CN109554484A

CN109554484A - 一种快速检测猪胚胎全基因组转录活性的方法

Info

Publication number: CN109554484A
Application number: CN201811552309.6A
Authority: CN
Inventors: 曹祖兵; 刘成雪; 许腾腾; 刘洪瑜; 王恒; 高迪; 童旭; 张丹丹; 王怡青; 张运海
Original assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Current assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Priority date: 2018-12-19
Filing date: 2018-12-19
Publication date: 2019-04-02

Abstract

本发明公开了一种快速检测猪胚胎全基因组转录活性的方法。包括如下步骤：将卵母细胞或各期胚胎放入有含有2mM EU的预热的完全培养基中孵育；卵母细胞或各期胚胎样品收集。将与EU共孵育过后的卵母细胞或各期胚胎进行固定、通透；“click”反应标记荧光染料。将与EU共孵育、固定、通透后的卵母细胞或各期胚胎放入Click‑iT reaction cocktail中孵育30min，使其标记上荧光染料。将带有荧光染料卵母细胞或各期胚胎进行压片、封片。EU染色可以大大缩短的检测时间且操作简单、方便、快捷，是一种理想的快速检测猪胚胎全基因组转录活性的方法。

Description

一种快速检测猪胚胎全基因组转录活性的方法

技术领域

本发明属于动物胚胎工程技术领域，具体是一种快速检测猪胚胎全基因组转录活性的方法。

背景技术

随着动物胚胎工程技术的发展，其在畜牧业和生物医学方面所起到的作用越来越重要，利用它可以改良家畜品种、培育转基因新品种、制备人类疾病模型、生产药用蛋白、研究胚胎发育机理等。由于哺乳动物生理和解剖结构与人类非常相似，这就奠定了胚胎生物学和遗传学研究中的重要地位。但是，在畜牧生产中，约有30％的哺乳动物胚胎发生死亡或丢失，而这些事件主要集中在早期胚胎发育阶段，所以，对早期胚胎的研究就变得非常重要。在哺乳动物早期胚胎发育过程中，会发生一系列生物学事件，例如：母源因子的降解、卵裂、胚胎基因组激活、细胞极化和致密化、成腔等。其中，胚胎基因组激活能否正常发生对胚胎发育尤为重要。

哺乳动物胚胎早期发育最初由母源性的mRNA和蛋白质调控。此时，胚胎自身的基因转录处于失活状态。随着母源性mRNA和蛋白质不断降解；胚胎自身的基因组逐渐被激活，进行基因转录和蛋白翻译以满足胚胎继续发育的所需物质。胚胎基因组的转录激活标志着胚胎发育由母源性因子调控向胚胎自主发育调控的转变，即“母型-合子型转变”。基因组激活是新生物体生命中最重要的事件之一。必须正确控制基因组激活的时间和激活的基因序列。基因组激活以逐步的方式发生，一些基因在主要的基因组激活事件发生之前就被转录，在这一事件中大多数的管家基因被激活。染色质蛋白含量，特别是组蛋白和染色质结构的变化似乎调节了转录基因组的可用性，并提供了转录的特异性。基因增强子最初并不需要用于转录，但随着染色质结构的改变，它变得必要了。转录因子含量或活性的变化也是必需的，而蛋白质合成对于转录激活的早期和后期基因组激活至关重要。染色质结构的改变和转录因子的有效性都是由细胞周期依赖机制调控的，从而提供了这些过程和其他过程之间必要的协调，如DNA复制和分裂。一旦胚胎基因组激活失败，将会导致胚胎转录紊乱，组蛋白甲基化、乙酰化表达异常，胚胎发育受阻等现象。

合子基因组的激活(ZGA)促使胚胎产生新的mRNA并转录翻译为蛋白质调控胚胎后期的发育。研究胚胎基因组激活对于理解早期胚胎发育的分子机制具有重要的理论意义，对于胚胎的体外培养和发育、转基因动物和细胞核移植等技术具有潜在的应用价值。目前，用于检测基因组活性的方法有单细胞定量PCR、转录组测序及全基因组测序等，但这些生物技术都存在自身局限性。例如：单细胞定量PCR，需要筛选与设计大量的基因来验证其转录活性，同时操作比较繁琐，其结果的稳定性受到的影响因素较多。转录组及全基因组测序虽能整体水平检测到相关基因转录活性的变化，但是价格昂贵且需要大量的实验材料。但由于受胚胎实验材料和实验技术的困扰。事实上，现在有一种新的方法能够更加准确、快捷、廉价的检测胚胎的全转录活性--EU染色。

