CN107630027B

CN107630027B - 一种过表达pcnp基因的药物的制备及用途

Info

Publication number: CN107630027B
Application number: CN201710824523.1A
Authority: CN
Inventors: 吴东栋; 李涛; 高荧苒; 王大勇; 陆丹; 刘诗语; 洪亚; 魏建设; 姬新颖
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2017-09-14
Filing date: 2017-09-14
Publication date: 2021-02-26
Anticipated expiration: 2037-09-14
Also published as: CN107630027A

Abstract

本发明提供了一种过表达PCNP基因的药物的制备及用途。该药物包括过表达PCNP基因的质粒以及过表达PCNP基因获得的PCNP蛋白。所述过表达PCNP基因的质粒的构建方法，其包括以下步骤：根据PCNP基因序列，设计引物，PCR扩增目的基因；对GV230载体中的限制性酶切位点Xho I和Kpn I进行酶切，形成线性化GV230载体；将目的基因与线性化GV230载体进行连接构建GV230‑PCNP载体，即为过表达PCNP基因的质粒。将过表达PCNP基因的药物用于人神经母细胞瘤中时，过表达人神经母细胞瘤中PCNP基因后，可促进细胞凋亡，抑制细胞生长；抑制细胞迁移；抑制人神经母细胞瘤的生长。

Description

一种过表达PCNP基因的药物的制备及用途

技术领域

本申请属于生物制药技术领域，具体涉及一种过表达PCNP基因的药物的制备及用途。

背景技术

神经母细胞瘤(neuroblastoma，NB)属胚胎性肿瘤，多位于大脑半球，是儿童最常见的颅外肿瘤，是婴幼儿最常见的肿瘤。有将近一半的神经母细胞瘤发生在2岁以内的婴幼儿。神经母细胞瘤约占6-10％的儿童肿瘤，15％的儿童肿瘤死亡率。

PCNP(PEST-containing nuclear protein)是一种新近发现的含有PEST序列的核蛋白，PCNP作为泛素连接酶NIRF(Np95/ICBP90-like RING figer protein)的底物首次于2004年由日本科学家侧面报道，PCNP和NIRF一起构成一种新的信号转导通路，与细胞周期的调控和细胞增殖有密切关系。PCNP主要存在细胞核内，这种新型的指环状蛋白是一种具有泛素化能力的蛋白连接酶，参与到蛋白降解的泛素化途径中。目前关于PCNP的相关报道较少，但关于PEST结构域的研究相对较多，PEST domin对于细胞周期和增殖具有调控作用，并且和染色体的稳定、肿瘤的发生以及免疫系统疾病有关。

另有实验表明，PCNP在多种肿瘤组织中的表达显著高于癌旁组织和正常对照组织。因而关于PCNP与肿瘤的相关性尚待进一步研究，而关于调节PCNP过表达在肿瘤治疗中的作用更是缺乏相关的研究报道。

