KR101582483B1

KR101582483B1 - 심근 세포의 세포괴의 제조 방법 및 상기 심근 세포괴의 용도

Info

Publication number: KR101582483B1
Application number: KR1020137019696A
Authority: KR
Inventors: 후미유키 핫토리; 게이이치 후쿠다
Original assignee: 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤; 각고호우징 게이오기주크
Priority date: 2007-07-31
Filing date: 2008-07-31
Publication date: 2016-01-06
Also published as: IL203404A; BRPI0813729B8; RU2467066C2; KR20130090423A; US20100189699A1; KR20100040276A; JP5523830B2; JPWO2009017254A1; CA2690610C; CN101711277B; US20150366918A1; BRPI0813729B1; EP2172542A1; RU2010101091A; AU2008283255A1; WO2009017254A1; US10918671B2; EP2172542A4; BRPI0813729A2; US9109205B2

Abstract

본 발명은, 심근 세포 이외의 세포는 포함하지 않고, 다른 종으로부터 유래된 성분을 포함하지 않도록, 정제된 심근 세포의 이식 후 생착율을 개선시키는 것을 과제로 한다. 본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해, 정제된 심근 세포가 세포괴를 구축할 수 있는지를 검토하였다. 그 결과, 만능 줄기 세포로부터 분화, 유도된 심근 세포를 포함하는 응집된 세포괴를 분산시켜 단일 세포화함으로써 얻어지는 정제된 만능 줄기 세포 유래의 심근 세포를, 무혈청 조건의 배지에서 배양하고, 상기 세포를 응집시키는 것을 특징으로 하는, 만능 줄기 세포 유래 심근 세포의 세포괴를 제조하는 방법을 제공함으로써, 상기 과제를 해결할 수 있음을 명백하게 하였다.

Description

심근 세포의 세포괴의 제조 방법 및 상기 심근 세포괴의 용도{METHOD FOR CONSTRUCTING MASS OF MYOCARDIAL CELLS AND USE OF THE MYOCARDIAL CELL MASS}

본 발명은 단일 세포화되어 정제된 만능 줄기 세포 유래의 심근 세포를 응집시켜 세포괴(cell mass)를 만드는 방법, 상기 심근 세포괴를 심장 조직에 생착시킴으로써 이루어지는 심장 질환의 치료 방법, 및 상기 심근 세포괴를 이용한 시트형의 세포괴의 제조 방법 등에 관한 것이다.

성체의 심근세포는 증식 활성이 없어 중증의 심근 경색, 심근증 등의 심장 질환시에는 심장을 이식할 수 밖에 없다. 그러나, 현재로서는 심장의 도너(donor)가 부족한 문제를 해결하기 어려워 심장 이식 이외의 치료 방법을 발견하는 것이 급선무이다.

이에 대하여, 심근 세포를 체외에서 제조하여, 심근 세포의 보충을 충당하는 것이, 심장 이식에 의지할 수 밖에 없는 환자를 구제하는 가장 유망한 방법인 것으로 예상되고 있다. 이러한 치료 방침을 심장의 세포 치료라고 한다. 이러한 치료를 실현시키기 위해, 다양한 시행 착오가 이루어지고 있다. 예를 들면, 실험적으로 태아, 신생아 또는 성체로부터 심근 세포 또는 골격근모세포, 및 골수 세포 등을 추출하는 방법, 배아 줄기 세포를 분화시켜 사용하는 방법, 및 생체내에 존재하고 있을 것으로 추정되는 줄기 세포(체세포성 줄기 세포)를 수득하여 분화를 유도하는 방법 등이 검토되고 있다(비특허 문헌 1: Zhonghua Yi Xue Za Zhi 2003, 83, 1818-22).

이러한 방법들을 분류하여 보면 주로 2가지 방향성으로 나눌 수 있다. 한가지는, 심근 세포를 세포 이식에 사용하는 것으로, 단일 세포로 분산시킨 심근 세포를 주사 바늘을 사용하여 직접 조직 내에 주입하는 방법(이후, "주입법(injection method)"이라 함)이다. 다른 방법은, 체외에서 조직이나 장기를 구축한(이후, "조직 조작(tissue engineering)법"이라 함) 다음, 이 인공 조직이나 인공 장기를 체내에 이식하여 치료하는 방법이다.

이러한 조직 조작법으로는, 1) 심근 세포를 시트형으로 형성시켜 조직 상에 붙이는 방법(비특허 문헌 2: Circulation Research 2002, 90(3): e-40), 2) 심근 세포와 비심근 세포를 심장 조직과 동일한 비율로 혼합하고, 입체 구조로 형성시켜 조직과 치환하는 방법, 3) 단일 세포로 분산시킨 심근 세포로 입체 구조를 형성시키고, 또한 혈관 구조도 구축하여, 조직과 치환하는 방법, 또는 4) 심장 조직을 치환하는 것이 아니라 본래의 장기 기능을 보조하기 위해, 새로운 보조 장기로서 이소적으로 이식하여 사용하는 방법(비특허 문헌 3: Circulation Research 20072, 100: 263-272) 등이 시도되고 있다.

그러나, 현 단계는 임상 치료 응용을 위한 다양한 시행 착오가 이루어지고 있는 단계이므로, 어떠한 방법에서도 충분히 실용적인 데이터가 도출되지 않고 있다. 심근 세포를 심장에 이식하기 위해서는, 몇가지 문제점, 예를 들면, 심근 세포 이외의 다른 세포가 포함되거나, 심근 세포의 생착성이 낮은 문제, 다른 종으로부터 유래된 성분을 배제시킬 수 없는 문제 등의 문제점이 있기 때문이다.

심근 세포를 세포괴로서 이식에 사용하기 위한, 설치류의 태아 또는 신생아의 심근 세포를 포함하는 세포괴를 구축하는 방법이 알려져 있으며, 최근 보고에 따르면, 태아 심장으로부터 유래된 전체 세포(비심근 세포를 포함함)를 이용하여 세포괴를 구축하였다(비특허 문헌 4: Developmental dynamics 235; 2200-2209, 2006). 또한, 심근 세포의 이식과 관련하여, 마우스 태아 심근 세포를 마우스 성체의 심장에 이식하여 생착을 확인한 예도 보고되고 있다(비특허 문헌 5: Science 1994, 264(5155): 98-101). 그러나, 상기한 심근 세포의 제조 방법은 태아 심장을 콜라게나제로 분산시킨 전체 세포를 사용하고 있어, 이식되는 세포는 심근 세포와 비심근 세포가 혼합된 세포 집단이다. 또한, 미정제의 생체 유래 심근 세포를 심장에 이식하는 것도 가능한 것으로 알려져 있다(비특허 문헌 5: Science 1994, 264(5155): 98-101, 비특허 문헌 1: Zhonghua Yi Xue Za Zhi 2003, 83, 1818-22).

또한, ES 세포의 배상체(embryoid body) 분화 과정에서, 배상체를 불완전하게 단백질 분해 효소로 처리하여, 심근 세포를 많이 포함하는 세포괴와 그렇지 않은 세포괴를 포함하는 세포괴 집단을 수득한 다음, 이를 밀도 구배 원심법으로 분리함으로써, 심근 세포가 최대 약 70% 포함된 세포괴를 수득하는 방법도 알려져 있다(특허 문헌 1: US2005-0214938A).

그러나, 이러한 방법들은 모두 심근 세포 이외의 세포도 포함된 세포 집단을 이용하는 방법으로, 심근 세포 이외의 세포의 혼입은 이식 후 환자의 생명과 관련있는 중대한 예측 불가능한 부작용을 일으킬 가능성이 있다. 그래서, 이식 치료에 사용하는 경우에는 심근 세포를 정제한 후 사용할 필요가 있다고 인식되고 있다.

지금까지, ES 세포 유래의 미정제의 심근 세포를 심장에 이식한 후 이의 생착을 달성한 보고도 있다(비특허 문헌 6: Cardiovasc Res. 2007 May 17; 비특허 문헌 7: Stem Cells. 2007 May 31; 비특허 문헌 8: FASEB J. 2007 Apr 13). 한편, 최근들어, ES 세포 유래의 심근 세포를 정제하여 심장에 주입하였으나, 생착율이 매우 낮고, 생착된(즉, 이식된 장기에서 장기간 생존하고, 장기에 접착되어 고정됨) 심근 세포를 발견할 수 없었다고 보고되고 있어, 정제된 ES 세포 유래의 심근 세포를 개체(생체)에 이식해도 생착시킬 수 없는 것으로 판명되었다(비특허 문헌 9: J Exp Med. 2006; 203: 2315-27).

이러한 보고들에 따라, 정제된 심근 세포의 이식 이후의 생착 곤란성이 표면화되었다. 이와 같은 보고에 따른, 상기한 문제점을 해결하기 위하여, 정제된 ES 세포 유래의 심근 세포의 이식 이후의 생착율을 높일 목적으로, 마우스 배아성 섬유모 세포를 혼합하여 이식하는 방법이 발견되었다(비특허 문헌 9: J Exp Med. 2006 Oct 2; 203(10): 2315-27). 이는, 정제된 ES 세포 유래의 심근 세포를 순도를 유지하면서 이식하여 생착시키는 방법은 기존의 방법에서는 실시할 수 없었음을 의미한다.

또한, 인체 치료를 목적으로 한 이식 세포의 제조는, 혈청 등의 타동물 유래의 인자를 배제시켜야 한다. 이식에 사용되는 심근 세포의 제조 방법에서는, 배양은 통상적으로 혈청이 존재하는 조건에서(유혈청) 이루어지지만, 무혈청 조건 하에서도 인간 ES 세포로부터 배상체를 형성시킬 수 있으며, 이에 포함된 심근 세포의 양도 통상의 유혈청 배양에서와 거의 동일한 수준인 것으로 확인되었다(비특허 문헌 10: Stem cell and development 15: 931-941, 2006). 그러나, 상기한 보고 등의 기존의 보고에서는, 심근 세포를 혈청 등의 다른 동물 유래의 인자를 이용하지 않고 제조하여 이식한 예는 전혀 보고된 바 없다.

따라서, 전술한 바와 같이, 심근 세포의 심장 이식에 있어서의 몇가지 문제점, 즉 심근 세포 이외의 세포가 포함되거나, 심근 세포의 생착성이 낮은 문제, 다른 종으로부터 유래된 성분을 배제할 수 없는 문제, 등의 문제점이 모두 해결되어야 한다.

또한, 심장 조직에 이식할 때, 이른바 "세포 시트"의 형태로 이식하는 것이 고려되고 있는데, 세포 시트의 제조는, 신생아의 심근 세포를 단층의 시트로 만든 다음 이 시트를 시험관내에서 최대 3층으로 중첩시킬 수 있는 것으로 알려져 있다(비특허 문헌 11: FASEB J. 2006 Apr; 20(6): 708-10). 그러나, 산소 투과성의 한계로 인해, 혈관의 신생 없이는 세포 시트를 그 이상의 두께로 만들 수 없는 것으로 기재되어 있으며, 심장의 환부 조직의 크기에 맞게 임의의 세포 시트를 제조하는 것은 아직 불가능한 실정이다.

전술한 바와 같이, 이식에 사용되는 심근 세포의 제조이나 심근 세포의 이식에 있어, 실용성의 관점에서 추가적인 개선이 요구되고 있는 실정이다.

특허 문헌 1: US2005-0214938A

비특허 문헌 1: Zhong hua Yi Xue Za Zhi 2003, 83, 1818-22

비특허 문헌 2: Circulation Research 2002, 90(3): e-40

비특허 문헌 3: Circulation Research 2007 2, 100: 263-272

비특허 문헌 4: Developmental dynamics 235; 2200-2209, 2006

비특허 문헌 5: Science 1994, 264(5155): 98-101

비특허 문헌 6: Cardiovasc Res. 2007 May 17(Flk1(+) cardiac stem/progenitor cells derived from embryonic stem cells improve cardiac function in a dilated cardiomyopathy mouse model)

비특허 문헌 7: Stem Cells. 2007 May 31(Differentiation in vivo of Cardiac Committed Human Embryonic Stem Cells in Post-myocardial Infarcted Rats)

비특허 문헌 8: FASEB J. 2007 Apr 13(Identification and selection of cardiomyocytes during human embryonic stem cell differentiation)

비특허 문헌 9: J Exp Med. 2006 Oct 2; 203(10): 2315-27

비특허 문헌 10: Stem cell and development 15: 931-941, 2006

비특허 문헌 11: FASEB J. 2006 Apr: 20(6): 708-10

이에, 본 발명자들은 배양 심근 세포를 임상에 사용하기 위해 적어도 현재 상정되어 있는 최소한의 조건을 검토하였고, 그에 따라 과제가 명확하게 되었다.

(1) 심근 세포의 정제: 심근 세포를 생체 또는 만능 줄기 세포로부터 얻는 경우, 미지의 세포가 혼입되어 존재하는 상태에서는 안전성을 보장하기 불가능하기 때문에, 어떤 경우에도 심근 세포의 고도의 정제가 필수적이다. 이 심근 세포를 고도로 정제된 순도로 안정적으로 유지하기 위해서는, 생체 또는 만능 줄기 세포로부터 얻어진 심근 세포를 흩어지게 분산(단일 세포화)시켜, 개개의 세포의 종류를 판별한 다음, 심근 세포만을 선별하는 것이 필요할 것으로 생각된다.

