CN110218741A - 采用串联sgRNA同步激活多个猪内源性干细胞因子转录活性的方法 - Google Patents

采用串联sgRNA同步激活多个猪内源性干细胞因子转录活性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种采用串联sgRNA策略同步激活猪多个内源性干细胞因子的方法，首先利用杀稻瘟菌素和潮霉素药物筛选并构建了能稳定表达dCAS‑VP64和MS2‑P65‑HSF1的PK‑15细胞株（PK‑15‑dCas9‑MS2）。分别设计和构建能靶向猪干细胞因子Oct4、Sox2、Klf4、c‑Myc和miR‑302/367启动子的sgRNAs，在上述细胞上进行高活性的sgRNA筛选，将基因转录激活效率最高的5条sgRNA进行串联组合和构建表达载体，将其导入PK‑15‑dCas9‑MS2细胞中，同步激活猪OSKM和miR‑302/367转录活性，该技术对诱导产生猪的iPSC具有潜在的应用价值。

Description

采用串联sgRNA同步激活多个猪内源性干细胞因子转录活性 的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及采用串联sgRNA的策略同步激活多个猪内源性干细胞因子转录活性的方法。
背景技术
2006年8月，Takahashi和Yamanaka最早通过逆转录病毒将鼠源的KLF4、Sox2、Oct-3/4和c-Myc(OSKM)这4个转录因子导入到小鼠的成纤维细胞中(Mouse embryonicfibroblasts cell MEF细胞)，MEF细胞经重编程后产生诱导性多能干细胞(iPSC)。在此基础上，他们将这4个转录因子载体转入到人的皮肤成纤维细胞中，并且成功的诱导出人的iPSC。早期iPSC诱导效率较低且周期长，随着相关技术的不断发展，Anokye-Danso等人发现miR-302/367可以把克隆的数量有效地提高了两个数量级。OSKM和miR-302/367在iPSC诱导过程中有重要作用。研究发现，将人、小鼠或猪的OSKM和miR-302/367基因导入猪的成纤维细胞，可诱导产生人或小鼠样iPSC克隆。但目前猪的iPSC效率低，且外源过表达OSKM和miR-302/367能诱导产生iPSC，但其内源性的干细胞因子表达量均未被有效激活。内源激活多能因子可能是导致培养真正猪的iPSC。
随着CRISPR/Cas9激活系统的开发，特别是Konermann等人构建的CRISPR SAM激活系统，为激活内源靶基因的转录活性提供了新的工具。SAM激活系统包括有dCAS-VP64、MS2-P65-HSF1和sgRNA三个功能元件，其最大特点是需要将三个元件同时导入进一个细胞中才能发挥激活靶基因转录的作用。因此，最佳的方法是采用lenti dCAS-VP64_Blast和lentiMS2-P65-HSF1_Hygro慢病毒感染后，利用杀稻瘟菌素(blasticidin)和潮霉素(hygromycin)药物来筛选出阳性稳定表达dCAS-VP64和MS2-P65-HSF1的细胞，由此可提高sgRNA的激活效率。一方面，建立的lenti dCAS-VP64_Blast和lenti MS2-P65-HSF1_Hygro稳定表达的PK-15细胞可用于开展高通量筛选激活猪内源因子的细胞模型；其次，筛选到的针对OSKM和miR-302/367启动子的高活性sgRNA及串联表达载体，可用于后续诱导产生猪的iPSC。
发明内容
本发明的目的在于提供一种采用串联sgRNA策略同步激活猪多个内源性干细胞因子转录活性的方法，利用blasticidin和hygromycin药物筛选构建了能稳定表达dCAS-VP64和MS2-P65-HSF1的PK-15细胞株，简称PK-15-dCas9-MS2。然后通过双荧光素酶试验检测不同sgRNA靶向激活猪内源干细胞因子(Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc、miR-302/367)启动子的活性水平，将筛选到的激活效率最高的5条sgRNA串联在lenti-sgRNA(MS2)-zeo慢病毒表达载体上，双荧光试验检测发现显著激活猪内源性Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc和miR-302/367的转录活性。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
采用串联sgRNA同步激活多个猪内源性干细胞因子转录活性的方法，包括以下步骤：
(1)构建dCAS-VP64和MS2-P65-HSF1稳定表达的PK-15细胞系：通过慢病毒的感染的方式将包含SAM激活元件的lenti dCAS-VP64_Blast和lenti MS 2-P65-HSF1_Hygro导入PK-15细胞，慢病毒感染2天后，在细胞培养液中同时添加10μg/ml的blasticidin和500μg/ml的hygromycin，用这两种药物筛选6天后，获得同时稳定表达lenti dCAS-VP64_Blast和lenti MS2-P65-HSF1_Hygro的PK-15细胞阳性克隆，简称PK-15-dCas9-MS2细胞；
