ES2872730T3 - Nx-1207 para el uso en métodos para reducir la necesidad de cirugía en pacientes que sufren de hiperplasia prostática benigna - Google Patents

Abstract

Un péptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 66 (lle-Asp-Gln-Gln-Val-Leu- Ser-Arg-lle-Lys-Leu-Glu-lle-Lys-Arg-Cys-Leu para el uso en un método para reducir la necesidad de una intervención quirúrgica invasiva posterior en seres humanos sin tratamiento previo que tienen hiperplasia prostática benigna (BPH) que no tomaron previamente un agente activo adicional, o que no recibieron previamente tratamiento contra BPH, el método comprende: (a) seleccionar seres humanos sin tratamiento previo que tengan BPH que no tomaron previamente un agente activo adicional, o que no recibieron previamente tratamiento contra BPH; y (b) administrar al ser humano sin tratamiento previo una cantidad terapéuticamente efectiva del péptido aislado para tratar BPH, en donde el método reduce las intervenciones quirúrgicas invasivas posteriores para BPH en una cantidad dentro del intervalo de aproximadamente 70 al 100 %, en comparación con los seres humanos que tienen BPH que reciben un placebo.

Description

DESCRIPCIÓN

Nx-1207 para el uso en métodos para reducir la necesidad de cirugía en pacientes que sufren de hiperplasia prostética benigna

Antecedentes

1. Campo de las modalidades

La presente invención se define en las reivindicaciones. La descripción incluye métodos para tratar afecciones que requieren la eliminación o destrucción de elementos celulares, tales como tumores benignos o malignos en seres humanos, mediante el uso de composiciones que contienen compuestos basados en péptidos pequeños y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los métodos incluyen, pero no se limitan a, administrar las composiciones intramuscularmente, oralmente, intravenosamente, intraperitonealmente, intracerebralmente (intraparenquimatosamente), intracerebroventricularmente, intralesionalmente, intraocularmente, intraarterialmente, intratecalmente, intratumoralmente, intranasalmente, tópicamente, transdérmicamente, subcuténeamente, o intradérmicamente a los pacientes que lo necesiten, en donde es menos probable que esos pacientes requieran una intervención quirúrgica invasiva posterior.

2. Descripción de la técnica relacionada

La esencia de muchos tratamientos y procedimientos médicos implica la eliminación o destrucción de tejido dañino o no deseado. Los ejemplos de tales tratamientos incluyen la extirpación quirúrgica de crecimientos cancerosos o precancerosos, la destrucción de tumores metastésicos mediante quimioterapia y la reducción de la hiperplasia glandular (por ejemplo, de próstata). Otros ejemplos incluyen la eliminación del vello facial no deseado, la eliminación de verrugas, y la eliminación de tejido graso no deseado.

Existe la necesidad de una composición efectiva que destruya y, por tanto, facilite la eliminación o inhiba el crecimiento adicional de células y tejidos dañinos o no deseados, pero que tenga principalmente efectos locales y una toxicidad sistémica mínima o nula. También existe la necesidad de reducir la necesidad de una intervención quirúrgica invasiva, incluso después del tratamiento con una composición efectiva.

Algunos agentes que se sabe que tienen la capacidad de destruir y, por lo tanto, facilitar la eliminación o inhibir el crecimiento adicional de células y tejidos dañinos o no deseados se describen en la solicitud de patente de Estados Unidos núm. 14/606,683, presentada el 27 de enero de 2015, titulada: METHOD OF TREATING DISORDERS REQUIRING DESTRUCTION OR REMOVAL OF CELLS, solicitud de Estados Unidos núm. 14/738,551, presentada el 12 de junio de 2015, titulada: COMBINATION COMPOSITIONS FOR TREATING DISORDERS REQUIRING REMOVAL OR DESTRUCTION OF UNWANTED CELLULAR PROLIFERATIONS, publicación de solicitud de patentes de Estados Unidos núm. 2007/0237780 (ahora abandonada); 2003/0054990 (ahora patente de Estados Unidos núm. 7,172,893); 2003/0096350 (ahora patente de Estados Unidos núm. 6,924,266); 2003/0096756 (ahora patente de Estados Unidos núm. 7,192,929); 2003/0109437 (ahora patente de Estados Unidos núm. 7,241,738); 2003/0166569 (ahora patente de Estados Unidos núm. 7,317,077); y 2005/0032704 (ahora patente de Estados Unidos núm. 7,408,021).

El céncer es una anomalía en los mecanismos reguladores internos de una célula que da como resultado un crecimiento y reproducción incontrolados de la célula. Las células normales forman los tejidos, y cuando estas células pierden su capacidad para comportarse como una unidad específica, controlada, y coordinada (desdiferenciación), el defecto conduce a un desorden entre la población celular. Cuando esto ocurre, se forma un tumor.

Los sobrecrecimientos benignos de tejido son anomalías en las que es deseable eliminar células de un organismo. Los tumores benignos son proliferaciones celulares que no hacen metéstasis en todo el cuerpo pero que, sin embargo, causan síntomas de enfermedad. Estos tumores pueden ser letales si se encuentran en éreas inaccesibles de órganos como el cerebro. Hay tumores benignos de órganos que incluyen pulmón, cerebro, piel, pituitaria, tiroides, corteza suprarrenal y médula, ovario, útero, testículo, tejido conectivo, músculo, intestinos, oído, nariz, garganta, amígdalas, boca, hígado, vesícula biliar, péncreas, próstata, corazón, y otros órganos.

La cirugía suele ser la primera etapa en el tratamiento del céncer. El objetivo de la cirugía varía. A veces se usa para extirpar tanto tumor evidente como sea posible, o al menos para "reducirlo" (eliminar la mayor parte del tumor para que haya menos que deba tratarse por otros medios). En dependencia del tipo de cáncer y la ubicación, la cirugía también puede brindar cierto alivio sintomático al paciente. Por ejemplo, si un cirujano puede extirpar una gran parte de un tumor cerebral en expansión, la presión dentro del cráneo disminuirá, lo que mejorará los síntomas del paciente.

No todos los tumores son susceptibles de cirugía. Algunos pueden ubicarse en partes del cuerpo que hacen que sea imposible eliminarlos por completo. Ejemplos de estos serían tumores en el tronco del encéfalo (una parte del cerebro que controla la respiración) o un tumor que creció dentro y alrededor de un vaso sanguíneo principal. En estos casos, el papel de la cirugía es limitado debido al alto riesgo asociado con la extirpación del tumor.

En algunos casos, la cirugía no se usa para reducir el volumen del tejido tumoral porque simplemente no es necesaria. Un ejemplo es el linfoma de Hodgkin, un cáncer de los ganglios linfáticos que responde muy bien a las combinaciones de quimioterapia y radioterapia. En el linfoma de Hodgkin, la cirugía rara vez se necesita para lograr la cura, pero casi siempre se usa para establecer un diagnóstico.

La quimioterapia es otra forma común de tratamiento del cáncer. Esencialmente, implica el uso de medicamentos (usualmente administrados por vía oral o inyectables) que atacan específicamente a las células que se dividen rápidamente (tales como las que se encuentran en un tumor) en todo el cuerpo. Esto hace que la quimioterapia sea útil para tratar cánceres que ya hicieron metástasis, así como tumores que tienen una alta probabilidad de diseminarse a través de los sistemas sanguíneo y linfático, pero que no son evidentes más allá del tumor primario. La quimioterapia también puede usarse para mejorar la respuesta de los tumores localizados a la cirugía y la radioterapia. Este es el caso, por ejemplo, de algunos cánceres de cabeza y cuello.

Desafortunadamente, otras células del cuerpo humano que normalmente también se dividen rápidamente (como el revestimiento del estómago y el cabello) también se ven afectadas por la quimioterapia. Por esta razón, muchos agentes de quimioterapia inducen efectos secundarios indeseables como náuseas, vómitos, anemia, caída del cabello u otros síntomas. Estos efectos secundarios son temporales y existen medicamentos que pueden ayudar a aliviar muchos de estos efectos secundarios. A medida que nuestro conocimiento crece, los investigadores idean agentes quimioterapéuticos más nuevos que no solo son mejores para matar las células cancerosas, sino que también tienen menos efectos secundarios para el paciente.

La quimioterapia se administra a los pacientes de diversas formas. Algunas incluyen píldoras y otros se administran por vía intravenosa u otra inyección. Para la quimioterapia inyectable, el paciente va al consultorio del médico o al hospital para recibir tratamiento. Otros agentes quimioterapéuticos requieren una infusión continua en el torrente sanguíneo, las 24 horas del día. Para estos tipos de quimioterapia, se realiza un procedimiento quirúrgico menor para implantar una pequeña bomba que usa el paciente. Después la bomba administra lentamente el medicamento. En muchos casos, se coloca un puerto permanente en la vena del paciente para eliminar la necesidad de pinchazos repetidos con la aguja.

Los tumores benignos y las malformaciones también pueden tratarse mediante una variedad de métodos que incluyen cirugía, radioterapia, terapia con medicamentos, ablación térmica o eléctrica, crioterapia, y otros. Aunque los tumores benignos no hacen metástasis, pueden crecer y pueden reaparecer. La extirpación quirúrgica de tumores benignos tiene todas las dificultades y efectos secundarios de la cirugía en general y, a menudo, debe realizarse repetidamente para algunos tumores benignos, tales como adenomas hipofisarios, meningeomas del cerebro, hiperplasia prostática, y otros. En adición, algunos pacientes que reciben tratamiento no quirúrgico para mejorar los síntomas causados por tumores benignos, aún requieren una intervención quirúrgica invasiva posterior. Lepor, “Medical Treatment of Benign Prostatic Hyperplasia”, Reviews in Urology, vol. 13, núm. 1, pág. 20-33 (2011), describe una variedad de estudios sobre la eficacia de las terapias con medicamentos en el tratamiento de la BPH, y la necesidad de un tratamiento quirúrgico invasivo posterior.

La función de los andrógenos en el desarrollo de hiperplasia prostática benigna en hombres se documenta bien (Wilson, N. Engl. J. Med. 317: 628-629, 1987). De hecho, la hiperplasia prostática benigna no se desarrolla en ausencia de los testículos (se refiere en Wendel y otros, J. Urol. 108: 116-119, 1972).

Se sabe que el bloqueo de la secreción de andrógenos testicular por castración quirúrgica o médica (agonista de LHRH) disminuye el tamaño prostático (Auclair y otros, Biochem. Biophys. Res. Commun. 76: 855-862, 1977; Auclair y otros, Endocrinology 101: 1890-1893, 1977; Labrie y otros, Int. J. Andrología, supl. 2 (V. Hansson, ed.), Scriptor Publisher APR, pág. 303-318, 1978; Labrie y otros, J. Andrology 1: 209-228, 1980; Tremblay y Belanger, Contraception 30: 483-497, 1984; Tremblay y otros, Contraception 30: 585-598, 1984; Dube y otros, Acta Endocrinol. (Copenh) 116: 413-417, 1987; Lacoste y otros, Mol. Cell. Endocrinol. 56: 141-147, 1988; White, Ann. Surg. 22: 1-80, 1895; Faure y otros, Fertil. Steril. 37: 416-424, 1982; Labrie y otros, Endocrine Reviews 7: 67-74, 1986; Huggins y Stevens, J. Urol. 43: 705-714, 1940; Wendel y otros, J. Urol. 108: 116-119, 1972; Peters y Walsh, N. Engl. J. Med.

