CN105624195A - 构建灵长类动物miRNA-122敲除模型的方法、灵长类动物肝癌模型及用途 - Google Patents

Abstract

构建灵长类动物肝癌模型的方法，包括以下步骤：a)将特异性靶向miR122的gRNA序列插入到适宜的载体中，构建出体外转录miR122的模板载体；b)将cas9基因的序列插入到适宜的载体中，构建出体外转录cas9基因的模板载体；c)以步骤a)中的载体为模板进行PCR扩增，得到体外转录miR122的gRNA的模板；d)用限制性内切酶将步骤b)中的模板载体线性化，得到体外转录cas9基因的模板；e)以步骤c)和d)中的产物为模板进行体外转录，得到特异性靶向miR122的gRNA和cas9基因的mRNA；f)将步骤e)中的gRNA和mRNA注射到所述动物的受精卵细胞中，或者注射到卵母细胞中，再与所述动物的精子进行体外受精得到受精卵细胞；g)将步骤f)中的受精卵细胞移植入所述动物的子宫中，由此产生稳定的敲除miR122的动物子代。

Description

构建灵长类动物miRNA-122敲除模型的方法、灵长类动物肝癌模型及用途

技术领域

本发明涉及一种构建灵长类动物肝癌模型的方法、动物肝癌模型及用该模型筛选药物的方法。特别涉及用表达于肝脏的miRNAmiR-122构建猴肝癌模型的方法。

背景技术

肝细胞癌是最常见的肝脏肿瘤，在世界范围内肿瘤相关性死亡因素中排名第三，全球每年有超过50万新患者。2012年美国预期有超过2.87万新增病例，20,550预计会死于这一恶性肿瘤。肝细胞癌的主要风险因子包括乙型和丙型肝炎病毒感染以及饮酒造成的肝损伤。如果发现及时尚有治愈的希望，但大多数病例在确诊时均已至晚期无法医治的阶段。

2012年，来自俄亥俄州立大学综合癌症中心的研究人员证实一种称作microRNA-122(miR-122)的小分子在防止肝细胞癌变的过程中发挥了重要的“刹车”功能，丧失这一小RNA分子有可能导致肝癌发生，修复该分子则可能减慢肿瘤生长，从而为治疗该疾病指明了一条新的途径。相关研究发表在《临床研究期刊》(JournalofClinicalInvestigation)上。

研究者开始开发出一种缺失miR-122的小鼠品系，通过初始的脂肪肝沉积，随后的炎症和肝癌一系列事件，小鼠形成了肝细胞癌。研究人员随后利用了第二种小鼠品系，由于过表达致癌基因MYC这些小鼠会自发形成肝癌。研究人员在肿瘤形成过程中将miR-122传递到动物肝癌内。三周后，这些用分子治疗的小鼠肿瘤既小且少。科学家利用这些研究开发的模型来了解肝脏生物学，也可以用于测试新开发药物对抗包括HCC在内的肝脏疾病的治疗效应。

然而，本发明的发明人发现，肝脏特异的分子miR-122在人和其它非灵长类动物中调控的基因不一样。导致的结果是，老鼠肝癌模型不适于人类肝癌机制的研究，也不适用于肝癌药物的筛选，只有灵长类动物才能作为有效的肝癌动物模型。

发明内容

原发性肝癌是全球第五最常被诊断的癌症，同时也是癌症死亡的第二大诱因^5，6。许多文献已经报道了TGFβ信号通路在肝肿瘤的转移过程中发挥重要的作用^7，8。我们首先估计了miR-122在三种肝细胞系中对内源TGFβ1水平的影响，其中HepG2和Huh7是人的肝癌细胞系，Hepa1-6是小鼠的肝癌细胞系。HepG2含有较低水平的miR-122，而Huh7和Hepa1-6有较高的miR-122表达(见图7)。当用miR-122过表达载体处理HepG2细胞时，细胞表达的TGFβ1下降了54％(图1a和图8)。同时，当用miR-122海绵转染Huh7细胞时，其TGFβ1的量上升了2倍。然而，沉默Hepa1-6细胞的miR-122表达并不能引起TGFβ1的变化，但有趣的是，TGFβR1的表达却上升了2倍。与此相对，人肝癌细胞系的TGFβR1表达量在miR-122或者其海绵作用下并无变化。除此之外，我们发现miR-122的这种正交作用并不仅仅局限于肝细胞(图9)。

接下来我们研究了miR-122对下游信号通路组分的抑制作用。在HepG2细胞中过表达miR-122形成一个稳定的细胞系，称作HepG2-122。蛋白质印迹分析表明了在HepG2-122细胞中p-Smad2转变成Smad2的比率下降了50％。在HepG2-122细胞中过表达TGFβ1之后，该转变比率又回复到较高的水平(图1b)。类似地，当miR-122在NIT-1细胞中过表达时，p-Smad2转变成Smad2的比率下降了。同时，我们发现miR-122的抑制效果特异于TGFβ1(图10)。综上所述，这些数据表明了miR-122在人体中能够抑制TGFβ1，但在小鼠中却是抑制TGFβR1。