(2)从核酸数据库中分别调取猪干细胞因子Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc(简称OSKM)和miR-302/367的启动子序列，利用sgRNAcas9软件设计sgRNAs，分别构建sgRNA表达载体后，通过实验在PK-15-dCas9-MS2细胞中进行活性检测，每个靶基因选择一条激活效率最高的sgRNA，将筛选到的活性最高的5条s gRNA(核苷酸序列如SEQ ID NO.1～5所示)组合和串联成SEQ ID NO.6所示的序列，把串联序列连接在lenti sgRNA(MS2)_zeo酶切线性化的表达载体中，测序鉴定成功后再抽提无内毒素质粒，包装为慢病毒后感染PK-15-dCas9-MS2细胞，检测发现可以同步激活猪内源性的Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc、miR-302/367基因的转录。
采用上述步骤(1)所述方法构建的稳定表达dCAS-VP64和MS2-P65-HSF1的PK-15细胞(PK-15-dCas9-MS2)，也可作为构建全基因组CRISPR/Cas9激活文库的细胞模型，用于高通量筛选功能基因。
含有SEQ ID NO.6所述序列的lenti sgRNA(MS2)_zeo表达载体，将靶向激活猪内源干细胞因子(Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc、miR-302/367)启动子的活性最高的5个sgRNA串联表达，为诱导产生猪的iPSC提供了新的方法。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
(1)将靶基因的过表达载体导入细胞中而实现基因表达上调的方法，一方面受到基因片段过大而造成的载体构建和转染效率的影响；另一方面导入的外源基因可能无法激活内源性基因的表达，这不利于特定需求的细胞水平的功能研究。本发明的主要策略在于在猪中利用CRISPR SAM激活系统，为了提高CRISPR激活效率，构建出稳定表达dCAS-VP64和MS2-P65-HSF1的细胞模型。因此，在PK-15-dCas9-MS2的基础上激活猪内源性的目标基因，仅需导入单个的sgRNA即可检测sgRNA的激活效率。构建PK-15-dCas9-MS2细胞系也一定程度提高了sgRNA的激活效率。
(2)针对猪多个干细胞因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc、miR-302/367，利用软件分别针对设计不同靶基因启动子的sgRNA进行活性评估，进而在PK-15-dCas9-MS细胞中筛选出活性相对高的sgRNA，构建串联sgRNA表达载体。发现该载体导入细胞后，可使细胞中的Oct4基因的启动子的转录活性增强1.6倍，Sox2启动子的转录活性增强200倍，Klf4启动子的转录活性增强16倍，c-Myc启动子的转录活性增强500倍，miR-302/367启动子的转录活性增强35倍。该sgRNA串联表达载体可用于激活猪内源性Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc、miR-302/367的转录活性。
附图说明
图1是PK-15细胞对blasticidin敏感性检测(40×)。A：0μg/mL blasticidin 48h后细胞状态；B：6μg/mL blasticidin 48h后细胞状态；C：8μg/mL blasticidin 48h后细胞状态；D：10μg/mL blasticidin 48h后细胞状态。
图2是PK-15细胞对hygromycin敏感性检测(40×)。A：0μg/mL hygromycin72h后细胞状态；B：300μg/mL hygromycin 72h后细胞状态；C：400μg/mL hygromycin 72h后细胞状态；D：5000μg/mL hygromycin 72h后细胞状态。
图3是PK-15-dCas9-MS2克隆样阳性细胞。
图4是PK-15-dCas9-MS2细胞中dCas9和MS2的表达检测图。A：PCR检测(M：DL2000bp)；B：定量检测PK-15-dCas9-MS2细胞和PK细胞中dCas9表达；C：定量检测PK-15-dCas9-MS2细胞和PK细胞中MS2的表达；D：蛋白Western Blot检测PK-15-dCas9-MS2细胞和PK细胞中Cas9蛋白的表达；**P<0.01，*P<0.05。
图5是OSKM、miR-302/367串联质粒模型图和酶切鉴定图。A：Oct4-pGL3表达质粒双酶切；B：Sox2-pGL3表达质粒双酶切；C:Klf4-pGL3表达质粒双酶切；D：c-Myc-pGL3表达质粒双酶切；E：miR-302/367-pGL3表达质粒双酶切。