317: 599-604, 1987; Gabrilove y otros, J. Clin. Endocrinol. Metab. 64: 1331-1333, 1987).

Varios estudios demostraron que el tratamiento con un antiandrógeno también disminuye el tamaño prostático (Neri y otros, Endocrinology, 82: 311-317, 1968; Neri y otros, Investigative Urology, 10: 123-130, 1972; Tunn y otros, Acta Endocrinol. (Copenh.) 91: 373-384, 1979; Seguin y otros, Mol. Cell. Endocrinol., 21: 37-41, 1981; Lefebvre y otros, The Prostate 3: 569-578, 1982; Marchetti y Labrie, J. Steroid Biochem, 29: 691-698, 1988; Lacoste y otros, Mol. Cell. Endocrinol. 56: 141-147, 1988; Tunn y otros, Invest. Urol. 18: 289-292, 1980; Scott y Wade, J. Urol. 101: 81-85, 1969; Caine y otros, J. Urol. 114: 564-568, 1975; Stone y otros, J. Urol. 141: 240A, 1989; Clejan y otros, J. Urol. 141: 534A, 1989).

La patente de Estados Unidos núm. 3,423,507 describe el uso del antiandrógeno acetato de ciproterona (1a, 2pmetilen-6-cloro-17 a-acetoxi-6-dehidroprogesterona) para el tratamiento de la hiperplasia prostética benigna. Los antiandrógenos puros (patente de Estados Unidos núm. 4,329,364) provocan un aumento en la secreción de testosterona, lo que puede resultar en un mayor grado de aromatización en estrógenos, una situación que, según los conocimientos actuales, se espera que tenga efectos negativos sobre la hiperplasia prostética (Jacobi y otros, Endocrinology 102: 1748-1755, 1978). Varios estudios demostraron que el tratamiento con la combinación de castración química (agonista de LHRH) y un antiandrógeno causa una mayor inhibición del tamaño prostético que cualquier tratamiento usado solo (Seguin y otros, Mol. Cell. Endocrinol. 21: 37-41, 1981; Lefebvre y otros, The Prostate 3: 569-578, 1982; Marchetti y Labrie, J. Steroid Biochem. 29: 691-698, 1988.

En la próstata, así como en muchos otros tejidos, la 5a-reductasa convierte irreversiblemente la testosterona en el andrógeno més potente dihidrotestosterona (Bruchovsky y Wilson, J. Biol. Chem. 243: 2012-2021, 1968; Wilson, Handbook of Physiology 5). (sección 7), pég. 491-508, 1975). Se descubrió que los inhibidores de la 5 a-reductasa inhiben el crecimiento prostético (Brooks y otros, Endocrinology 109: 830, 1981; Brooks y otros, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 169: 67, 1982; Brooks y otros, Prostate 3: 35, 1982; Wenderoth y otros, Endocrinology 113, 569-573, 1983; McConnell y otros, J. Urol. 141: 239A, 1989); Stoner, E., Conferencia sobre la función del inhibidor de la 5-alfareductasa en la hipertropía prostética benigna, 84a AUA Annual Meeting, Dallas, 8 de mayo de 1989.

El efecto inhibidor del inhibidor de la 5 a-reductasa Merck L 652,931 sobre el desarrollo de vesículas seminales y prostéticas en ratas prepúberes se describió en Proc. 71a Annual Meeting of Endocr. Soc. abst. núm. 1165, pég. 314, 1989. El efecto inhibidor de MK-906 sobre la formación de dihidrotestosterona en hombres se describió en hombres por Gormley y otros, en Proc. 71a Annual Meeting of Endocr. Soc., abst. núm.1225, pég. 329, 1989; Imperato-McGinley y otros, en Proc. 71a Annual Meeting of Endocr. Soc., abst. núm. 1639, pég. 432, 1989; Geller y Franson, en Proc. 71a Annual Meeting of Endocr. Soc., abst. núm. 1640, pég. 432, 1989 y Tenover y otros, en Proc. 71a Annual Meeting of Endocr. Soc., abst. núm. 583, pég. 169, 1989. La actividad de los inhibidores de la 5 a-reductasa N,N-dietil-4-metil-3-oxo-4-aza-5.alfa.-androstano-17.beta.-carboxamida (4-MA) y 6-metilen-4-pregneno-3,20-diona (LY 207320) se describió por Toomey y otros, Proc. 71a Annual Meeting of Endocr. Soc., abst. núm. 1226, pég. 329, 1989.

En adición al conocido efecto de los andrógenos sobre el crecimiento prostético, hay muchos estudios que muestran que los estrógenos también desempeñan una función en la proliferación de la próstata (Walsh y Wilson, J. Clin. Invest. 57: 1093-1097, 1976; Robinette y otros, Invest. Urol. 15: 425-432, 1978; Moore y otros, J. Clin. Invest. 63: 351-257, 1979). Ademés, se demostró que los estrógenos potencian el crecimiento prostético inducido por andrógenos en el perro (Walsh y Wilson, J. Clin. Invest. 57: 1093-1097, 1976; Jacobi y otros, Endocrinology 102: 1748-1755, 1978; Tunn y otros, Urol. Int. 35: 125-140, 1980). Una posible explicación de este efecto potenciador del estrógeno sobre el crecimiento de la próstata inducido por andrógenos es la observación de que se demostró que el 17p-estradiol aumenta la unión de andrógenos en la próstata del perro (Moore y otros, J. Clin. Invest. 63: 351-357, 1979).

Se demostró que el antiestrógeno Tamoxifeno mejora la hiperplasia prostética benigna inducida por esteroides en el perro (Funke y otros, Acta Endocrinol. 100: 462-472, 1982). La administración del antiestrógeno Tamoxifeno en asociación con el antiandrógeno acetato de ciproterona esteroideo en pacientes que padecían hiperplasia prostética benigna mostró efectos beneficiosos sobre los síntomas de la enfermedad (Di Silverio y otros, en Ipertrofia Prostatica Benigna (F. Di Silverio, F. Neumann y M. Tannenbaum, ed), Excerpta Medica, pég. 117-125, 1986). En la patente de Estados Unidos núm. 4,310,523, se propone que una combinación de un antiandrógeno y un antiestrógeno es efectiva para la profilaxis y/o terapia de la hiperplasia prostética benigna. El tamoxifeno, sin embargo, tiene una actividad estrogénica intrínseca que limita su efectividad.

La formación de estrógenos resultante de la aromatización de andrógenos se produce en varios sitios. En el hombre, se demostró la aromatización de andrógenos en los testículos, tejido adiposo y muscular, piel, hígado, cerebro y próstata (Schweikert y otros, J. Clin. Endocrinol. Metab. 40: 413-417, 1975; Folker y James, J. Steroid Biochem. 49: 687-690, 1983; Longcope y otros, J. Clin. Endocrinol. Metab. 46: 146-152, 1978; Lacoste y Labrie, datos no publicados; Stone y otros, The Prostate 9: 311-318, 1986; Stone y otros, Urol. Res. 15: 165-167, 1987). Existe evidencia de una mayor producción de estrógenos en el tejido prostético de pacientes con hiperplasia prostética benigna (Stone y otros, The Prostate 9: 311-318, 1986). Tales datos indican que la formación local de estrógenos puede desempeñar una función crucial en la estimulación del crecimiento prostético en exceso de la acción predicha por los estrógenos circulantes.

La patente de Estados Unidos núm. 4,472,382 describe el tratamiento de BPH con un antiandrógeno y ciertos péptidos que actúan como agonistas de LH-RH. La patente de Estados Unidos núm. 4,596,797 describe inhibidores de aromatasa como un método de profilaxis y/o tratamiento de la hiperplasia prostética. La patente de Estados Unidos núm. 4,760,053 describe un tratamiento de ciertos cénceres que combina un agonista de LHRH con un antiandrógeno y/o un antiestrógeno y/o al menos un inhibidor de la biosíntesis de esteroides sexuales. La patente de Estados Unidos núm. 4,775,660 describe un método para tratar el céncer de mama con una terapia de combinación que puede incluir la prevención quirúrgica o química de las secreciones ovéricas y la administración de un antiandrógeno y un antiestrógeno.

La patente de Estados Unidos núm. 4,659,695 describe un método de tratamiento del cáncer de próstata en animales machos susceptibles que incluyen seres humanos cuyas secreciones hormonales testiculares se bloquean por medios quirúrgicos o químicos, por ejemplo, mediante el uso de un agonista de LHRH, que comprende la administración de un antiandrógeno, por ejemplo, flutamida, en asociación con al menos un inhibidor de la biosíntesis de esteroides sexuales, por ejemplo, aminoglutetimida y/o ketoconazol.

La BPH tiene como causa una mayor actividad tanto de los andrógenos como de los estrógenos. Debido a esta doble etiología de la BPH, las terapias hormonales propuestas son menos que satisfactorias y todas son impredecibles mientras que, con frecuencia, causan efectos secundarios inaceptables. Además, el tratamiento de la técnica anterior rara vez da como resultado una disminución del volumen prostático por encima de aproximadamente el 20 al 30 % con efectos inconsistentes sobre la sintomatología (Scott y Wade, J. Urol. 101: 81-85, 1969; Caine y otros, J. Urol. 114: 564-568, 1975; Peters y Walsh, New Engl. J. Med. 317: 599-604, 1987; Gabrilove y otros, J. Clin. Endocrinol. Metab. 64: 1331-1333, 1987; Stone y otros, J. Urol. 141: 240A, 1989; Clejan y otros, J. Urol. 141: 534A, 1989; Stoner, E., Conferencia sobre la función del inhibidor de la 5 a-reductasa en la hipertrofia prostática benigna, 84a AUA Annual Meeting, Dallas, 8 de mayo de 1989.

La elucidación del mecanismo resumido anteriormente resultó en el desarrollo reciente de agentes efectivos para controlar, y en muchos casos revertir, el avance de la BPH. A la vanguardia de estos agentes se encuentra el producto PROSCAR® (finasterida) de Merck & Co., Inc. El efecto de este compuesto es inhibir la enzima testosterona 5a reductasa, que convierte la testosterona en 5a-dihidrotesterona, lo que resulta en una tasa de agrandamiento prostático reducida y, a menudo, en la reducción de la masa prostática.

El desarrollo de agentes como PROSCAR® es un buen augurio para el control a largo plazo de la BPH. Sin embargo, como puede apreciarse por el desarrollo prolongado del síndrome, su reversión tampoco es inmediata. Mientras tanto, los varones que padecen BPH continúan con sufrimiento y, de hecho, pueden perder la esperanza de que los agentes actúen con la suficiente rapidez.