为了验证miR-122是否直接调控人体内的TGFβ1或小鼠中的TGFβR1，我们构建了一组双荧光报告体系，每一组都含有人或者小鼠的3’UTR(图11)。因为人TGFβ1的3’UTR含有多个亚型，我们全部采用最长的亚型进行荧光素酶报告实验^9，10。转染含有人的TGFβ1或者小鼠的TGFβR13’UTR的载体会使得荧光量显著下降，但是转入含有人的TGFβR1或者小鼠的TGFβ13’UTR的报告载体则不会引起变化，这些说明了它们的3’UTR上没有靶点位置。(图1d和1e)。

因为miR-122的序列是脊椎动物中相同的，我们开始研究在不同物种中的miR-122作用于TGFβ1/TGFβR1的靶点的保守程度。首先，我们实验测定了在恒河猴、猪、大鼠中miR-122是否靶向于TGFβ1/TGFβR1，我们克隆了它们的3’UTR并分别构建入荧光素酶报告载体中(图11)。令人意外的是，我们并没有在这3个物种中的TGFβ1/TGFβR13’UTR中发现任何的miR-122的靶点(图1d，1e)。然而，蛋白质印迹实验却显示miR-122能够在大鼠和猪的细胞系中抑制TGFβR1的表达水平。所以，我们将研究的方向转到了TGFβ1/TGFβR15’UTR和编码区区域(CDS)。

我们将5个物种的5’UTR全长克隆并构建成荧光素酶报告载体(图12)。其中仅含有人和恒河猴TGFβ15’UTR的报告载体的荧光亮度能够被miR-122显著降低(图2a和图13)。为了确定精确的靶点位置，我们构建了一系列含有人TGFβ15’UTR截断区域的荧光报告载体，发现当这些载体中含有第4部分片段或者第7部分片段时，能够被miR-122沉默(图2b)。出人意料地，含有第6部分片段的报告载体不受miR-122的影响。我们假设因为第6部分片段有很高的GC比例导致了其形成了比较稳定的RNA二级结构，而接下来的互换与突变实验很好地证明了这点(图14)。序列比对分析和随后的突变实验最终确定了精确的靶点位置，miR-122的3’端能够以一种非经典的方式在该位置形成一个很强的碱基互补配对(图2c)。

然后我们对动物系统进化树上的有代表性物种的该靶点位置进行了基因组序列分析。miR-122能够显著的抑制含有海牛TGFβ15’UTR的报告载体的荧光，而该保守5’UTR对应区域的第一位C碱基变成T碱基(图2c，2d，图15)。该保守序列中的第21位的C碱基变成T碱基，同时如果伴随着在第11位和第12位碱基之间插入一个或多个碱基，都会或多或少地影响miR-122对该部分的抑制效果，例如在小鼠、大鼠、狗和猪等物种中。另外在早期的脊椎动物的TGFβ15’UTR中并没有发现这些同源的序列，比如鸟或者鱼，说明该miR-122的靶点位置是在非洲兽类和灵长类的共同祖先时获得的。

接下来，我们在TGFβR1CDS区域确定了一组可能为miR-122的靶点，该位置在所有的脊椎动物中高度保守(表S1)¹¹。我们将这些保守的序列分别构建入一个能表达荧光素酶一绿色荧光蛋白融合蛋白的载体中间(图2e)。荧光素酶报告实验证明了再大鼠和猪的TGFβR1CDS区域含有miR-122的靶点，但是在人和猴子中却没有，随后的荧光检测实验也证明了这点(图16)。通过对系统进化树中的代表性物种的miR-122靶点位置的基因组比较分析，我们模拟追踪了进化轨迹。基于简单的推理，我们发现在该靶点的获得与缺失的过程中共发生了三个事件(图2f)。首先，在丛猴与人和狨猴的共同祖先之间出现分化时，一个G变成A的突变(图2f红色)出现在人和狨猴的最近的祖先中，然后形成了猴子和其他灵长类产生了目前保存的等位基因。该位置的突变导致了miR-122和靶点位置的一个碱基配对的缺失。然后，在人和黑猩猩最近的共同祖先中，第二个突变(A变成G，图2f中蓝色)产生，这个突变进一步降低了miR-122和其靶点之间的亲和力。同时另一方面，在小鼠和大鼠最近的共同祖先中，一个G变成A的突变(图2f中绿色)产生了一个和miR-122的配对，进一步加强了miR-122和该靶点位置的亲和力。因此，这些在进化上有力地说明了miR-122在小鼠中靶向于TGFβR1CDS区域而在人中却转变为TGFβ15’UTR。

