CN111575227A - 一种人源性糖尿病心肌病疾病模型的建立方法 - Google Patents

一种人源性糖尿病心肌病疾病模型的建立方法 Download PDF

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Abstract

本发明公布了一种“人源性”糖尿病心肌病疾病模型的建立方法。本方法首先获取病人的尿液肾上皮细胞，然后将尿液肾上皮细胞重编程为iPSCs，进而将其进行定向分化获得病人特异性的心肌细胞(Cardiomyocytes，CMs)，再利用这些心肌细胞建立一个稳定的二维体外心肌细胞疾病模型用于糖尿病心肌病的研究。本发明使用人源性诱导多能干细胞来源的心肌细胞，与人的遗传背景相同，拥有人类心脏的电生理学特性，拥有人类心肌细胞生化和分子生物学特性，拥有动物模型无法比拟的优势，纯化方便并且可以长时间体外培养，可批量生产满足高通量实验需求缩短实验周期，以利于广泛用于疾病表型分析和功能学研究，疾病分子机制研究，治疗药物筛选和安全性评估。

Description

一种人源性糖尿病心肌病疾病模型的建立方法
技术领域
本发明属于干细胞与再生医学研究领域，具体是一种涉及应用体细胞重编程技术建立病人特异性的诱导多能干细胞株，进而应用心肌定向分化技术获得病人特异性的心肌细胞，建立“人源性”糖尿病心肌病模型的技术。
背景技术
糖尿病是胰岛素分泌绝对或相对不足，并以高血糖、高血脂为病理特征的代谢紊乱综合征。我国糖尿病患病率高达9.4％，远远超出全球平均水平，继发于糖尿病的心血管并发症已成为糖尿病患者的主要死亡原因。其中，糖尿病心肌病是糖尿病患者的主要心脏并发症之一，发病率高，危害大，与糖尿病病人心血管疾病的高发生率和高病死率密切相关。糖尿病心肌病是糖尿病引起心脏微血管病变和心肌代谢紊乱所致的心肌广泛局灶性坏死。早期通常表现为心肌顺应性降低和舒张期充盈受阻的舒张功能不全，晚期以收缩功能不全为主，易发生充血性心力衰竭。大量的研究在动物模型中探讨了糖尿病发生中的心脏功能异常以及可能的发生机制，其中包括：心肌代谢障碍、心脏电生理异常、心脏局部肾素-血管紧张素系统异常、蛋白激酶C代谢异常、细胞外基质增生及心肌间质纤维化等。然而，糖尿病心肌病发生的分子机制仍不明确。目前缺乏糖尿病心肌病合适的人源性疾病模型，造成大多数研究只能在糖尿病动物模型中开展，阻碍了将这些研究结果向人类疾病的转化。
人诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)的出现为转化医学和再生医学提供了强大的动力和革命性的模式转变，拉近了干细胞用于临床疾病治疗的距离，在疾病模型的建立、疾病分子机制的研究以及新药研发等方面具有巨大的潜在价值。2006年，Takahashi和Yamanaka通过对4个特定转录因子 (Oct3/4，Sox2，c-Myc和Klf4，也称为Yamanaka因子)的逆转录病毒介导的转导，建立了第一个诱导多能干细胞(iPSCs)，最终分化成小鼠成纤维细胞。这些由小鼠衍生的iPSCs的性质被发现与人胚胎干细胞的性质相同。此后不久，人类体细胞被成功地重新编程到为iPSCs。由于iPSCs具有多能干细胞的明显特征，包括无限的自我更新和多能性，它们被用于广泛的应用领域中，如细胞替代再生疗法、发展生物学研究、疾病建模和药物筛选。最令人兴奋的iPSCs研究领域之一是疾病建模，即iPSCs是由患有遗传疾病的病人产生的，即病人特异性iPSCs。将病人特异性iPSCs分化为与疾病相关的细胞，为研究者提供了稳定、可再生的靶细胞替代来源进行疾病建模。