En respuesta a este problema, una solución es identificar compuestos farmacéuticamente activos que complementen las terapias de acción más lenta y proporcionen un alivio agudo. Los agentes que inducen la relajación del tejido del tracto urinario inferior, mediante la unión a los receptores adrenérgicos alfa 1, y que reducen así el tono adrenérgico aumentado debido a la enfermedad, serían buenos candidatos para esta actividad. Por tanto, uno de estos agentes es la alfuzosina, que se informa en el documento núm. EP 0204597 para inducir la micción en casos de hiperplasia prostática. Asimismo, en el documento núm. WO 92/00073, se informó sobre la capacidad selectiva del enantiómero R(+) de la terazosina para unirse a receptores adrenérgicos del subtipo alfa-^i. En adición, en el documento núm. WO 92/16213, se describieron combinaciones de compuestos inhibidores de la S a -reductasa y bloqueadores del receptor alfa1-adrenérgico (terazosina, doxazosina, prazosina, bunazosina, indoramina, alfulzosina). Sin embargo, no se proporcionó información sobre la especificidad del subtipo alfa 1d, alfa 1b, o alfa 1a de estos compuestos, ya que se desconocían estos datos y su relevancia para el tratamiento de la BPH. La terapia actual para BPH usa antagonistas de alfa 1 no selectivos existentes, como prazosina (Minipress, Pfizer), terazosina (Hytrin, Abbott) o mesilato de doxazosina (Cardura, Pfizer). Estos antagonistas no selectivos padecen de efectos secundarios relacionados con el antagonismo de los receptores alfa 1d y alfa 1b en la vasculatura periférica, por ejemplo, hipotensión y síncope.

La clonación del receptor adrenérgico alfa 1a humano (ATCC CRL 11140) y el uso de un ensayo de cribado que usa el receptor alfa 1a humano clonado permite la identificación de compuestos que interactúan específicamente con el receptor adrenérgico alfa 1a humano. [Publicaciones de solicitud internacional del PCT núm. WO94/08040, publicada el 14 de abril de 1994 y WO94/10989, publicada el 26 de mayo de 1994], WO 96/14846, publicada el 23 de mayo de 1996, describen un amplio género de compuestos de dihidropirimidina y propone su uso como antagonistas selectivos de los receptores alfa 1a humanos. Los compuestos se ensayaron mediante el uso de receptores alfa adrenérgicos humanos clonados, y se describió que algunos de los compuestos así ensayados eran antagonistas selectivos de alfa 1a.

Existen otras condiciones que implican elementos celulares no deseados donde es deseable la eliminación celular selectiva. Por ejemplo, las enfermedades cardíacas y los accidentes cerebrovasculares comúnmente tienen como causa la aterosclerosis, que es una lesión proliferativa de elementos fibrograsos y del músculo liso modificado que distorsionan la pared de los vasos sanguíneos, estrechan el lumen, restringen el flujo sanguíneo, predisponen a coágulos sanguíneos focales y, en última instancia, conducen a bloqueo e infarto. Existen varios tratamientos para la aterosclerosis, como los injertos de derivación; injertos artificiales; angioplastia con recanalización, curetaje, radiación, láser, u otra extirpación; farmacoterapia para inhibir la aterosclerosis mediante la reducción de lípidos; terapias anticoagulantes; y medidas generales de dieta, ejercicio, y estilo de vida. Se necesita un método para eliminar las lesiones ateroscleróticas sin el riesgo y los efectos secundarios de los procedimientos quirúrgicos.

Otros ejemplos de elementos celulares no deseados en los que es deseable la eliminación celular selectiva incluyen crecimientos inducidos por virus, tales como verrugas. Otro ejemplo son las masas inflamatorias hipertróficas que se encuentran en condiciones inflamatorias y cicatrices hipertróficas o queloides. Otros ejemplos más se encuentran en contextos cosméticos tales como la eliminación de vello no deseado, por ejemplo, vello facial, o para el encogimiento de áreas de tejido no deseado con fines cosméticos, tales como en la dermis facial y tejidos conectivos o en la dermis y tejido conectivo de las extremidades.

Otros ejemplos de elementos celulares no deseados en los que es deseable la eliminación celular selectiva o la inhibición de la proliferación celular incluyen estenosis y reestenosis de cualquier arteria, válvula o canal en el sistema circulatorio, que incluyen, pero no se limitan a, válvulas (por ejemplo, estenosis aórtica que implica el estrechamiento del orificio de la válvula aórtica), arterias coronarias (por ejemplo, esclerosis ostial coronaria que implica el estrechamiento de las bocas de las arterias coronarias), arterias carótidas, y arterias renales. Otros ejemplos incluyen la inhibición o eliminación del crecimiento o acumulación celular no deseado que causa la ocultación parcial o completa de dispositivos médicos tales como stents colocados o implantados dentro de un vaso sanguíneo para tratar estenosis, estenosis, o aneurismas en el mismo o dentro del tracto urinario y en los conductos biliares.

Otros ejemplos más serán obvios para los expertos en la técnica. En todos o en la mayoría de estos ejemplos existe la necesidad de tratamientos que puedan eliminar o destruir los elementos celulares no deseados sin los riesgos y efectos secundarios de las terapias convencionales o eliminar los elementos celulares no deseados con más precisión.

La descripción anterior de la técnica relacionada no pretende en modo alguno admitir que cualquiera de los documentos descritos en la misma, incluidas las solicitudes de patente estadounidenses pendientes, sean una técnica anterior a la presente descripción. Además, la descripción en la presente descripción de cualquier desventaja asociada con los productos, métodos, y/o aparatos descritos no pretende limitar las modalidades. De hecho, los aspectos de las modalidades pueden incluir ciertas características de los productos, métodos, y/o aparatos descritos sin sufrir las desventajas descritas.

Resumen de las modalidades

Aún existe una necesidad en la técnica de tratamientos nuevos, menos tóxicos y menos frecuentes (por ejemplo, que eviten la necesidad de tomar medicamentos diaria o semanalmente) para tratar elementos celulares no deseados. También existe aún una necesidad en la técnica de tales tratamientos que reduzcan la necesidad de una intervención quirúrgica invasiva posterior. Las modalidades satisfacen estas necesidades.

Esta descripción se basa en parte en el descubrimiento de que ciertos péptidos NTP, que incluyen un péptido específico descrito por la secuencia de aminoácidos lle-Asp-Gln-Gln-Val-Leu-Ser-Arg-lle-Lys-Leu-Glu-lle-Lys-Arg-Cys-Leu, son capaces de tratar y/o matar proliferaciones celulares no deseadas en mamíferos cuando se combinan con al menos un agente activo adicional capaz de tratar y/o matar proliferaciones celulares no deseadas en mamíferos. Estas proliferaciones celulares no deseadas incluyen, entre otros, tumores benignos y malignos, hiperplasia glandular (por ejemplo, de próstata), vello facial no deseado, verrugas, y tejido graso no deseado.

Esta descripción también se basa en parte en el descubrimiento de que ciertos péptidos NTP, que incluyen un péptido específico descrito por la secuencia de aminoácidos lle-Asp-Gln-Gln-Val-Leu-Ser-Arg-lle-Lys-Leu-Glu-lle-Lys-Arg-Cys-Leu, ya sea solo o en combinación con un agente activo adicional capaz de tratar y/o matar proliferaciones celulares no deseadas en mamíferos, proporciona una mejora inesperada en pacientes que posteriormente se someten a un tratamiento quirúrgico. La mejora es más pronunciada en pacientes sin tratamiento previo y en pacientes a los que se les administra el péptido NTP, solo o en combinación con un agente activo adicional, más de una vez.

Algunas modalidades se dirigen a métodos para reducir la necesidad de una intervención quirúrgica invasiva posterior en pacientes que padecen proliferaciones celulares no deseadas (tumores benignos y malignos, hiperplasia glandular (por ejemplo, de próstata), vello facial no deseado, verrugas, y tejido graso no deseado) que comprenden la administración a un mamífero que lo necesite de una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición que comprende un péptido NTP, solo o en combinación con al menos un agente activo adicional capaz de tratar y/o matar proliferaciones celulares no deseadas en mamíferos. En una modalidad, los pacientes tratados son aquellos que no se trataron previamente para la proliferación celular no deseada. En otra modalidad, las composiciones se administran más de una vez.

Las composiciones pueden administrarse por intramuscularmente, oralmente, intravenosamente, intraperitonealmente, intracerebralmente (intraparenquimatosamente), intracerebroventricularmente, intratumoralmente, intralesionalmente, intradérmicamente, intratecalmente, intranasalmente, intraocularmente, intraarterialmente, tópicamente, transdérmicamente, mediante un dispositivo de implantación, aerosol, infusión, inyección de bolo, sistema de liberación sostenida, etc. Alternativamente, los péptidos NTP pueden expresarse in vivo mediante la administración de un gen que expresa los péptidos NTP, mediante la administración de una vacuna que induce tal producción o mediante la introducción de células, bacterias o virus que expresan el péptido in vivo, debido a modificación genética o de otro manera.

Tanto la descripción general anterior como la siguiente descripción detallada son ilustrativas y explicativas y pretenden proporcionar una explicación adicional de las modalidades reivindicadas. Otros objetos, ventajas, y características serán fácilmente evidentes para los expertos en la técnica a partir de la siguiente descripción detallada de las modalidades.

Descripción detallada de las modalidades preferidas

Antes de que se describan las presentes proteínas, secuencias de nucleótidos, péptidos, composiciones, agentes activos, etc., y métodos, se entiende que esta invención no se limita a la metodología, protocolos, líneas celulares, vectores y reactivos particulares descritos, ya que estos pueden variar. También debe entenderse que la terminología usada en la presente descripción tiene el propósito de describir únicamente modalidades particulares, y no pretende limitar el alcance de las presentes modalidades que se limitarán únicamente por las reivindicaciones adjuntas.

Los términos y frases usados en la presente descripción se definen como se establece más abajo a menos que se especifique de otra manera. A través de la descripción, las formas singulares "un", "una", "uno", y "el", "la" incluyen referentes plurales a menos que el contexto lo indique claramente de otra manera. Así, por ejemplo, una referencia a "una célula huésped" incluye una pluralidad de tales células huésped, y una referencia a "un anticuerpo" es una referencia a uno o más anticuerpos y sus equivalentes conocidos por los expertos en la técnica, y así en adelante. Puede hacerse referencia a los aminoácidos y residuos de aminoácidos descritos en la presente descripción de acuerdo con el código aceptado de una o tres letras que se proporciona en la tabla siguiente.

Tabla 1

La expresión "péptido NTP" se refiere a péptidos que comprenden secuencias de aminoácidos correspondientes a al menos una parte de la secuencia de aminoácidos de las proteínas del hilo neural o fragmentos de proteínas del hilo neural e incluye homólogos, derivados, variantes, proteínas de fusión, y miméticos de péptidos de tales péptidos a menos que el contexto indique lo contrario. La expresión "péptido ⁿT^p" también se refiere a un péptido u otra composición de materia reivindicada en una o más de las siguientes publicaciones de solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2007/0237780 (ahora abandonada); 2003/0054990 (ahora patente de Estados Unidos núm.

7,172,893); 2003/0096350 (ahora patente de Estados Unidos núm. 6,924,266); 2003/0096756 (ahora patente de Estados Unidos núm. 7,192,929); 2003/0109437 (ahora patente de Estados Unidos núm. 7,241,738); 2003/0166569 (ahora patente de Estados Unidos núm. 7,317,077); y 2005/0032704 (ahora patente de Estados Unidos núm.

7,408,021). Los péptidos específicos se enumeran más abajo.