基于miR-122是一个肝脏特异的小分子，TGFβR1的上升水平受肝脏细胞的局限。然而，TGFβ1作为一种分泌蛋白，能够调控邻近细胞的功能。因此，我们假设miR-122在人和小鼠中的缺失会导致不同的病理学影响，特别是在肿瘤的迁移方面。我们研究了miR-122介导的TGFβ1/TGFβR1抑制是否会影响上皮细胞向间充质细胞的转变(EMT)，EMT是肿瘤侵袭的早期表征。培养HepG2或者HepG2-122细胞48h之后，收集培养上清液。用该上清液或者重组的TGFβ1蛋白(终浓度为2.5ng/ml)处理Huh7细胞。24h后蛋白质印迹实验检测结果表明，HepG2细胞培养上清能够和重组的TGFβ1蛋白一样，使huh7细胞内的钙黏蛋白含量下降50％，同时使波形蛋白含量上升2倍(图3a)。而hepG2-122细胞的培养上清却产生了与上面相反的变化。为了进一步确认miR-122能够通过TGFβ1调节EMT，我们分别在HepG2和HepG2-122细胞的培养上清中加入了TGFβ1的中和抗体(TGFβ1-Ab)和TGFβ1。然后我们发现，TGFβ1-Ab使HepG2细胞的培养上清的作用颠倒了过来，而TGFβ1也使HepG2-122的培养上清作用相反。这些结果都与免疫荧光结果一致(图3b)。

对Hepa1-6和过表达miR-122海绵的hepa1-6细胞培养上清进行上面同样的处理，在两种情况下，钙黏蛋白和波形蛋白都没有展现出差异(图3c，3d)。为了确认小鼠的TGFβ1能够引起人细胞的EMT，将重组的小鼠TGFβ1加到huh7细胞的DMEM培养基中时，钙黏蛋白的表达量下降了4倍，同时波形蛋白则上升了2.5倍。

VEGF是另外一个关键的肿瘤迁移调控因子，它在TGFβ1诱导时上调^12，13。我们发现miR-122介导的TGFβ1/TGFβR1的改变对人和小鼠的血管生成具有明显的影响(图17)。这些体外实验结果说明miR-122介导的TGFβ1/TGFβR1的活性能够在人和小鼠细胞内产生明显的迁移相关活性。

然后我们检测了降低miR-122对体内肝癌的发展的影响，首先使用人源肿瘤移植或者小鼠同源的肿瘤，然后使用临床样本和小鼠的肝癌模型进行研究。使用人或者小鼠的肝癌细胞植入到小鼠体内形成肿瘤模型，比较肿瘤的大小和迁移状态。将HepG2-NC，HpeG2-122和HepG2-122-TGFβ1三种稳定转染的人细胞系皮下注射到裸小鼠体内，5周之后，处理小鼠并对肿瘤称重。HepG2-122组小鼠的肿瘤重量和大小相对于其他组有明显的降低(图4a，图18)。然后我们使用CD31染色检测新生血管的数量，发现在HepG2-122组的肿瘤新生血管数量降低了4倍(图4b，图13)。当在HepG2-122细胞过表达TGFβ1时，肿瘤重量和新生血管数量的降低幅度都受到了影响(图4a和4b)。同样地，我们研究了在异源或同源移植的肿瘤中miR-122对局部侵袭和远端转移的影响。我们发现表达miR-122的肿瘤形状紧密并且没有侵袭现象(图4c)。肺部检查时发现，在全部的对照组小鼠中都出现了迁移囊肿(7/7)，但是在注射HepG2-122细胞的小鼠中却没有发现(0/7)(图4d)。而注射HepG2-122-TGFβ1细胞组过表达TGFβ1，颠倒了miR-122的对于局部侵袭和远端迁移的作用。然后我们将Hepa1-6-NC和过表达miR-122海绵的Hepa1-6两组细胞皮下注射到裸小鼠体内，检测这些小鼠体内肿瘤的重量、新生血管的状态、侵袭和转移情况。尽管在过表达miR-122海绵的Hepa1-6组的肿瘤重量有轻微的增加，但是在其他特征方面两个组没有明显区别(图4a-4d，图19b)。

然后我们分别检测了人和小鼠肝癌样本中miRNA-122、TGFβ1和TGFβR1的表达量。定量分析结果表明人肝癌样本中miR-122的表达量比正常的癌旁组织低了10倍(图4e)。蛋白质印迹实验显示肝癌样本中的TGFβ1上调了接近4倍，但是TGFβR1的表达量却没有发生变化(图4f)。我们研究肝脏组织的样本的血管生长情况发现，癌症组织样本中的新生血管数量比正常样本上升了6倍(图4g)。有文献报道肝脏出现侵袭现象时伴随着miR-122的抑制^1，14。为了研究肝癌的迁移是否与miR-122、TGFβ1或者TGFβR1的表达量相关，我们分析了原发性肝癌中基因的表达数据集和相对应的疾病注释^15-17，通过处理之后发现，miR-122低表达与低生存率相关(图4h)。TGFβ1高表达组比低表达组具有更低的生存期，5年后存活下来的患者中有70％低表达TGFβ1，而高表达TGFβ1的患者中有超过50％的人会在这段时间内死亡(图4i)。结合我们的细胞实验结果，TGFβR1与生存期并不直接相关(图20)。