发明内容

基于上述现有技术中的缺陷，本发明的目的在于提供一种过表达PCNP基因的药物的制备及用途，该药物用于人神经母细胞瘤中，能够促进细胞凋亡，抑制肿瘤细胞的生长。

本发明的目的通过以下技术方案得以实现：

一方面，本发明提供一种过表达PCNP基因的质粒的构建方法，其包括以下步骤；

根据PCNP基因序列(NM_020357)，设计引物，PCR扩增目的基因；

对GV230载体中的限制性酶切位点Xho I和Kpn I进行酶切，形成线性化GV230载体；

将目的基因与线性化GV230载体进行连接构建GV230-PCNP载体，即为过表达PCNP基因的质粒。

上述过表达PCNP基因的质粒的构建方法中，优选地，PCR扩增目的基因的引物序列为：

正向引物：

5’-TACCGGACTCAGATCTCGAGCGCCACCATGGCGGACGGGAAGGCGGGAGAC-3’(如SEQ IDNO：1所示)；

反向引物：

5’-GATCCCGGGCCCGCGGTACCGTATTGTCTTGGTCATGGACATTTC-3’(如SEQ ID NO：2所示)。

上述过表达PCNP基因的质粒的构建方法中，优选地，所述GV230载体的载体顺序为CMV-MCS-EGFP-SV40-Neomycin。

上述过表达PCNP基因的质粒的构建方法中，优选地，对构建的GV230-PCNP载体还包括对PCNP基因进行正确性鉴定，其步骤如下：

对GV230-PCNP载体设计引物，扩增PCNP基因，进行琼脂糖凝胶电泳PCR鉴定；

阳性克隆测序，鉴定GV230-PCNP载体中PCNP基因的正确性。

上述过表达PCNP基因的质粒的构建方法中，优选地，对GV230-PCNP载体设计引物的引物序列为：

正向引物：5’-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3’(如SEQ ID NO：3所示)；

反向引物：5’-CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG-3’(如SEQ ID NO：4所示)。

另一方面，本发明还提供一种过表达PCNP基因的药物，所述药物包括上述的过表达PCNP基因的质粒以及该质粒过表达上述PCNP基因获得的PCNP蛋白。

上述“过表达PCNP基因的质粒”指该质粒具备过表达PCNP基因的能力，转染人神经母细胞瘤细胞后能够过表达PCNP基因。

再一方面，本发明还提供上述过表达PCNP基因的质粒在制备治疗人神经母细胞瘤的药物中的应用。

上述应用中，优选地，将所述过表达PCNP基因的质粒作为制备治疗人神经母细胞瘤的药物转染入人神经母细胞瘤细胞中，然后加入遗传霉素G418，培养获得稳定转染细胞株。

上述应用中，优选地，所述遗传霉素G418的浓度为600μg/mL。

上述应用中，优选地，所述人神经母细胞瘤细胞包括人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y和/或人神经母细胞瘤细胞系SK-N-SH。

本发明提供的过表达PCNP基因的药物用于人神经母细胞瘤中时，通过TUNEL法及EDU法检测发现，过表达人神经母细胞瘤中PCNP基因后，可促进细胞凋亡，抑制细胞生长；通过transwell法及invasion法检测时，过表达人神经母细胞瘤中PCNP基因后，可抑制细胞迁移；通过裸鼠成瘤实验表明，过表达人神经母细胞瘤中PCNP基因能够抑制人神经母细胞瘤的生长。

附图说明

图1为过表达PCNP基因的质粒转染人神经母细胞瘤细胞后，PCNP基因及其蛋白表达检测结果图(其中：control为野生型细胞，Mock为阴性对照组细胞，PCNP为基因过表达组细胞；图1中的A为实时荧光定量PCR检测PCNP的mRNA在人神经母细胞瘤细胞中的相对表达量，其中野生型细胞中PCNP的mRNA表达量假设为1，结果为PCNP基因过表达细胞和阴性对照细胞相对于野生型细胞中PCNP的表达倍数；图1中的B为Western blot检测肿瘤细胞中PCNP的蛋白表达水平结果)；

图2为过表达PCNP基因对人神经母细胞瘤细胞增殖的影响结果图(其中：Mock为阴性对照组，PCNP为基因过表达组；图2中的A为采用MTS法时PCNP过表达对人神经母细胞瘤细胞增殖的影响；图2中的B为EDU法检测时，PCNP过表达对人神经母细胞瘤细胞增殖的影响)；

图3为TUNEL法检测时，过表达PCNP基因对人神经母细胞瘤细胞凋亡的影响结果图(其中：Mock为阴性对照组；PCNP为基因过表达组)；

图4为过表达PCNP基因对人神经母细胞瘤细胞迁移和侵袭的影响结果图(其中：Mock为阴性对照组，PCNP为基因过表达组；图4中的A为transwell法检测时，过表达PCNP基因对人神经母细胞瘤细胞迁移的影响；图4中的B为invasion法检测时，过表达PCNP基因对人神经母细胞瘤细胞侵袭的影响)；