图6是sgRNAs靶向猪OSKM、miR-302/367示意图。A：Oct4的sgRNAs位点；B：Sox2的sgRNAs位点；C:Klf4的sgRNAs位点；D：c-Myc的sgRNAs位点；E3的sgRNAs位点。
图7是OSKM、miR-302/367单个sgRNA的激活效率。A：Oct4单个sgRNA的激活效率；B：Sox2单个sgRNA的激活效率；C：Klf4单个sgRNA的激活效率；D：c-Myc单个sgRNA的激活效率；E：miR-302/367单个sgRNA的激活效率。
图8是比较OSKM、miR-302/367单个sgRNA和两个sgRNA混合的激活效率。A：比较Oct4单个sgRNA和两个sgRNA的激活效率；B：比较Sox2单个sgRNA和两个sgRNA的激活效率；C：比较Klf4单个sgRNA和两个sgRNA的激活效率；D：比较c-Myc单个sgRNA和两个sgRNA的激活效率；E：比较miR-302/367单个sgRNA和两个sgRNA的激活效率。A：定量检测Oct4两个sgRNA混合激活的相对表达量；B：定量检测Sox2两个sgRNA混合激活的相对表达量；C：定量检测Klf4两个sgRNA混合激活的相对表达量；D：定量检测c-Myc两个sgRNA混合激活的相对表达量；E：定量检测miR-302/367两个sgRNA混合激活的相对表达量。
图9是定量检测两个sgRNA混合激活的相对表达量。A：定量检测Oct4两个sgRNA混合激活的相对表达量；B：定量检测Sox2两个sgRNA混合激活的相对表达量；C：定量检测Klf4两个sgRNA混合激活的相对表达量；D：定量检测c-Myc两个sgRNA混合激活的相对表达量；E：定量检测miR-302/367两个sgRNA混合激活的相对表达量。
图10是串联OSKM、miR-302/367的sgRNA载体模型图和双酶切鉴定图。A：OSKM、miR-302/367串联质粒模型图；B：OSKM、miR-302/367串联质粒酶切鉴定图(M:2000marker)。
图11是双荧光检测串联OSKM、miR-302/367的sgRNA激活效率。A：Oct4的激活效率；B：Sox2的激活效率；C：Klf4的激活效率；D：c-Myc的激活效率；E：miR-302/367的激活效率。
具体实施方式
实施例1.构建和检测dCAS-VP64和MS2-P65-HSF1稳定表达的PK-15细胞系
为了PK-15细胞中稳定表达dCAS-VP64和MS2-P65-HSF1，利用慢病毒的方式导入。包装lenti dCAS-VP64_Blast的慢病毒，慢病毒包装24h前，在10cm培养皿中分别接种适量HEK 293T细胞，于37℃、5％CO2培养箱中培养，诱导培养液为含10％胎牛血清的DMEM。第二天待细胞密度达到80％时，用470μL opti-MEM稀释30μL lipofectamine2000，用opti-MEM培养基稀释24μg质粒DNA，质粒DNA包括PMD2.G 4μg、psPAX 8μg和目的质粒lenti dCAS-VP64_Blast(addgene,#61425)12μg，三者混合静置5min，加到已经换液的10cm皿HEK293T细胞中。转染6h后更换新鲜的DMEM诱导培养液；转染后32h和60h分别回收病毒上清液，上清液经0.45μm的过滤膜处理后，30000rpm，4度离心2h后置于-80℃冰箱中备用。包装lenti MS2-P65-HSF1_Hygro(addgene,#61426)的慢病毒方法同包装lenti dCAS-VP64_Blast的慢病毒。
为了测试采用CRISPR/dCas9策略激活猪内源性干细胞因子的表达水平，针对CRISPR SAM激活系统，lenti dCAS-VP64_Blast和lenti-MS2-P65-HSF1-Hy gro激活质粒中含有blasticidin和hygromycin的抗性片段，通过添加blasticidin和hygromycin可以筛选出阳性的lenti dCAS-VP64_Blast和lenti-MS2-P65-HSF1-Hygro。首先评估PK-15细胞最佳的blasticidin和hygromycin的敏感性，当使用的blasticidin浓度在10μg/ml，48h内可见PK-15细胞基本全部死亡(如图1)，而当使用浓度500μg/ml的Hygro在72h内可发现PK-15细胞基本全部死亡(如图2)，由此可以得出PK-15对blasticidin和hygromycin的敏感性分别为10μg/ml和500μg/ml。用lenti dCAS-VP64_Blast和lenti-MS2-P65-HSF1-Hygro慢病毒同时感染PK-15细胞2天后在培养液中添加10μg/ml blasticidin和500μg/ml h ygromycin的抗生素筛选6天后能获得同时表达lenti dCAS-VP64_Blast和lenti-MS2-P65-HSF1-Hygro的PK-15克隆细胞(如图3)。