使用文献中报道过的方法¹⁸获得了8只表达敲入HBx基因的小鼠。检测miR-122、TGFβ1和TGFβR1的表达量发现，在肿瘤样本中miR-122表达量下降了8倍，同时TGFβR1的表达量上升了8倍(图4e，4f)，然而TGFβ1的表达量却没有发生变化。尽管在这些肿瘤中发现了部分血管数量的增加(图4g)，但是在这些敲入HBX基因的18个月小鼠的肺部却没有出现迁移的囊肿。基于这些结果，我们认为miR-122的抑制在人和小鼠中会引起不同类型的肝脏功能的病理性变化，包括肿瘤大小，血管新生和肿瘤迁移。

在本项研究中，我们证明了miR-122靶向于TGFβ1通路中的不同组分，即人的TGFβ1和小鼠的TGFβR1，这第一次佐证了物种之间miRNA信号通路的不同。这种依赖于不同物种间的miRNA调节配体/受体活力，从而作用于同一通路的现象，证明了一种新的功能保守的机制。在正常条件下，miRNA导致的受体或者配体的抑制会对下游信号分子造成相似的调控效应。然而，这种类型的调控可能会因为miRNA的异常调控而在不同物种间产生比较有趣的结果，比如在癌症中、病理或压力条件下。我们的结果清晰地表明miR-122的缺失能够在人和小鼠的肝癌迁移时展现出明显不同的影响。

除了癌症，其他类型的肝脏疾病中也会出现miR-122失调的现象²⁰。例如miR-122在非酒精性脂肪肝炎患者中降低了40％，或丙肝病毒感染者miR-122会降低到正常的50-60％。我们的发现为肝癌或者相关疾病提供了可能的新的治疗和预防方案，并且与Santaris制药公司近期进行的二期临床直接相关²¹。目前使用抗microRNA-122药物miravirsen治疗HCV而且无剂量限制等不良影响。研究结果表明在未来的临床研究中需要小心地控制TGFβ1的浓度，因为TGFβ1是一种广泛存在并参与免疫排斥、心脏疾病、代谢综合征和其他病理特征的信号蛋白分子。

材料和方法：

siRNA双链，miRNA模拟体，细胞培养，转染和感染

siRNA双链和所有的miRNA模拟体都是从上海吉玛制药公司购买。RNAi沉默效率是在转染后24-48h用实时定量PCR反应检测。每个反应都是3个平行，所有基因的PCR引物序列在表S2列出。

Hela，HepG2，Huh7，293T，PANC-1，MCF-7，Hepa1-6和C5.18细胞都使用含有10％胎牛血清、100units/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素的高糖DMEM培养，同时NiT-1细胞使用低糖DMEM培养。人脐静脉内皮细胞(HUVEC)由北京大学黄岩谊捐赠，使用含有1％ECGS、5％FBS和1％P/S的ECM(ScienCell)培养基和附着鼠尾胶原蛋白的培养皿培养。猪肾内皮细胞(LLC-PK1)使用含3％FBS和1％P/S的M199培养基(Gibco)培养。所有细胞都是在5％CO₂37℃的温润条件下培养。细胞培养2-3天之后使用PBS清洗，然后用含0.5mMEDTA0.25％的胰酶消化，使用含有血清的培养基终止消化反应。离心后使用培养基重悬，血球计数板计数，然后以合适的细胞密度接种。

使用Lipofectamine2000(Invitrogen)作为转染试剂。细胞数量和核酸用量以说明书操作。293T细胞使用慢病毒侵染，HepG2细胞使用之前提到的不同病毒感染。转染48h后，换液并加入嘌呤霉素(Sigma)至终浓度为2ug/ml。筛选3-5周后，分别选择稳定的细胞系作为HepG2-NC、HepG2-122和HepG2-122-TGF细胞系。

荧光素酶检测实验

克隆不同基因的5’UTR和3’UTR连接到萤火虫荧光素酶基因的5’和3’区域构建相应的pGL3载体，进行荧光素酶报告实验。使用4.0×10⁴Hela细胞，共转染200ng构建的基因载体和20ng海肾荧光素酶pGL3对照载体，同时，转染相应的miRNA质粒载体或者模拟体。48h后，裂解细胞并使用双荧光素酶报告分析系统(Promega)检测荧光素酶活力。