图5为裸鼠成瘤实验时，过表达PCNP基因对人神经母细胞瘤细胞生长的影响结果图(其中Mock为阴性对照组；PCNP为基因过表达组；图5中的A为人神经母细胞瘤在裸鼠腋下注射后4周将肿瘤取出图；图5中的B为4周内肿瘤体积变化趋势；图C为肿瘤的重量；图D为抑瘤率)。

具体实施方式

为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。

下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。介绍具体实施例前，对本发明所用到的主要仪器设备及实验试剂简要介绍如下。

主要试剂、药品及样品：

人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y、SK-N-SH购自南京科佰生物技术有限公司。

转染试剂Lipofectamine 3000购自Thermo Fisher公司；

遗传霉素G418购自索莱宝公司；

MTS购自美国Sigma公司；

细胞增殖检测试剂盒购自锐博生物科技有限公司；

细胞凋亡检测试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；

Transwell小室购自Corning公司；

GV230载体、质粒由上海吉凯基因化学技术有限公司提供；

其余未说明试剂、药品等均为实验室常用分析纯类制品，不再赘述。

主要仪器设备：

实时定量PCR仪(型号：ABI 7500FAST)，为美国Applied Biosystems公司产品；

荧光倒置显微镜(型号：ECLIPSE Ti)，购自Nikon公司。

实施例1

本实施例提供一种过表达PCNP基因的质粒的构建方法，其包括以下步骤：

1、首先依据PCNP基因序列(NM_020357)，设计引物，用于PCR扩增目的基因，具体序列如下：

正向引物：

反向引物：

对GV230载体(载体顺序：CMV-MCS-EGFP-SV40-Neomycin)中的限制性酶切位点XhoI和Kpn I进行酶切，形成线性化GV230载体；

2、目的基因片段的获取

将金唯智生物科技(北京)有限公司合成提供的引物分别用双蒸水溶解，制备成浓度为100μM的溶液，50μL反应体系设计如下：

5×PS Buffer，10μL；

dNTP Mix(2.5mM each)，4μL；

上游扩增引物(10μM)，1μL；

下游扩增引物(10μM)，1μL；

模板(10ng/μL)，1μL；

PrimeSTAR HS DNA polymerase，0.5μL；

ddH₂O加至50μL

PCR反应条件：

(1)98℃、5min；

(2)98℃、10sec；

(3)55℃、10sec；

(4)72℃、90sec；

(5)返回(2)循环30次；

(6)72℃、8min；

(7)4℃、10min。

3、连接构建GV230-PCNP载体

将步骤(1)回收的酶切产物与步骤(2)回收的PCR扩增产物配制如下反应体系：

5×CE II Buffer，2μL；

酶切后的载体DNA，2.5μL；

纯化后的PCR产物片段，1μL；

Exnase^TMII，1μL；

ddH₂O加至10μL

一般而言，对所构建的GV230-PCNP载体尚需进一步进行转化鉴定并测序验证后才能进一步应用。

对GV230-PCNP载体设计引物的引物序列为：

正向引物：5’-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3’(如SEQ ID NO：3所示)；

反向引物：5’-CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG-3’(如SEQ ID NO：4所示)。

阳性克隆测序，鉴定GV230-PCNP载体中PCNP基因的正确性。

转化鉴定采用DH5α感受态细胞，具体过程如下：

首先从-80℃冰箱取E.coli DH5α感受态细胞，置于冰上，冰浴20min；然后从-20℃吸取质粒2μL，加50μL感受态细胞，混匀移至1.5mL EP管，冰浴30min；

将EP管在42℃热激90s，注意不要摇动离心管，然后快速转至冰浴2min；

向上述EP管加入950μL不含抗生素的LB培养基，混匀后放入37℃，220rpm恒温摇床中，振荡培养1小时，使细菌复苏；

取50μL左右涂布于含有卡那霉素(100μg/mL)的LB固体培养基上，37℃倒置培养16小时，第二天早上收板，4℃保存；

挑取单一菌落移至5mL的LB培养基(含卡那霉素5μL)，37℃，220rpm振荡培养16小时；

从每块平板上挑取3个菌落，分别接种到含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃培养16小时；培养结束后碱裂解法抽提质粒并进行测序验证。