分别采用PCR、qRT-PCR和Western blot技术对筛选的阳性克隆进行鉴定。提取克隆细胞的基因组DNA进行PCR检测(引物见表1、反应体系和程序见表2)，PCR扩增用lentidCAS-VP64_Blast、lenti MS2-P65-HSF1_Hygro阳性质粒作为对照模板，水作为阴性对照模板，可以发现PK-15-dCas9-MS2细胞基因组中插入有dCas9和MS2(图4-A)。提取细胞的总RNA，通过定量RT-PCR技术检测(引物见表3、反应体系见表4)发现dCas9和MS2相对高表达(图4-B和4-C)。最后通过Western blot实验检测到候选克隆细胞中有Cas9蛋白表达(图4-D)。表明筛选到的克隆细胞株的基因组中分别插入了dCas9和MS2，且能转录mRNA和翻译为蛋白，可见成功构建了PK-15-dCas9-MS2稳定细胞系。
表1 dCas9和MS2的PCR引物
表2 PCR反应体系和程序
表3实时定量RT-PCR反应体系
表4实时定量PCR反应体系
实施例2.应用PK-15-dCas9-MS2稳定细胞系筛选靶向猪内源性Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc、miR-302/367启动子活性的sgRNA
2.1构建和测序验证猪Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc、miR-302/367启动子双荧光素酶报告基因载体
为了快速评估不同sgRNA靶向激活不同干细胞因子启动子的活性，通过PCR分别扩增了Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc、miR-302/367的一定长度启动子区域(引物见表5)，连接到双荧光素酶载体pGL3-Basic上，分别构建了5个双荧光素酶报告基因表达质粒，且通过测序和限制性双酶切鉴定，分别命名为pGL3-Oct4、pGL3-Sox2、pGL3-Klf4、pGL3-c-Myc。
表5 OSKM、miR-302/367启动子区的PCR引物
注：下划线为Xho I的位点：CTCGAG，HindIII切割位点：AAGCTT酶切位点，加粗部分为保护碱基
2.2设计和构建靶向猪内源干细胞因子的sgRNA表达载体
为了检测采用CRISPR/dCas9策略，激活内源猪Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc(OSKM)四个干细胞因子与miR-302/367的表达水平，利用sgRNAcas9软件(https://sourceforge.net/projects/sgrnacas9/)针对每个靶基因的启动子区域分别设计了6-10条特异sgRNA(图6)。进一步合成sgRNA寡核苷酸序列，构建lenti-sgRNA(MS2)-zeo(addgene,#61427)慢病毒质粒，提取质粒后进行测序，比对发现序列无误。Oct4和c-Myc基因各构建7条sgRNA的质粒，Sox2和Klf4基因各构建6条sgRNA质粒，miR-302/367构建10条sgRNA质粒，结果成功构建了36个靶向猪的OSKM、miR-302/367基因的不同sgRNA慢病毒质粒。
表6设计的sgRNA序列
2.3靶向猪Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc、miR-302/367启动子的不同sgRNA活性检测
利用PK-15-dCas9-MS2稳定表达细胞系，通过双荧光素酶试验检测不同sgRNA靶向激活目标基因启动子的活性水平。(1)将PK-15-dCas9-MS2细胞接种于24孔板中培养板，加入含10％胎牛血清的DMEM诱导培养液，37℃，5％CO2培养，待细胞密度到70％～80％时，更换培养液，PBS洗1～2次，加入500μL 2％FBS诱导培养液，放入培养箱等待转染。(2)转染混合液的配置：21μLbuffer+1μg的sgRNA质粒、1μg双荧光素酶报告质粒+1.6μL的转染试剂jetprime混匀，静止10分钟，分别加入到24孔板中。(3)在37℃的CO2培养箱培养6h后，更换含有血清的新鲜培养基，继续培养。(4)细胞转染24-48h后进行双荧光素酶活性测定，将24孔板中细胞用PBS洗两次，每孔加入现配的100μL 1×PLB，室温下放入摇床温和摇20min。待细胞充分裂解后，将细胞吹打均匀，取10μL细胞裂解液加入酶标板中，利用PerkinElmer公司的VICTORTMX2multilabel PlateReader仪器进行双荧光素酶活性测定。首先加入50μLLARⅡ，混匀，读取萤火虫荧光素酶的值A，然后加入50μL Stop&Glo Reagent，混匀，测定海肾荧光素酶的活性值B。A/B值为双荧光活性。
