CN114015693B - 一种环状rna、其检测试剂、试剂盒、应用及药物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种环状RNA、其检测试剂、试剂盒、应用及药物。所述环状RNA是序列如SEQ ID NO.1所示的circLuc7L。本发明的研究结果证实，circLuc7L在细胞中的含量可以影响到黑色素瘤细胞的迁移能力，circLuc7L含量的升高也可以抑制黑色素瘤细胞的迁移，其具有深远的临床意义和重要的推广应用前景。

Description

一种环状RNA、其检测试剂、试剂盒、应用及药物
技术领域
本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种环状RNA、其检测试剂、试剂盒、应用及药物。
背景技术
黑色素瘤是由黑素细胞失控且大量繁殖引起的一种肿瘤疾病，多数由正常的痣和色素斑演变而来。该病多发于皮肤，临床表现主要为皮肤出血、瘙痒、压痛、溃疡等。在黑色素瘤早期，90％以上的病人可以通过手术切除的治疗手段被治愈，但是如果黑色素瘤进入迅速生长期，则极难治愈。主要是该时期的黑色素瘤转移率较高，可以在短时期内转移至淋巴、心、肝、肺、肾等多种器官。因此该病治疗困难极大且致死率极高，仅次于胰腺癌。
环状RNA(circRNA)的内源性非编码RNA，该基因的特点在于首尾连接形成一个环状结构，可以稳定的存在于各种类型的真核细胞中。随着对circRNA的深入研究，circRNA的生物学功能也被逐渐挖掘，研究发现circRNA参与了机体生长、发育等各项生物学过程。其发挥作用的主要途径是通过吸附miRNA以调控下游基因。
环状RNA circLuc7L是由Luc7I基因反向剪切得到，所以命名为circLuc7L。目前，还未见任何关于circLuc7L和其功能相关的报道。
发明内容
针对上述技术问题，本发明的目的之一是提供一种环状RNA，其是序列如SEQ IDNO.1所示的circLuc7L。
本发明的目的之二是提供检测所述的环状RNA表达水平的试剂在制备评估黑色素瘤转移风险的试剂盒中的应用。
本发明的目的之三是提供一种评估黑色素瘤转移风险的试剂盒，所述试剂盒含有检测所述环状RNA表达水平的试剂。
进一步的，所述试剂包括扩增所述环状RNA的引物和/或检测所述环状RNA的探针。
更进一步的，检测所述环状RNA的探针序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的目的之四是提供所述的环状RNA在制备抑制黑色素瘤转移的药物中的应用。
本发明的目的之五是提供所述环状RNA的表达促进剂在制备抑制黑色素瘤转移的药物中的应用。
本发明的目的之五是提供一种抑制黑色素瘤转移的药物，含有所述的环状RNA或所述的环状RNA的表达促进剂。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明首先运用RNA-FISH定位技术，设计与circLuc7L匹配的探针对细胞中的circLuc7L进行定位，最终发现circLuc7L存在并表达于细胞质中。
2、本发明对circLuc7L进行了体外细胞功能的研究，转染circLuc7L时，细胞的迁移能力都会显著降低。即circLuc7L在细胞中的含量可以影响到B16F10细胞系的迁移能力。
附图说明
图1为circLuc7L定位结果，图中，A为定位细胞在白光下的状态；B为细胞在蓝光照射下的细胞状态；C为A图B图重叠后的效果图。
图2为细胞划痕实验，图中，A列为空白组，B列为转染circLuc7L组。
图3为细胞划痕分析结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
circLuc7L在B16F10细胞中的定位分析
试验方法
B16F10黑色素10代细胞(山西农业大学生命科学学院113实验室提供)。
1、细胞培养
第一步：胎牛血清、PBS、终止液(DMEM+10％胎牛血清)、黑素细胞培养液(DMEM+10％胎牛血清+1％双抗)提前放置水浴锅中预热，24孔板的每一个孔中提前放入适合细胞粘附的玻片。
第二步：取冻存的的第10代B16F10细胞于液氮中取出迅速放入水浴锅融化后转移入提前加好终止液的洁净的细胞级别10mL离心管中于低速离心机离心10min。后去掉上清液，用黑素细胞培养液将细胞沉淀重悬后接种入24孔板内。
第三步：将24孔板放入二氧化碳培养箱中培养1d。
2、circLuc7L在细胞中的定位
针对circLuc7L的核苷酸序列(SEQ ID NO.1所示)设计特异性探针，在细胞中对其定位。
第一步：准备37℃培养箱，提前准备37℃水浴锅给杂交缓冲液预热2h，准备73℃水浴锅给探针变性5min，SSC准备2×和0.4×浓度各10mL备用，特异性探针(探针序列：AAGTGATCCATAGCTGTCAAG，如SEQ ID NO.2所示)用DEPC水稀释到0.1ng/μL，DAPI稀释到0.1％备用，Tween20分别稀释至0.1％和0.3％备用，0.1％tritonX-100备用，洗涤液提前制备好：2×SSC+0.1％Tween20。
第二步：清洗细胞，PBS冲洗取出的24孔板内的细胞两次，每次3min，后用无水乙醇固定细胞15min，固定后，室内用0.1％tritonX-100去污15min，用PBS冲洗两次，每次5min。2×SSC清洗细胞30min(培养箱条件下)。逐级在70％、85％、无水乙醇的条件下处理3min脱水并干燥(该步骤如果认为细胞清洗不干净则可以重复操作一次)。