对测序正确的质粒重新转化至感受态细胞DH5α中，采用高纯度质粒中量抽提试剂盒抽提质粒备用，该质粒即为过表达PCNP基因的质粒。

实施例2

本实施例提供上述实施例所制备的过表达PCNP基因的质粒在制备治疗人神经母细胞瘤的药物中的应用。将该过表达PCNP基因的质粒作为制备治疗人神经母细胞瘤的药物转染入人神经母细胞瘤细胞中，通过G418筛选得到稳定株，最终过表达PCNP基因，具体操作过程介绍如下：

1、首先确定最优遗传霉素G418浓度，即能够完全杀死细胞的最低G418浓度，具体为：

消化人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y、SK-N-SH，并接种于96孔培养板，接种量为1×104个/孔；

肿瘤细胞接种于96孔培养板后，第二天每孔分别加入100μL含有G418的培养基，G418梯度设置，具体为：100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL、600μg/mL、700μg/mL、800μg/mL、900μg/mL、1mg/mL；

加入含有G418的培养基后，定期观察细胞培养情况，获得能够完全杀死细胞的最低G418浓度；

结果表明，针对上述2种人神经母细胞瘤细胞系，最优G418浓度均为600μg/mL。

2、利用实施例1所制备的过表达PCNP基因的质粒转染细胞，具体过程为：

分别消化上述2种人神经母细胞瘤细胞系，并接种6孔培养板，接种量3×10⁵个/孔，接种后置于5％CO₂、37℃培养箱内过夜；

第二天转染前，将完全培养基换成DMEM基础培养基；

取一个EP管作为A管，加入100μL Optimem，然后加入3.75μL lip3000，轻轻混匀；

另取一EP管作为B管，加入100μL Optimem，然后加入2.5μg质粒，再加5μL P3000，混匀；

将B管的液体加入A管混匀，孵育5min；

从培养箱内取出已接种细胞的6孔培养板，每孔分别加入上述混合物；

轻轻摇晃混匀溶液，放入培养箱内继续培养，6小时后换成完全培养基继续培养；

48h后向瞬转的PCNP过表达及过表达对照质粒的细胞中加600μg/mL的G418，以后每3天换一次液，以去除被G418杀死的肿瘤细胞，在显微镜下观察转染效果，直至未转染细胞全部杀死，转染细胞不断增殖铺满整个孔板底面，并在荧光显微镜下可见绿色荧光表达即得到稳定株。

对上述肿瘤细胞中PCNP基因的过表达效果进行客观评价，可对肿瘤细胞中PCNP蛋白表达进行蛋白表达水平检验，具体过程简要介绍如下：

(1)PCNP基因表达水平检测

分别提取肿瘤细胞的野生型(即空白对照)、阴性对照和过表达PCNP基因后肿瘤细胞中的总RNA，反转录成cDNA，进行实时荧光定量PCR检测，检测时以β-actin作为参考对照：

检测时引物序列设计如下：

PCNP引物(全长产物536bp)：

上游引物：ATAGGATCCAAAATGGCGGACGGGAAGGCG(如SEQ ID NO：5所示)，

下游引物：CCGAAGCTTTTAATTGTCTTGGTCATGGAC(如SEQ ID NO：6所示)；

β-actin引物(扩增产物210bp)：

上游引物：CACTGGCATCGTGATGGA(如SEQ ID NO：7所示)，

下游引物：GGCCATCTCTTGCTCGAA(如SEQ ID NO：8所示)；

20μL反应体系设置如下：

2×SYBR Mixture(withROX)，10μL；

上、下游引物，各0.5μL(10μM)；

cDNA，2μL；

ddH₂O加至20μL；

PCR仪中反应条件如下：95℃、10min；95℃、15s，60℃、1min；共40个循环。

(2)PCNP蛋白表达水平检测

分别提取肿瘤细胞的野生型(即空白对照)、阴性对照和过表达PCNP基因后肿瘤细胞中的总蛋白，对其浓度进行测定后，进行免疫印迹(Western blotting)检测，以确定细胞中PCNP蛋白的表达水平。