结果如图7所示，尽管靶向OSKM、miR-302/367启动子sgRNA均有活性，但靶向同一个基因启动子不同位置的sgRNA活性有差别。如靶向Oct4基因启动子的6个sgRNA，其中sgR6_oct4的激活效率最高，其能激活Oct4启动子活性达到13.3倍，依次为sgR5_oct4和sgR7_oct4(图7-A)。而靶向Sox2基因启动子的sg4_sox2的激活效率高达到32倍(图7-B)。靶向Klf4基因启动子的sg4_klf4的激活效率最高，效率为50倍左右，其次为sg3_klf4(图7-C)。靶向c-Myc基因启动子的sg1_c-Myc的激活效率最高，效率为100倍左右(图7-D)。而靶向miR-302/367启动子的sg4_miR-302/367的激活效率最高，激活倍数为55倍(如图7-E)。通过比较靶向同一个基因不同sgRNA，可以筛选具有最高激活效果的sgRNA。结果也表明，靶向启动子不同位点的sgRNA活性不同。
2.4比较同时表达2个sgRNA与单个sgRNA激活干细胞因子启动子活性效率的差异
对分别靶向OSKM和miR-302/367启动子的sgRNA活性排名前二的两个sgRNA，与单独表达激活效率最高的sgRNA进行激活效率比较。(1)将PK-15-dCas9-MS2细胞接种于24孔板中培养，加入含10％胎牛血清的DMEM诱导培养液，37℃，5％CO2培养，待细胞密度到70％～80％时，更换诱导培养液，PBS洗1～2次，加入500μL 2％FBS诱导培养液，放入培养箱等待转染。(2)2个sgRNA混合转染混合液的配置：21μLbuffer+各0.5μg的sgRNA质粒、1μg双荧光素酶报告质粒+1.6μ的转染试剂jetprime混匀，静止10分钟，分别加入到24孔板中。(3)1个sgRNA转染混合液的配置：21μL buffer+1μg的sgRNA质粒、1μg双荧光素酶报告质粒+1.6μL的转染试剂jetprime混匀，静止10分钟，分别加入到24孔板中。(4)在37℃的CO2培养箱培养6h后，更换含有血清的新鲜培养基，继续培养。(5)细胞转染24-48h后进行双荧光素酶活性测定，将24孔板中细胞用PBS洗两次，每孔加入现配的100μL 1×PLB，室温下放入摇床温和摇20min。待细胞充分裂解后，将细胞吹打均匀，取10μL细胞裂解液加入酶标板中，利用PerkinElmer公司的VICTORTMX2multilabel Plate Reader仪器进行双荧光素酶活性测定。首先加入50μL LARⅡ，混匀，读取萤火虫荧光素酶的值A，然后加入50μL Stop&GloReagent，混匀，测定海肾荧光素酶的活性值B。A/B值为双荧光活性。
由图8可见，通过双荧光素酶实验检测发现，无论是单独表达单个sgRNA或同时表达2个sgRNA，均能显著激活靶标基因启动子活性，但是，靶向不同基因或miRNA的sgRNA激活效率有差别。靶向Oct4基因启动子的单个sgRNA的激活效率显著低于同时表达2个sgRNA的激活效率(P<0.05)(如图8-A)。靶向Sox2基因启动子的混合sgRNA的激活效率是单个sgRNA激活启动子活性效率的1.5倍(如图8-B)。而靶向Klf4基因启动子的同时表达2个sgRNA的激活效率略高于单个sgRNA，但差异不明显(如图8-C)。靶向c-Myc启动子的混合sgRNA的激活效率高于单个的sgRNA启动子活性(如图8-D)。靶向miR-302/367启动子的混合sgRNA的激活效率高于单个的sgRNA启动子活性(如图8-E)。2.5同时表达2个sgRNA可显著提高PK-15-dCas9-MS2细胞中靶基因的表达水平
进一步检测同时表达2个sgRNA对内源干细胞因子的转录水平影响。在PK-15-dCas9-MS2细胞中转染靶向OSKM和miR-302/367启动子的sgRNA，分别提取细胞总RNA，利用定量RT-PCR技术检测(定量引物见表7)，结果发现靶向OSKM和miR-302/367启动子的sgRNA，对应的靶基因和miRNA的表达水平均有显著提高(如图9)。靶向Oct4基因启动子的sgRNA，其对应的基因相对表达量极显著增加(P<0.01)，表达量提高3倍左右(如图9-A)。靶向Sox2基因启动子的sgRNA也可以促进该基因表达(P<0.05)，表达量提高了约30倍(如图9-B)。靶向Klf4基因启动子的sgRNA同样可以促进该基因的表达，其相对表达量极显著增加(P<0.01)，提高了约25倍(如图9-C)。靶向c-Myc基因启动子的sgRNA对应的靶基因mRNA的相对表达量极显著增加(P<0.01)，提高了13倍(如图9-D)。而靶向miR-302/367启动子的sgRNA靶基因的相对表达量极显著增加(P<0.01)，但仅提高了约5倍(如图9-E)。实验结果表明，同时表达两个sgRNA可激活内源性靶基因的转录水平，但针对不同靶点激活转录效果不同。
表7实时定量PCR反应体系
实施例3.利用PK-15-dCas9-MS2稳定细胞系和串联sgRNA表达载体可实现同步化激活猪内源性Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc和miR-302/367的转录