到目前为止，许多关于各种疾病的研究已经证明，病人特异性iPSCs模型系统可以再现与实际病人相似的疾病表型，这些系统可以帮助我们更好地理解疾病的机制，并可能产生新的治疗策略。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于现有的糖尿病心肌病疾病模型主要是动物模型，具有明显的种属差异，其研究结果不能直接应用于人类疾病。从而本申请提出应用糖尿病心肌病病人的尿液肾上皮细胞重编程为iPSCs，再将其定向分化为心肌细胞以建立稳定的携带特定突变位点的糖尿病心肌病体外疾病模型。该方法不需要繁琐的动物培养及建模技术，利用与人的遗传背景相同的优势，其拥有人类心脏的电生理学特性，拥有人类心肌细胞生化和分子生物学特性，拥有动物模型无法比拟的优势，纯化方便并且可以长时间体外培养，可批量生产满足高通量实验需求缩短实验周期，以利于广泛用于疾病表型分析和功能学研究，疾病分子机制研究，治疗药物筛选和安全性评估。
在本发明的实施例公开了一种“人源性”糖尿病心肌病疾病模型的建立方法，包括如下步骤：
A)2型糖尿病病人尿液肾上皮细胞的获得和培养；
B)采用非整合型仙台病毒将病人的尿液肾上皮细胞重编程为病人特异性 iPSCs；
C)将病人特异性iPSCs定向分化为病人特异性心肌细胞；得到“人源性”糖尿病心肌病疾病模型。
作为本发明的优选方案，所述步骤A)具体包括如下步骤：
A1)病人尿液的收集；
A2)尿液肾上皮细胞的分离；
A3)尿液肾上皮细胞的贴壁扩增；
A4)尿液肾上皮细胞的传代培养。
作为本发明的优选方案，所述的步骤B)具体为：
B1)在24孔板中种植尿液肾上皮细胞，每日更换新鲜尿液扩增培养基；
B2)当细胞密度达到50-80％进行病毒感染，首先给细胞更换新鲜尿液扩增培养基，然后取分装好的仙台病毒，冰上溶化，完全溶化后加入细胞中，水平晃动24孔板使培养基和病毒均匀分布；
B3)感染24小时后撤掉病毒液，更换新鲜的89％DMEM+10％FBS+1％双抗的培养基；感染第2天不做任何处理，之后隔日以89％DMEM+10％FBS+1％双抗的培养基换液；
B4)感染第7天，吸弃陈旧培养基后使用DPBS漂洗一遍，单孔加入0.25ml TrypLE消化酶，置于5％CO2的37℃恒温细胞培养箱中3-5分钟，终止消化并 300g离心收集细胞，以89％DMEM+10％FBS+1％双抗的培养基重悬细胞，接种于Matrigel包被的培养皿中，静置于细胞培养箱中继续培养；
B5)24小时后细胞贴壁，使用mTeSR培养基继续每日换液培养，直至在显微镜下观察有克隆出现；
CB6)待克隆长至适合挑取的大小，用枪头在显微镜下挑取单个克隆转移到Matrigel包被12孔板中，此时的iPSCs为P1代细胞，继续使用mTeSR培养基培养；
B7)克隆在12孔板中扩增7至10天后可进行传代，以0.5ml/孔的Accutase 消化细胞，每孔细胞种植至Matrigel包被的6孔板的1个孔中，此时的iPSCs为 P2代细胞，并继续用mTeSR培养基培养；待细胞长至80％，进行传代冻存，以 1:6-1:12的稀释比例传代培养；
B8)待iPSCs传代至P19-21代。
作为本发明的优选方案，所述的步骤C)具体包括如下步骤：
C1)第-5-0天iPSCs的培养；
C2)第0-1天完成iPSCs向中胚层的诱导分化；
C3)第2-3天完成中胚层向心脏中胚层的诱导转分化；
C4)第3-5天完成中胚层向心肌细胞的诱导分化；
C5)第7天以后以心肌细胞完全培养基持续培养，每日换液，第7-10天可看到成片跳动的心肌细胞，第30天后，得到建立完成的“人源性”糖尿病心肌病疾病模型。其中，得到“人源性”糖尿病心肌病疾病模型主要是心肌细胞的成熟过程。