(2) 심근 세포의 유래: 면역 거부 문제나, 윤리적 문제 뿐만 아니라, 심근 세포의 성질의 종간 차이가 임상상의 안전성 및 유효성에 중대한 영향을 미치므로, 수용자 개체와 동일한 종으로부터 유래된 공여 세포를 사용하는 것이 중요하다.

(3) 다른 종의 동물 유래 인자의 배제: 면역원성 및 미지 병원체의 혼입을 방지하기 위해, 혈청으로 대표되는 다른 동물로부터 유래된 인자의 혼입을 배제하여야 한다.

(4) 이식한 심근 세포의 생착: 이식한 심근 세포는 숙주의 심근 세포와 동일하게 기능하여야 하지만, 우선 숙주의 심근 세포에 생착(생존 상태를 장기간 유지함)되어야 한다.

(5) 다음 단계로는 세포가 성숙(성장하여 커짐)되어야 한다.

즉, 본 발명은, 심근 세포 이외의 세포와 다른 종으로부터 유래되는 성분이 포함되지 않도록 정제된 심근 세포의, 이식 이후의 생착율을 개선시키고, 이식 후의 성숙을 촉진시키는 것을 과제로 한다.

과제를 해결하기 위한 수단

본 발명자들은, 심근 세포 이외의 세포와 다른 종으로부터 유래된 성분이 포함되지 않도록 정제된 생체 유래 또는 만능 줄기 세포 유래의 심근 세포의 생착율을 개선시키기 위해, 정제된 심근 세포의 세포괴 구축 가능성을 검토하였다. 그 결과, 만능 줄기 세포인 배아 줄기 세포(Embryonic Stem cell: ES 세포)나 유도된 만능 줄기 세포(induced pluripotent stem cells: PS 세포)로부터 분화, 유도된 심근 세포를 포함하는 세포괴를 일단 분산시켜 단일 세포화하고, 이로써 수득되는 정제된 심근 세포를 무혈청 조건 하의 배양 배지를 사용하여 배양하여, 상기 세포를 응집시키는 것을 특징으로 하는, 배아 줄기 세포 유래 또는 유도된 만능 줄기 세포 유래의 심근 세포의 세포괴를 제조하는 방법을 제공함으로써, 상기한 과제를 해결할 수 있다는 것이 명백하게 되었다.

본 발명의 발명자들은 먼저 생체 유래의 심근 세포를 사용하여, 상기 과제를 해결할 수 있는지를 검토하였다. 즉, 심근 세포 이외의 세포가 포함되지 않고, 또 다른 종으로부터 유래된 성분이 포함되지 않도록 정제된 생체 유래의 심근 세포를 사용하여, 이식 후 생착율 증가 여부를 검토하였다.

구체적으로는, 정제된 생체 유래의 심근 세포는 10% 혈청을 포함하는 배양액내에서 24시간 경과시에도 세포괴를 형성하지 않았다. 이러한 결과는, 미정제로 수행된 기존의 생체 심근 세포의 세포괴 형성이, 비심근 세포의 보조적인 작용에 매우 의존적임을 강하게 시사한다. 또한, 정제된 생체 유래의 심근 세포가 무혈청 조건 하에서는 어떻게 거동하는 지를 실험적으로 검토한 결과에 따르면, 세포괴의 구축 뿐만 아니라 세포 그 자체도 사멸되었다. 이러한 사실로부터, "생체 심장 유래의 미정제 심근 세포괴의 구축"은 실현불가능한 기술이며, 더구나 무혈청 조건 하에서는 정제된 생체 심장 유래 심근 세포의 거동을 예상조차 할 수 없는 것으로 판단되었다.

다음으로, 기존의 심근 세포 응집괴의 제조 방법에서는, 사용 세포가 신생아 또는 태아의 심장 유래 세포이며, 혈청을 포함하는 배양 배지를 사용하여 배양하였다. 이는, 일반적으로 혈청이 세포 종에 상관없이 보호 효과가 강력하다는 공통된 인식에 기인한 것이다. 그러나, 전술한 바와 같이, 예를 들어, 인체에 치료를 행하는 경우, 다른 종의 동물 유래물(예, 혈청)의 사용은 피하여야 한다. 그래서, 무혈청 배양 배지에, 혈청 대신 혈청 대체물을 포함하는 다양한 첨가물을 사용하여, 생체 유래의 심근 세포의 응집 능력을 검토하였다. 그러나, 생체 유래 심근 세포는, 어떠한 무혈청 조건에서도, 세포괴를 충분히 구축하지 못하였고, 세포의 생존율도 낮았다.

또한, 기존의 방법에서는 생체 유래의 심근 세포를 세포괴로서 배양하였을 때 심근 세포의 생존이 장기간 유지된다는 보고가 있었으므로, 정제된 생체 유래의 심근 세포를 무혈청 조건하에서 세포괴로 형성시키고자 시도하였다. 그런나, 배양 5일 후에도, 세포괴를 형성시킬 수 없었다. 이러한 실험 결과에 따라, 무혈청 조건에서는 정제된 생체 유래의 심근 세포로부터 세포괴를 구축시킬 수 없다는 새로운 사실을 알게 되었다.

그래서, 본 발명자들은 심근 세포를 얻기 위한 공급원을 변경함으로써 이러한 기술적 곤란을 타개할 수 있지 않을까 생각하게 되었다. 그리고, 다양한 공급원에 대해 동일하게 검토한 결과, 정제된 배아 줄기 세포 유래의 심근 세포는 무혈청 조건 하에서는 불과 12시간만에 신속하게 서로 결합하여, 효과적으로 입체적인 심근 세포괴를 구축할 수 있으며, 그 시점에서는 이미 동기적으로(synchronous) 수축이 개시되어 있음이 확인되었다.

이는, 배아 줄기 세포 유래의 심근 세포가 정제된 동일 세포들 간의 세포 접착을 효율적으로 구축할 수 있음을 의미하며, 정제된 배아 줄기 세포 유래의 심근 세포가 무혈청 조건하에서 높은 응집력을 가짐을 시사한다. 이러한 사실은, 복수개의 종에 대하여 각각의 종 유래의 배아 줄기 세포를 사용한 각각의 경우에서도 재현되므로, 이와 같은 특징은 인간 유래를 포함한 배아 줄기 세포로부터 얻어지는 심근 세포에 공통되는 성질인 것으로 여겨진다. 이러한 무혈청 조건 하에서의 배아 줄기 세포의 특이적인 성질에 기초하여, 본 발명자들은 최초로 무혈청 조건하에서 정제된 심근 세포로 세포괴를 만들 수 있었다.

또한, 기존의 보고에 따르면, 이식 후 생착 능력이 낮은 배아 줄기 세포 유래의 심근 세포는 재응집 능력도 낮을 것으로 예측되며(Transplantation 70: 1310-1317, 2000), 한편, 정제된 배아 줄기 세포 유래의 심근 세포를 응집시키는 것 자체가 곤란할 것으로 예측되어, 상기 세포는 응집시킬 수 없는 것으로 여겨졌다. 그럼에도 불구하고, 본 발명자들은 이와 같은 예측에 반하여, 정제된 배아 줄기 세포 유래의 심근 세포가 다른 세포의 도움없이도 세포괴를 구축할 수 있으며, 또한 이를 이식에 사용함으로써 생착율의 비약적인 향상을 초래한다는 것을 최초로 확인하였다. 즉, 배아 줄기 세포 유래의 심근 세포가 단일 세포로 정제된 후, 또한 무혈청 조건하에서도 세포괴를 구축 가능하다는 점에서, 생체 심장 유래의 심근 세포와는 전혀 상이한 특성을 가지고 있음이 성공적으로 확인되었다.

또한, 본 발명자들은, 보다 이식에 적절한 배아 줄기 세포 유래 심근 세포괴의 제조 방법을 확립하고자, 배아 줄기 세포 유래의 심근 세포가 무혈청 조건하에서 보다 효율적으로 세포괴를 구축할 수 있는 조건으로서, 배양 배지의 첨가물을 검토하였다. 그 결과, 첨가물로서 인슐린, 트랜스페린, 셀레늄(ITS)을 첨가한 결과에 따르면, 세포괴 자율 박동이 ITS 미첨가시의 세포괴에 비해 보다 강하게 재현 및 관찰되었다. 즉, ITS(특히 인슐린)의 첨가가 배아 줄기 세포 유래의 정제된 심근 세포에 바람직한 것으로 나타났다. 그리고, ITS 중 가장 중요한 인자는 인슐린이며, 트랜스페린과 셀레늄은 보조적인 역할을 담당한다.

다음으로, 무혈청의 기초 배지(이하, 기초 배지)에 ITS를 첨가하고, 추가로 염기성 섬유모세포 증식 인자(bFGF) 및/또는 인슐린 유사 성장 인자 1(IGF1)의 첨가하였는데, bFGF 단독 첨가한 경우에는 세포괴 형성 후 5일째의 세포괴의 직경이 유의하게 증대되어, 상기 세포가 보호됨을 알 수 있었다. 이는, 혈청이 포함된 배양 조건에서는 관찰되지 않았으며, bFGF를 단독으로 첨가한 무혈청 조건에서만 특징적인 세포 보호·증식 효과였다. 혈청 첨가 조건하에서 평면 배양하는 실험 조건에서 배양하는 심근 세포에 대한 bFGF의 작용은 세포 보호, 세포 증식 촉진 등이 있는 것으로 알려져 있었지만(J Mol Cell Cardiol. 2007 Jan; 42(1): 222-33, Cardiovasc Res. 2004; 64: 516-25.), 무혈청 조건하에서의 심근 세포의 장기간 증식이나 보호에 대해서는 전혀 알려져 있지 않다.

또한, 이러한 효과는 10% 혈청 첨가 배지를 사용하여 세포괴를 형성하였을 때 보다 효과가 높았지만, bFGF를 첨가하여도 평면 배양에 의해 세포괴를 형성시키지 않은 경우에는, 10% 혈청 첨가 배지를 사용하여 세포괴를 형성시킨 경우에 비해 그 효과가 낮았다. 이러한 두가지 실험 결과로부터, bFGF가 10% 혈청 첨가 배지를 사용하여 세포괴를 형성한 경우의 효과를 웃도는 세포 보호·증식 촉진 효과를 형성시키도록 하기 위해서는, 세포괴의 구축이 필수적인 것으로 생각되었다.

그래서, 본 발명자들은 상기한 효과의 발휘에 있어 세포괴의 구축이 필수 요건인 것을 확인하기 위하여, 정제된 마우스 배아 줄기 세포 유래의 심근 세포를 평면 접착 배양하고, 상기 배지에 bFGF를 첨가하여, 그 영향을 분석하였다.

세포괴가 형성되지 않는 평면 배양에서, 기초 배지에 ITS를 첨가한 환경에서는 정제된 심근 세포는 거의 생존할 수 없었다. 그러나, bFGF 첨가에 의해, 보다 많은 수의 세포가 생존 접착된 상태임을 관찰할 수 있었다. 이러한 작용은 10% 혈청 첨가 배지를 사용하여 세포괴를 형성한 경우의 효과보다 낮았다.

정제된 배아 줄기 세포 유래의 심근 세포괴를 구축한 경우, 무혈청 + ITS + bFGF의 작용과 10% 혈청의 작용을 장기 배양한 다음 후 비교한 결과, 10% 혈청 함유 배지에서는 세포괴의 크기가 유의하게 축소된 것에 반해, 무혈청 + ITS + bFGF 군에서는 유의하게 증대되었다. 이는, 본 발명자들이 발견한 bFGF의 작용이, 정제·무혈청·세포괴의 모든 요소들과 상승 작용함을 의미한다.

이러한 결과로부터, 즉, 본 발명자들은 무혈청 배지에 ITS 및/또는 bFGF 첨가가 심근 세포괴 상태를 장기간 유지시킴을 확인하였다. 이러한 지견에 의해, 심근 세포의 생존율을 종래 방법인 평면 배양법의 60∼70%에 비하여, 90% 이상으로 비약적으로 향상시킬 수 있게 되었다.

이상으로부터, 본 발명자들은, 종래 기술에서는 달성할 수 없었던 무혈청 조건이면서 고도로 정제된 조건에서의 심근 세포괴의 구축을, 배아 줄기 세포 유래의 심근 세포를 사용함으로써 달성하였고, 또한 ITS 및 bFGF를 첨가하는 조건으로 가장 효율적으로 심근 세포괴를 구축할 수 있음을 발견하였다.

즉, 본 발명의 일 태양은, 배아 줄기 세포로부터 분화, 유도된 심근 세포를 포함하는 응집된 세포괴를 분산시켜 단일 세포화하여 수득되는 정제된 배아 줄기 세포 유래의 심근 세포를, 무혈청 조건하의 배지를 사용하여 배양하여, 상기 세포를 재응집시키는 것을 특징으로 하는, 배아 줄기 세포 유래 심근 세포의 세포괴 제조 방법을 제공한다. 상기 배양에 사용되는 배지에는, ITS 중 적어도 인슐린이 첨가된 배지가 바람직하고, 또한 bFGF가 첨가된 것이 바람직하다. 또한, 상기 방법에서는, 단일 세포화한 세포괴를 기존의 방법과 같이 단일 공간에서 배양하지 않고, 10,000개까지의 세포군으로 분할하여 독립된 공간에서 배양할 수 있다.