为了测试采用CRISPR/dCas9激活策略是否能同时促进细胞内OSKM和miR-302/367的表达，分别把sg6_Oct4、sg4_Sox2、sg4_Klf4、sg1_c-Myc和sg4_miR-302/367串联(序列见序列1)，串联序列由南京金斯瑞合成。把串联序列连接在lenti-sgRNA(MS2)-zeo线性载体。并通过Nhe1和BamH1双酶切实验进行了验证(如图10)。随后，分别在PK-dCas9-MS细胞中转染过表达串联sgRNA和双荧光素启动子活性检测载体，结果发现，靶向Oct4基因启动子的sgRNA活性增强1.6倍左右(如图11-A)，靶向Sox2基因启动子的sgRNA活性增强200倍左右(如图11-B)，靶向Klf4基因启动子的sgRNA活性增强16倍左右(如图11-C)，靶向c-Myc基因启动子的sgRNA活性增强500倍左右(如图11-D)，靶向miR-302/367启动子的sgRNA活性增强35倍左右(如图11-E)。结果显示，串联sgRNA的表达载体可以在PK-15-dCas9-MS细胞株中显著激活OSKM、miR-302/367的转录活性。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 采用串联sgRNA同步激活多个猪内源性干细胞因子转录活性的方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gggggagggg tcggtggggg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcatgcaaaa cccggccgcg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggctcaggcg ctgggtatac 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcccgggttc ccaaagccga 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aaaggcatcc agacccaccc 20
<210> 6
<211> 2091
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ttagctagcg agggcctatt tcccatgatt ccttcatatt tgcatatacg atacaaggct 60
gttagagaga taattggaat taatttgact gtaaacacaa agatattagt acaaaatacg 120
tgacgtagaa agtaataatt tcttgggtag tttgcagttt taaaattatg ttttaaaatg 180
gactatcata tgcttaccgt aacttgaaag tatttcgatt tcttggcttt atatatcttg 240
tggaaaggac gaaacaccgg ggggaggggt cggtgggggg ttttagagct aggccaacat 300
gaggatcacc catgtctgca gggcctagca agttaaaata aggctagtcc gttatcaact 360
tggccaacat gaggatcacc catgtctgca gggccaagtg gcaccgagtc ggtgcttttt 420
ttgggagggc ctatttccca tgattccttc atatttgcat atacgataca aggctgttag 480
agagataatt ggaattaatt tgactgtaaa cacaaagata ttagtacaaa atacgtgacg 540
tagaaagtaa taatttcttg ggtagtttgc agttttaaaa ttatgtttta aaatggacta 600
tcatatgctt accgtaactt gaaagtattt cgatttcttg gctttatata tcttgtggaa 660
aggacgaaac accgtcatgc aaaacccggc cgcggtttta gagctaggcc aacatgagga 720
tcacccatgt ctgcagggcc tagcaagtta aaataaggct agtccgttat caacttggcc 780
aacatgagga tcacccatgt ctgcagggcc aagtggcacc gagtcggtgc tttttttggg 840
agggcctatt tcccatgatt ccttcatatt tgcatatacg atacaaggct gttagagaga 900