作为本发明的优选方案，所述的步骤C1)具体包括如下步骤：
C11)首先将iPSCs按1:8-1:12稀释比例接种至6孔板中；
C12)每日更换mTeSR培养基；
C13),至细胞密度达到80％左右进行分化操作。
作为本发明的优选方案，所述的步骤C2)中：
在分化开始的第0天，小心吸走陈旧培养基，使用心肌分化培养基 RPMI+B27-Insulin清洗一遍，每孔加入含8μM的CHIR的心肌分化培养基2ml。心肌分化培养基(RPMI+B27-Insulin)为RPMI 1640添加不有胰岛素的B27 (B27-Insulin)组成，体积比为500mlRPMI 1640:10ml B27-Insulin。
作为本发明的优选方案，所述的步骤C3)中：
持续作用2天后即第2天更换为新的心肌分化培养基，每孔2ml；第3天吸走陈旧培养基，加入含5μM的IWR-1的心肌分化培养基，每孔2ml。
作为本发明的优选方案，所述的步骤C4)中：加入含5μM的IWR的心肌分化培养基持续作用2天后即第5天，更换新的心肌分化培养基，每孔2ml。
作为本发明的优选方案，所述的步骤C5)中：持续作用2天后即第7天更换新的心肌细胞完全培养基RPMI+B27+Insulin，以心肌细胞完全培养基持续培养，每日换液，第7-10天可看到成片跳动的心肌细胞，第20-30天，得到建立完成的“人源性”糖尿病心肌病疾病模型。心肌细胞完全培养基 (RPMI+B27+Insulin)为RPMI 1640添加含有胰岛素的B27(B27+Insulin)组成，体积比为500ml RPMI 1640:10ml B27+Insulin。
本发明的有益效果在于：本发明使用与人的遗传背景相同糖尿病心肌病病人特异性的心肌细胞进行疾病表型分析和功能学研究，疾病分子机制研究，治疗药物筛选和安全性评估，有望将研究成果迅速运用于现有的临床治疗过程中，实现科研与临床地快速转化，推动医学研究的快速发展和应用。
附图说明
以下附图仅旨在于对本发明做示意性说明和解释，并不限定本发明的范围。
其中：
图1为本发明1个实施例的一种2型糖尿病病人特异性的iPSC的建立和多能性特征鉴定的代表图；
图2为本发明1个实施例的一种2型糖尿病病人特异性iPSC衍生的心肌细胞(iPSC-CMs)具有心肌细胞肥大表型的代表图；
图3为本发明1个实施例的一种2型糖尿病病人特异性iPSC-CMs具有脂质沉积表型的代表图；
图4为本发明1个实施例的一种对2型糖尿病病人特异性iPSC-CMs具有心律失常表型的代表图；
图5为本发明1个实施例的一种2型糖尿病病人特异性iPSC-CMs具有线粒体结构和功能异常表型的代表图；
图6为本发明1个实施例的一种使用高糖髙脂诱导2型糖尿病病人特异性 iPSC-CMs出现凋亡信号增加表型的代表图；
图7为本发明方法的流程示意图。
具体实施方式
本实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。本实施例中的定量实验，均设置3次独立重复实验。
如图7所示，本实施例所述的一种“人源性”糖尿病心肌病疾病模型的建立方法，本方法首先按2型糖尿病诊断标准入组病人并获取病人的尿液肾上皮细胞，然后将尿液肾上皮细胞重编程为iPSCs，进而将其进行定向分化获得病人特异性的心肌细胞，再利用这些心肌细胞建立一个稳定的二维体外心肌细胞疾病模型用于糖尿病心肌病的研究。
本实施例以如下标准诊断2型糖尿病(T2DM)病人：
1)糖化血红蛋白HbA1c≥6.5％；
2)空腹血糖FPG≥7.0mmol/L，空腹定义为至少8小时内无热量摄入；
3)口服糖耐量试验时2小时血糖≥11.1mmol/L；
4)在伴有典型的高血糖或高血糖危象症状的患者，随机血糖≥11.1mmol/L；