증식성의 비심근 세포가 혼입된 경우, 응집괴의 크기가 극단적으로 커지게 되고, 형태도 변형된다. 또한, 이러한 지표 외에도, 미토콘드리아에 축적되는 형광 색소로 염색함으로써, 증식성 세포를 색소가 쉽게 축적되지 않는 세포로서 동정할 수 있다. 이와 같이 비심근 세포가 혼입한 세포괴는 이식 치료 등의 사용에 거부되므로, 일부 혼입된 증식성 비심근 세포는 이식 세포에서 제외시킬 수 있다.

또한, 떨어져 분산(단일 세포화)된 배아 줄기 세포 유래의 정제된 심근 세포는, 그대로 개체(생체)의 심장 조직에 이식되더라 생착할 수 없는 것으로 지금까지 보고되어 있었으며, 본 발명자들도 동일한 결과를 수득하였다. 이러한 문제는, 종래 기술에서는 정제된 배아 줄기 세포 유래의 심근 세포에 보조 세포를 혼합함으로써 해결되었는데, 이는 생체 내에서의 비심근 세포의 보호 작용이 심근 세포의 생존에 있어 필수적임을 명확하게 나타낸다. 그러나, 비심근 세포의 혼입은 이식 후의 환자의 생명와 관련된 중대한 예기할 수 없는 부작용을 일으킬 가능성이 있으므로, 본 발명자들은 보조 세포를 혼합시키지 않고 정제된 심근 세포를 그대로 고순도로 개체(생체) 내에 이식할 수 있다면, 보다 안전성과 치료 효과가 높을 것으로 생각하였다.

그래서, 상기 방법에 의해 얻어지는 정제된 배아 줄기 세포 유래의 심근 세포괴의 이용에 착안하여, 상기 세포괴를 개체(생체)의 심장 조직에 이식함으로써, 이식 후의 생착성을 비약적으로 향상시킬 수 있음을 확인하였다. 즉, 세포괴를 분산시켜 단일 세포화함으로써 얻어지는 정제된 배아 줄기 세포 유래의 심근 세포를, 무혈청 조건하의 배지를 사용하여 배양하고, 상기 세포를 재응집시켜 세포괴를 형성함으로써, 정제된 배아 줄기 세포 유래 심근 세포의 이식 후 생착성을 비약적으로 향상시킬 수 있음을 확인하였다.

즉, 본 발명의 다른 태양은, 단일 세포화하여 정제한 배아 줄기 세포 유래의 심근 세포를 재응집화해 얻어진 세포괴를, 개체(생체)의 심장 조직(특히 환부)에 이식해 생착시키는 것을 특징으로 하는 심질환의 치료 방법에 관한 것이다. 본원 발명에 있어서 "생착"은 이식된 장기 내에서 장기간 생존하며, 장기 내에 접착되어 고정되는 것을 의미한다.

또한, 전술한 바와 같이, 기존의 방법에서는, 신생아 심근 세포를 단층의 시트로 3장까지 중첩시킬 수 있는 것으로 알려져 있었지만, 그 이상의 두께로는 심근 세포 시트를 제조할 수 없었다.

상기 과제를 해결하기 위해, 상기 방법에 의해 얻어지는 정제된 배아 줄기 세포 유래의 심근 세포괴를 이용하는데 착안하였다. 상기 방법에 의해 상기 세포괴를 구축하고, 얻어진 세포괴를 회수하여, 벽면에 의해 분할된 세포 비접착성 용기의 표면에 세포괴가 서로 연속 접촉될 정도로 간극없이 배열되게 파종하고, 부유 배양을 행하였다. 그 결과, 상기 세포괴는 시간 경과에 따라 세포괴끼리 접합하여, 50∼300㎛의 두께를 가진 시트형의 세포괴를 수득할 수 있어, 종래 기술의 한계를 초과하는 두께를 가지는 이른바 "세포 시트"를 생체외에서 제조할 수 있음을 확인하였다. 이로써, 실제의 응용 형태에서, 임의의 크기를 가지는 정제된 배아 줄기 세포 유래의 심근 세포괴를 임의 갯수로 사용하여, 임의의 크기의 세포 시트를 제조할 수 있음이 밝혀졌다.

즉, 본 발명의 다른 태양은, 정제된 배아 줄기 세포 유래의 심근 세포괴를 동일 평면형에 조밀하게 배열하여 부유 배양을 행하고, 세포괴끼리 접합되어 50∼300㎛의 임의 두께가 될 때까지 상기 배양을 행하는 것을 특징으로 하는, 시트형 세포괴(세포 시트)의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명에서는, 전술한 바와 같은 특징을 가진 정제된 배아 줄기 세포 유래의 심근 세포의 세포괴를 심장 조직에 이식하여 생착시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다. 이와 같은 세포괴는 인체를 포함하는 동물의 신체에 이식할 수 있는 이식용 의료기기로서 이용할 수 있다.

즉, 본 발명의 새로운 태양에 있어서, 배아 줄기 세포로부터 분화, 유도된 심근 세포를 포함하는 응집된 세포괴를 분산시켜 단일 세포화함으로써 정제된 배아 줄기 세포 유래의 심근 세포를 수득하고, 상기 심근 세포를 무혈청 조건하의 배지를 사용하여 배양하고, 상기 세포를 응집시킴으로써 제조된, 배아 줄기 세포 유래 심근 세포의 세포괴를 포함하는, 의료기기를 제공한다. 이와 같은 의료기기는 개체의 심장 조직에 이식해 생착시키는 것을 목적으로 하며, 심장 이식을 필요로 하는 환자에 사용할 수 있는, 현저한 효과가 있다.

이상과 같이, 본 발명자들은, 흩어지게 분산(단일 세포화)시켜 완전히 정제된 배아 줄기 세포 유래의 심근 세포의 생존율을 대폭 개선하기 위한 배양 조건을 열심히 검토한 결과, 동물 유래 혈청을 사용하지 않는 조건(즉, 무혈청 조건)의 배지, 바람직하게는 인슐린을 함유하는 상기 배지, 또한 바람직하게는 트랜스페린, 셀레늄, 및/또는 염기성 섬유모세포 증식 인자를 추가로 포함하는 상기 배지를 사용하여 배양함으로써, 상기 세포가 응집되어 세포괴를 형성한다는 특성을 새롭게 발견하였다. 또한, 상기 세포를 개체(생체)의 심장 조직에 이식한 바에 따르면, 상기 조직으로의 생착율이 비약적으로 높아진다는 사실을 새롭게 발견하였다. 또한, 상기 세포를 사용하면 공지 기술에 비해 예상 두께 이상의 두께를 가진 시트형의 세포괴, 및 그와 같은 세포괴를 포함하는 의료기기가 수득된다는 사실을 새롭게 발견하였고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

이렇게 배아 줄기 세포를 배양함으로써 알게 된 사실은, 배아 줄기 세포 대신 다른 다능성을 가지는 줄기세포를 사용하더라도 동일한 결과를 수득할 수 있다. 즉, 흩어지게 분산(단일 세포화)되어 완전히 정제된 만능 줄기 세포를, 동물 유래 혈청을 사용하지 않는 조건(즉, 무혈청 조건)하의 배지, 바람직하게는 인슐린을 포함하는 상기 배지, 또한 바람직하게는 트랜스페린, 셀레늄, 및/또는 염기성 섬유모세포 증식 인자를 추가로 포함하는 상기 배지를 사용하여 배양함으로써, 상기 세포는 응집하여 세포괴를 형성할 수 있으며, 그리고, 심근 세포의 생존율을 대폭 개선시킬 수 있다. 이와 같은 만능 줄기 세포로는, 배아 줄기 세포 외에도 포유 동물의 성체 장기나 조직의 세포, 골수 세포, 혈액 세포, 또한 배아 및 태아의 세포 등으로부터 유래되는, 배아 줄기 세포와 유사한 형질을 가지는 모든 만능 줄기 세포를 사용할 수 있으며, 예를 들면, 배아 생식 줄기 세포(Embryonic Germcells: EG 세포), 생식 줄기 세포(Germline Stem cells: GS 세포), 및 유도된 만능 줄기 세포(induced pluripotent stemc ells: iPS 세포) 등을 들 수 있다.

즉, 본 발명은 이하의 사항에 관한 것이다.

(1) 배아 줄기 세포, 배아 생식 줄기세포, 생식 줄기 세포나 유도된 만능 줄기 세포 등의 만능 줄기 세포로부터 분화, 유도된 심근 세포를 포함하는 응집된 세포괴를 분산시켜 단일 세포화함으로써 얻어지는 정제된 만능 줄기 세포 유래의 심근 세포를, 무혈청 조건하의 배지를 사용하여 배양하고, 상기 세포를 응집시키는 것을 특징으로 하는, 만능 줄기 세포 유래의 심근 세포의 세포괴의 제조 방법;

(2) 배지가 인슐린을 포함하는 배지인, 상기 (1)에 기재된 방법;

(3) 배지가 트랜스페린, 셀레늄, 염기성 섬유모세포 증식 인자(bFGF), 표피 세포 증식 인자(EGF), 혈소판 유래 성장 인자-BB(PDGF-BB) 및 엔도텔린-1(ET-1)으로 이루어지는 물질 군으로부터 선택되는 1종 이상의 물질을 포함하는 배지인, 상기 (1) 또는 (2)에 기재된 방법;

(4) 배지내 함유량이 인슐린 0.1∼10 mg/L, 트랜스페린 O.1∼10 ㎍/L, 셀레늄 0.1∼10 ㎍/L, 염기성 섬유모세포 증식 인자 1 ng/ml∼100 ng/ml, 표피 세포 증식 인자 1 ng/ml∼10OO ng/ml, 혈소판 유래 성장 인자 1 ng/ml∼10OO ng/ml, 엔도텔린-1(ET-1) 1x10^-8∼1x10^-6M인, 상기(1)∼(3) 중 어느 한 항에 기재된 방법;

(5) 단일 세포화하여 정제된 만능 줄기 세포 유래의 심근 세포를 응집시켜 얻어진 세포괴를, 개체의 심장 조직에 이식해 생착시키는 것을 특징으로 하는 심질환의 치료 방법;

(6) 심근 세포괴가 상기 (1)∼(4) 중 어느 한 항의 방법에 의해 얻어진 심근 세포괴인, 상기 (5)에 기재된 방법:

(7) 이식이 심근 세포괴를 심장 조직 내에 주입함으로써 이루어지는, 상기 (5) 또는 (6)에 기재된 방법;

(8) 이식이 시트형 세포괴를 심장 조직 상에 이식함으로써 이루어지는, 상기 (5) 또는 (6)에 기재된 방법;

(9) 정제된 만능 줄기 세포 유래의 심근 세포괴를, 벽면으로 분할된 세포 비접착성 용기의 표면에 세포괴가 서로 연속 접촉될 정도로 간극없이 배열하여 파종하고, 부유 배양을 행하여, 세포괴끼리 접합되어 50∼300 ㎛의 임의 두께가 될 때까지 상기 배양을 행하는 것을 특징으로 하는 시트형 세포괴의 제조 방법;

(10) 심근 세포괴가 상기 (1)∼(4) 중 어느 한 항의 방법에 의해 얻어진 심근 세포괴인, 상기 (9)에 기재된 방법;

(11) 만능 줄기 세포로부터 분화, 유도된 심근 세포를 포함하는 응집된 세포괴를 분산시켜 단일 세포화하여 정제된 만능 줄기 세포 유래의 심근 세포를 수득하고, 상기 심근 세포를 무혈청 조건의 배지에서 배양한 다음 상기 세포를 응집시켜 제조한, 만능 줄기 세포 유래 심근 세포의 세포괴를 포함하는, 개체의 심장 조직에 이식하여 생착시키기 위한 의료기기;

(12) 이식이 심근 세포괴를 심장 조직 내에 주입함으로써 이루어지는, (11)에 기재된 의료기기;

(13) 이식이 시트형 세포괴를 심장 조직 상에 이식함으로써 이루어지는, (11)에 기재된 의료기기.

발명의 효과

본 발명에서, 단일 세포화하여 정제한 만능 줄기 세포 유래의 심근 세포가 무혈청 조건하에서 배양하였을 때 응집력을 가지게 되는 특성이 있다는 것을 확인하였다. 본 발명의 방법에 따라 세포괴를 구축함으로써, 상기 심근 세포의 생존율 또는 증식력을 높게 유지하면서 장기간 배양할 수 있는 방법을 찾을 수 있었다. 또한, 상기 세포를 개체(생체)의 심장 조직에 이식하면 상기 조직으로의 생착율이 비약적으로 높아지는 것으로 확인되어, 상기 세포는 다른 세포가 혼재하지 않는 상태로 심장 조직 내에 장기간 생착할 수 있었다. 이로써, 심장의 세포 치료에서 유망한 치료 방법, 및 심근 세포의 세포괴를 포함하는 의료기기의 실용성을 가능하게 할 수 있다.