)

SEQ ID NO. 1: MEFSLLLPRLECNGA o Met-Glu-Phe-Ser-Leu-Leu-Leu-Pro-Arg-Leu-Glu-Cys-Asn-Gly-Ala

)

SEQ ID NO. 2: GAISAHRNLRLPGSS o Gly-Ala-Ile-Ser-Ala-His-Arg-Asn-Leu-Arg-Leu-Pro-Gly-Ser-Ser )

SEQ ID NO. 3: DSPASASPVAGITGMCT o Asp-Ser-Pro-Ala-Ser-Ala-Ser-Pro-Val-Ala-Gly-lle-Thr-Gly-Met-Cys-Thr )

SEQ ID NO.4: MCTHARLILYFFLVEM o Met-Cys-Thr-His-Ala-Arg-Leu-lle-Leu-Tyr-Phe-Phe-Leu-Val-Glu-Met

)

SEQ ID NO.5: YFFLVEMEFLH o Tyr-Phe-Phe-Leu-Val-Glu-Met-Glu-Phe-Leu-His

)

SEQ ID NO.6: VGQAGLELPTS o Val-Gly-Gln-Ala-Gly-Leu-Glu-Leu-Pro-Thr-Ser

)

SEQ ID NO.7: DDPSVSASQSARYRTGH o Asp-Asp-Pro-Ser-Val-Ser-Ala-Ser-Gln-Ser-Ala-Arg-Tyr-Arg-Thr-Gly-His )

SEQ ID NO.8: TGHHARLCLANFCG o Thr-Gly-His-His-Ala-Arg-Leu-Cys-Leu-Ala-Asn-Phe-Cys-Gly

)

SEQ ID NO.9: ANFCGRNRVSLMCPSWS o Ala-Asn-Phe-Cys-Gly-Arg-Asn-Arg-Val-Ser-Leu-Met-Cys-Pro-Ser-Trp-Ser 0)

SEQ ID NO.10: PELKQSTCLSLPKCWDYRR o Pro-Glu-Leu-Lys-Gln-Ser-Thr-Cys-Leu-Ser-Leu-Pro-Lys-Cys-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg

1)

SEQ ID NO.11: LKQSTCLSLPKCWDYRR o Leu-Lys-Gln-Ser-Thr-Cys-Leu-Ser-Leu-Pro-Lys-Cys-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg 2)

SEQ ID NO.12: STCLSLPKCWDYRR o Ser-Thr-Cys-Leu-Ser-Leu-Pro-Lys-Cys-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg

3)

SEQ ID NO.13: LSLPKCWDYRR o Leu-Ser-Leu-Pro-Lys-Cys-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg

)

SEQ ID NO.14: KCWDYRRAAVPGL o Lys-Cys-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Leu

)

SEQ ID NO.15: KCWDYRRAAVPGLFILFFL o Lys-Cys-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Leu-Phe-lle-Leu-Phe-Phe-Leu

)

SEQ ID NO.16: KCWDYRRAAVPGLFILFFLRHRCP o Lys-Cys-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Leu-Phe-lle-Leu-Phe-Phe-Leu-Arg-His-Arg-Cys-Pro

)

SEQ ID NO.17:

KCWDYRRAAVPGLFILFFLRHRCPTLTQDEVQWCDHSS o Lys-Cys-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Leu-Phe-Ne-Leu-Phe-Phe-Leu-Arg-His-Arg-Cys-Pro-Thr-Leu-Thr-Gln-Asp-Glu-Val-Gln-Trp-Cys-Asp-His-Ser-Ser ) SEQ ID NO.18: WDYRR o Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg

)

SEQ ID NO.19: FILFFLRHRCPTL o Phe-lle-Leu-Phe-Phe-Leu-Arg-His-Arg-Cys-Pro-Thr-Leu

)

SEQ ID NO.20: FILFFLRHRCPTLTQDEVQWCDHSS o Phelle-Leu-Phe-Phe-Leu-Arg-His-Arg-Cys-Pro-Thr-Leu-Thr-Gln-Asp-Glu-Val-Gln-Trp-Cys-Asp-His-Ser-Ser )

SEQ ID NO.21: HRCPTLTQDEVQWCDHSSLQPSTPEIKHP

o His-Arg-Cys-Pro-Thr-Leu-Thr-Gln-Asp-Glu-Val-Gln-Trp-Cys-Asp-His-Ser-Ser-Leu-Gln-Pro-Ser-Thr-Pro-Glu-lle-Lys-His-Pro )

SEQ ID NO.22: PASASQVAGTKDMH o Pro-Ala-Ser-Ala-Ser-Gln-Val-Ala-Gly-Thr-Lys-Asp-Met-His

)

SEQ ID NO.23: DMHHYTWLIFIFIFNFLR o Asp-Met-His-His-Tyr-Thr-Trp-Leu-Ile-Phe-Ile-Phe-Ne-Phe-Asn-Phe-Leu-Arg )

SEQ ID NO.24: HYTWLIFIFIFNFLRQSLN o His-Tyr-Thr-Trp-Leu-lle-Phe-lle-Phe-lle-Phe-Asn-Phe-Leu-Arg-Gln-Ser-Leu-Asn

)

SEQ ID NO.25:

SVTQAGVQWRNLGSLQPLPPGFKLFSCPSLLSSWDYRRPP

RLANF o Ser-Val-Thr-Gln-Ala-Gly-Val-Gln-Trp-Arg-Asn-Leu-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Pro-Pro-Gly-Phe-Lys-Leu-Phe-Ser-Cys-Pro-Ser-Leu-Leu-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg-Pro-Pro-Arg-Leu-Ala-Asn-Phe

)

SEQ ID NO.26: PGFKLFSCPSLLSSWDYRR o Pro-Gly-Phe-Lys-Leu-Phe-Ser-Cys-Pro-Ser-Leu-Leu-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg

)

SEQ ID NO.27: FKLFSCPSLLSSWDYRRPPRLANF o Phe-Lys-Leu-Phe-Ser-Cys-Pro-Ser-Leu-Leu-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg-Pro-Pro-Arg-Leu-Ala-Asn-Phe

)

SEQ ID NO.28: FSCPSLLSSWDYRR o Phe-Ser-Cys-Pro-Ser-Leu-Leu-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg )

SEQ ID NO.29: SLLSSWDYRR o Ser-Leu-Leu-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg

) SEQ ID NO.30: SSWDY o Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr

) SEQ ID NO.31: SSWDYRR o Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg

)

SEQ ID NO.32: SSWDYRRPPRLANFFVFLVEMGFTM o Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg-Pro-Pro-Arg-Leu-Ala-Asn-Phe-Phe-Val-Phe-Leu-Val-Glu-Met-Gly-Phe-Thr-Met )

SEQ ID NO.33: FVFLVEMGFTM o Phe-Val-Phe-Leu-Val-Glu-Met-Gly-Phe-Thr-Met

)

SEQ ID NO.34: MGFTMFARLILISGPCDLPASAS o Met-Gly-Phe-Thr-Met-Phe-Ala-Arg-Leu-lle-Leu-lle-Ser-Gly-Pro-Cys-Asp-Leu-Pro-Ala-Ser-Ala-Ser

) SEQ ID NO.35: ISGPC o lle-Ser-Gly-Pro-Cys

)

SEQ ID NO.36: DLPASASQSAGITGVSH o Asp-Leu-Pro-Ala-Ser-Ala-Ser-Gln-Ser-Ala-Gly-lle-Thr-Gly-Val-Ser-His )

SEQ ID NO.37: GVSHHARLIFNFCLFEM o Gly-Val-Ser-His-His-Ala-Arg-Leu-lle-Phe-Asn-Phe-Cys-Leu-Phe-Glu-Met )

SEQ ID NO.38: NFCLFEMESH o Asn-Phe-Cys-Leu-Phe-Glu-Met-Glu-Ser-His

)

SEQ ID NO.39:

SVTQAGVQWPNLGSLQPLPPGLKRFSCLSLPSSWDYGHLP

PHPANF o Ser-Val-Thr-Gln-Ala-Gly-Val-Gln-Trp-Pro-Asn-Leu-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Pro-Pro-Gly-Leu-Lys-Arg-Phe-Ser-Cys-Leu-Ser-Leu-Pro-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Gly-His-Leu-Pro-Pro-His-Pro-Ala-Asn-Phe

)

SEQ ID NO.40: PPGLKRFSCLSLPSSWDYG o Pro-Pro-Gly-Leu-Lys-Arg-Phe-Ser-Cys-Leu-Ser-Leu-Pro-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Gly

)

SEQ ID NO.41: FSCLSLPSSWDYGH o Phe-Ser-Cys-Leu-Ser-Leu-Pro-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Gly-His )

SEQ ID NO.42: LSLPSSWDY o Leu-Ser-Leu-Pro-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr

)

SEQ ID NO.43:

SSWDYGHLPPHPANFCIFIRGGVSPYLSGWSQTPDLR o Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Gly-His-Leu-Pro-Pro-His-Pro-Ala-Asn-Phe-Cys-lle-Phe-Ne-Arg-Gly-Gly-Val-Ser-Pro-Tyr-Leu-Ser-Gly-Trp-Ser-Gln-Thr-Pro-Asp-Leu-Arg

)

SEQ ID NO.44: PGFFKLFSCPSLLSSWDYRR o Pro-Gly-Phe-Phe-Lys-Leu-Phe-Ser-Cys-Pro-Ser-Leu-Leu-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg

)

SEQ ID NO.45: PELKQSTCLSLPKCWDYRR o Pro-Glu-Leu-Lys-Gln-Ser-Thr-Cys-Leu-Ser-Leu-Pro-Lys-Cys-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg

)

SEQ ID NO.46: PPGLKRFSCLSLPSSWDYG o Pro-Pro-Gly-Leu-Lys-Arg-Phe-Ser-Cys-Leu-Ser-Leu-Pro-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Gly

)

SEQ ID NO.47: FSCLSLPSSWDYGH o Phe-Ser-Cys-Leu-Ser-Leu-Pro-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Gly-His )

SEQ ID NO.48: STCLSLPKCWDYRR o Ser-Thr-Cys-Leu-Ser-Leu-Pro-Lys-Cys-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg

)

SEQ ID NO.49: FSCPSLLSSWDYRR o Phe-Ser-Cys-Pro-Ser-Leu-Leu-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg )

SEQ ID NO.50: LSLPSSWDY o Leu-Ser-Leu-Pro-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr

)

SEQ ID NO.51: LSLPKCWDYRR o Leu-Ser-Leu-Pro-Lys-Cys-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg

)

SEQ ID NO.52: SLLSSWDYRR o Ser-Leu-Leu-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg

)

SEQ ID NO.53: LPSSWDYRR o Leu-Pro-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg

) SEQ ID NO.54: SSWDYRR o Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg

) SEQ ID NO.55: SSWDY o Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr

)

SEQ ID NO.56: SSWDYRRFILFFL o Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg-Phe-Ile-Leu-Phe-Phe-Leu

)

SEQ ID NO.57: WDYRRFIFNFL o Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg-Phelle-Phe-Asn-Phe-Leu

) SEQ ID NO.58: FNFCLF o Phe-Asn-Phe-Cys-Leu-Phe

) SEQ ID NO.59: FIFNFL o Phe-lle-Phe-Asn-Phe-Leu

)