在无明确高血糖时，应通过重复检测来证实标准1-3。
实施例1 2型糖尿病病人尿液肾上皮细胞的获得和培养
1-1)搜集尿液前1h嘱咐患者饮水，可一次性饮用600-800ml；
1-2)收集尿时用消毒湿巾擦拭尿道口，取清洁中段尿，最好不少于200ml (加入缓冲液后可在4℃存放4h)。
2-1)将尿液细胞分离培养基从4℃冰箱取出放置37℃水浴锅温浴，使用前约半小时将Matrigel提前包被过的24孔板置于5％CO2的37℃恒温细胞培养箱中；尿液细胞分离培养基为Urineasy尿液细胞分离培养基，采购于北京赛贝生物公司。
2-2)用移液管将尿液转移至50ml离心管中，300g离心10min。将移液器吸液速度调至最小，用移液管沿液面缓慢吸弃上清，每管保留约5ml，将每管液体重悬后转移合并到单独的50ml离心管中，300g离心10min。用移液管沿液面小心吸弃上清，保留约5ml液体。
2-3)加入5ml尿液细胞分离培养洗涤液，重悬细胞后转移至15ml离心管中，300g离心10min。完全吸弃上清后用0.8ml尿液细胞分离培养基重悬细胞，接种于准备好的24孔板中置于5％CO2的37℃恒温细胞培养箱中培养。
2-4)静置培养24h后，沿24孔板内壁缓慢补充加入0.5ml/孔尿液细胞分离培养基。每2天半量换液，即从24孔板中吸出半量的培养基，300g离心10min，吸弃上清后加入0.5ml尿液细胞分离培养基重悬，并小心沿内壁加回到原孔。
2-5)尿液细胞贴壁后，使用0.5ml尿液细胞扩增培养基每2天换液一次，当细胞增殖密集时，进行传代扩增。尿液细胞扩增培养基为Urineasy尿液扩增培养基，采购于北京赛贝生物公司。
2-6)传代按照原代尿液肾上皮细胞的增殖速度按照1:3-1:6稀释比例进行传代，用于重编程的尿液细胞最大代数不能超过P3代。
实施例2采用非整合型仙台病毒将病人的尿液肾上皮细胞重编程为病人特异性iPSCs；
C1)感染前2天，在24孔板中种植适量尿液肾上皮细胞，每日更换新鲜尿液细胞扩增培养基；尿液细胞扩增培养基为Urineasy尿液扩增培养基，采购于北京赛贝生物公司。
C2)当天细胞密度达到50-80％进行病毒感染，首先给细胞更换尿液扩增培养基，然后从-80度冰箱中取出1支分装好的仙台病毒，冰上溶化，完全溶化后小心加入到细胞中，轻轻水平晃动24孔板使培养基和病毒均匀分布；
C3)感染24小时后撤掉病毒液，更换新鲜的89％DMEM+10％FBS+1％双抗的培养基；感染第2天不做任何处理，之后隔日以89％DMEM+10％FBS+1％双抗的培养基换液；
C4)感染第7天，吸弃尿液陈旧培养基后使用DPBS漂洗一遍，单孔加入 0.25mlTrypLE消化酶，置于5％CO2的37℃恒温细胞培养箱中3-5分钟，终止消化并300g离心收集细胞，以89％DMEM+10％FBS+1％双抗的培养基重悬细胞，接种于Matrigel包被的培养皿中，静置于细胞培养箱中继续培养；
C5)24小时后细胞贴壁，使用mTeSR培养基继续每日换液培养，直至在显微镜下观察有克隆出现；
C6)感染3-4周左右克隆长至适合挑取的大小，此时用20μl枪头在显微镜下挑取12个左右单个克隆转移到Matrigel包被12孔板中，此时的iPSCs为P1 代细胞，继续使用mTeSR培养基培养；
C7)克隆在12孔板中扩增7至10天后可进行传代，以0.5ml/孔的Accutase 消化细胞，每孔细胞种植至Matrigel包被的6孔板的1个孔中，此时的iPSCs为 P2代细胞，并继续用mTeSR培养基培养。待细胞长至80％左右，进行传代冻存，以1:6-1:12的稀释比例传代培养，剩余细胞分5管进行冻存；