발명을 실시하기 위한 형태

본 발명의 실시에 있어서, 분자 생물학이나 재조합 DNA 기술 등의 유전자 공학 방법 및 일반적인 세포 생물학 방법과 종래 기술에 대해, 실시자는, 특별히 언급된 경우를 제외하고는, 상기 분야의 표준 서적을 참조할 수 있다. 이와 같은 서적으로서는, 예를 들면, 「Molecular Cloning: A Laboratory Manua1 제3판」(Sambrook & Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001);「Current Protocols in Molecular bio1ogy」(Ausubel et al., John Wiley & Sons, 1987);「Methods in Enzymology 시리즈」(Academic Press);「PCR Protocols: Methods in Molecular Biology」(Bartlett & Striling, Humana Press, 2003);「Animal Cell Culture: A Practical Approach 제3판」(Masters, Oxford University Press, 2000); Antibodies: A Laboratory Manual」(Harlow et al. & Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1987) 등을 들 수 있다. 또, 본 명세서에 참조되는 세포 배양, 세포 생물학 실험을 위한 시약 및 키트는 Sigma사나 Aldrich사, Invitrogen/GIBC0사, Clontech사, Stratagene사 등의 시판 업자로부터 입수 가능하다.

(1) 만능 줄기 세포

만능 줄기 세포를 이용한 세포 배양, 및 발생·세포 생물학 실험의 일반적 방법에 대해, 실시자는, 상기 분야의 표준 서적을 참조할 수 있다. 서적으로는, 「Guide to Techniques in Mouse Development」(Wasserman et al., Academic Press, 1993);「Embryonic Stem Cell Differentiation in vitro」(M.V.Wiles, Meth. Enzymol.225: 900, 1993);「Manipulating the Mouse Embryo: A laboratory manual」(Hoganetal., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994);「Embryonic Stem Cells」(Turksen, Humana Press, 2002)이 포함된다. 본 명세서에 참조되는 세포 배양, 발생·세포 생물학 실험을 위한 시약 및 키트류는 Invitrogen/GIBCO사나 Sigma사 등의 시판 업자로부터 입수 가능하다.

마우스나 인간의 만능 줄기 세포의 제조, 계대, 보존법은 이미 표준적인 프로토콜이 확립되어 있어, 실시자는, 전술한 단락에서 예를 든 참고 서적 뿐만 아니라 복수개의 참고 문헌 등을 참조하여, 이들 만능 줄기 세포를 이용할 수 있다. 상기 문헌으로서는, 이하의 문헌 등을 들 수 있다: Matsui et al., Cell 70: 841, 1992); Thomson et al., 미국 특허 제5,843,780호: Thomson et al., Science 282: 114, 1998); Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13726, 1998); Shamblottetal., 미국 특허 제6,090,622호; Reubinoff et al., Nat. Biotech. 18: 399, 2000): 국제 공개 번호 제00 /27995호. 또한, 그 외의 동물 종, 예를 들면, 원숭이(Thomson et al., 미국 특허 제5,843,780호; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 7844, 1996)나 랫(Iannaccone et al., Dev. Biol. 163: 288, 1994); Loring et al., 국제 공개 번호 제1599/27076호), 닭(Pain et al., Development 122: 2339, 1996); 미국 특허 제5,340,740호; 미국 특허 제5,656,479호), 돼지(Wheeler et al., Reprod. Fertil. Dev. 6: 563, 1994; Shim et al., Biol. Reprod. 57: 1089, 1997) 등에 대한 배아 줄기 세포나 배아 줄기 세포-유사 세포 등의 만능 줄기 세포의 수립 방법이 알려져 있어, 각 기재된 방법에 따라 본 발명에 사용할 수 있는 만능 줄기 세포를 제조 또는 사용할 수 있다.

본 발명의 방법은, 임의의 모든 포유 동물 유래의 만능 줄기 세포에도 적용할 수 있다. 예를 들면, 마우스, 소, 염소, 개, 고양이, 마모셋, 붉은 털 원숭이, 인간 유래의 만능 줄기 세포에 대해 적용할 수 있지만, 이들 동물 종 유래의 만능 줄기 세포 만으로 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 본 발명에 사용되는 만능 줄기 세포로서는, 이미 배양 세포로서 널리 사용되고 있는 마우스, 원숭이, 인간 등의 포유 동물 유래 배아 줄기 세포(ES 세포)를 들 수 있다.

마우스 유래 배아 줄기 세포의 구체 예로서는, EB3 세포, E14 세포, D3 세포, CCE 세포, R1 세포, 129SV 세포, J1 세포 등을 들 수 있다. 본원에서 마우스 유래 배아 줄기 세포는, 예를 들면, American Type Culture Collection(ATCC)나 Chemicon사, Cell & Molecular Technologies 사 등으로부터 입수할 수 있다.

원숭이 유래 배아 줄기 세포로서는, 붉은 털 원숭이(rhesus monkey: Macaca mulatta)(Thomson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995; 92:7844)나 시노몰거스 원숭이(cynomolgus monkey: Macaca fascicularis)(Suemori et al., Dev. Dyn. 2001; 222: 5273-279), 코몬 마모셋(common marmoset: Callithrix jacchus)(Sasaki et al., Stem Cells. 2005: 23): 1304-1313)으로부터의 확립이 보고되어 있어, 이를 사용할 수 있다. 예를 들면, 마모셋 배아 줄기 세포는, 재단법인·실험 동물 중앙 연구소로부터도 입수할 수 있다.

사람 유래 배아 줄기 세포는, 현재, 전세계적으로 수십 종 이상이 확립되어 있으며, 예컨대 미국 국립 위생 연구소의 리스트(http://stemcells.nih.gov/registry/index.asp)에는 다수의 주가 등록되어 이용할 수 있으며, Cellartis 사나 ES Cell International 사, Wisconsin Alumni Research Foundation 등으로부터 구입할 수도 있다. 또, 일본의 경우, 국립대학 법인 교토대학 재생의과학연구소 부속 줄기세포 의학 연구 센터에서 입수할 수 있다(Suemori et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2006; 345: 926-932).

또한, 소(Mitalipova et al., Cloning 2001; 3: 59-67), 조류(Petitte et al., Mech. Dev. 2004; 121: 1159-1168), 제브라 피쉬(Fishman, M.C., Science 2001; 294: 1290-1291)에서도 배아 줄기 세포가 확립된 것으로 보고되어 있다.

일반적으로 배아 줄기 세포는 초기 배아를 배양함으로써 확립하지만, 체세포의 핵으로 핵 이식된 초기 배아로부터 배아 줄기 세포를 제조할 수도 있다(Munsie et al., Curr. Biol. 10: 989, 2000; Wakayama et al., Science 292: 740, 2001; Hwang et al., Science 303: 1669, 2004). 또한, 단위 생식 배아(parthenogenetic embryos)를 배반포기와 동등한 단계로 발생시킨 후, 그 단계로부터 배아 줄기 세포를 제조하는 시도(미국 특허 공개 제02 /168763호; VranaK et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 11911-6)나, 배아 줄기 세포와 체세포를 융합시켜 체세포핵의 유전 정보를 가진 배아 줄기 세포를 만드는 방법도 보고되어 있다(국제 공개 번호 제00/49137호; Tada et al., Curr. Biol. 11: 1553, 2001). 본 발명에서 사용할 수 있는 배아 줄기 세포에는, 이와 같은 방법으로 제조한 배아 줄기 세포 또는 배아 줄기 세포의 염색체상의 유전자를 유전공학적 방법에 의해 변형한 것도 포함된다.

또한, 본 발명에 따른 방법에 사용할 수 있는 만능 줄기 세포는 배아 줄기 세포로만 한정되지 않으며, 포유 동물의 성체 장기나 조직의 세포, 골수 세포, 혈액 세포, 또한 배아 세포나 태아의 세포 등으로부터 유래되는, 배아 줄기 세포와 유사한 형질을 가진 모든 만능 줄기 세포가 포함된다. 이 경우, "배아 줄기 세포와 유사한 형질"이란, 배아 줄기 세포에 특이적인 표면(항원) 마커의 존재, 배아 줄기 세포에 특이적인 유전자의 발현, 또는 테라토마(teratoma) 형성능이나 키메라 마우스 형성능과 같은, 배아 줄기 세포에 특이적인 세포 생물학적 성질로써 정의할 수 있다. 그 구체 예로서는, 원시 생식 세포로부터 제조되는 배아 생식 줄기 세포(EG 세포), 정소의 생식 세포로부터 제조되는 생식 줄기 세포(GS 세포), 및 섬유모세포 등의 체세포로부터 특수한 유전자 조작에 의해 제조되는 유도된 만능 줄기 세포(iPS 세포) 등을 들 수 있다. 유도된 만능 줄기 세포로는 체세포에 특정한 인자를 도입함으로써 제조할 수 있는 유도된 만능 줄기 세포를 들 수 있으며, 상기 세포는 쿄토 대학 야마나카 신야 교수 그룹의 문헌(K. Takahashi, et al., "Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors" Cell 2007 131: 861-872)이나, Wisconsin 대학의 Thomson 그룹의 문헌(J. Yu, et al., "Induced P1uripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cells" Science 2007 318: 1917-1920)에 기재된 방법에 따라 제조할 수 있다. 구체적으로는, 임의의 체세포에 0ct3/4, Sox2, c-Myc, Klf4, Nanog, LIN28 중 적어도 1개의 이상의 유전자를 도입하고, 만능 줄기 세포에 특이적인 유전자나 단백질의 발현을 검출하고, 이들을 선별함으로써 제조할 수 있다. 이와 같이 하여 제조한 유도된 만능 줄기 세포는, 배아 줄기 세포와 동일하게, 증식 불활성화된 마우스 섬유모세포나 이를 대체할 수 있는 세포의 존재하에서, 염기성 섬유모세포 증식 인자와 함께 배양할 수 있으며, 배아 줄기 세포와 동일하게 만능 줄기 세포로서 이용할 수 있다.

상기한 유도된 만능 줄기 세포는, 각종 조직으로의 분화 특징이나 세포 내에서의 유전자 발현 특징이, 배아 줄기 세포와 동일한 성질과 상태를 가지고 있는 것으로 지금까지 밝혀져 있으며(ParkI. H. et al., Nature, 2008, 451, 141-147), 배아 줄기 세포에서 각종 조직으로의 분화 유도 조건을, 유도된 만능 줄기 세포에도 그대로 적용할 수 있다(타카하시 및 야마나카, 세포 공학, Vol. 27, No.3, 252-253, 2008).

(2) 만능 줄기 세포로부터 심근 세포를 분화 유도하는 방법

하기에서는 만능 줄기 세포로서 배아 줄기 세포(ES 세포)를 예를 들어 설명한다. 심근 세포 분화능을 가진 배아 줄기 세포에 적절한 심근 세포로의 분화를 유도 처리하면, 심근 세포로의 분화가 이루어진다. 즉, 예를 들면, 마우스 배아 줄기 세포를 백혈병 억제인자(LIF)가 없는 배양 배지에서 부유 배양하여 세포괴(배상체)를 형성시키고, 행잉-드롭 기법(hanging-drop technique)에 의해 배아 줄기 세포로부터 심근 세포로의 분화를 유도할 수 있다. 또는, 마모셋 배아 줄기 세포나 인간 배아 줄기 세포를 사용하여, 동일하게 배아 줄기 세포로부터 심근 세포로의 분화를 유도할 수 있다. 배아 줄기 세포로부터 심근 세포를 분화 유도하는 방법은 공지의 방법을 이용할 수 있으며, 특정되는 것은 아니다. 예를 들면, BMP 시그널 전달을 억제하는 물질의 존재하에 분화를 유도하는 방법(W02005/033298)이나, 카노니칼 Wnt 시그널 경로의 활성화를 자극하는 물질의 존재하에서 분화를 유도하는 방법(PCT/JP2007/59242, WO2007/126077으로서 공개)을 사용하여, 배아 줄기 세포로부터 심근 세포로의 분화를 유도할 수 있다.

(3) 심근 세포의 정제

상기 (2) 방법에 의해 배아 줄기 세포로부터 분화 유도된 심근 세포를 정제(선택)하는 방법은, 효소의 작용에 의해 심근 세포를 흩어지게 분산(단일 세포화)시켜 개개의 심근 세포로서 정제할 수 있는 방법일 수 있으며, 특정되는 것은 아니다. 예를 들면, 심근 세포 내의 미토콘드리아를 지표로서 선택하는 방법(WO2006/022377), 저영양 조건에서 생존할 수 있는 세포를 선발하는 방법(PCT/JP2007/051563, W02007/088874으로서 공개)을 사용하여 심근 세포만 정제(선택)할 수 있다.

(4) 심근 세포괴의 제조

상기 (3) 방법에 의해 단일 세포화하여 수득한 정제된 배아 줄기 세포 유래의 심근 세포를 무혈청 조건하에서 배양하여 상기 세포를 응집시킴으로써, 배아 줄기 세포 유래의 심근 세포괴를 제조할 수 있다. 바람직하게는, 상기 배양에 사용되는 배지에 인슐린(0.1∼10 mg/L), 트랜스페린(0.1∼10 ㎍/L), 셀레늄(0.1∼10 ㎍/L), 염기성 섬유모세포 증식 인자(bFGF; 1 ng/ml∼100 ng/ml), 표피 세포 증식 인자 1 ng/ml∼1000 ng/ml), 혈소판 유래 성장 인자(1 ng/ml∼1000 ng/ml), 및 엔도텔린-1(ET-1)(1x10^-8∼1x10^-6M)로 이루어지는 물질 군으로부터 선택되는 1종 이상의 물질이 포함되는 것이 바람직하다.