SEQ ID NO.60: PASASPVAGITGM o Pro-Ala-Ser-Ala-Ser-Pro-Val-Ala-Gly-lle-Thr-Gly-Met

)

SEQ ID NO.61: PASASQVAGTKDM o Pro-Ala-Ser-Ala-Ser-Gln-Val-Ala-Gly-Thr-Lys-Asp-Met

)

SEQ ID NO.62: PASASQSAGITGV o Pro-Ala-Ser-Ala-Ser-Gln-Ser-Ala-Gly-lle-Thr-Gly-Val

)

SEQ ID NO.63: PASASPVAG o Pro-Ala-Ser-Ala-Ser-Pro-Val-Ala-Gly

) SEQ ID NO.64: FFLVEM o Phe-Phe-Leu-Val-Glu-Met

)

SEQ ID NO.65: SVTQAGVQW o Ser-Val-Thr-Gln-Ala-Gly-Val-Gln-Trp

)

SEQ ID NO.66: IDQQVLSRIKLEIKRCL o lle-Asp-Gln-Gln-Val-Leu-Ser-Arg-lle-Lys-Leu-Glu-lle-Lys-Arg-Cys-Leu

)

SEQ ID NO.67: LSRIKLEIK o Leu-Ser-Arg-lle-Lys-Leu-Glu-Ile-Lys

)

SEQ ID NO.68: GDHGRPNLSRLKLAIKYEVKKM o Gly-Asp-His-Gly-Arg-Pro-Asn-Leu-Ser-Arg-Leu-Lys-Leu-Ala-lle-Lys-Tyr-Glu-Val-Lys-Lys-Met

)

SEQ ID NO.69: QQSIAVKFLAVFGVSI o Gln-Gln-Ser-lle-Ala-Val-Lys-Phe-Leu-Ala-Val-Phe-Gly-Val-Ser-lle )

SEQ ID NO.70: GLLFPVFSVCYLIAPKSPLGL o Gly-Leu-Leu-Phe-Pro-Val-Phe-Ser-Val-Cys-Tyr-Leu-lle-Ala-Pro-Lys-Ser-Pro-Leu-Gly-Leu

)

SEQ ID NO.71: MMVCWNRFGKWVYFI o Met-Met-Val-Cys-Trp-Asn-Arg-Phe-Gly-Lys-Trp-Val-Tyr-Phe-lle )

SEQ ID NO.72: SAIFNFGPRYLYHGV o Ser-Ala-lle-Phe-Asn-Phe-Gly-Pro-Arg-Tyr-Leu-Tyr-His-Gly-Val )

SEQ ID NO.73: PFYFLILVRIISFLI o Pro-Phe-Tyr-Phe-Leu-lle-Leu-Val-Arg-Ne-Ne-Ser-Phe-Leu-Ne

)

SEQ ID NO.74: GDMEDVLLNCTLLKR o Gly-Asp-Met-Glu-Asp-Val-Leu-Leu-Asn-Cys-Thr-Leu-Leu-Lys-Arg

)

SEQ ID NO.75: SSRFRFWGALVCSMD o Ser-Ser-Arg-Phe-Arg-Phe-Trp-Gly-Ala-Leu-Val-Cys-Ser-Met-Asp

)

SEQ ID NO.76: SCRFSRVAVTYRFIT o Ser-Cys-Arg-Phe-Ser-Arg-Val-Ala-Val-Thr-Tyr-Arg-Phe-Ile-Thr )

SEQ ID NO.77: LLNIPSPAVWMARNT o Leu-Leu-Asn-lle-Pro-Ser-Pro-Ala-Val-Trp-Met-Ala-Arg-Asn-Thr )

SEQ ID NO.78: MAQSRLTATSASRVQ o Met-Ala-Gln-Ser-Arg-Leu-Thr-Ala-Thr-Ser-Ala-Ser-Arg-Val-Gln )

SEQ ID NO.79: AILLSQPPKQLGLRA o Ala-lle-Leu-Leu-Ser-Gln-Pro-Pro-Lys-Gln-Leu-Gly-Leu-Arg-Ala )

SEQ ID NO.80: PANTPLIFVFSLEAG o Pro-Ala-Asn-Thr-Pro-Leu-lle-Phe-Val-Phe-Ser-Leu-Glu-Ala-Gly )

SEQ ID NO.81: FHHICQAGLKLLTSG o Phe-His-His-lle-Cys-Gln-Ala-Gly-Leu-Lys-Leu-Leu-Thr-Ser-Gly

)

SEQ ID NO.82: DPPASAFQSAGITGV o Asp-Pro-Pro-Ala-Ser-Ala-Phe-Gln-Ser-Ala-Gly-Ile-Thr-Gly-Val )

SEQ ID NO.83: SHLTQPANLDKKICS o Ser-His-Leu-Thr-Gln-Pro-Ala-Asn-Leu-Asp-Lys-Lys-lle-Cys-Ser )

SEQ ID NO.84: NGGSCYVAQAGLKLLASCNPSK o Asn-Gly-Gly-Ser-Cys-Tyr-Val-Ala-Gln-Ala-Gly-Leu-Lys-Leu-Leu-Ala-Ser-Cys-Asn-Pro-Ser-Lys

)

SEQ ID NO.85: MWTLKSSLVLLLCLT o Met-Trp-Thr-Leu-Lys-Ser-Ser-Leu-Val-Leu-Leu-Leu-Cys-Leu-Thr )

SEC ID NO 86: CSYAFMFSSLRQKTS o Cys-Ser-Tyr-Ala-Phe-Met-Phe-Ser-Ser-Leu-Arg-Gln-Lys-Thr-Ser

)

SEQ ID NO.87: EPQGKVPCGEHFRIR o Glu-Pro-Gln-Gly-Lys-Val-Pro-Cys-Gly-Glu-His-Phe-Arg-lle-Arg )

SEQ ID NO.88: QNLPEHTQGWLGSKW o Gln-Asn-Leu-Pro-Glu-His-Thr-Gln-Gly-Trp-Leu-Gly-Ser-Lys-Trp )

SEQ ID NO.89: LWLLFAWPFVILKC o Leu-Trp-Leu-Leu-Phe-Ala-Val-Val-Pro-Phe-Val-lle-Leu-Lys-Cys )

SEQ ID NO.90: QRDSEKNKVRMAPFF o Gln-Arg-Asp-Ser-Glu-Lys-Asn-Lys-Val-Arg-Met-Ala-Pro-Phe-Phe

)

SEQ ID NO.91: LHHIDSISGVSGKRMF o Leu-His-His-lle-Asp-Ser-lle-Ser-Gly-Val-Ser-Gly-Lys-Arg-Met-Phe )

SEQ ID NO.92: EAYYTMLHLPTTNRP o Glu-Ala-Tyr-Tyr-Thr-Met-Leu-His-Leu-Pro-Thr-Thr-Asn-Arg-Pro )

SEQ ID NO.93: KIAHCILFNQPHSPR o Lys-lle-Ala-His-Cyslle-Leu-Phe-Asn-Gln-Pro-His-Ser-Pro-Arg )

SEQ ID NO.94: SNSHSHPNPLKLHRR o Ser-Asn-Ser-His-Ser-His-Pro-Asn-Pro-Leu-Lys-Leu-His-Arg-Arg

)

SEQ ID NO.95: SHSHNRPRAYILITI o Ser-His-Ser-His-Asn-Arg-Pro-Arg-Ala-Tyr-Ne-Leu-Ne-Thr-Ne

)

SEQ ID NO.96: LPSKLKLRTHSQSHH o Leu-Pro-Ser-Lys-Leu-Lys-Leu-Arg-Thr-His-Ser-Gln-Ser-His-His

)

SEQ ID NO.97: NPLSRTSNSTPTNSFLMTSSKPR o Asn-Pro-Leu-Ser-Arg-Thr-Ser-Asn-Ser-Thr-Pro-Thr-Asn-Ser-Phe-Leu-Met-Thr-Ser-Ser-Lys-Pro-Arg

)

SEQ ID NO.98: SSSLGLPKCWDYRHE o Ser-Ser-Ser-Leu-Gly-Leu-Pro-Lys-Cys-Trp-Asp-Tyr-Arg-His-Glu

)

SEQ ID NO.99: LLSLALMINFRVMAC o Leu-Leu-Ser-Leu-Ala-Leu-Met-lle-Asn-Phe-Arg-Val-Met-Ala-Cys

0)

SEQ ID NO.100: TFKQHIELRQKISIV o Thr-Phe-Lys-Gln-Hislle-Glu-Leu-Arg-Gln-Lys-lle-Ser-lle-Val

1)

SEQ ID NO.101: PRKLCCMGPVCPVKI o Pro-Arg-Lys-Leu-Cys-Cys-Met-Gly-Pro-Val-Cys-Pro-Val-Lys-lle

2)

SEQ ID NO.102: ALLTINGHCTWLPAS o Ala-Leu-Leu-Thr-lle-Asn-Gly-His-Cys-Thr-Trp-Leu-Pro-Ala-Ser

3)

SEQ ID NO.103: MFVFCLILNREKIKG o Met-Phe-Val-Phe-Cys-Leu-lle-Leu-Asn-Arg-Glu-Lys-lle-Lys-Gly

4)

SEQ ID NO.104: GNSSFFLLSFFFSFQ o Gly-Asn-Ser-Ser-Phe-Phe-Leu-Leu-Ser-Phe-Phe-Phe-Ser-Phe-Gln

5)

SEQ ID NO.105: NCCQCFQCRTTEGYA o Asn-Cys-Cys-Gln-Cys-Phe-Gln-Cys-Arg-Thr-Thr-Glu-Gly-Tyr-Ala

6)

SEQ ID NO.106: VECFYCLVDKAAFECWWFYSFDT o Val-Glu-Cys-Phe-Tyr-Cys-Leu-Val-Asp-Lys-Ala-Ala-Phe-Glu-Cys-Trp-Trp-Phe-Tyr-Ser-Phe-Asp-Thr

7)

SEQ ID NO.107: MEPHTVAQAGVPQHD o Met-Glu-Pro-His-Thr-Val-Ala-Gln-Ala-Gly-Val-Pro-Gln-His-Asp

108)

SEQ ID NO.108: LGSLQSLLPRFKRFS o Leu-Gly-Ser-Leu-Gln-Ser-Leu-Leu-Pro-Arg-Phe-Lys-Arg-Phe-Ser

109)

SEQ ID NO.109: CLILPKIWDYRNMNT o Cys-Leu-lle-Leu-Pro-Lys-Ile-Trp-Asp-Tyr-Arg-Asn-Met-Asn-Thr

110)

SEQ ID NO.110: ALIKRNRYTPETGRKS o Ala-Leu-lle-Lys-Arg-Asn-Arg-Tyr-Thr-Pro-Glu-Thr-Gly-Arg-Lys-Ser

111)

SEQ ID NO.111: IDQQVLSRI o lle-Asp-Gln-Gln-Val-Leu-Ser-Arg-lle

112)

SEQ ID NO.112: KLEIKRCL o Lys-Leu-Glu-lle-Lys-Arg-Cys-Leu

113) SEQ ID NO.113: VLSRIK o Val-Leu-Ser-Arg-lle-Lys

114) SEQ ID NO.114: RIKLEIK o Arg-lle-Lys-Leu-Glu-lle-Lys

115)

SEQ ID NO.115: VLSRIKLEIKRCL o Val-Leu-Ser-Arg-lle-Lys-Leu-Glu-lle-Lys-Arg-Cys-Leu; and

116)

SEQ ID NO.116: IDQQVLSRIKLEI o lle-Asp-Gln-Gln-Val-Leu-Ser-Arg-lle-Lys-Leu-Glu-lle.