RNA转录是细胞活动的基本特征，定量分析细胞中新生RNA是研究基因转录的快速方法。EU是一种尿嘧啶核苷类似物，能够在RNA转录时代替尿嘧啶(U)插入正在合成的RNA分子，通过“click”化学反应能够标记上荧光染料，然后利用这种特异性反应进行RNA检测。EU能够在体内和体外水平检测时间和空间上新合成的RNA，和相关抗体结合能够更方便地检测与RNA有相互作用的蛋白。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速检测猪胚胎全基因组转录活性的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种快速检测猪胚胎全基因组转录活性的方法，包括如下步骤：

1)配制含有2mM EU的完全培养基，在培养皿中做多个50μm的微滴，覆盖石蜡油，放入培养箱中预热；

2)将卵母细胞或各期胚胎放入上述培养基中，共孵育1h；

3)将步骤2)得到的卵母细胞或各期胚胎放入DPBS/PVP液滴中快速清洗3遍，随后放入4％PFA室温固定15min，再放入DPBS/PVP液滴中清洗3遍，每遍清洗5min；

4)将步骤3)得到的卵母细胞或各期胚胎样品置于0.5％Triton X-100在室温下通透20min，然后在DPBS/PVP液滴中清洗3遍，每遍清洗5min；

5)将步骤4)得到的样品放在EU试剂盒中的reaction cocktail在培养皿中做50μm的微滴，覆盖石蜡油，室温孵育30min，过程避光；

6)再将步骤5)得到的样品用EU试剂盒中的Click-iT reaction rinse buffer洗涤一次。

7)将步骤6)得到的样品在DPBS/PVP液滴中快速清洗3遍，然后放置于EU试剂盒中的Hoechst 33342中，室温孵育15min，避光。

8)将步骤7)得到的样品在DPBS/PVP液滴中清洗3遍，每遍清洗5min；

9)依据样品的多少取相应的盖玻片和载玻片，盖玻片的四角作为大小参考，在载玻片点上适量的凡士林，在凡士林的四个点的中间加入5μm抗荧光淬灭封片液，然后将样品放入，用移卵针拨动至互不重叠，然后盖上盖玻片，用指甲油沿盖玻片四周封好；

10)将封好的盖玻片置于荧光倒置显微镜下进行拍照。

步骤1)中，培养箱的温度为38.5°、含体积分数5％CO₂、完全湿度。

步骤2)中，孵育条件为温度38.5°、体积分数5％CO₂。

所述的DPBS/PVP液滴配制方法：将0.3g PVP加入80ml的DPBS中充分溶剂，定容至100ml，再用直径为0.22μm滤器过滤，离心管分装备用，4℃保存。

所述0.5％Triton X-100配制方法：将0.5ml Triton X-100加入99.5ml DPBS/PVP，混匀。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明整个检测过程只需要3-4个小时，大大缩短的检测时间，整个过程无毒、安全、操作简单方便。同时可以为后续单细胞定量PCR、转录组测序及全基因组测序检测与否提供预判断。EU染色的高精度、高灵敏度等特点可以广泛用于各种细胞和体内试验的研究同时也是我们研究细胞活性、毒性及RNA转录情况和机制等的理想工具，亦可以协助深入开展有关细胞增殖、细胞周期、细胞毒性、DNA复制及修复、信号通路等方面的研究。

卵母细胞或各期胚胎与EU共孵育，使得EU能够在卵母细胞或各期胚胎转录时代替尿嘧啶(U)插入正在合成的RNA中以及通过“click”反应标记荧光染料，使得与EU共孵育过卵母细胞或各期胚胎通过“click”化学反应标记上荧光染料。

附图说明

图1为4-cell胚胎的EU免疫荧光染色图。

具体实施方式

1.材料：

盖玻片(Fisherfinest，12-544-10)，载玻片(帆船，7105)，EU试剂盒(Click-iT^TMRNA Alexa Fluor^TM488 Imaging Kit，C10329)，DPBS(Gibco，758054，无钙镁)，4％多聚甲醛(Solarbio，09115)，Triton X-100(Solarbio，0694)，ddH₂O(去离子水)，DMSO(Sigma，D-2650)PVP(Sigma，P0930)，抗荧光淬灭封片液(P0126，碧云天)，石蜡油(Sigma)，荧光倒置显微镜(Olympus，LX71型)，体式显微镜(Nikon，SMZ1000)