또한, 상기 방법에 의해 얻어지는 정제된 배아 줄기 세포 유래의 심근 세포괴에서 일부 혼재된 증식성 세포를 검출하여, 이식용 세포에서 제외시킴으로써, 추가적인 안전성을 확보할 수 있다. 현재, 심근 세포를 정제하는 방법으로는 미리 줄기 세포의 게놈에 특정 마커 유전자를 도입하는 방법이 알려져 있다(FASEB J. 2000: 14: 2540-2548). 그러나, 이들 방법들 모두 99%의 순도는 제공할 수 있어도 100 ± 0%의 순도를 보증하진 못한다. 예를 들면, 인간의 심근 경색을 치료하기 위해 10¹¹의 비심근 세포가 필요하다고 하면, 순도 99%인 경우 10⁹로 비심근 세포가 혼입되는 것을 의미한다. 이와 같이, 기존의 기술 수준으로는 완전에 가까운 정제라고 할 수 있는 방법으로도 완전한 심근 세포의 정제가 가능하지 않으므로, 추가적인 정제 방법의 조합이나 안전성을 확보할 수 있는 다른 방법을 적용하여야 한다.

그래서, 상기 방법에 대하여, 고의로 미분화 배아 줄기 세포를 혼입시켰다. 그러면, 증식 능력이 심근 세포 보다 높은 미분화 배아 줄기 세포는 심근 세포괴의 외측에 크기가 더 큰 다른 세포괴를 구축하였다. 상기 혼입된 배아 줄기 세포가 존재하는 심근 세포괴는 세포괴 전체의 크기를 판정함으로써 자동적으로 판별할 수 있다. 또한, 상기 세포괴에 미토콘드리아 지시약(예, TMRM)을 첨가한 바에 의하면, 미토콘드리아의 수가 많은 심근 세포는 밝고, 미토콘드리아 수가 적은 배아 줄기 세포나 그 외 증식성 세포는 어둡게 관찰할 수 있다. 이렇게 세포괴 내 형광 강도의 차이가 큰 세포괴를 제외하는 것은, Arrayscan(Cellomics), Incell 1000(GE/Amersham Biosciences, Cardiff, UK), Scanalyzer(Scanalyzer LemnaTec, Aachen Germany) 및"ImageXpress MICRO"(Molecular Devices, Union City, USA), "Pathway HT"(Becton Dickinson Biosciences), "Scan^R(Olympus Soft Imaging Solutions, Germany) 등을 이용하여 자동적으로 행할 수 있다. 따라서, 상기 방법으로 간단하고 자동적으로 미분화된 배아 줄기 세포의 혼입을 식별할 수 있다. 즉, 무혈청 조건에서 배양되어 응집된 배아 줄기 세포 유래의 정제된 심근 세포괴에, 일부 혼재된 증식성 세포는, 상기 세포괴의 크기나 형상을 지표로 하거나, 또는 상기 지표에 추가로 미토콘드리아 지시약으로 염색하고 형광 강도와 세포괴 내의 형광 강도 분포 등을 지표로 하여 식별할 수 있다. 이러한 방식으로, 심근 세포 이외의 세포가 혼입된 세포괴를 이식용 세포에서 배제함으로써, 안전성을 높일 수 있다.

(5) 심근 세포괴의 심장 조직으로의 이식 및 생착

상기 방법에 의해 응집하여 수득한 세포괴, 즉 정제된 배아 줄기 세포 유래의 심근 세포괴를 사용하여, 심근 세포만을 개체(생체)의 심장 조직에 이식할 수 있다. 예를 들면, 주사로 심근 세포를 심장 조직 내에 직접 주입할 수 있으며, 이 경우, 29, 30 게이지의 가늘고 저침습성의 주사 바늘을 이용한 주입을 실시할 수 있다. 이러한 방법으로 이식된 심근 세포의 생착율은, 기존의 방법에 비해 현저하게 개선된다. 상기, "생착"은 이식된 장기 내에서 장기간 생존하고, 장기 내에 접착 및 고정되는 것을 의미한다.

(6) 심근 세포괴의 이식용 시트

기존의 방법에서는 신생아 심근 세포를 사용하더라도, 한번에 세포 3층의 이상의 두께를 가진 심근 세포 시트를 제조할 수 없었다. 그러나, 본 발명에서는, 정제된 배아 줄기 세포 유래의 심근 세포의 세포괴를 구축한 후, 얻어진 세포괴를 회수하여, 벽면으로 분할된 세포 비접착성 용기의 표면에 세포괴끼리 연속 접촉할 정도로 간극없이 배열되게 파종하여, 부유 배양을 행함으로써, 상기 부유 배양 중에 심근 세포괴는 시간 경과에 따라 세포괴끼리 접합되어 50∼300 ㎛의 두께를 가진 시트형의 세포괴(세포 시트)로 만들어질 수 있다. 따라서, 임의 두께가 형성될 때까지 배양한다. 이로써, 실제의 응용 형태에서는, 임의의 크기를 가지는 정제된 배아 줄기 세포 유래 심근 세포괴를 임의의 갯수로 사용하여, 임의 크기의 세포 시트를 구축할 수 있다.

본 발명에 따라, 단일 세포화에 의해 정제한 배아 줄기 세포 유래의 심근 세포가, 무혈청 조건하에서 배양한 경우, 응집되는 능력이 있다는 특성이 발견되었다. 본 발명의 방법에 따라 세포괴를 구축함으로써, 상기 심근 세포의 생존율 또는 증식력을 높게 유지하면서 장기간 배양하는 방법을 확립할 수 있었다. 또한, 상기 세포를 개체(생체)의 심장 조직에 이식하면, 심장 조직 생착율은 비약적으로 증가되었으며, 심근 세포를 비심근 세포와 혼재하지 않게 심장 조직 내에 장기간 생착시킬 수 있었다. 따라서, 본 발명에 따라, 이식용 심근 세포를 제공하는 방법 또는 심장 이식 이외의 치료 방법으로서, 체외에서 제조한 심근 세포를 이식함으로써 심장 질환을 치료하는 방법으로서의 심장의 세포 치료 방법, 및 심근 세포의 세포괴를 포함하는 의료기기를 제공할 실현성을 높일 수 있다.

도 1은 EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein) 발현 마우스 배아 줄기 세포로부터 유래된 정제한 심근 세포를 사용하여 심근 세포괴를 구축하는 방법 및 마우스 배아 줄기 세포 유래 정제된 심근 세포 313 내지 10000개를 이용하여 수득한 세포괴를 나타낸 것이다.
도 2는 분주 후 24시간 후(도 2A) 또는 48시간 후(도 2B)에 마모셋 배아 줄기 세포로부터 유래된 정제한 심근 세포를 이용한 심근 세포괴의 구축을 나타낸 것이다.
도 3은 마우스 배아 줄기 세포 유래의 정제된 심근 세포를 이용하여, 접착 기질에 의한 세포 생존율 비교 결과를 기초로 한 평면 배양에 최적인 접착 기질의 동 정(도 3A) 및 세포괴와 평면 배양시의 심근 세포 생존율을 비교(도 3B 및 도 3C)하여 나타낸 것이다.
도 4는 마우스 배아 줄기 세포 유래의 정제된 심근 세포를 이용하여 세포괴를 형성함에 있어, 혼재된 배아 줄기 세포를 검출하는 방법(1)을 나타낸 것이다. 붉은 프레임으로 표시한 세포괴에서는 세포 증식에 의해 거대한 세포괴가 검출되었다.
도 5는 마우스 배아 줄기 세포 유래의 정제된 심근 세포를 이용하여 세포괴를 형성함에 있어, 혼재된 배아 줄기 세포를 검출하는 방법(2)을 나타낸 것이다. TMRM(미토콘드리아를 특이적으로 염색하는 시약) 유래의 형광 시그널이 약한 것을 토대로 혼입된 비심근 증식 세포를 검출할 수 있으며, 정상 심근 세포(도 5A)와는 대조적으로, 비정상 심근 세포괴에는 비심근 증식 세포가 혼입되어 있는 것으로 확인되었다(도 5B).
도 6A는 세포 비접착성의 둥근 바닥 96웰 디쉬에 배양하였을 때, 신생아 랫 심장 유래의 정제된 심근 세포에서는 24시간 후에 있어서도 세포괴를 구축할 수 없었음을 나타낸 것이고, 도 6B는 신생아 랫 심장 유래 정제 심근 세포는 무혈청 조건하에서 5일 후 세포괴를 형성하지 못하고 사멸함을 나타낸 것이다.
도 7은 ITS 및 bFGF 등의 각종 첨가물을 첨가한 무혈청 배지를 이용하여 세포 비접착성 둥근 바닥 96웰 디쉬에서 배양한 경우, 이들 첨가물이 세포괴의 직경 증가에 어떠한 작용을 가지는 지를 확인한 것으로, 이들 첨가물에 의해 세포 보호 작용 및 증식 촉진 활성이 검출됨 것을 나타낸다.
도 8은 피브로넥틴으로 코팅한 세포 배양용 디쉬 상에 마우스 배아 줄기 세포 유래의 정제된 심근 세포를 평면 접착 배양한 결과, 무혈청 ITS, ITS + bFGF군에서 유의하게 세포 생존율이 낮아지는 것을 나타낸 것이다.
도 9는 재응집법을 적용하지 않고 분산된 세포 상태로 심장에 이식하였을 때 마우스 배아 줄기 세포 유래의 단일 세포화된 정제 심근 세포의 이식 후 조직내 세포 생존율을 계측한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 마우스 배아 줄기 세포 유래의 정제된 심근 세포를 재응집법으로 세포괴로 만든 후, 적색 색소(Mitotracker Red)를 사용하여 표지하여 심장에 이식하였을 때, 심근 세포가 효율적으로 생존함을 나타낸 것이다.
도 11(A) 및 (B)는 재응집한 다음 이식한 EGFP 발현 마우스 배아 줄기 세포 유래의 정제된 심근 세포의 세포괴에 대해, 심장 조직 내에서의 세포수를 계측하고, 그 결과를 이용하여 세포의 조직내 생존율을 확인한 결과를 나타낸 것이다. 도 11(C) 및 (D)는 마우스 심근 세포괴가 이식 심장 내에서 장기간 생착하며, 시간의 경과에 따라 성숙될 수 있음을 나타낸 것이다.
도 12는 무혈청(도 12A) 또는 무혈청에 KSR(도 12B) 또는 ITS(도 12C)를 첨가한 조건에서의 마모셋 배아 줄기 세포 유래의 정제된 심근 세포괴의 제조를 나타낸 것이다.
도 13은 마모셋 배아 줄기 세포 유래의 정제된 심근 세포괴를 이용한, 임의의 두께를 가지는 임의의 크기의 심근 세포 시트의 제조를 나타낸 것이다.
도 14는 무혈청 조건에서 정제 인간 배아 줄기 세포 유래의 심근 세포괴를 제조할 수 있음을 나타낸 것이다.
도 15는 이식된 인간 배아 줄기 세포 유래 심근 세포가 면역 부전 마우스 심장 조직 내에서 2주간 생존할 수 있음을 나타낸 것이다.
도 16은 이식 세포의 추적에 사용한 적색 색소를 이용하여, 이식된 인간 배아 줄기 세포 유래 심근 세포가 면역 부전 마우스의 심장 조직 내에서 5주간 생존할 수 있음을 나타낸 것이다.
도 17은 이식 세포의 추적에 사용한 색소(Mitotracker Red: 적색), Nkx2.5(물색) 및 항-사르코메릭 액티닌 항체(녹색)를 이용하여, 이식된 인간 배아 줄기 세포 유래 심근 세포가 면역 부전 마우스의 심장 조직 내에서 5주간 생존할 수 있음을 나타낸 것이다.
도 18은 Nkx2.5(물 색) 및 항 인간 항체(녹색)를 사용하여, 이식된 인간 배아 줄기 세포 유래 심근 세포가 면역 부전 마우스의 심장 조직 내에서 5주간 생존할 수 있음을 나타낸 것이다.
도 19는 무혈청 또는 무혈청에 ITS 또는 KSR를 첨가한 조건에서의, 마우스 iPS 세포 유래의 정제된 심근 세포괴의 제조 결과를 나타낸 것이다.
도 20은 인간 ES 세포 유래의 정제된 심근 세포의, 무혈청 조건에 bFGF 및 다른 증식 인자를 첨가한 경우의 세포 보호 및 증식 활성화 작용에 있어서, bFGF가 우위성을 가짐을 나타낸 것이다.
도 21은 마우스 심근 세포괴가 이식 심장 내에 장기 생착하는 경우의 성숙 메카니즘과 관련있는, 숙주 심장 내에서의 bFGF, EGF, PDGF-BB, ET-1의 유전자 발현을 나타낸 것이다.

본 발명을 이하의 실시예를 들어 보다 상세하게 설명한다.