PCNP蛋白表达水平检测如图1中的A所示，从图中可以看出，转染后的肿瘤细胞中的PCNP基因表达水平相较于野生型和阴性对照组均有大幅度明显提高；PCNP蛋白表达水平检测如图1中的B所示，从图中可以看出，细胞中的PCNP的蛋白表达水平也较对照组有大幅度明显提高，表明本发明所制备的质粒较好地过表达了肿瘤细胞中的PCNP基因。

实施例3

为了检测上述实施例2中过表达PCNP基因对肿瘤细胞增殖的影响，发明人做了进一步的检测实验，相关过程介绍如下：

1、首先采用MTS法确定PCNP过表达后对肿瘤细胞增殖的影响，具体过程如下：

分别消化计数实施例2中阴性对照及PCNP基因过表达的肿瘤细胞，铺至96孔培养板中，接种量为8×10³个/孔，每组设6个副孔，每孔加入100μL培养基，培养箱中37℃孵育；

24h后，每孔分别加入20μL、5mg/mL的MTS溶液，培养箱中继续培养2h；

然后取出细胞，使用酶标仪490nm处测定各孔的吸光值，根据吸光值计算PCNP过表达对细胞生长的抑制率。

细胞生长抑制率计算公式为；

细胞生长抑制率(％)＝(对照孔OD值-实验孔OD值)/对照孔OD值×100％。

实验结果如图2中的A所示，从图2中的A可以看出，PCNP基因过表达后的肿瘤细胞，细胞增殖生长情况显著低于阴性对照组的肿瘤细胞，可以认为PCNP过表达抑制肿瘤细胞的生长。

(2)采用EDU法确定PCNP过表达后对肿瘤细胞增殖的影响，具体过程如下：

EdU标记(12孔板操作)：用细胞培养基按1000∶1的比例稀释EdU溶液(试剂A)，制备适量50μM EdU培养基；每孔加入300μL 50μM EdU培养基孵育2h，弃培养基；PBS清洗细胞2次，每次5min。

细胞固定化：每孔加入150μL细胞固定液(即含4％多聚甲醛的PBS)室温孵育30min，弃固定液；每孔加入150μL 2mg/mL甘氨酸，脱色摇床孵育5min，弃甘氨酸溶液；每孔加入300μL PBS，清洗1次，5min，弃PBS；(加强)每孔加入100μL渗透剂(0.5％Triton-X 100的PBS)脱色摇床孵育10min，PBS清洗1次，5min。

Apollo染色：每孔加入300μL的1×Apollo染色反应液(一定要按顺序配，现用现配，30min用完)，避光，室温，脱色摇床孵育30min，弃染色反应液；

Apollo染色反应液配制： 1.5mL

去离子水 1407μL

Apollo反应缓冲液(B) 75μL

Apollo催化剂溶液(C) 15μL

Apollo荧光染料溶液(D) 4.5μL

Apollo缓冲添加剂(E) 13.5mg

加入300μL渗透剂(0.5％Triton-X 100的PBS)脱色摇床清洗2次，每次10min，弃渗透剂；(加强)每孔每次加入300μL甲醇清洗1-2次，每次5min，PBS洗1次，每次5min。

DNA染色：用去离子水按100∶1的比例稀释试剂F，制备适量1×Hoechst33342反应液，避光保存；每孔加入300μL1×Hoechst33342反应液，避光，室温，脱色摇床孵育30min，弃染色反应液；每孔每次加入300μLPBS洗3次，每次5min；每孔加300μLPBS保存，拍照，计数细胞增值率。

