脏移植手术登记注册，心脏移植已成为治疗各种终末期心脏病的最有效方式。然而，以移植心脏冠脉内膜不断增厚为主要特征的心脏移植物血管病变(cardiac allograftvasculopathy，CAV)成为降低心脏移植者长期生存率的主要原因之一。
目前，CAV确切的发病机理仍不清楚，也缺少有效的治疗措施。然而，有研究表明，心脏移植过程中血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)可被激活，合成细胞外基质导致内膜增厚。因此，抑制心脏移植后VSMC的迁移，可为寻找CAV有效的干预靶点并开发新的治疗药物提供理论依据，对于实现心脏移植者的远期生存有着十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种抑制肿瘤细胞增殖的多肽类似物及应用，至少能够解决上述问题之一。
为实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种抗CAV的多肽类似物，其氨基酸序列如序列表SEQ NO.1所示。
抗CAV的多肽类似物用于促进TIMP-1与MMP-14相互作用，抑制心脏移植后VSMC的迁移，抑制CAV发生发展。
相应地，本发明还提供了上述抗CAV的多肽类似物的应用，在制备抗心脏移植物血管病变药物的应用。
相应地，本发明还提供了上述抗CAV的多肽类似物的cDNA序列，其序列如序列表SEQ NO.2所示。
相应地，本发明还提供了上述抗CAV的多肽类似物的cDNA序列的应用，在制备抗心脏移植物血管病变药物的应用。
基质金属蛋白酶-14(MMP-14)，是基质金属蛋白酶(MMPs)家族成员之一。研究表明，MMP-14通过促进细胞外基质(extracellular matrixc，ECM)降解和降低细胞间粘附发挥促进VSMC迁移，对CAV有显著的促进作用。通过质谱分析发现能与MMP-14相互作用的蛋白——金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)，在大鼠心脏移植模型中，TIMP-1可与MMP-14相互作用抑制MMP-14促进VSMC迁移的功能，从而抑制CAV发生发展。
本发明的有益效果为：本发明基于CAV中TIMP-1与MMP-14相互作用结构域的确立，提供了一种利用基因工程方法生产的重组多肽类似物myc HisA-TIMP-1△102-217aa的方法。该多肽类似物高效表达，纯化工艺简单，有利于进一步大规模制备。本发明所获得的多肽类似物能够促进TIMP-1与MMP-14相互作用，抑制心脏移植后VSMC的迁移，抑制CAV发生发展。可为寻找CAV有效的干预靶点并开发新的治疗药物提供理论依据。对于应用于CAV的临床治疗实现心脏移植者的远期生存具有十分重要的开发前景。
附图说明
图1为步骤S102中重组真核表达载体图谱；
图2为步骤S103中免疫印迹法明确TIMP-1和MMP14的相互作用增强的实验结果图；
图3为步骤S104中免疫印迹法明确抗CAV的多肽类似物加强TIMP-1对MMP14的抑制实验结果图；
图4为步骤S201中划痕实验检测结果照片；
图5为步骤S202中Transwell实验检测结果照片。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步详细的说明。
为实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种抗CAV的多肽类似物，其氨基酸序列如序列表SEQ NO.1所示。抗CAV的多肽类似物用于促进TIMP-1与MMP-14相互作用，抑制心脏移植后VSMC的迁移，抑制CAV发生发展。
相应地，本发明还提供了上述抗CAV的多肽类似物的应用，在制备抗心脏移植物血管病变药物的应用。
相应地，本发明还提供了上述抗CAV的多肽类似物的cDNA序列，其序列如序列表SEQ NO.2所示。
相应地，本发明还提供了上述抗CAV的多肽类似物的cDNA序列的应用，在制备抗心脏移植物血管病变药物的应用。
一、本发明的抗CAV的多肽类似物的真核表达载体的重组步骤。
S101、多肽类似物的克隆载体构建。