실시예 1: 마우스 배아 줄기 세포 유래의 심근 세포의 제조 및 미토콘드리아 법을 이용한 심근 세포의 정제

본 실시예는, 마우스 배아 줄기 세포로부터 심근 세포를 제조할 수 있는지, 또한, 미토콘드리아 지시약을 사용하여 심근 세포를 정제할 수 있는지의 여부를 검토하기 목적으로 수행하였다.

배아 줄기 세포로서 EB3 세포주(Niwa H, et al., Nat Genet 2000; 24: 372-376)를 사용하여, 이 세포에 EGFP 발현 유닛을 플라스미드로 사용하여 EB3주에 도입하고, EGFP를 발현하는 세포를 취득·주화하였다. 이와 같이 하여 취득한 EGFP 발현-배아 줄기 세포(EB3 세포)를, 최종 농도 10%의 비동화(55℃, 30분) 소 태아 혈청이 첨가된 MEM 배양액(시그마사제)에, 배아 줄기 세포수 75개/35μL의 농도로 희석하였다. 이어서, 시판제품인 세포 배양용 384웰 플레이트(Greiner사제, 형식 788161; 개구부 내직경 3.0 mm)에 상기에서 준비한 마우스 배아 줄기 세포를 분주하고, 하기 방법에 따라 배상체를 제조하였다.

사용한 384웰 플레이트의 공칭 용액 허용량은 웰 당 25 μL이지만, 액체의 표면이 솟아오르게 하기 위해 웰 당 35 μL로 분주하였다. 이로써, 웰 당 배아 줄기 세포 75개를 분주하였다. 이 때, 개구부 수평면까지의 필요 용액량은 28 μL이며, 수면을 높이는데 필요한 용액량은 7 μL였다. 분주에는 Theremo Labsystems사 제품의 멀티 채널 피펫(제품 번호 4610070), 또는 바이오텍 가부시키가이야 제품의 분주 기계(모델 LD-01)를 사용하였다.

배아 줄기 세포를 포함하는 배양액을 분주하여 배양액이 올라온 상태의 플레이트를 뒤집어, 아래쪽 개구단에 배양액의 돌출 부분을 만들었다. 이 상태를 유지한 채, 커버를 덮어 인큐베이터 내에서 37℃, 5% CO₂ 조건하에서 배양하고, 상기 하단측 개구단의 돌출 부분에서 배아 줄기 세포를 증식시켰다. 배양 개시 후 1일 후에, 돌출된 배양액면이 아래가 되어 있는 상태의 플레이트를 청결한 핀셋 등으로 잡고, 다른 대형 용기에 담긴 최종 농도 10%의 비동화(55℃, 30분) 소 태아 혈청이 첨가된 α-MEM 배양액(시그마사)의 표면에 상기 배양액의 돌출 부분을 접촉시켜, 세포괴를 자기 무게에 의해 대형 용기내 배양액으로 침강되게 함으로써, 배아 줄기 세포 유래의 세포괴인 배상체를 회수하였다.

회수한 배상체를 추가적으로 2일 내지 3일간 비세포 접착 디쉬(Asahi Techno Glass: 멸균 샬레 #SH90-15, 또는 Eiken Chemical Co., Ltd., 멸균 직사각형 샬레 2형)를 사용하여 배상체를 배양하였다. 이 배상체를 원심관에 회수하고, 용액을 무혈청 배지(α-MEM(SIGMA사 #M0644에 ITS 용액(GIBCO#41400-045)(여기서, 본 발명에서 사용한 ITS 용액에는, 인슐린이 1 g/L, 트랜스페린이 0.55 g/L, 및 염화 셀레늄이 0.67 mg/L 각각 포함됨)을 1/100로 희석하여 첨가함)로 교체하여, 세포 접착성 멸균 배양 디쉬(FALCON#353003)에서 배양하였다.

분화 배양 개시 후 15일째까지, 이틀에 한번 배지를 교체하였다. 15일째 샘플에, 미토콘드리아 지시약 TMRM(Invitrogen #T668)을 최종 농도 10 nM로 첨가하여 2시간 배양한 후, 콜라게나제(Wortington Type 3)를 최종 농도 0.1%, 트립신(DIFCO #215240)을 최종 농도 0.1%로 각각 첨가한 생리 완충액(116 mM NaCl, 20 mM Hepes, 12.5 mM NaH₂PO₄, 5.6 mM 글루코오스, 5.4 mM KCl, 0.8 mM MgSO₄, pH7.35)을 사용하여, 교반기(stirrer)로 용액을 교반하면서, 세포를 단일 세포화하였다. 단일 세포화한 샘플을 형광 활성화 세포 분류기(Fluorescent Activated Cell Sorter; FACS)에 제공하여, 고형광 세포군을 회수하였다(W0 2006/022377). 정제된 세포의 생존 세포수와 죽은 세포수를 혈구계로 계측하였다. 그 결과, 생존 세포의 비율은 약 75%였다.

실시예 2: 마우스 배아 줄기 세포 유래의 심근 세포로 세포괴의 제조

본 실시예는, 실시예 1에서 제조한 마우스 배아 줄기 세포 유래의 심근 세포를 사용하여, 세포괴를 제조할 수 있는지의 여부를 명확히하기 위한 목적으로 실시하였다.

실시예 1에서 제조한 배아 줄기 세포 유래의 정제 심근 세포를, 10000, 5000, 2500, 1250, 625 및 313개의 세포가 세포 비접착성 둥근 바닥 96 웰 플레이트(스SUMITOMO BAKELIKE CO., LTD.; 셀펙타이트 스페로이드)의 각 웰에 존재하도록 분주하였다. 배양 배지는 10% 소 태아 혈청이 포함된 α-MEM이다. 분주한 세포를 경시적으로 관찰하였으며, 그 결과 10시간 후에는 세포괴가 형성되었고 동기적으로 자율 박동하였다. 24시간 후에는 거의 완전한 구형을 이루었으며, 10일 후에는, 리드미컬한 동기적인 자율 박동을 보였다(도 1).

이러한 결과로부터, 마우스 배아 줄기 세포 유래의 심근 세포는 단일 세포화한 후 심근 세포로 재응집되어 세포괴를 형성할 수 있는 능력을 가지고 있는 것으로 밝혀졌다.

실시예 3: 마모셋 배아 줄기 세포 유래 심근 세포를 이용한 세포괴의 제조

본 실시예는, 실시예 1의 방법에 준하여 제조한 마모셋 배아 줄기 세포 유래의 심근 세포를 사용하여, 세포괴의 제조 여부를 명백하게 하기 위한 목적으로 수행하였다.

마모셋 배아 줄기 세포는 실험 동물 중앙 연구소로부터 입수하였다(Sasaki E, et al., Stem Cells. 2005: 23(9): 1304-13). 이 마모셋 배아 줄기 세포를, 미토마이신 C 처리에 의해 증식 불활성시킨 마우스 배아 섬유모세포(mouse embryonic fibroblast: MEF)를 이용하여, 미분화가 유지되도록 배양하였다. 배양액[KO-DMEM(GIBCO), 20% KO-SERUM(GIBCO), 1.6 mM L-글루타민, 0.1 mM 비필수 아미노산(MEM), 0.2 mM β-머캅토에탄올(2-ME; Sigma), 100 IU/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 황산 스토렙토마이신, 8 ng/ml 재조합 인간 백혈병 저해 인자(LIF: Chemicon), 재조합 인간 염기성 섬유모세포 증식 인자(bFGF: Peprotech)]을 사용하였다. 연속 계대를 위해, 0.1% III형 콜라게나제(Wortington)를 37 ℃에서 10분간 처리하여 배아 줄기 세포 콜로니를 분리하였다.

이어, MEF와 배아 줄기 세포를 분리하기 위해, 기공 크기 100 ㎛의 메쉬를 통과시킨 통과액을 수득하고, 이를 기공 크기 40 ㎛의 메쉬를 통과시켜, 비통과 세포괴를 취득하였다. 이 세포괴가 바로 순수한 배아 줄기 세포괴이다. 분화를 위해, EB 당 50 내지 1,000개의 배아 줄기 세포괴를, 세포 비접착성 박테리아 디쉬(아사히테크노 글라스: 멸균 샬레) 상에서, 배상체로서 총 15∼30일간 배양하여, 심근 세포를 포함하는 배상체로 분화시켰다. 이 때 사용한 배양 배지는, 전술한 본 실시예의 배양 배지에서 bFGF를 제외한 배양 배지[KO-DMEM(GIBCO), 20% KO-SERUM(GIBCO), 1.6 mM L-글루타민, 0.l mM 비필수 아미노산(MEM), 0.2 mM β-머캅토 에탄올(2-ME; Sigma), 100 IU/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 황산 스트렙토마이신 및 8 ng/ml 재조합 인간 백혈병 저해 인자(LIF: Chemicon)]이다.

배상체 제조 후 1∼2개월 지난 배상체를 사용하여, WO 2006/022377에 기재된 방법으로 심근 세포를 정제하였다. 즉, 배상체를 콜라게나제 및 트립신으로 처리하여, 분산된 단일 세포를 수득하였다. 세포가 분산된 배양액에 미토콘드리아 지시약 TMRM(Invitrogen #T66)을 최종 농도 10 nM로 첨가하여, 37 ℃에서 15분간 노출시킨 후, 3번 세정한 후 바로 FACS 분석하였다. 주세포 집단에 비해 고형광을 나타내는 세포(심근 세포)를 분리 및 회수하였다.

이렇게 분리한 심근 세포를 실시예 2와 동일한 방법으로 심근 세포괴를 제조하였다. 즉, 마모셋 배아 줄기 세포 유래의 정제된 심근 세포 2000개가 세포 비접착성 둥근 바닥 96 웰 플레이트(스미토모 베이크라이크; 셀펙타이트 스페로이드)의 각 웰에 존재하도록 분주하였다. 분주한 세포를 경시적으로 관찰한 바에 따르면, 24시간 후(도 2A)에 세포괴가 형성되어 동기적으로 자율 박동하였다. 48시간 후(도 2B)에는 거의 완전한 구형을 이루었으며, 10일 후에는 리드미컬한 동기적인 자율 박동이 관찰되었다(도 2).

이러한 결과로부터, 마모셋 배아 줄기 세포 유래의 심근 세포에는 단일 세포화한 후 심근 세포가 재응집되어 세포괴로 형성되는 능력이 있다는 것이 확인되었다.

실시예 4: 마우스 배아 줄기 세포 유래의 심근 세포를 이용한 세포괴 형성에 있어 세포 생존율 측정 및 접착 배양법과의 비교

본 실시예는, 평면 배양 조건 하에서의 보호 작용의 강도를 지표로 접착 기질을 검토하고, 평면 접착 배양과 세포괴 배양에서의 배아 줄기 세포 유래의 정제된 심근 세포의 생존율을 비교하여, 강력한 세포 보호 작용을 가진 혈청을 이용하여 평면 접착 조건과, 유혈청 조건 및 무혈청 조건에서의 세포 생존율을 비교 검토함으로써, 세포괴 배양 방법의 무혈청 조건에서 우수한 세포 보호 작용이 있음을 확인하기 위한 목적으로 실시하였다.

본 실시예에서는 실시예 1에서와 같이 마우스 배아 줄기 세포 유래 심근 세포를 정제하였다. 정제한 심근 세포를, (1) 젤라틴, (2) 피브로넥틴으로 코팅한 플라스틱으로 만든 배양접시(BD사)에, 유혈청 조건으로 파종하였다(도 3A). 동시에, 세포괴를 형성시키기 위해, 실시예 2에 따라, (3) 세포 비접착성 둥근 바닥 96웰 플레이트에 1,000개의 세포를 각각 분주하고, 120g로 5분 동안 원심 분리를 수행하였다. 또한, (4) 세포괴 구축에서 무혈청 조건을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 2에 따라 세포 비접착성 둥근 바닥 96웰 플레이트에 1,000개의 세포를 각각 분주하고, 120g로 5분간 원심 분리하였다. (1)∼(4)를 동일한 인큐베이터 내에서 12시간 및 4일간 배양하였다. 4일 후, 각 디쉬에 접착된 세포수(생존 세포수)와, 접착되지 않고 부유하는 세포수(죽은 세포수)를 계측하였다. 그 결과를 도시한다((1) 및 (2)는 도 3A, (3) 및 (4)는 각각 도 3B 및 도 3C를 참조).

이러한 결과로부터, 세포괴의 무혈청 배양 조건에서의 세포 생존율은, 평면 접착 혈청 함유 조건에서의 최대 세포 생존율((2)의 경우, 약 60%의 생존율)에 비해, 명백하게 높은 것으로 확인되었다((3):, 99.2%의 생존율, (4): 90.4%의 생존율).

실시예 5: 정제한 마우스 배아 줄기 세포 유래의 심근 세포를 사용한 세포괴 의 제조 및 혼재하는 배아 줄기 세포의 검출

본 실시예는, 정제한 마우스 배아 줄기 세포 유래의 심근 세포로 형성된 세포괴에 혼재하는 비심근 세포를 검출하기 위한 목적으로 수행하였다.