结果如图2中的B所示。从图中可以看出，PCNP基因过表达的肿瘤细胞其细胞增殖率显著低于对照组肿瘤细胞，这表明在肿瘤细胞中过表达PCNP，可以抑制肿瘤细胞的生长。

实施例4

为检测上述实施例2中过表达PCNP基因对肿瘤细胞凋亡的影响，发明人做了TUNEL检测实验，相关过程介绍如下。

采用TUNEL法确定PCNP过表达后对肿瘤细胞凋亡的影响，具体过程如下：

将细胞消化计数，铺至24孔培养板中，接种量为5×10⁴个/孔，于5％CO₂、37℃培养箱内孵育；

待细胞贴壁12小时后，用PBS将细胞清洗1次；用4％多聚甲醛固定30min；PBS清洗1次；

加入含0.1％Triton-X 100的PBS，冰浴孵育2min；PBS洗2次，配250μL Tunel检测液；10μL TdT酶+240μL荧光标记液；在样品上加50μL Tunel检测液，37℃避光孵育60min；PBS洗3次；

DAPI染色：5％BSA 1∶1000稀释，3min；每孔加200μLPBS保存，荧光显微镜下观察，拍照，计数细胞凋亡率。

结果如图3所示。从图中可以看出，PCNP基因过表达的肿瘤细胞其细胞凋亡率显著高于对照组肿瘤细胞，这表明在肿瘤细胞中过表达PCNP，可以促进肿瘤细胞的凋亡。

实施例5

为检测上述实施例2中过表达PCNP基因对肿瘤细胞迁移的影响，发明人做了transwell检测实验，相关过程介绍如下：

1、采用Transwell法确定PCNP过表达后对肿瘤细胞迁移的影响，具体过程如下：

将小室置于24孔板中，小室下层加入600μL含20％血清的培养基，上层加入200μL不含血清的培养基，每孔4×10⁴个细胞，37℃培养箱内孵育24h；

取出培养板，弃去培养基，每孔加75％酒精固定15min，PBS洗2次；

结晶紫染色10min，自来水冲洗，将结晶紫洗去，用棉签将小室上层擦干净，用刀片轻轻刮下薄膜放于载玻片上，用中性树胶固定，100×镜下拍照。

2、采用Invasion法确定PCNP过表达后对肿瘤细胞侵袭的影响，具体过程如下：

具体操作同(1)，不同的是小室上有基质胶，每孔6×10⁴个细胞。

迁移结果如图4中的A所示，PCNP基因过表达肿瘤细胞与对照组相比，迁移能力明显降低；侵袭结果如图4中的B所示，PCNP过表达后细胞侵袭能力明显降低，因此表明在神经母细胞瘤细胞中过表达PCNP，可以抑制细胞迁移和侵袭。

实施例6

为证明在体内过表达人神经母细胞瘤中PCNP基因能够抑制人神经母细胞瘤的生长，进行了裸鼠成瘤实验，相关过程介绍如下。

采用裸鼠成瘤实验确定PCNP过表达在体内抑制人神经母细胞瘤细胞生长，具体过程如下：

将细胞消化计数，用PBS重悬细胞配制成1×10⁷个/mL的细胞悬液，采用1mL注射器取细胞悬液0.1mL注射于裸鼠腋下；

之后每天测量肿瘤体积，给小鼠称重，观察肿瘤变化，连续测量4周；

4周后将小鼠处死，从腋下取出肿瘤，称重并拍照，计算抑瘤率。

实验结果如图5所示，图5中的A为注射细胞4周后从裸鼠腋下取出的肿瘤图片，可见PCNP过表达后肿瘤体积明显减小；图5中的B为28天内肿瘤体积变化，结果表明与对照相比，PCNP过表达后肿瘤体积增速明显减慢；图5中的C为肿瘤取出后测得的瘤重，PCNP过表达后肿瘤重量明显减轻；图5中的D是根据瘤重统计得出的抑瘤率，可见PCNP过表达对肿瘤形成有明显抑制作用。

综上所述，本发明提供的过表达PCNP基因的药物用于人神经母细胞瘤中时，通过TUNEL法及EDU法检测发现，过表达人神经母细胞瘤中PCNP基因后，可促进细胞凋亡，抑制细胞生长；通过transwell法及invasion法检测时，过表达人神经母细胞瘤中PCNP基因后，可抑制细胞迁移；通过裸鼠成瘤实验表明，过表达人神经母细胞瘤中PCNP基因能够抑制人神经母细胞瘤的生长。