Trizol法从大鼠组织中提取TIMP-1的总mRNA，逆转录为cDNA，以cDNA为模板，应用PCR技术成功扩增出对应的cDNA序列。扩增得到的片段与载体连接，将连接产物转入感受态大肠杆菌中，在含Amp+琼脂平板上挑选克隆，以碱裂解法小提重组质粒后，以ECOR1酶切鉴定。
S102、多肽类似物真核表达载体构建及其表达检测。
将步骤S101克隆质粒和质粒pcDNA3.1双酶切后，利用回收试剂盒获得目的片段和载体连接。经转化、提取等步骤获得重组真核表达载体，期图谱如图1所示。酶切鉴定重组体，并且测序进一步确定，测序结果如序列表所示。将正确连接的多肽真核表达载体mycHisA-TIMP-1△102-217aa转染VSMC，48小时后搜集样品，通过免疫印迹法结果证明了此多肽的表达。
S103、多肽类似物促进TIMP-1和MMP14的相互作用的确定。
将构建的myc HisA-TIMP-1△102-217aa转染至大鼠VSMC中，转染36～48h后，收集细胞并以IP裂解液(50mM Tris-HCl pH 8.0、150mM NaCl、1％NP-40、5mM EDTA、20mM MgCl2、1×Roche phosphatase&Protease inhibitor cocktail)裂解细胞，13000g、4℃离心15min。将上清转移至新管，保留部分样品作为Input后，加入4μg的对照myc HisA抗体过夜孵育后，加入30μl Protein A/G beads进行免疫沉淀。以IP裂解液洗涤4遍后，加入25μl上样缓冲液并煮沸5min。如图2所示，设空白对照实验组，通过免疫印迹法明确TIMP-1和MMP14的相互作用增强。
S104、多肽类似物加强TIMP-1对MMP14的抑制。
将构建的myc HisA-TIMP-1△102-217aa转染至大鼠VSMC中，转染36～48h后，收集细胞。如图3所示，设空白对照实验组，通过免疫印迹法，明确此多肽类似物加强TIMP-1对MMP14的抑制。
二、本发明的抗CAV的多肽类似物的抗CAV功能检测。
S201、划痕实验检测多肽类似物抑制心脏移植后VSMC迁移的能力。
设转染VSMC和未转染VSMC实验组。在六孔板中加入约5×105个细胞，具体数量因细胞不同而不同，掌握为过夜能铺满。第二天用枪头比着直尺，尽量垂至于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜。用PBS洗细胞3次，去除划下的细胞，加入培养基。放入37度5％CO2培养箱进行培养。培养完成后取样，拍照如图4所示，显示转染VSMC的迁移的能力明显低于未转染细胞。
S202、Transwell实验检测多肽类似物抑制心脏移植后血管平滑肌细胞迁移的能力。
设转染VSMC和未转染VSMC实验组。Transwell小室加入200ul单细胞悬液(细胞数约为1.5×105/室)，下室加入含20％FBS的DMEM。装有Transwell小室的24孔板放置在37℃、5％CO2的培养箱中培养。培养结束，取出Transwell小室，PBS洗涤3遍(每遍5min)；4％多聚甲醛室温固定15min，PBS洗涤3遍；用棉签轻轻擦去上层未穿透膜的VSMC；0.5％结晶紫染色15～30min，PBS洗涤3遍；风干，用显微镜低倍镜观察，如图5所示。计算每个视野的平均细胞数，显示转染VSMC的迁移的能力明显低于未转染细胞。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (2)

1.抗CAV的多肽类似物，其特征在于，其氨基酸序列如序列表SEQ NO.1所示：RSEEFLIAGR LRNGNLHITA CSFLVPWHNL SPAQQKAFVK TYSAGCGVCT VFPCSAIPCK LESDSHCLWTDQILMGSEKG YQSDHFACLP RNPDLCTWQY LGVSMTRSLP LAKAEA。
2.权利要求1所述的抗CAV的多肽类似物在制备抗心脏移植物血管病变药物的应用。
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CN101268102A (zh) * 2005-09-20 2008-09-17 拉尔夫·胡斯 用于治疗癌症和皮肤损伤的与糖基磷脂酰肌醇(gpi)锚相连的金属蛋白酶组织抑制剂(timp)

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