실시예 1, 2의 방법으로 정제된 심근 세포괴를 제조하였다. 단, 최종 96웰 플레이트에 파종하는 전 단계에서, 심근 세포 현탁액에 2%의 미분화 배아 줄기 세포를 첨가하였다. 세포괴는 무혈청 + 1 mg/ml의 인슐린 및 10 nM TMRM이 포함된 α-MEM 용액에서 배양하고, 14일 후에 모든 웰의 형광이미지 및 위상차 이미지를 수득하였다.

그 결과, 약 2%에 해당되는 웰 2개에서, 대형(정상 세포괴의 2배 이상의 크기) 세포괴가 관찰되었고(도 4), 이 비구형 세포괴의 일부는 TMRM 유래의 약한 형광 신호를 가지고 있는 세포 집단(즉, 비심근 세포)인, 비정상 심근 세포로 판명되었다(도 5B). 그리고, 정상 심근 세포괴는 세포괴 전체가 TMRM 유래의 형광 시그널을 발색하고 있었다(도 5A).

따라서, 본 실시예의 방법으로 고감도로 비심근 세포의 혼입을 식별할 수 있었다.

실시예 6: 신생아 랫 심장 유래 정제 심근 세포를 사용한 세포괴의 제조

본 실시예는, 신생아 랫의 심장으로부터 유래된, 정제한 심근 세포로 세포괴의 제조 여부를 명백하게 확인할 목적으로 수행하였다.

생후 0∼2일된 신생아 랫을 에테르 마취하였다. 심장을 적출하고, 0.1% 콜라게나제(wortington)를 사용하여 세포를 흩어지도록 분산시켰다. 이를 10 nM TMRM으로 염색한 후, FACS로 심근 세포를 정제하였다.

정제한 심근 세포의 세포수를 계측하고, 세포 3000개씩 세포 비접착성 96웰 디쉬(스미토모 베이크라이크)에서 배양하였다. 배양 배지는 10% FBS(JRH)가 포함된 DMEM-고 글루코오스(Invitrogen)를 사용하였다.

24시간 후의 세포 상태를 도면에 나타낸다. 신생아 랫 유래 정제 심근 세포는 세포괴를 형성하지 않았으며 둥근 바닥을 따라 존재하고 있었다(도 6A). 배양 5일째의 신생아 랫 심장 유래 정제 심근 세포는, 무혈청 조건(기초 배지인 α-MEM (도 6B의 좌측) 또는 α-MEM + ITS(도 6B의 우측))에서는 세포가 거의 사멸되어 있었다(도 6B).

실시예 7: 마우스 배아 줄기 세포 유래 심근 세포로 세포괴를 형성하는데 있 어 최적인 배지 조성

본 실시예는, 신생아 랫 초대 심근 세포와 마우스 배아 줄기 세포 유래 심근 세포의 다양한 특성을 분석하여, 배아 줄기 세포 유래의 심근 세포에 가장 적합한 배양 배지를 찾는 것을 목적으로 하였다.

마우스 배아 줄기 세포 유래의 정제된 심근 세포 및 신생아 랫의 정제된 심근 세포를 전술한 바와 같이 제조하였다. 이를, α-MEM 단독, α-MEM + ITS, α-MEM +ITS + 50 ng/ml bFGF(peprotech), α-MEM + ITS + 50 ng/ml IGF-1(Wako), α-MEM + ITS + 50 ng/ml bFGF + 50 ng/ml IGF-1, α-MEM + 5% KSR(Knockout Serum Replacement: Invitrogen)(Invitrogen), α-MEM + 10% KSR(Knockout Serum Replacement: Invitrogen), α-MEM + 1% FBS(Equitech Bio), α-MEM + 5% FBS, α-MEM + 10% FBS의 총 10종의 배양 배지에서 배양하여 분석하였다.

그 결과, 마우스 배아 줄기 세포 유래의 정제된 심근 세포를 세포 비접착성 둥근 바닥 96웰 디쉬에 배양하였을 때, 불과 12시간만에 모든 배양 배지들에서 세포괴가 형성되었다(도 7A). 그러나, 신생아 랫 심근 세포는 24시간 후 모든 배양 조건들에서 세포괴가 형성되지 않았다. 10% 혈청을 포함하는 배지를 예시한다. 4일 후, 신생아 랫 심근 세포는 5% FBS 및 10% FBS를 포함하는 배지에서만 심근 세포괴를 형성하였다.

한편, 세포 비접착성 둥근 바닥 96웰 디쉬에서 배양한 6일 후에 마우스 배아 줄기 세포 유래의 정제된 심근 세포괴를 관찰한 결과에 따르면(도 7B), α-MEM + ITS + 50 ng/ml bFGF에서만 세포괴 형성 시 유의한 세포괴의 직경 증가를 볼 수 있었다(도 7C, *로 표시한 컬럼 참조). 혈청이 포함된 배지에서도 세포괴의 직경은 초기 직경의 1/2 정도였다(도 7C).

따라서, 무혈청 조건하에서, ITS 및 bFGF를 첨가한 배지는, 세포 보호 작용이 매우 강하며, 심근 세포 증식을 유도하는 특이한 성질을 발휘하는 것으로 생각된다.

실시예 8: 마우스 배아 줄기 세포 유래 심근 세포로 세포괴를 형성함에 있어 최적인 배지 조성

실시예 7에 있어서, 무혈청 조건하에서, ITS 및 bFGF를 첨가한 배지가, 매우 세포 보호 작용이 강하고, 심근 세포 증식을 유도하는 특이한 성질을 발휘하는 것이 밝혀진 것으로부터, 본 실시예에서는, bFGF나 ITS 용액을 구성하는 성분의 하나인 인슐린이, 세포괴의 직경 증가에 대하여 어떠한 작용을 가지는 지를를 명백하게하는 것을 목적으로 행하였다.

기본적으로는, 배양 배지로서α-MEM 만, α-MEM + 50 ng/ml bFGF, α-MEM + 10㎍/ml 인슐린 + 5ng/ml bFGF, α-MEM + 1㎍/ml 인슐린 + 1 ng/ml bFGF를 사용한 점 이외는, 실시예 7과 마찬가지로 실험을 행하였다.

이 결과, 6일 후의 마우스 배아 줄기 세포 유래 심근 세포괴를 관찰한 바에 의하면, α-MEM + 50 ng/ml bFGF, α-MEM + 10㎍/ml 인슐린 + 5ng/ml bFGF, α-MEM + 1㎍/ml 인슐린 + 1ng/ml bFGF의 어디에 있어서도, α-MEM 만의 경우의 세포괴와 비교하여 의미가 있는 세포괴의 직경 증가를 볼 수 있었다(도 7B). 또, 심근 세포의 수축 활성도 강하였고, 실시예 7에서 ITS를 첨가한 경우와 동일한 수축 활성에 대한 효과가 확인되었다.

따라서, 무혈청 조건하에서, bFGF, 또는 인슐린 + bFGF를 첨가한 배지는, 세포 보호 작용이 매우 강하고, 심근 세포 증식을 유도하는 특이한 특성을 보이는 것으로 생각된다.

실시예 9: 마우스 배아 줄기 세포 유래의 정제된 심근 세포의 평면 접착 배양 시스템에서의 무혈청 및 bFGF 의 작용

실시예 1에 따라, 마우스 배아 줄기 세포 유래 심근 세포를 정제하였다. 이 정제한 심근 세포를 피브로넥틴으로 코팅한 세포 배양용 디쉬에 동일 갯수로 세포를 파종하고, 각종 배양 배지를 사용하여 평면 접착 배양하였다. 각종 배양 배지는, 모두 기초 배지에 α-MEM을 사용하고, 10% FBS, 10% FBS + 50 ng/ml bFGF, 10% KSR(Knockout Serum Replacement: Invitrogen), ITS, ITS + 50 ng/ml bFGF를 첨가한 것이다. 이들 조건에서 파종한 세포를 총 5일간 배양한 후, 각각 사진 촬영하였다(도 8A). 그 결과, 무혈청 ITS, ITS + bFGF 군은 10% FBS 첨가군 또는 10% KSR 첨가군에 비해 유의하게 세포 생존율이 낮았다(도 8B).

실시예 10: 마우스 배아 줄기 세포 유래의 정제된 심근 세포의 면역 부전 마우스 심근 조직내 이식 및 생착율 계측

먼저, 재응집법을 적용하지 않는 경우 마우스 배아 줄기 세포 유래의 정제된 심근 세포의 생존율을 계측하기 위하여, 이하의 실험을 행하였다.

총 2 x 10⁵ 세포를 면역 부전 마우스(NOD-SCID)의 좌심실 자유벽(ventricular free wall)에 이식하였다. 마우스를 에테르로 마취하고, 2% 이소플루란이 포함된 공기를 인공 호흡기를 통해 지속적으로 처치하였다. 마우스를 깊은 마취하에서 개흉하고(제3 늑간), 심낭을 핀셋으로 찢어, 심장을 노출시켰다. 30G의 바늘이 부착된 시린지로 심근 세포괴가 포함된 생리 식염수 30 ㎕를 주입하였다. 주사 바늘을 심첨부에서 심장 자유벽을 통과해 심기부 쪽으로 3 mm 정도 밀어 주입하였다. 이식 후 신속하게 폐흉하고, 자율 박동의 회복을 기다린 후 케이지로 돌려보냈다.

이식 3주 후, 심장을 관류 고정하여, 동결 절편을 제조하였다. 절편을 항-사르코메릭 액티닌 항체로 면역 염색하고, 형광 현미경 이미지를 수득하였다(도 9A). 그 결과, 생존하는 이식 세포는 거의 발견되지 않았으며, 트레이서인 적색 색소 반응만 겨우 발견할 수 있었다(도 9A, 도 9D).

다음으로, 실시예 7에 기재된 무혈청 조건에서 구축한 2000개의 세포로 이루어지는 심근 세포괴를 총 2 x 10⁵세포로 면역 부전 마우스(NOD-SCID)의 좌심실 자유벽에 이식하였다. 상기 실험과 동일하게, 이식하고, 이식 3주 후 심장을 관류 고정하여, 동결 절편을 제조하였다. 절편을 항-사르코메릭 액티닌 항체로 면역 염색하고, 형광 현미경 이미지를 수득하였다(도 10). 형광 현미경 이미지에서 하나의 세포괴에 포함된 숙주 심장 조직에 생착시킨 세포수를 카운트하였다.

그 결과, 이식한 세포괴가 정확하게 2000개의 심근 세포로 이루어지도록 한 경우, 92.05 ± 11.1%의 심근 세포가 생착된 것으로 확인되었다(n=4)(도 11(A) 및 (B)). 반면, 흩어지게 분산시켜 정제한 세포를 그대로 주입한 경우에는, 생착 세포를 발견할 수 없었다. 이러한 결과는, 이식 후 생착율이 0%에서 92%로 극적으로 향상됨을 의미한다.

또한, 장기 이식에서의 심근 세포의 변화를 확인하기 위해, 이식 후 3주, 8주에 심장의 면역 염색 조사를 행하였다. 그 결과, 이식 전 심근 세포(도 11(C)의"Pre")와 비교하여, 이식 후 3주, 8주에는, 심근 세포의 세포질 체적이 현저하게 증가하였으며, 이식된 심근 세포는 숙주의 심근 세포와 동일한 방향으로 나란히 존재되었다(도 11(C) 및 (D)). 이는, 이식된 심근 세포괴가 이식된 심장 조직 내에서 성숙되었음을 의미한다.

실시예 11: 마모셋 배아 줄기 세포 유래의 정제된 심근 세포를 이용한 세포 괴의 제조

본 실시예는, 무혈청 또는 무혈청에 ITS 또는 KSR를 첨가한 조건에서 마모셋배아 줄기 세포 유래의 정제된 심근 세포괴를 제조하기 위한 것이다.

즉, 무혈청 배지(도 12A) 또는 무혈청 배지에 10% KSR(도 12B) 또는 ITS(도 12C)를 사용하는 점을 제외하고는, 실시예 3에 따라 마모셋 배아 줄기 세포 유래의 정제된 심근 세포괴를 제조하였다. 배양 개시 후 12시간 또는 3일 후에 구축된 세포괴는 도 12에 나타낸다.

실시예 12: 마모셋 배아 줄기 세포 유래의 정제된 심근 세포괴를 이용하여, 두께를 가진 세포 시트의 구축

실시예 11에서 제조한 마모셋 배아 줄기 세포 유래의 정제된 심근 세포괴를, 동일 평면형에서 부유 배양하였다. 이 부유 배양한 심근 세포괴는 0∼12시간 동안에 시간 경과에 따라 세포괴끼리 접합되어, 두께를 가진 세포 시트로 구축되었다. 이 실시예는 방법의 실증을 목표로 한 모델 실험으로서, 실제 응용 형태에서는, 임의의 크기를 가지는 정제 배아 줄기 세포 유래 심근 세포괴를 임의 갯수로 사용하여, 임의 크기의 세포 시트를 구축할 수 있다(도 13). 또한, 사용하는 세포괴의 크기에 따라, 임의의 두께의 세포 시트를 만들 수 있다.

실시예 13: 인간 배아 줄기 세포 유래 심근 세포의, 면역 부전 마우스 심장으로의 이식

본 실시예는, 인간 배아 줄기 세포로부터 심근 세포를 분화시키고, 이와 같이 제조한 심근 세포괴의 심장 조직내 생착 능력 여부를 조사하기 위한 목적으로 실험을 수행하였다.