C8)当iPSCs传代至P20代左右可进行心肌分化操作。
如图1所示，为本发明实施例的病人特异性的iPSC的生成和表型特征代表图；实验具体包括如下步骤：
A)使用倒置显微镜明场拍摄正常人对照(CON)和2型糖尿病(T2DM) 病人特异性iPSCs的典型形态学代表图；
B)对CON和T2DM iPSCs使用碱性磷酸酶底物试剂盒进行碱性磷酸酶染色，使用倒置显微镜明场拍摄的代表图；
C)对CON和T2DM iPSCs使用G-band对至少30个增殖细胞的染色体进行计数和分析产生的细胞核型代表图。
图1中的实验结果表明：我们成功建立了正常人和2型糖尿病病人特异性的 iPS细胞株，这些细胞具有很好的多能性特征。
实施例3病人特异性iPSCs定向分化为病人特异性心肌细胞(iPSC-CMs)
1)首先将iPSCs按1:8-1:12稀释比例接种至6孔板中，每日更换新鲜mTeSR 培养基；
2)当细胞密度达到80％左右开始分化操作，在分化开始的第0天，小心吸走陈旧培养基，使用心肌分化培养基RPMI+B27-Insulin清洗一遍，加入含8μM 的CHIR99021的心肌分化培养基，每孔2ml。
3)持续作用2天后即第2天更换为新的心肌分化培养基，每孔2ml。第3 天小心吸走陈旧培养基，加入含5μM的IWR-1的心肌分化培养基，每孔2ml。
4)持续作用2天后即第5天更换为新的心肌分化培养基，每孔2ml。
5)持续作用2天后即第7天更换新的心肌细胞完全培养基 RPMI+B27+Insulin，以心肌细胞完全培养基持续培养，每日换液，第10天可看到成片跳动的心肌细胞，第30天，得到建立完成的“人源性”糖尿病心肌病疾病模型。
实施例4对获得的心肌细胞和“人源性”糖尿病心肌病疾病模型各项指标进行检测，包括细胞形态学、脂质沉积、电生理、钙成像、线粒体结构和功能、细胞凋亡等分析。
如图2所示，为本发明实施例的病人特异性iPSC衍生的心肌细胞(iPSC-CMs) 的心肌肥大表型的代表图；实验具体包括如下步骤：
A)使用心肌特异性标志物TNNT2和α-actinin抗体对CON和T2DM iPSC-CMs进行免疫荧光染色，使用激光共聚焦显微镜拍摄大于100张的心肌细胞图片，比较两组之间心肌细胞大小的代表图；
B)使用心肌特异性标志物TNNT2和α-actinin抗体对CON和T2DM iPSC-CMs进行免疫荧光染色，使用激光共聚焦显微镜拍摄大于100张的心肌细胞图片，比较两组之间心肌细胞多核细胞比例的代表图；
C)使用心肌特异性标志物TNNT2和心肌肥大特异性标志物ANP抗体对 CON和T2DMiPSC-CMs进行免疫荧光染色，使用激光共聚焦显微镜拍摄大于 100张的心肌细胞图片，比较两组之间心肌细胞ANP强度的代表图；
D)从CON和T2DM iPSC-CMs中提取RNA，逆转录为cDNA，通过qPCR 比较两组之间ANP基因表达的代表图；
E)使用D)中获得的cDNA，通过qPCR比较两组之间心肌肥大相关基因BNP 表达的代表图；
F)使用ELISA技术比较CON和T2DM iPSC-CMs之间的心肌肥大相关蛋白BNP分泌水平的代表图。
图2中的实验结果表明：2型糖尿病病人特异性的iPSC衍生的心肌细胞 (iPSC-CMs)具有显著的心肌细胞肥大表型。
如图3所示，为本发明实施例的病人特异性iPSC-CMs的脂质沉积；实验具体包括如下步骤：
A)使用心肌特异性标志物α-actinin和脂质探针尼罗红对CON和T2DM iPSC-CMs进行免疫荧光染色，使用激光共聚焦显微镜拍摄大于20张的心肌细胞图片，比较两组之间的尼罗红阳性细胞百分比的代表图；
B)使用透射电子显微镜对CON和T2DM iPSC-CMs拍摄的代表图，箭头指示T2DMiPSC-CMs中显著增多的脂滴沉积。