La expresión "péptido NTP" también incluye, preferentemente, (pero no se limita a) las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 a 116.

El término "fragmento" se refiere a una proteína o polipéptido que consiste en una subsecuencia continua de la secuencia de aminoácidos de una proteína o péptido e incluye fragmentos de origen natural tales como variantes de corte y empalme y fragmentos resultantes de la actividad proteasa in vivo de origen natural. Un fragmento de este tipo puede truncarse en el extremo amino, el extremo carboxi, y/o internamente (por ejemplo, mediante corte y empalme natural). Tales fragmentos pueden prepararse con o sin una metionina amino terminal. El término "fragmento" incluye fragmentos, idénticos o diferentes, de la misma proteína o péptido, con una secuencia de aminoácidos contigua en común o no, unidos entre sí, ya sea directamente o mediante un enlazador. Una persona experta en la técnica será capaz de seleccionar un fragmento adecuado para usar en las modalidades sin experimentación indebida mediante el uso de las pautas y procedimientos descritos en la presente descripción. El término "variante" se refiere a una proteína o polipéptido en el que están presentes una o más sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de una proteína o péptido e incluye variantes alélicas naturales o variantes de corte y empalme alternativas de una proteína o péptido. El término "variante" incluye el reemplazo de uno o más aminoácidos en una secuencia de péptidos con uno o más aminoácidos similares u homólogos o con uno o varios aminoácidos diferentes. Hay muchas escalas en las que los aminoácidos pueden clasificarse como similares u homólogos. (Gunnar von Heijne, Sequence Analysis in Molecular Biology, pág. 123-39 (Academic Press, Nueva York, NY 1987). Las variantes preferidas incluyen sustituciones de alanina en una o más de las posiciones de los aminoácidos. Otras sustituciones preferidas incluyen sustituciones conservadoras que tienen poco o ningún efecto sobre la carga neta global, polaridad, o hidrofobicidad de la proteína. Las sustituciones conservadoras se establecen en la Tabla 2 más abajo.

Tabla 2

La Tabla 3 establece otro esquema de sustitución de aminoácidos:

Tabla 3

Otras variantes pueden consistir en sustituciones de aminoácidos menos conservadoras, tales como la selección de residuos que difieran más significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura de la cadena principal polipeptídica en el área de la sustitución, por ejemplo, como una hoja o una conformación helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo, o (c) la mayor parte de la cadena lateral. Las sustituciones que en general se espera que tengan un efecto más significativo sobre la función son aquellas en las que (a) glicina y/o prolina se sustituyen por otro aminoácido o se eliminan o insertan; (b) un residuo hidrófilo, por ejemplo, serilo o treonilo, se sustituye por (o por) un residuo hidrófobo, por ejemplo, leucilo, isoleucilo, fenilalanilo, valilo, o alanilo; (c) un residuo de cisteína se sustituye por (o por) cualquier otro residuo; (d) un residuo que tiene una cadena lateral electropositiva, por ejemplo, lisilo, arginilo o histidilo, se sustituye por (o por) un residuo que tiene una carga electronegativa, por ejemplo, glutamilo o aspartilo; o (e) un residuo que tiene una cadena lateral voluminosa, por ejemplo, fenilalanina, se sustituye por (o por) uno que no tiene tal cadena lateral, por ejemplo, glicina. Otras variantes incluyen aquellas diseñadas para generar un(os) nuevo(s) sitio(s) de glicosilación y/o fosforilación, o aquellas diseñadas para eliminar un(os) sitio(s) de glicosilación y/o fosforilación existente. Las variantes incluyen al menos una sustitución de aminoácido en un sitio de glicosilación, un sitio de escisión proteolítica y/o un residuo de cisteína. Las variantes también incluyen proteínas y péptidos con residuos de aminoácidos adicionales antes o después de la secuencia de aminoácidos de la proteína o del péptido en los péptidos enlazadores. Por ejemplo, puede adicionarse un residuo de cisteína en los extremos amino y carboxi de un péptido NTP para permitir la ciclación del péptido mediante la formación de un enlace disulfuro. El término "variante" también abarca polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos de un péptido NTP con al menos uno y hasta 25 o más aminoácidos adicionales que flanquean el extremo 3' o 5' del péptido.

El término "derivado" se refiere a una proteína o polipéptido químicamente modificado que fue químicamente modificado ya sea por procesos naturales, tales como procesamiento y otras modificaciones postraduccionales, pero también por técnicas de modificación química, como por ejemplo, mediante la adición de uno o más moléculas de polietilenglicol, azúcares, fosfatos, y/u otras moléculas de este tipo, donde la molécula o moléculas no se unen naturalmente a péptidos NTP o proteínas de tipo salvaje. Los derivados incluyen sales. Tales modificaciones químicas se describen en textos básicos y en monografías más detalladas, así como en una voluminosa literatura de investigación, y se conocen bien por los expertos en la técnica. Se apreciará que el mismo tipo de modificación puede estar presente en el mismo grado o en un grado variable en varios sitios de una proteína o polipéptido dado. También, una proteína o polipéptido dado puede contener muchos tipos de modificaciones. Las modificaciones pueden ocurrir en cualquier lugar de una proteína o polipéptido, que incluyen la estructura del péptido, las cadenas laterales de aminoácidos, y los extremos amino o carboxilo. Las modificaciones incluyen, por ejemplo, acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de un resto hemo, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente de un lípido o derivado de lípido, unión covalente de fosfatidilinositol, reticulación, ciclación, formación de enlaces disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de cisteína, formación de piroglutamato, formilación, gamma-carboxilación, glicosilación, formación de anclaje GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, glicosilación, unión de lípidos, sulfatación, gamma-carboxilación de residuos de ácido glutámico, hidroxilación y ADP-ribosilación, selenoilación, sulfatación, adición de aminoácidos a proteínas mediada por ARN de transferencia, tal como arginilación, y ubiquitinación. Ver, por ejemplo, Proteins--Structure And Molecular Properties, 2a Ed., TE Creighton, WH Freeman and Company, Nueva York (1993) y Wold, F., "Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects", pág. 1-12 en Posttranslational Covalent Modification Of Proteins, BC Johnson, Ed., Academic Press, Nueva York (1983); Seifter y otros, Meth. Enzymol. 182: 626-646 (1990) y Rattan y otros, Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging, Ann. N.Y. Acad. Sci.

663: 48-62 (1992). El término "derivados" incluye modificaciones químicas que dan como resultado que la proteína o polipéptido se vuelva ramificada o cíclica, con o sin ramificación. Las proteínas o polipéptidos cíclicos, ramificados y circulares ramificados pueden resultar de procesos naturales postraduccionales y también pueden elaborarse por métodos completamente sintéticos.

El término "homólogo" se refiere a una proteína que es al menos un 60 por ciento idéntica en su secuencia de aminoácidos a un péptido NTP según se determina por métodos estándar que se usan comúnmente para comparar la similitud en la posición de los aminoácidos de dos polipéptidos. El grado de similitud o identidad entre dos proteínas puede calcularse fácilmente mediante métodos conocidos, incluidos, entre otros, los descritos en Computational Molecular Biology, Lesk, AM, ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., ed., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; y Carillo H. y Lipman, D., SI^a M, J. Applied Math., 48:1073 (1988). Los métodos preferidos para determinar la identidad se diseñaron para proporcionar la mayor coincidencia entre las secuencias probadas. Los métodos para determinar la identidad y la similitud se codifican en programas informáticos disponibles públicamente.

Los métodos de programas informáticos preferidos útiles para determinar la identidad y similitud entre dos secuencias incluyen, entre otros, el paquete de programas GCG (Devereux, J., y otros, Nucleic Acids Research, 12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, y FASTA, Atschul, S.F. y otros, J. Molec. Biol., 215: 403-410 (1990). El programa BLAST X está disponible públicamente de NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S., y otros, NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul, S. y otros, J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). A modo de ejemplo, mediante el uso de un algoritmo informático tal como GAP (Genetic Computer Group, Universidad de Wisconsin, Madison, Wis.), las dos proteínas o polipéptidos para los que se va a determinar el porcentaje de identidad de secuencia se alinean para una coincidencia óptima de sus respectivos aminoácidos (el "intervalo coincidente", según se determina por el algoritmo).

Una penalización de apertura de espacio (que se calcula como 3 veces la diagonal promedio; la "diagonal promedio" es el promedio de la diagonal de la matriz de comparación que se use; la "diagonal" es la puntuación o número asignado a cada coincidencia perfecta de aminoácidos por la matriz de comparación particular) y una penalización por extensión de la interrupción (que usualmente es {fracción (1/10)} veces la penalización por apertura de la interrupción), así como también una matriz de comparación como PAM 250 o BLOSUM 62 se usan junto con el algoritmo. Una matriz de comparación estándar (ver Dayhoff y otros en: Atlas of Protein Sequence and Structure, vol.

5, sup. 3 para la matriz de comparación PAM250; ver Henikoff y otros, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89: 10915 -10919 para la matriz de comparación BLOSUM 62) también puede usarse por el algoritmo. Después el algoritmo calcula el porcentaje de identidad. Los homólogos tendrán típicamente una o más sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos en comparación con la proteína o péptido de comparación, según sea el caso.

El término "proteína de fusión" se refiere a una proteína en la que uno o más péptidos se fusionan de manera recombinante o se conjugan químicamente (que incluye covalentemente y no covalentemente) a una proteína tal como (pero sin limitarse a) un anticuerpo o fragmento de anticuerpo como un fragmento F.sub.ab o Fv de cadena corta. El término "proteína de fusión" también se refiere a multímeros (es decir, dímeros, trímeros, tetrámeros y multímeros superiores) de péptidos. Tales multímeros comprenden multímeros homoméricos que comprenden un péptido, multímeros heteroméricos que comprenden más de un péptido, y multímeros heteroméricos que comprenden al menos un péptido y al menos otra proteína. Tales multímeros pueden ser el resultado de asociaciones, puentes o enlaces hidrófobos, hidrófilos, iónicos y/o covalentes, pueden formarse mediante reticulaciones mediante el uso de moléculas enlazadoras o pueden unirse indirectamente mediante, por ejemplo, formación de liposomas.

El término "mimético de péptido" o "mimético" se refiere a compuestos biológicamente activos que imitan la actividad biológica de un péptido o una proteína pero ya no son de naturaleza química peptídica, es decir, ya no contienen ningún enlace peptídico (es decir, amida enlaces entre aminoácidos). Aquí, el término mimético de péptidos se usa en un sentido más amplio para incluir moléculas que ya no son completamente de naturaleza peptídica, tales como pseudopéptidos, semipéptidos y peptoides. Más abajo se describen ejemplos de miméticos de péptidos en este sentido más amplio (donde parte de un péptido se reemplaza por una estructura que carece de enlaces peptídicos). Ya sean completamente o parcialmente no péptidos, los miméticos de péptidos de acuerdo con las modalidades proporcionan una disposición espacial de restos químicos reactivos que se asemeja mucho a la disposición tridimensional de los grupos activos en el péptido en el que se basa el mimético de péptido. Como resultado de esta geometría similar del sitio activo, el mimético de péptido tiene efectos sobre los sistemas biológicos que son similares a la actividad biológica del péptido.