2.试剂配制：

DPBS/PVP液滴：将0.3g PVP加入80ml的DPBS中充分溶剂，定容至100ml，再用直径为0.22μm滤器过滤，离心管分装备用，4℃保存。

0.5％Triton X-100：将0.5ml Triton X-100加入99.5ml DPBS/PVP，混匀，4℃保存。

EU试剂盒中各主要试剂配制依照说明书。

3.一种快速检测猪胚胎全基因组转录活性的方法，包括如下步骤：

1)配制含有2mM EU的完全培养基，在直径为35mm进口培养皿中做多个50μm的微滴，覆盖石蜡油，放入温度为38.5°、含体积分数5％CO₂、完全湿度的培养箱中预热；

2)将卵母细胞或各期胚胎放入上述培养基中，在温度38.5°、体积分数5％CO₂条件下共孵育1h。

5)将步骤4)得到的样品放在EU试剂盒中的reaction cocktail(反应混合液)在35mm进口培养皿中做50μm的微滴，覆盖石蜡油，室温孵育30min，过程避光。

6)再将步骤5)得到的样品用EU试剂盒中的Click-iT reaction rinse buffer(反应冲洗液)洗涤一次。

9)依据样品的多少取相应的盖玻片和载玻片，盖玻片的四角作为大小参考，在载玻片点上适量的凡士林，在凡士林的四个点的中间加入5μm抗荧光淬灭封片液，然后将样品放入，用移卵针拨动至互不重叠，然后盖上盖玻片，用指甲油沿盖玻片四周封好。

10)将封好的盖玻片置于荧光倒置显微镜下进行拍照。

4.实施

收集4-cell时期胚胎按照上述检测方法进行EU染色检测转录活性。

结果如图1所示，其中a为Hoechst 33342免疫荧光染色图，b为EU免疫荧光染色图，c为图a、图b合成后的Merge图，

结合上述实验结果我们发现EU染色可以用来检测胚胎转录活性。整个检测过程只需要3-4个小时，大大缩短的检测时间，整个过程无毒、安全、操作简单方便。同时可以为后续单细胞定量PCR、转录组测序及全基因组测序检测与否提供预判断。EU染色的高精度、高灵敏度等特点可以广泛用于各种细胞和体内试验的研究同时也是我们研究细胞活性、毒性及RNA转录情况和机制等的理想工具，亦可以协助深入开展有关细胞增殖、细胞周期、细胞毒性、DNA复制及修复、信号通路等方面的研究。

Claims

1.一种快速检测猪胚胎全基因组转录活性的方法，其特征在于，包括如下步骤：

2)将卵母细胞或各期胚胎放入上述培养基中，共孵育1h；

5)将步骤4)得到的样品放在EU试剂盒中的Click-reaction cocktail在培养皿中做50μm的微滴，覆盖石蜡油，室温孵育30min，过程避光；

6)再将步骤5)得到的样品用EU试剂盒中的Click-iT reaction rinse buffer洗涤一次；

7)将步骤6)得到的样品在DPBS/PVP液滴中快速清洗3遍，然后放置于EU试剂盒中的Hoechst 33342中，室温孵育15min，避光；

10)将封好的盖玻片置于荧光倒置显微镜下进行拍照。

2.根据权利要求1所述的快速检测猪胚胎全基因组转录活性的方法，其特征在于，步骤1)中，培养箱的温度为38.5°、含体积分数5％CO₂、完全湿度。

3.根据权利要求1所述的快速检测猪胚胎全基因组转录活性的方法，其特征在于，步骤2)中，孵育条件为温度38.5°、体积分数5％CO₂。

4.根据权利要求1所述的快速检测猪胚胎全基因组转录活性的方法，其特征在于，所述的DPBS/PVP液滴配制方法：将0.3g PVP加入80ml的DPBS中充分溶剂，定容至100ml，再用直径为0.22μm滤器过滤，离心管分装备用，4℃保存。

5.根据权利要求1所述的快速检测猪胚胎全基因组转录活性的方法，其特征在于，所述0.5％Triton X-100配制方法：将0.5ml Triton X-100加入99.5ml DPBS/PVP，混匀。