人肝组织和miRNA检测

人原发性肝癌组织和癌旁组织组织均从北京大学第三医院获得。在进行手术前，所有病人都已签署知情同意书允许将多余的组织用于科研研究。根据美国联合委员会对肿瘤淋巴转移的第六版分类，这些患者被分为I、II、III期。对所有手术切下的组织迅速冷冻并储存在干冰中。不同细胞系和组织的miRNA表达量使用之前建立的方法²⁹。

上清收集和酶联免疫试验

以合适的浓度接种不同的细胞，48h后细胞达到80％汇合度，将培养基转至无菌管中。离心后，收集上清冻存在-80℃用于中和反应，上清用含有1ug/ml的中和抗体(R&D)室温预处理2小时。使用酶联免疫反应(ELISA)检测上清液中的TGFβ1和VEGF的浓度。检测TGFβ1的Emax免疫反应试剂盒是从Promega公司购买，VEGF的ELISA试剂盒从R&D公司购买。实验的操作均按照公司提供的标准实验方法进行。

免疫荧光试验

6孔板每孔接种1×10⁵Huh7细胞，细胞贴壁后，使用不含胎牛血清的DMEM培养基过夜培养，然后分别换成不同的上清培养液。其中一个孔加入终浓度为2.5ng/ml的重组TGFβ1(SinoBiologicalInc.)作为阳性对照。24h后，依次使用4％福尔马林固定细胞，0.1％TritonX-100通透，2％BSA室温封闭1h。分别使用相应的第一抗体对钙黏蛋白和波形蛋白反应，并用抗兔第二抗体或者抗小鼠第二抗体、F(ab’)2片段(Alexa488Conjugate)(CellSignallingTech.)进行可视化标记反应。所有荧光图片均使用NikonTE2000-E(CCD：Regita2000R，Qimaging，Canada)拍摄。

免疫印迹

从细胞或者组织中提取总蛋白后使用SDS-PAGE电泳分离，然后转膜到聚偏氟乙烯膜(MilliporeCorporation)。这些膜分别使用TGFβ1(R&D)、TGFβ2(R&D)、TGFβ3(R&D)、TGFβR1(R&D)、Smad2(CellSignalingTech.)、Phospho-Smad2(CellSignalingTech.)、E-cadherin(CellSignalingTech.)、vimentin(Abcam)和β-actin(SantaCruz)作第一抗体标记。所有的图像都使用QuantityOne软件(Bio-Rad)获得。

免疫组织化学

免疫组织化学试验是在中国医学科学院完成。组织样本在4％福尔马林溶液中室温过夜固定，然后使用PBS和70％乙醇先后漂洗，再进行石蜡包埋，切片后用苏木精和伊红染色。在石蜡包埋的操作部分进行抗CD31第二抗体(BDbiosciences)检测。使用ImageJ软件计算血管数量。

体外人工基底膜血管新生试验

使用人工基底膜(BDBiosciences)铺盖24孔板，每孔接种5×10⁴HUVEC细胞。6h后，细胞贴壁并使用相应的上清液培养细胞。剩余孔中加入重组TGFβ1(SinoBiologicalInc.)至终浓度2ng/ml作为阳性对照，同时其他孔中加入新鲜的培养基作为空白对照。24h后使用ImageJ软件测量和计算血管长度和分支点数量并成像。

动物模型和体内成瘤试验

构建小鼠肝癌模型¹⁸。分别将HepG2-NC、HepG2-122和HepG2-122-TGF细胞皮下注射到裸鼠体内进行体内成瘤试验。5周后，处理小鼠并取肿瘤称重。所有涉及动物的实验操作都符合北京大学动物中心的提供的操作流程进行。

数据分析

使用Excel电子数据表格进行双侧t检验。P值＜0.05被认为统计上显著地，*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001。误差线代表至少三次独立实验的标准偏差。

附图说明

图1.miR-122在人的细胞中直接靶向TGFβ1，而在小鼠细胞中是TGFβR1。

图2.miR-122以一种非经典的“种子区”碱基配对方式靶向于TGFβ15’UTR。

图3.分别靶向于TGFβ1或TGFβR1导致了人和小鼠细胞中miR-122对间质转化(EMT)的差异影响。

图4.体内miR-122缺失导致人和小鼠肝癌不同的肿瘤迁移效应。

图5.特异性靶向mml-mir-122a的TALEN的体外活性检测。(a)为mml-mir-122a前体序列，其中粉色标识的碱基为mml-mir-122a的程序序列；(b)中所示的是SSA实验的结果。在293T细胞中共转染TALEN质粒和含有靶向序列的SSA报告载体，转染24小时之后，进行双荧光报告基因检测；图中看出报告基因的表达量比负对照组(NC)提高了10倍左右，说明TALEN剪切目的基因的效率很高。