인간 배아 줄기 세포는, 쿄토 대학 재생 의과학연구소 부속 줄기세포 의학 연구 센터(내셔널 바이오 자원 프로젝트에 의한 배아 줄기 세포 센터)로부터 입수하였다.

상기 인간 배아 줄기 세포를, 미토마이신 C 처리를 처리하여 증식 불활성화한 마우스 배아 섬유모세포(mouse embryonic fibro blast; MEF)를 사용하여, 미분화가 유지되도록 배양하였다. 배양 배지는, F12/DMEM(1:1)(SIGMA, 제품 번호 D6421), 20% KO-SERUM(GIBCO), 1.6 mM L-글루타민, 0.1 mM 비필수 아미노산(MEM, 0.1 mM β-머캅토에탄올(2-ME; Sigma), 100 IU/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 황산 스트렙토마이신, 및 재조합 인간 염기성 섬유모세포 증식 인자(bFGF; Peprotech) 조성의 배양 배지를 사용하였다. 연속 계대를 위해, 0.1% III형 콜라게나제(Wortington)를 37℃에서 10분 처리하여, 배아 줄기 세포 콜로니를 분리하였다.

이어, MEF과 배아 줄기 세포를 분리하기 위해, 기공 크기 40 ㎛의 메쉬에서 통과되지 못한 비통과 세포괴를 취득하였다. 이 세포괴가 바로 순수한 배아 줄기 세포괴이다. 분화에서는, EB 당 50∼1000개의 배아 줄기 세포괴를 세포 비접착성 박테리아 디쉬(아사히 테크노 글래스: 멸균 샬레) 상에 배상체로 총 15∼30일간 배양하여, 심근 세포를 포함하는 배상체로 분화시켰다. 이 때 사용 배지는 본 실시예의 상기 배양 배지에서 bFGF를 제외한 배지(즉, F12/DMEM(1:1)(SIGMA, 제품 번호 D6421), 20% KO-SERUM(GIBCO), 1.6 mM L-글루타민, 0.1 mM 비필수 아미노산(MEM, 0.1 mM β머캅토 에탄올(2-ME; Sigma, 100 IU/ml 페니실린, 및 100 ㎍/ml 황산 스트렙토마이신)이다.

실시예 1에 따라, 인간 배아 줄기 세포 유래 심근 세포를 정제하였다. 이어서, 실시예 8의 결과에 따라, 인슐린 1 ㎍/ml 및 bFGF 1 ng/ml은 포함하지만 혈청은 포함하지 않는 α-MEM 용액을 사용하여, 정제 심근 세포 1000개를 포함하는 세포괴를 제조하였다(도 14 참조).

또한, 실시예 10에 따라, 면역 부전 마우스 심장 조직에 이식하였다. 이식 22주 후, 실시예 10에 따라 동결 절편을 제조하였다. 이같이 하여 제조한 절편을 Nkx2.5 및 항-사르코메릭 액티닌 항체로 면역 염색하고, 형광 현미경 이미지를 수득하였다.

이식 세포의 트레이스에 사용한 적색 색소로 염색된 세포괴가 확인되었다. 이 절편은 Nkx2.5 및 항-사르코메릭 액티닌 항체로 면역 검출을 실시하였다. 그 결과는 도 15에 나타낸다.

이식 세포는 트레이스 색소로 염색되었으며, 전체적으로 적색이 강하게 나타났다. 또한, 액티닌의 면역 염색에 의해, 횡문의 염색도 나타났다. 또한, 심근 세포 마커인 Nkx2.5는, 이식 심근 세포의 핵내에서 강하게 나타나는 것으로 확인되었다. 이는, 유약한 심근 세포의 특유 현상이다. 또한, 인간 배아 줄기 세포로부터 유래된 심근 세포의 핵은 주변 마우스 심근 세포에 비해 커서, 구별할 수 있었다(도 15).

또한, 이식 5주 후에 실시예 10에 따라, 동결 절편을 제조하였다. 이식 세포의 트레이스에 사용한 적색 색소에 염색된 세포괴가 확인되었다(도 16). 이와 같이 하여 제조한 절편을, Nkx2.5(물색) 및 항-사르코메릭 액티닌 항체(녹색)나 Nkx2.5(물색) 및 항-인간 핵 항원(녹색: 마우스핵 내에는 존재하지 않는, 영장류에만 존재하는 항화원과 결합함)으로 면역 염색하고, 형광 현미경 이미지를 수득하였다. 그 결과는 도 17, 18에 나타낸다. 이식 세포에서, 미토콘드리아는 트레이서 색소로 염색되었고, 점형으로서 적색 색소가 검출되었다. 액티닌의 면역 염색에 의해, 횡문이 염색된 경우도 확인되었다(도 17). 또, 동일한 영역을 구성하고 있는 세포 집단이 인간 세포 유래인 것을 확인하기 위해, 항-인간 항체를 사용하여 검출한 결과, 역시 이식된 세포는 인간 세포였으며, 또한, Nkx2.5에도 염색되는 심근 세포라는 것이 입증되었다(도 18).

실시예 14: 마우스 유도된 만능 줄기 세포( iPS ) 유래의 정제된 심근 세포로 세포괴의 제조

본 실시예는, 무혈청 조건 또는 무혈청 조건하에서 ITS 또는 KSR를 첨가한 조건에서, 마우스 iPS 세포 유래의 정제된 심근 세포괴를 제조하기 위해 실시하였다.

마우스 iPS 세포는 쿄토 대학 재생 의과학연구소로부터 양도받았다. 마우스 iPS 세포의 심근 세포 분화를 실시예 1에서와 같이 수행하였다. 이 때, 하나의 배상체를 구성하는 초기 세포수는 1000개가 최적이다.

도 19(A)는 정제하기 위해 미토콘드리아 지시약인 TMRM을 사용하여 FACS를 분석한 결과이다. 도에서 사각은 심근 세포의 영역을 나타낸다. 이렇게 정제한 심근 세포를 접착 배양하고, 면역 염색(액티닌, Nkx2.5)한 결과는 도 19(B)에 나타낸다. 마우스 iPS-유도 심근 세포의 응집된 세포괴가 형성되는 것으로 나타나, FACS로 세포 분획에 대략 100%의 심근 세포가 포함되는 것으로 확인되었다. 또한, 도 19(C)는 정제된 심근 세포를 세포 비접착성 96웰 배양 디쉬에 파종한 다음 24시간 이후의 상태를 나타낸 것이다. 이 경우에는 무혈청 배지를 사용하였다. 그 결과, 마우스 iPS 세포 유래의 정제된 심근 세포도 본 방법의 방법에 따라 세포괴를 구축할 수 있다는 것을 알 수 있었다.

실시예 15: 인간 배아 줄기 세포 유래의 심근 세포로 세포괴를 형성하는데 있어 최적 배지 조성

실시예 7에서 무혈청 조건에 ITS 및 bFGF를 첨가한 배지가 마우스 유래 세포에 대한 보호 작용이 강력하고, 심근 세포 증식을 유도하는 특이한 특성을 발휘하는 것으로 밝혀진 바, 본 실시예에서는 인간 ES 세포 유래의 심근 세포에서의 bFGF의 유효성을 확인하고, 그 유효성을 보다 구체적으로 다른 증식 인자와 비교하기 위한 목적으로 실험을 수행하였다.

기본적으로는, 배양 배지로서 α-MEM + ITS를 사용하였다. 이 기초 배지에, 25 ng/ml bFGF(Peprotech, Inc., RockyHill, NJ, USA), 25 ng/ml 산성 FGF(aFGF), 25 ng/ml FGF-4, 20 ng/ml 케라티노사이트 성장 인자(keratinocyte growth factor; KGF, 10O ng/ml 줄기세포 인자(stem cell factor; SCF), 10O ng/ml 혈관내피 증식 인자(vascular endotherial growth factor; VEGF), 10 ng/ml 백혈병 억제 인자(LIF)(Millipore Corporation, Billerica, MA, USA), 100 ng/ml 신경교 세포주 유래 신경 영양 인자(glial cell line-derived neurotrophic factor; GDNF), 20 ng/ml 간세포 성장 인자(HGF), 10 ng/ml 인슐린 유사 성장 인자(IGF)-1, 10O ng/ml 표피 세포 증식 인자(EGF), 1 x 10^-7M 엔도텔린-1(ET-1), 10 ng/ml 혈소판 유래 성장 인자(PDGF)-AA 또는 10O ng/ml(PDGF)-BB(상기에 입수처에 대한 기재가 없는 것은 모두 R&D systems 사에서 구입)를 첨가하여, 배양하고, 응집괴를 제조하였다.

응집괴 제조 후, 3일, 8일, 25일, 40일 후의 세포괴의 직경을 계측하였다. 그 결과, 모든 측정일에서도 bFGF를 첨가한 세포괴의 크기가 가장 큰 것으로 확인되었다(도 20A). 또한, 이러한 보호 작용은 40일간의 장기간 동안 계속되는 것을 알 수 있었다. 또한, bFGF 대신 배양액에 전술한 다양한 물질 중 어느 하나를 첨가하여 세포괴 형성 효과를 조사한 결과, bFGF에는 못 미치지만, EGF, PDGF-BB, ET-1이 유효성이 있는 것으로 판명되었다(도 20B).

이로부터, 인간 ES 세포 유래 심근 세포의 분화에서도, bFGF는 무혈청 조건하에서 세포 보호·증진 촉진 활성을 보이며, 다른 증식 인자에 비해 이러한 작용이 가장 강한 것으로 판명되었다.

또한, 이식 후 숙주 심장내에서, 이식된 심근 세포를 성숙시킬 수 있는 메카니즘을 규명하기 위해, 본 실시예에서 나타낸 bFGF, EGF, PDGF-BB, ET-1의, 숙주 심장 내 유전자 발현 유무를, 실시간 PCR(Aplied biosystems)로 확인하였다. 각각의 프라이머, 프로브는 Applied Biosystems(TaqMan gene expression assays)로부터 구입하였고, 상세하게는 bFGF(Mm0128715_m1), EGF(Mm01316967_ml), PDGF-BB(Mm01298577_m1), ET-1(Mm01351840_g1)을 사용하였다. 분석 시약과 조작 방법은, Applied Biosystems의 사용 설명서에 따라 행하였다. 그 결과, 숙주 심장에서, 상기 유전자들이 발현되고 있는 것으로 판명되었다(도 21).

본 실시예의 결과로부터, 심장에 이식한 심근 세포괴는 생존하며, 성숙에 필요한 증식 인자군은 숙주의 심장으로부터 공급받는 것으로 시사되었다.

Claims

만능 줄기 세포로부터 분화, 유도되어, 단일 세포화된 심근 세포를, 세포 비접착성의 둥근 바닥 웰 플레이트 상의 무혈청 조건의 배지에서 배양하고, 상기 세포를 응집시켜 세포괴를 얻는 것을 포함하는, 만능 줄기 세포 유래의 심근 세포의 세포괴를 제조하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 만능 줄기 세포가 배아 줄기 세포, 배아 생식 줄기 세포, 생식 줄기 세포 및 유도된 만능 줄기 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 방법.
제1항에 있어서,
상기 배지가 인슐린을 포함하는 무혈청 조건의 배지인, 방법.
제1항에 있어서,
상기 배지가 트랜스페린, 셀레늄, 염기성 섬유아세포 증식 인자(bFGF), 상피 세포 증식 인자(EGF), 혈소판 유래 성장 인자-BB(PDGF-BB) 및 엔도텔린-1(ET-1)으로 이루어진 물질 군으로부터 선택되는 1종 이상의 물질을 포함하는 무혈청 조건의 배지인, 방법.
제4항에 있어서,
상기 배지내 함유량이 인슐린 0.1∼10 mg/L, 트랜스페린 O.1∼10 ㎍/L, 셀레늄 0.1∼10 ㎍/L, 염기성 섬유아세포 증식 인자 1 ng/ml∼100 ng/ml, 상피 세포 증식 인자 1 ng/ml∼10OO ng/ml, 혈소판 유래 성장 인자 1 ng/ml∼10OO ng/ml, 엔도텔린-1(ET-1) 1x10^-8∼1x10^-6M인, 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 제조되는 만능 줄기 세포 유래의 심근 세포의 세포괴를 포함하는 심장 질환 치료용 조성물로서, 상기 심근 세포의 세포괴는 심장 조직에 이식되어 생착되는, 심장 질환 치료용 조성물.
제6항에 있어서,
심장 조직 내에 주입하기 위한 세포괴를 포함하는, 심장 질환 치료용 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 제조되는 만능 줄기 세포 유래의 심근 세포의 세포괴를, 벽면에 의해 분할된 세포 비접착성 용기의 표면에 세포괴끼리 연속 접촉하도록 간극 없이 배열하여 파종하고;
부유 배양하고;
세포괴끼리 접합하여 50∼300㎛ 사이의 임의의 두께를 가지는 시트형으로 될 때까지 상기 배양을 실시하는 것
을 포함하는, 시트형 세포괴의 제조 방법.
제8항에 기재된 방법에 의해 제조된 시트형 세포괴를 포함하는 심장 질환 치료용 조성물로서, 상기 심근 세포의 세포괴는 심장 조직에 이식되어 생착되는, 심장 질환 치료용 조성물.
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