第三步：杂交，变性后的探针加入24孔板中，每孔100μL，放到培养箱中过夜，第二天用洗涤液清洗两次，每次2min。后加入DAPI染液染色20min，在避光条件下进行。
第四步：用PBS清洗后，将所制细胞玻片取出并滴加抗荧光淬灭剂，迅速放置荧光显微镜下观察。
对circLuc7L进行定位，结果见图1，circLuc7L染色为绿色荧光，于细胞质中表达，图1A为定位细胞在白光下的状态，图1B为细胞在蓝光照射下的细胞状态，图1C为A图B图重叠后的效果图。试验结果表明circLuc7L于细胞质中广泛表达。即circLuc7L的合成与发挥作用的途径均发生于细胞质中。
实施例2
过表达circLuc7L基因对黑色素瘤细胞迁移能力的影响
1、实验方法
1.1细胞培养及转染
1)液氮中取出黑色素细胞于37℃水浴锅中复苏，加入等量的DMEM+10％胎牛血清，1000r/mim低速离心10min，弃上清，使用黑色素细胞完全培养基(DMEM+10％胎牛血清+1％双抗)悬浮黑色素细胞并分装于6孔细胞培养板中于37℃，5％CO2培养箱中进行培养。
2)转染试剂转染前准备：稀释circLuc7L浓度为300xng/mL，稀释转染试剂100倍，稀释剂使用DMEM，稀释所用试剂后，室温静置20min，circLuc7L稀释液于稀释转染试剂混匀放置5min，作为转染溶液。
3)取出培养好的细胞，弃去培养液，使用无血清细胞培养液(DMEM+1％双抗)作为细胞培养液，向每孔细胞中加入对应的转染溶液后，将细胞培养板放置于细胞培养箱中培养4h后，细胞重新换黑色素细胞完全培养基继续培养。
4)48h后从培养箱中将细胞取出并收集，以未转染的B16F10细胞作为对照，进行上述实验，作为空白对照。
1.2细胞划痕
对细胞各组进行划痕试验，吸弃原有培养液，用200μL的无菌枪头在细胞中心划垂直线(沿直尺)，划好线后用PBS冲洗细胞两次(操作轻缓)，再加入新的细胞培养基置于显微镜下拍照记录，继续培养24h后，再次取出于显微镜下拍照记录。通过划痕之间的愈合程度判断各组分对细胞迁移的影响。
将划痕试验结果整合，见图2，对图中数据进行量化得到图3，图2中A列为空白组，B列为转染circLuc7L组，转染circLuc7L组的细胞愈合度极低甚至不愈合结果显示，当向B16F10细胞系中转入circLuc7L时，细胞的迁移能力会显著降低。
上述实验证实，转染circLuc7L时，细胞的迁移能力都会显著降低。即circLuc7L在细胞中的含量可以影响到B16F10细胞系的迁移能力，因此，通过检测circLuc7的表达量可以评估评估黑色素瘤转移风险，circLuc7L及其表达促促进剂也为靶向治疗黑色素瘤提供新的思路。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
序列表
<110> 山西农业大学
<120> 一种环状RNA、其检测试剂、试剂盒、应用及药物
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 496
<212> DNA
<213> 人
<400> 1
gctatggatc acttagagtc cttcattgca gagtgtgatc ggagaaccga acttgccaaa 60
aagcggctgg ctgaaacaca ggaggaaatc agtgcagaag tttcggctaa ggtatattaa 120
gtaactgcta taactcattt ctcttaccct cacactgggt gaggattctg gatagatggt 180
gctttccgtc ttgactgttt tcattggaga cagggtctgt gaccaagcat ttgtgtgtca 240
caggaacctg tatgcctccc tgcctgcctt tcttttattc tttttgtgac aagggctaac 300
taagaagatt aggtcagcct tgagtttaca gtgatctgcc tgcctcttga gtgctaggat 360
taaaggcatg cagatctaat taaaatttct taggctgtac gcagttactg attaaaaaaa 420
aagatgctat tgtgctgata aatcctagta attggatatt tgcttgcaac cttagtttgt 480
atgttaaacc ttgaca 496
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aagtgatcca tagctgtcaa g 21

Claims (6)

1.一种环状RNA，其特征在于，其是序列如SEQ ID NO.1所示的circLuc7L。
2.检测权利要求1所述的环状RNA表达水平的试剂在制备评估黑色素瘤转移风险的试剂盒中的应用。
3.一种评估黑色素瘤转移风险的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有检测权利要求1所述环状RNA表达水平的试剂。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂包括扩增所述环状RNA的引物和/或检测所述环状RNA的探针。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，检测所述环状RNA的探针序列如SEQ IDNO.2所示。
6.权利要求1所述的环状RNA在制备抑制黑色素瘤转移的药物中的应用。
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