图6.特异性靶向mml-mir-122a的gRNA的体外活性检测。(a)中为mml-mir-122a前体序列，其中粉色标识的碱基为mml-mir-122a的程序序列；(b)中所示的是用CRISPR系统体外剪切实验结果。在体外，把cas9蛋白和gRNA与含有靶位点的DNA片段混合，37度温浴1h，然后进行琼脂糖凝胶电泳实验。如图中所示，cas9可以跟mm-mir-122a的两条gRNA能将目的基因的DNA片段剪切开，剪切效率分别为63.5％和52.1％，而负对照组(NC)没有切开。

图7.HepG2、Huh7和Hepa1-6细胞中的miR-122表达水平。n＝3

图8.过表达miR-122的HepG2细胞中的miR-122的含量。转染NC和miR-122海绵后Huh-7细胞和Hepa1-6细胞内的miR-122含量。n＝3

图9.对PANC-1、MCF-7和NIT-1细胞转染NC质粒和miR-122表达载体后，免疫印迹检测TGFβ1和TGFβR1水平，右侧图为定量分析。n＝3

图10.在HepG2-122和HepG2细胞中的TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3表达水平。

图11.不同3’UTR的荧光素酶报告载体构建图。

图12.不同5’UTR的荧光素酶报告载体构建图。

图13.转染相应载体后的荧光素酶活力，将TGFβR15’UTR插入到载体的promoter部分。Hum：Human；Rhe：Rhesusmonkey；Mou-Mouse。n＝6

图14.互换突变实验以验证miR-122在人的TGFβR15’UTR区的靶点位置。

图15.转染相应载体后的荧光素酶活力，将不同物种对应的TGFβR15’UTR序列插入到pGL载体的promoter部分。n＝6

图16.Hela细胞中共转染miR-122和相应载体对应的荧光成像图，所有的目标序列都构建到荧光素酶和eGFP的编码区中间形成一个融合蛋白，载体的构建方式如图2E。n＝3

图17.miR-122对人和小鼠的血管新生产生不同的影响。

(a，b)进行相应处理的内皮细胞的生长图像，右侧定量图显示分支点数量和血管长度。误差线：500μm，n＝3

(c)酶联免疫实验检测相应处理HepG2和Hepa1-6细胞中的VEGF含量。

(d)荧光素酶报告基因显示miR-122并不是直接以VEGF作为靶点。误差线，±SD*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001，双侧t检验。ND：无差别。

图18.植入相应的细胞后肿瘤的大小。n＝7

图19.CD31浸染相应处理后的癌症组织。n＝7，误差线：50μm，n＝3

图20.相关肝癌细胞组(肝癌研究所和中山医院)的Kaplan-Meier生存曲线。表达值＝log2ofRMA-calculated信号强度，TGFβR1表达值＜4表示低表达组，而TGFβR1表达值＞5表示高表达组。n＝244；P值经过Mantel-Coxlog-rank检验。

具体实施方式

实施例1

参照附图1。miR-122在人的细胞中直接靶向TGFβ1，而在小鼠细胞中是TGFβR1。

(a)在HepG2、Huh7和Hepa1-6细胞中转染miR-122过表达质粒(122)、miR-122海绵(122sp)和NC，TGFβ1和TGFβR1的免疫印迹分析。

(b)HepG2细胞转染miR-122、NC和miR-122与TGFβ1的免疫印迹，分别为胞内的TGFβ1、Smad2和p-Smad2，定量分析结果在图右侧，n＝3。

(c)NIT-1细胞转染miR-122、NC和miR-122与TGFβR1的免疫印迹，分别为胞内的TGFβR1、Smad2和p-Smad2，。定量分析结果在图右侧，n＝3。

(d)转染相应的载体后测定荧光素酶活力。使用pGL质粒构建相应的TGFβ13’UTR荧光素酶载体。Hum：Human；Hum1：长3’UTR；Hum2：短3’UTR；Rhe：恒河猴；Mou：小鼠。n＝6。

(e)转染相应的载体后测定荧光素酶活力。使用pGL质粒构建相应的TGFβR13’UTR荧光素酶载体。人的TGFβR13’UTR因太长被分成两段，H1和H2。n＝6。

(f)C5.18(大鼠细胞)和LLC-PK1(猪细胞)转染miR-122过表达质粒和NC之后，TGFβ1和TGFβR1的表达量。定量分析结果在图右侧，n＝3。

误差线，±SD*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001，双侧t检验。β-Actin作为对照。NC：阴性对照。