taattggaat taatttgact gtaaacacaa agatattagt acaaaatacg tgacgtagaa 960
agtaataatt tcttgggtag tttgcagttt taaaattatg ttttaaaatg gactatcata 1020
tgcttaccgt aacttgaaag tatttcgatt tcttggcttt atatatcttg tggaaaggac 1080
gaaacaccgg gctcaggcgc tgggtatacg ttttagagct aggccaacat gaggatcacc 1140
catgtctgca gggcctagca agttaaaata aggctagtcc gttatcaact tggccaacat 1200
gaggatcacc catgtctgca gggccaagtg gcaccgagtc ggtgcttttt ttgggagggc 1260
ctatttccca tgattccttc atatttgcat atacgataca aggctgttag agagataatt 1320
ggaattaatt tgactgtaaa cacaaagata ttagtacaaa atacgtgacg tagaaagtaa 1380
taatttcttg ggtagtttgc agttttaaaa ttatgtttta aaatggacta tcatatgctt 1440
accgtaactt gaaagtattt cgatttcttg gctttatata tcttgtggaa aggacgaaac 1500
accgtcccgg gttcccaaag ccgagtttta gagctaggcc aacatgagga tcacccatgt 1560
ctgcagggcc tagcaagtta aaataaggct agtccgttat caacttggcc aacatgagga 1620
tcacccatgt ctgcagggcc aagtggcacc gagtcggtgc tttttttggg agggcctatt 1680
tcccatgatt ccttcatatt tgcatatacg atacaaggct gttagagaga taattggaat 1740
taatttgact gtaaacacaa agatattagt acaaaatacg tgacgtagaa agtaataatt 1800
tcttgggtag tttgcagttt taaaattatg ttttaaaatg gactatcata tgcttaccgt 1860
aacttgaaag tatttcgatt tcttggcttt atatatcttg tggaaaggac gaaacaccga 1920
aaggcatcca gacccacccg ttttagagct aggccaacat gaggatcacc catgtctgca 1980
gggcctagca agttaaaata aggctagtcc gttatcaact tggccaacat gaggatcacc 2040
catgtctgca gggccaagtg gcaccgagtc ggtgcttttt ttggatcctg c 2091

Claims (3)

1.一种采用串联sgRNA同步激活多个猪内源性干细胞因子转录活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)构建稳定表达CRISPR激活元件dCAS-VP64和MS2-P65-HSF1的PK-15细胞系：通过慢病毒感染的方法将包含CRISPR SAM激活元件的lenti dCAS-V P64_Blast和lenti MS2-P65-HSF1_Hygro导入PK-15细胞，慢病毒感染2天后，在细胞培养液中同时添加10μg/ml的杀稻瘟菌素和500μg/ml的潮霉素，通过这两种药物筛选6天后，可获得同时稳定表达有lentidCAS-VP64_Blast和lenti MS2-P65-HSF1_Hygro的PK-15阳性细胞克隆，简称PK-15-dCas9-MS2细胞系；
(2)将核苷酸序列如SEQ ID NO.1～5所示的5个sgRNA串联成SEQ ID NO.6所示的序列，双酶切后，将sgRNA串联的寡核苷酸序列连接到lenti sgRNA(MS2)_zeo酶切线性化的表达载体中，测序鉴定成功后再抽提无内毒素质粒，包装为慢病毒后感染PK-15-dCas9-MS2细胞，即可实现同步激活Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc和miR-302/367的转录活性。
2.含有SEQ ID NO.6所述序列的lenti sgRNA(MS2)_zeo表达载体。
3.权利要求1所述方法制备得到的PK-15-dCas9-MS2细胞系。
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