Los miméticos de péptidos de las modalidades son, preferentemente, sustancialmente similares tanto en forma tridimensional como en actividad biológica a los péptidos descritos en la presente descripción. Ejemplos de métodos para modificar estructuralmente un péptido conocido en la técnica para crear un mimético de péptido incluyen la inversión de los centros quirales de la cadena principal que conducen a estructuras de residuos de D-aminoácidos que pueden, particularmente en el extremo N-terminal, conducir a una mayor estabilidad para la degradación proteolítica sin afecta negativamente la actividad. Se da un ejemplo en el documento "Tritriated D-ala1-Peptide T Binding", Smith CS y otros, Drug Development Res., 15, pág. 371-379 (1988). Un segundo método consiste en alterar la estructura cíclica para la estabilidad, como las imidas y lactamas entre cadenas de N a C (Ede y otros en Smith y Rivier (Eds.) "Peptides: Chemistry and Biology", Escom, Leiden (1991), pág. 268-270). Un ejemplo de esto se da en compuestos similares a timopentina conformacionalmente restringidos, tales como los descritos en la patente de Estados Unidos núm. 4,457,489 (1985), Goldstein, G. y otros. Un tercer método consiste en sustituir enlaces peptídicos en el péptido por enlaces pseudopeptídicos que confieren resistencia a la proteólisis.

Se describieron varios enlaces pseudopeptídicos que, en general, no afectan a la estructura del péptido ni a la actividad biológica. Un ejemplo de este enfoque es la sustitución de enlaces pseudopeptídicos retroinversos ("Biologically active retroinverso analogues of thymopentin ", Sisto A. y otros en Rivier, J. E. y Marshall, G.R. (eds) "Peptides, Chemistry, Structure and Biology", Escom, Leiden (1990), pág. 722-773) y Dalpozzo, y otros (1993), Int. J. Peptide Protein Res., 41:561-566). De acuerdo con esta modificación, las secuencias de aminoácidos de los péptidos pueden ser idénticas a las secuencias de un péptido descritas anteriormente, excepto que uno o más de los enlaces peptídicos se reemplazan por un enlace de pseudopéptido retroinverso. Preferentemente, el enlace peptídico más N-terminal está sustituido, ya que tal sustitución conferirá resistencia a la proteólisis por exopeptidasas que actúan sobre el N-terminal. También pueden realizarse modificaciones adicionales mediante el reemplazo de grupos químicos de los aminoácidos con otros grupos químicos de estructura similar. Otro enlace de pseudopeptídico adecuado que se sabe que mejora la estabilidad de la escisión enzimática con poca o ninguna pérdida de actividad biológica es el enlace pseudopeptídico isóstero reducido (Couder, y otros (1993), Int. J. Peptide Protein Res., 41:181-184).

Por tanto, las secuencias de aminoácidos de estos péptidos pueden ser idénticas a las secuencias de un péptido, excepto que uno o más de los enlaces peptídicos se reemplazan por un enlace pseudopeptídico isóstero. Preferentemente, el enlace peptídico más N-terminal está sustituido, ya que tal sustitución conferiría resistencia a la proteólisis por exopeptidasas que actúan sobre el N-terminal. La síntesis de péptidos con uno o más enlaces pseudopeptídicos isóstero reducidos es conocida en la técnica (Couder, y otros (1993), citado anteriormente). Otros ejemplos incluyen la introducción de enlaces cetometileno o metilsulfuro para reemplazar enlaces peptídicos.

Los derivados peptoides de péptidos representan otra clase de miméticos de péptidos que retienen los determinantes estructurales importantes para la actividad biológica, pero eliminan los enlaces peptídicos, lo que confiere resistencia a la proteólisis (Simon, y otros, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:9367-9371). Los peptoides son oligómeros de glicinas N-sustituidas. Se describieron varios grupos N-alquilo, cada uno de los cuales corresponde a la cadena lateral de un aminoácido natural (Simon, y otros (1992), citado anteriormente). Algunos o todos los aminoácidos de los péptidos pueden reemplazarse con la glicina N-sustituida correspondiente al aminoácido reemplazado.

El término "mimético de péptido" o "mimético" también incluye enantiómeros y péptidos D inversos como se define más abajo.

El término "péptido D inverso" se refiere a una proteína o péptido biológicamente activo que consta de D-aminoácidos dispuestos en orden inverso en comparación con la secuencia de L-aminoácidos de un péptido. Por tanto, el residuo carboxi terminal de un péptido de L-aminoácidos se convierte en el amino terminal para el péptido de D-aminoácidos y así sucesivamente. Por ejemplo, el péptido ETESH se convierte en HdSdEdTdEd, donde Ed, Hd, Sd, y Td son los D-aminoácidos correspondientes a los L-aminoácidos, E, H, S, y T respectivamente.

El término "enantiómero" se refiere a una proteína o péptido biológicamente activo en el que uno o más residuos de L-aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de un péptido se reemplazan con los correspondientes residuos de D-aminoácidos.

Una "composición", como se usa en la presente descripción, se refiere ampliamente a cualquier composición que contenga un péptido o secuencia de aminoácidos enumerados y, opcionalmente, un agente activo adicional. La composición puede comprender una formulación seca, una solución acuosa, o una composición estéril. Las composiciones que comprenden péptidos pueden emplearse como sondas de hibridación. Las sondas pueden almacenarse en forma liofilizada y pueden asociarse con un agente estabilizador como un carbohidrato. En las hibridaciones, la sonda puede desplegarse en una solución acuosa que contiene sales, por ejemplo, NaCl, detergentes, por ejemplo, dodecilsulfato de sodio (SDS) y otros componentes, por ejemplo, solución de Denhardt, leche en polvo, ADN de esperma de salmón, etc.

En una modalidad alternativa en la que se usa un agente activo adicional junto con el péptido NTP, la expresión "agente activo" se usa para indicar cualquier agente capaz de eliminar proliferaciones celulares no deseadas y/o crecimiento tisular. Los agentes activos adecuados pueden incluir, pero no se limitan a: (i) agentes activos contra el cáncer (tales como agentes alquilantes, inhibidores de topoisomerasa I, inhibidores de topoisomerasa II, antimetabolitos de ARN/ADN, y agentes antimitóticos); (ii) agentes activos para tratar crecimientos benignos tales como agentes activos antiacné y antiverrugas; (iii) compuestos antiandrógenos (acetato de ciproterona (1a, 2pmetilen-6-cloro-17 a-acetoxi-6-deshidroprogesterona) tamoxifeno, inhibidores de aromatasa); (iv) bloqueadores de los receptores alfa1-adrenérgicos (tamsulosina, terazosina, doxazosina, prazosina, bunazosina, indoramina, alfulzosina, silodosina); (v) inhibidores de la 5 a-reductasa (finasterida, dutasterida); (vi) inhibidores de la fosfodiesterasa tipo 5 (PDE5) (tadalafil) y combinaciones de estos.

Las modalidades se dirigen a métodos de métodos para reducir la necesidad de una intervención quirúrgica invasiva posterior en pacientes que padecen proliferaciones celulares no deseadas (tumores benignos y malignos, hiperplasia glandular (por ejemplo, de próstata), vello facial no deseado, verrugas, y tejido graso no deseado) que comprenden administrar a un mamífero que lo necesite una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición que comprende un péptido NTP, solo o en combinación con al menos un agente activo adicional capaz de tratar y/o matar proliferaciones celulares no deseadas en mamíferos. En una modalidad, los pacientes tratados son aquellos que no se trataron previamente para la proliferación celular no deseada. En otra modalidad, las composiciones se administran más de una vez. A lo largo de esta descripción, la expresión "intervención quirúrgica invasiva" o "procedimiento quirúrgico" para BPH incluye, entre otros, resección transuretral de la próstata, tratamientos de ablación con láser tal como vaporización, nucleación, resección y otros tratamientos con láser, tratamientos con microondas, ablaciones transuretrales con aguja, colocación de stents, y otros procedimientos quirúrgicos invasivos para tratar la BPH.

Otras secuencias de péptidos derivadas de un péptido NTP que se encontró que son un agente efectivo para provocar la muerte celular también pueden usarse como un agente activo adicional en combinación con los péptidos NTP descritos en la presente descripción. Una persona experta en la técnica puede, mediante el uso de las pautas proporcionadas en la presente descripción, sintetizar sin experimentación indebida fragmentos de un péptido efectivo que abarque la secuencia completa de aminoácidos de esa proteína para identificar otras secuencias de péptidos efectivas.

El inventor descubrió que el uso de péptidos NTP en el tratamiento de mamíferos que necesitan la eliminación o destrucción de elementos celulares no deseados proporcionó una reducción inesperadamente superior en la necesidad de una intervención quirúrgica invasiva posterior en mamíferos sin tratamiento previo, en comparación con mamíferos que se trataron previamente (que incluyen aquellos tratados previamente, pero en los que el tratamiento no tuvo éxito ("fracaso del tratamiento"). El término "sin tratamiento previo" se usa en la presente descripción para indicar un tratamiento de primera línea, o tratamiento de un mamífero que no recibió previamente tratamiento para la eliminación de ese elemento celular particular. Por ejemplo, un mamífero tratado previamente para la eliminación de una verruga, todavía se consideraría un mamífero "sin tratamiento previo" para el tratamiento para la eliminación de células de cáncer de páncreas. En adición, un mamífero tratado previamente por cáncer de mama todavía se consideraría un mamífero "sin tratamiento previo" para el tratamiento del cáncer de próstata. Los pacientes con fracaso del tratamiento incluyen, preferentemente, aquellos tratados previamente para la eliminación o destrucción del elemento celular particular con un agente diferente a los péptidos NTP descritos en la presente descripción, pero que nuevamente fueron sintomáticos (o el tratamiento no fue efectivo inmediatamente después del tratamiento o el tratamiento fue efectivo un período de tiempo, pero los síntomas volvieron).

El inventor también descubrió que la administración de composiciones que comprenden los péptidos NTP más de una vez para tratar mamíferos que necesitan la eliminación o destrucción de elementos celulares no deseados proporcionó una reducción inesperadamente superior en la necesidad de una intervención quirúrgica invasiva posterior, en comparación con los mamíferos a quienes las composiciones que comprenden los péptidos NTP se administraron solo una vez. Los inventores descubrieron que la administración del péptido NTP dio como resultado una reducción en la intervención quirúrgica posterior de aproximadamente un 15-100 %, en comparación con los mamíferos que recibieron un placebo. En algunas modalidades, la reducción mejorada está dentro del intervalo de aproximadamente 25 a aproximadamente 75 %, o de aproximadamente 30 % a aproximadamente 50 %, o de aproximadamente 31 % a aproximadamente 35 %.