实施例2

参照附图2。miR-122以一种非经典的“种子区”碱基配对方式靶向于TGFβ15’UTR。

(a)转染相应的载体后测定荧光素酶活力。将TGFβ15’UTR连接到pGL质粒的启动子区域。n＝6。

(b)转染相应的载体后测定荧光素酶活力。将人的TGFβ15’UTR截断成7个不同的部分并且将每段连接到pGL质粒的启动子区域。n＝6。

(c)图示miR-122作用于TGFβ15’UTR和突变区域。不同载体的荧光素酶活力如下。

(d)miR-122在不同动物TGFβ15’UTR靶点位置的进化轨迹。miR-122靶点的获得发生在海牛与人和其他灵长类的共同祖先(黑色箭头)，在猪、狗、大鼠和小鼠中由于第11位和第12位之间插入了数个碱基而导致了靶点的丢失(红色箭头)。点表示与人对应的位置碱基相同，红线表示插入一个或多个碱基。

(e)转染相应的载体后测定荧光素酶活力。目标序列(表S1)被连接到荧光素酶和增强型绿色荧光蛋白的CDS中间。Rhes：恒河猴；PC：阳性对照；NC：阴性对照。n＝6。

(f)miR-122在动物TGFβR1CDS区域的靶点位置的进化轨迹。在靶点的获得与缺失的过程中有3个事件发生：G-＞A突变(红色)；A-＞G突变(蓝色)和G-＞A突变(绿色)。点表示与人对应的位置碱基相同。

误差线，±SD*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001，双侧t检验。

实施例3

参照附图3。因为分别靶向于TGFβ1或TGFβR1导致了人和小鼠细胞中miR-122对间质转化(EMT)的差异影响。

(a)相应处理后对Huh7细胞的钙黏蛋白和波形蛋白的免疫印迹分析。HepG2和HepG2-122分别代表HepG2和HepG2-122细胞的培养上清液。定量分析结果在图右侧，n＝3。

(b)使用钙黏蛋白和波形蛋白作为Huh7细胞的EMT标签，DAPI浸染细胞核。比例尺：50μm。

(c)相应处理后对Huh7细胞的钙黏蛋白和波形蛋白的免疫印迹分析。Hepa1-6和Hepa1-6-122sp分别代表Hepa1-6和Hepa1-6-122sp细胞的培养上清液。定量分析结果在图右侧，n＝3。

(d)使用钙黏蛋白和波形蛋白作为Huh7细胞的EMT标签，DAPI浸染细胞核。比例尺：50μm。

实施例4

参照附图4。体内miR-122缺失导致人和小鼠肝癌不同的肿瘤迁移效应。

(a)皮下注射表达miRNA或者对照发卡结构(NC)的细胞到免疫缺陷的小鼠体内，5周后，测量肿瘤的体积。

(b)相应组织的血管数量统计结果。n＝7。

(c)皮下注射60天后对原发性肿瘤进行苏木精伊红染色。对小鼠皮下注射能稳定表达NC、miR-122或者共表达miR-122和TGFβ1(122-TGFβ1)的HepG2细胞，能稳定表达NC或miR-122海绵(122sp)的Hepa1-6细胞。N＝7，比例尺：50μm。

(d)皮下注射相应的细胞后取小鼠的肺部进行苏木精伊红染色。N＝7，比例尺：50μm。

(e)敲入HBx基因的转基因小鼠的肝肿瘤和正常肝脏组织(n＝8)以及人肝癌肿瘤与正常癌旁组织的miR-122(n＝6)表达水平分析。

(f)组织的TGFβ1和TGFβR1免疫印迹分析结果。相关代表性图片在插图中展示。

(g)使用CD31浸染相关组织对血管数量定量分析。

(h)相关肝癌细胞组(肝癌研究所和中山医院)的Kaplan-Meier生存曲线。表达值＝log2ofRMA-calculated信号强度，miR-122表达值＞0.39表示高表达组，而miR-122表达值＜-0.58表示低表达组。n＝165；P值经过Mantel-Coxlog-rank检验。

(i)相关肝癌细胞组(肝癌研究所和中山医院)的Kaplan-Meier生存曲线。表达值＝log2ofRMA-calculated信号强度，TGFβ1表达值＜4表示低表达组，而TGFβ1表达值＞5表示高表达组。n＝244；P值经过Mantel-Coxlog-rank检验。

误差线，±SD*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001，双侧t检验。ND：无差别。

实施例5

参照附图5。特异性靶向mml-mir-122a的TALEN的体外活性检测。

(a)根据mml-mir-122前体序列设计TALEN结合位点，分别为：GTCTAAACTATCAAACG和GCCTAGTAGTAGCTATT；

(b)根据现有TALEN合成规则在pCS2载体上组装TALEN；同时把TALEN靶位点序列(TGTCTAAACTATCAAACGCCATTATCACACTAAATAGCTACTACTAGGC)构建到pSSA上；

(c)为了检测TALEN结合效率，TALEN质粒和SSA载体共转染到293T细胞中。转染24h之后，裂解液裂解细胞，用Promega公司的双荧光素酶检测试剂盒检测荧光素酶基因的表达水平，从而得出TALEN的效率。