图3中的实验结果表明：2型糖尿病病人特异性的iPSC衍生的心肌细胞 (iPSC-CMs)具有显著的脂质沉积表型。
如图4所示，为本发明实施例对病人特异性iPSC-CMs进行电生理和钙成像功能分析出现心律失常表型的代表图；实验具体包括如下步骤：
A)使用膜片钳技术记录CON和T2DM iPSC-CMs的动作电位的代表图；
B)使用A)中膜片钳记录，比较两组之间心律失常发生率的代表图；
C)使用钙成像技术记录CON和T2DM iPSC-CMs的钙瞬变的代表图；
D)使用C)中钙成像记录，比较两组之间钙信号异常百分比的代表图；
图4中的实验结果表明：2型糖尿病病人特异性的iPSC衍生的心肌细胞 (iPSC-CMs)具有显著的心律失常表型。
如图5所示，为本发明实施例的病人特异性iPSC-CMs的线粒体结构和功能异常；实验具体包括如下步骤：
A)使用透射电子显微镜对CON和T2DM iPSC-CMs拍摄的代表图，箭头指示T2DMiPSC-CMs中的线粒体结构显著异常。
B)使用A)中透射电子显微镜对CON和T2DM iPSC-CMs拍摄大于10张图片，比较两组之间的线粒体数量的代表图；
C)将CON和T2DM iPSC-CMs接种到96孔板上，使用JC-1线粒体膜电位染料染色。使用多模式酶标仪在488nm和562nm处定量JC-1荧光，比较两组之间JC-1多聚体/单体比例的代表图；
D)CON和T2DM iPSC-CMs使用氧自由基分析试剂盒比较两组之间氧自由基含量的代表图；
E)CON和T2DM iPSC-CMs使用ATP含量试剂盒比较两组之间ATP含量的代表图；
F)CON和T2DM iPSC-CMs使用Seahorse XFe96分析仪和XF Cell Mito StressTest试剂盒比较两组之间线粒体呼吸的代表图。
图5中的实验结果表明：2型糖尿病病人特异性的iPSC衍生的心肌细胞 (iPSC-CMs)具有显著的线粒体结构和功能异常表型。
如图6所示，为本发明实施例的使用高糖髙脂诱导病人特异性iPSC-CMs出现凋亡信号增加表型的代表图；实验具体包括如下步骤：
A)使用心肌特异性标志物TNNT2抗体和细胞凋亡特异性标志物TUNEL对 CON和T2DM iPSC-CMs进行免疫荧光染色，使用荧光倒置显微镜拍摄大于20 张图片，比较两组之间TNNT2阳性细胞中TUNEL/DAPI比率的代表图。
图6中的实验结果表明：2型糖尿病病人特异性的iPSC衍生的心肌细胞 (iPSC-CMs)对于高糖高脂诱导的高敏感性表型。
本发明使用人源性诱导多能干细胞来源的心肌细胞，与人的遗传背景相同，拥有人类心脏的电生理学特性，拥有人类心肌细胞生化和分子生物学特性，拥有动物模型无法比拟的优势，纯化方便并且可以长时间体外培养，可批量生产满足高通量实验需求缩短实验周期，以利于广泛用于疾病表型分析和功能学研究，疾病分子机制研究，治疗药物筛选和安全性评估。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (9)

1.一种“人源性”糖尿病心肌病疾病模型的建立方法，其特征在于包括如下步骤：
2型糖尿病病人尿液肾上皮细胞的获得和培养；
采用非整合型仙台病毒将病人的尿液肾上皮细胞重编程为病人特异性iPSCs；
将病人特异性iPSCs定向分化为病人特异性心肌细胞；得到“人源性”糖尿病心肌病疾病模型。
2.根据权利要求1所述的“人源性”糖尿病心肌病疾病模型的建立方法，其特征在于，所述步骤A)具体包括如下步骤：
A1)病人尿液的收集；
A2)尿液肾上皮细胞的分离；
A3)尿液肾上皮细胞的贴壁扩增；
A4)尿液肾上皮细胞的传代培养。