实施例6

参照附图6。特异性靶向mml-mir-122a的gRNA的体外活性检测。

(a)根据mml-mir-122前体序列设计gRNA结合位点，分别为：AGAGCTGTGGAGTGTGACAA和GTAGCTATTTAGTGTGATAA。

(b)设计合成含有T7启动子的引物(序列如下)以含有gRNA骨架的质粒为模板PCR，回收得到gRNA转录模板，用T7体外转录试剂盒进行体外转录，回收得到gRNA；

其中NNNNNNNNNNNNNN是gRNA靶点，

(c)设计引物，以基因组DNA为模板进行扩增，跑胶回收得到活性检测底物DNA

(d)将体外转录得到的gRNA，底物DNA和cas9蛋白在反应液中充分混匀，37摄氏度反应0.5小时，65摄氏度5分钟，跑琼脂糖凝胶电泳检测gRNA活性。

表S1.不同灵长类中保守的TGFβ15’UTR序列。

表S1

Human	CGGGAGACCCCCAGCCCCTGCAGG
		Chimp	CGGGAGACCCCCAGCCCCTGCAGG
Gorilla	CGGGAGACCCCCAGCCCCTGCAGG
		Orangutan	CGGGAGACCCCCAGCCCCTGCAGG
Rhesus	CGGGAGACCCCCAGCCCCTGCAGG
		Baboon	CGGGAGACCCCCAGCCCCTGCAGG
Squirrel monkey	CGCGAGACCCCCAGCCCCTGCGGG
		Bushbaby	CGGGAGACCCCCAGCCCCTACAGG

表S2.相关基因的PCR引物。注：其余相关的TGFβ1和TGFβR1的3’UTR与5’UTR都按照GenBank上对应的序列合成。

表S2

Claims (14)

1.一种构建灵长类动物miRNA-122敲除模型的方法，包括以下步骤：

a)将特异性靶向miR-122的gRNA序列插入到适宜的载体中，构建出体外转录miR-122的模板载体；

b)将cas9基因的序列插入到适宜的载体中，构建出体外转录cas9基因的模板载体；

c)以步骤a)中的载体为模板进行PCR扩增，得到体外转录miR-122的gRNA的模板；

d)用限制性内切酶将步骤b)中的模板载体线性化，得到体外转录cas9基因的模板；

e)以步骤c)和d)中的产物为模板分别进行体外转录，得到特异性靶向miR-122的gRNA和cas9基因的mRNA；

f)将步骤e)中的gRNA和mRNA注射到所述灵长类动物的受精卵细胞中，或者先注射到所述灵长类动物的卵母细胞中，再与所述灵长类动物的精子进行体外受精得到受精卵细胞；

g)将步骤f)中的受精卵细胞移植入所述灵长类动物的子宫中，由此产生稳定的敲除miR-122的灵长类动物子代。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述灵长类动物为猴。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述猴为恒河猴、猕猴、豚尾猴、食蟹猴或绒猴。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤a)中所述模板载体含有特异性靶向miR-122的gRNA序列。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤b)中所述模板载体含有cas9基因的序列。

6.一种构建灵长类动物miRNA-122敲除模型的方法，包括以下步骤：

a)将特异性靶向miR-122的TALEN序列插入到适宜的载体中，构建出体外转录特异性靶向miR-122的TALEN的模板载体；

b)用限制性内切酶将步骤a)中的模板载体线性化，得到体外转录TALEN基因的模板；

c)以步骤b)中的产物为模板进行体外转录，得到特异性靶向miR-122的TALEN基因的mRNA；

d)将步骤c)中的mRNA注射到所述灵长类动物的受精卵细胞中，或者先注射到所述灵长类动物的卵母细胞中，再与所述灵长类动物的精子进行体外受精得到受精卵细胞；

e)将步骤d)中的受精卵细胞移植入所述灵长类动物的子宫中，由此产生稳定的敲除miR-122的灵长类动物子代。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述动物为猴。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述猴为恒河猴、猕猴、豚尾猴、食蟹猴或绒猴。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于步骤a)中所述模板载体含有特异性靶向miR-122的TALEN基因的序列。

10.根据前述任一权利要求所述的方法构建的灵长类动物模型。

11.根据权利要求1-9的任一项所述的方法构建的灵长类动物模型，其特征在于随着年龄增加，该模型会出现肝硬化、原位肝癌、肝癌转移等症状。

12.权利要求10或11所述灵长类动物模型的用途，其特征在于所述动物模型用于研究人类相应的症状。

13.一种利用权利要求10或11所述灵长类动物模型筛选药物的方法，其特征在于，对所述动物模型施用待筛选的药物，然后检测所述待筛选药物对所述动物模型所起的作用。

14.一种利用权利要求10或11所述灵长类动物模型筛选药物的方法，其特征在于，对所述动物模型施用待筛选的药物，然后检测所述待筛选药物在所述动物模型体内的药物代谢动力学、毒性及有效性。