3.根据权利要求1所述的“人源性”糖尿病心肌病疾病模型的建立方法，其特征在于所述的步骤B)具体为：
B1)在24孔板中种植尿液肾上皮细胞，每日更换新鲜尿液扩增培养基；
B2)当细胞密度达到50-80％进行病毒感染，首先给细胞更换新鲜尿液扩增培养基，然后取分装好的仙台病毒，冰上溶化，完全溶化后加入细胞中，水平晃动24孔板使培养基和病毒均匀分布；
B3)感染24小时后撤掉病毒液，更换新鲜的89％DMEM+10％FBS+1％双抗的培养基；感染第2天不做任何处理，之后隔日以89％DMEM+10％FBS+1％双抗的培养基换液；
B4)感染第7天，吸弃陈旧培养基后使用DPBS漂洗一遍，单孔加入0.25ml TrypLE消化酶，置于5％CO2的37℃恒温细胞培养箱中3-5分钟，终止消化并300g离心收集细胞，以89％DMEM+10％FBS+1％双抗的培养基重悬细胞，接种于Matrigel包被的培养皿中，静置于细胞培养箱中继续培养；
B5)24小时后细胞贴壁，使用mTeSR培养基继续每日换液培养，直至在显微镜下观察有克隆出现；
B6)待克隆长至适合挑取的大小，用枪头在显微镜下挑取单个克隆转移到Matrigel包被12孔板中，此时的iPSCs为P1代细胞，继续使用mTeSR培养基培养；
B7)克隆在12孔板中扩增7至10天后可进行传代，以0.5ml/孔的Accutase消化细胞，每孔细胞种植至Matrigel包被的6孔板的1个孔中，此时的iPSCs为P2代细胞，并继续用mTeSR培养基培养；待细胞长至80％，进行传代冻存，以1:6-1:12的稀释比例传代培养；
B8)待iPSCs传代至P19-21代。
4.根据权利要求1所述的“人源性”糖尿病心肌病疾病模型的建立方法，其特征在于所述的步骤C)具体包括如下步骤：
C1)第-5-0天iPSCs的培养；
C2)第0-1天完成iPSCs向中胚层的诱导分化；
C3)第2-3天完成中胚层向心脏中胚层的诱导转分化；
C4)第3-5天完成中胚层向心肌细胞的诱导分化；
C5)第7天以后以心肌细胞完全培养基持续培养，每日换液，30天以后得到“人源性”糖尿病心肌病疾病模型。
5.根据权利要求4所述的“人源性”糖尿病心肌病疾病模型的建立方法，其特征在于所述的步骤C1)具体包括如下步骤：
C11)首先将iPSCs按1:8-1:12稀释比例接种至6孔板中；
C12)每日更换mTeSR培养基,至细胞密度达到80％。
6.根据权利要求5所述的“人源性”糖尿病心肌病疾病模型的建立方法，其特征在于所述的步骤C2)中：
在分化开始的第0天，吸走陈旧培养基，使用心肌分化培养基RPMI+B27-Insulin清洗一遍，每孔加入含8μM的CHIR的心肌分化培养基2ml。
7.根据权利要求6所述的“人源性”糖尿病心肌病疾病模型的建立方法，其特征在于所述的步骤C3)中：
持续作用2天后即第2天更换为新的心肌分化培养基，每孔2ml；第3天吸走陈旧培养基，加入含5μM的IWR-1的心肌分化培养基，每孔2ml。
8.根据权利要求7所述的“人源性”糖尿病心肌病疾病模型的建立方法，其特征在于所述的步骤C4)中：
加入含5μM的IWR的心肌分化培养基持续作用2天后即第5天，更换新的心肌分化培养基，每孔2ml。
9.根据权利要求8所述的“人源性”糖尿病心肌病疾病模型的建立方法，其特征在于所述的步骤C5)中：
持续作用2天后即第7天更换新的心肌细胞完全培养基RPMI+B27+Insulin，以心肌细胞完全培养基持续培养，每日换液，第30天后，得到建立完成的“人源性”糖尿病心肌病疾病模型。
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