El inventor descubrió que la reducción mejorada en las intervenciones quirúrgicas posteriores es incluso más pronunciada en mamíferos a los que se les administró péptidos NTP más de una vez. Los inventores descubrieron que la administración del péptido NTP más de una vez dio como resultado una reducción en la intervención quirúrgica posterior de aproximadamente un 45-100 %, en comparación con los mamíferos a los que se les administró el péptido NTP una vez. En algunas modalidades, la reducción mejorada está dentro del intervalo de aproximadamente 50 a aproximadamente 80 %, o de aproximadamente 60 % a aproximadamente 75 %, o de aproximadamente 65 % a aproximadamente 70 %. Los inventores descubrieron, además, que la administración del péptido NTP más de una vez dio como resultado una reducción en la intervención quirúrgica posterior de aproximadamente un 60-100 %, en comparación con los mamíferos que recibieron un placebo. En algunas modalidades, la reducción mejorada está dentro del intervalo de aproximadamente 70 a aproximadamente 95 %, o de aproximadamente 75 % a aproximadamente 90 %, o de aproximadamente 77 % a aproximadamente 85 %.

El inventor descubrió que la reducción mejorada en las intervenciones quirúrgicas posteriores es incluso más pronunciada en mamíferos sin tratamiento previo que no tomaron previamente un agente activo adicional (o que no recibieron previamente tratamiento contra tal afección). Los inventores descubrieron que la administración del péptido NTP a mamíferos sin tratamiento previo dio como resultado una reducción en la intervención quirúrgica posterior de aproximadamente un 70-100 %, en comparación con los mamíferos sin tratamiento previo que recibieron un placebo. En algunas modalidades, la reducción mejorada está dentro del intervalo de aproximadamente 75 a aproximadamente 95 %, o de aproximadamente 80 % a aproximadamente 90 %, o de aproximadamente 85 % a aproximadamente 90 %. Los inventores descubrieron, además, que la administración del péptido NTP a mamíferos sin tratamiento previo dio como resultado una reducción en la intervención quirúrgica posterior de aproximadamente un 60-100 %, en comparación con los mamíferos que fracasaron en el tratamiento a los que también se les administró el péptido NTP. En algunas modalidades, la reducción mejorada está dentro del intervalo de aproximadamente 75 a aproximadamente 95 %, o de aproximadamente 80 % a aproximadamente 90 %, o de aproximadamente 85 % a aproximadamente 90 %. Los inventores descubrieron, además, que la administración del péptido NTP a mamíferos sin tratamiento previo dio como resultado una reducción en la intervención quirúrgica posterior de aproximadamente 75-100 %, en comparación con los mamíferos con fracaso del tratamiento que recibieron un placebo. En algunas modalidades, la reducción mejorada está dentro del intervalo de aproximadamente 80 a aproximadamente 98 %, o de aproximadamente 85 % a aproximadamente 97 %, o de aproximadamente 90 % a aproximadamente 95 %.

Las modalidades incluyen un método para tratar a un mamífero que padece una afección que requiere la eliminación o destrucción de proliferaciones celulares no deseadas, en donde el mamífero recibió o no previamente tratamiento contra tal afección, que comprende administrar una o más de una vez un péptido NTP al mamífero, ya sea solo o en combinación con la administración de un agente activo adicional. El método incluye, pero no se limita a, administrar los péptidos NTP por intramuscularmente, oralmente, intravenosamente, intraperitonealmente, intracerebralmente (intraparenquimatosamente), intracerebroventricularmente, intralesionalmente, intraocularmente, intraarterialmente, intratecalmente, intratumoralmente, intranasalmente, tópicamente, subcutáneamente, intradérmicamente, ya sea solo o conjugado a un portador. Las proliferaciones celulares no deseadas incluyen, entre otras, tumores benignos y malignos, hiperplasia glandular (por ejemplo, de próstata), vello facial no deseado, verrugas, y tejido graso no deseado. Los péptidos NTP preferidos incluyen uno o más de los siguientes:

SEQ ID No. 66 IDQQVLSRIKLEIKRCL lle-Asp-Gln-Gln-Val-Leu-Ser-Arg-lle-Lys-Leu-Glu-lle-Lys-Arg-Cys-Leu

SEQ ID NO.111 IDQQVLSRI lle-Asp-Gln-Gln-Val-Leu-Ser-Arg-lle

SEQ ID NO.115 VLSRIKLEIKRCL Val-Leu-Ser-Arg-lle-Lys-Leu-Glu-lle-Lys-Arg-Cys-Leu

SEQ ID NO.116 IDQQVLSRIKLEI lle-Asp-Gln-Gln-Val-Leu-Ser-Arg-lle-Lys-Leu-Glu-lle Cualquier mamífero puede beneficiarse del uso de la invención, incluidos humanos, ratones, conejos, perros, ovejas y otro ganado, cualquier mamífero tratado o tratable por un veterinario, cuidador de un zoológico, o empleado de una reserva de vida silvestre. Los mamíferos preferidos son humanos, ovejas, y perros. A lo largo de esta descripción, los mamíferos y los pacientes se usan indistintamente.

Será evidente para un experto en la técnica que pueden seleccionarse otros fragmentos más pequeños de los péptidos NTP anteriores de manera que estos péptidos posean la misma o similar actividad biológica. Un experto en la técnica puede seleccionar otros fragmentos de tal forma que estos péptidos posean la misma o similar actividad biológica. Los péptidos de las modalidades abarcan estos otros fragmentos. En general, los péptidos de las modalidades tienen al menos 4 aminoácidos, preferentemente, al menos 5 aminoácidos y con mayor preferencia al menos 6 aminoácidos.

Las modalidades también abarcan métodos para tratar mamíferos (o pacientes) que necesitan la eliminación o destrucción de proliferaciones celulares no deseadas que comprenden administrar una composición que comprende péptidos NTP que comprenden dos o más péptidos ⁿT^p unidos entre sí, junto con un agente activo adicional. En la medida en que un péptido NTP tenga la actividad biológica deseada, se deduce que dos de tales péptidos también poseerían la actividad biológica deseada.

Los fragmentos y péptidos NTP, variantes, derivados, homólogos, proteínas de fusión y miméticos de estos incluidos en esta modalidad pueden prepararse mediante el uso de métodos conocidos por los expertos en la técnica, tales como tecnología de ADN recombinante, síntesis de proteínas y aislamiento de péptidos y proteínas de origen natural, AD7c-proteína y fragmentos, variantes, derivados y homólogos de estos.

Los péptidos NTP y fragmentos, variantes, derivados, homólogos, proteínas de fusión y miméticos de estos pueden prepararse a partir de otros péptidos, proteínas y fragmentos, variantes, derivados y homólogos de estos mediante el uso de métodos conocidos por los expertos en la técnica. Tales métodos incluyen (pero no se limitan a) el uso de proteasas para escindir el péptido o proteína en los péptidos NTP deseados.

Puede prepararse un péptido NTP mediante el uso de métodos de tecnología de ADN recombinante bien conocidos, tales como los expuestos en Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. y/o Ausubel y otros, Ed., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishers Inc. y Wiley and Sons, NY.

Puede obtenerse un gen o ADNc que codifica un péptido NTP, por ejemplo, mediante la selección de una biblioteca genómica o de ADNc, o mediante amplificación por PCR. Pueden generarse sondas o cebadores útiles para cribar la biblioteca con base en la información de secuencia para otros genes conocidos o fragmentos de genes de la misma o de una familia de genes relacionada, tales como, por ejemplo, motivos conservados encontrados en otros péptidos o proteínas. En adición, cuando se identifica un gen que codifica un péptido NTP, puede usarse todo o una parte de ese gen como sonda para identificar genes homólogos. Las sondas o cebadores pueden usarse para cribar bibliotecas de ADNc de diversas fuentes de tejido que se cree que expresan un gen del péptido NTP. Típicamente, se emplearán condiciones de alta rigurosidad para el cribado para minimizar el número de falsos positivos obtenidos del cribado.

Otro medio para preparar un gen que codifica un péptido NTP es emplear síntesis química mediante el uso de métodos bien conocidos por el experto en la técnica, tales como los descritos por Engels y otros, Angew. Chem. Intl. Ed. 28:716-734. Estos métodos incluyen, entre otros, los métodos de fosfotriéster, fosforamidita, y H-fosfonato para la síntesis de ácidos nucleicos. Un método preferido para tal síntesis química es la síntesis soportada por polímeros mediante el uso de química de fosforamidita estándar. Típicamente, el ADN que codifica un péptido o proteína tendrá una longitud de varios cientos de nucleótidos. Los ácidos nucleicos mayores de aproximadamente 100 a nucleótidos pueden sintetizarse como varios fragmentos mediante el uso de estos métodos. Después los fragmentos pueden ligarse juntos para formar el péptido o la proteína de longitud completa. Usualmente, el fragmento de ADN que codifica el extremo amino de la proteína tendrá un ATG, que codifica un residuo de metionina. Esta metionina puede estar presente o no en la forma madura de la proteína o péptido, en dependencia de si la proteína producida en la célula huésped se diseñó para ser secretada por esa célula.

El gen, ADNc, o fragmento de este que codifica el péptido NTP puede insertarse en un vector de expresión o amplificación apropiado mediante el uso de técnicas de ligamiento estándar. El vector se selecciona típicamente para que sea funcional en la célula huésped particular empleada (es decir, el vector es compatible con la maquinaria de la célula huésped de manera que puede producirse la amplificación del gen y/o la expresión del gen). El gen, ADNc, o fragmento de este que codifica el péptido NTP puede amplificarse/expresarse en células huésped procariotas, de levadura, de insectos (sistemas de baculovirus) y/o eucariotas. La selección de la célula huésped dependerá en parte de si el péptido NTP debe glicosilarse y/o fosforilarse. Si es así, son preferibles las células huésped de levadura, insectos, o mamíferos.

Típicamente, los vectores usados en cualquiera de las células huésped contendrán al menos una secuencia flanqueante 5' (también denominada promotor) y también otros elementos reguladores, como un(os) potenciador(es), un elemento de origen de replicación, un elemento de terminación de la transcripción, una secuencia de intrón completa que contiene un sitio de corte y empalme donante y aceptor, una secuencia de péptido señal, un elemento de sitio de unión de ribosoma, una secuencia de poliadenilación, una región polienlazadora para insertar el ácido nucleico que codifica el polipéptido que se va a expresar, y un marcador seleccionable elemento. Cada uno de estos elementos se analiza más abajo. Opcionalmente, el vector puede contener una secuencia de etiqueta, es decir, una molécula de oligonucleótido ubicada en el extremo 5' o 3' de la secuencia codificante de proteína o péptido; la molécula de oligonucleótido codifica poliHis (como hexaHis) u otra etiqueta como FLAG, HA (hemaglutinina de virus de la gripe) o myc para los que existen anticuerpos disponibles comercialmente. Esta etiqueta se fusiona típicamente con el polipéptido tras la expresión del polipéptido y puede servir como medio para la purificación por afinidad de la proteína o péptido a partir de la célula huésped. La purificación por afinidad puede lograrse, por ejemplo, mediante cromatografía en columna mediante el uso de anticuerpos contra la etiqueta como una matriz de afinidad. Opcionalmente, la etiqueta puede eliminarse posteriormente de la proteína o péptido purificado por diversos medios, tales como el uso de ciertas peptidasas.

La región Fc y bisagra de la inmunoglobulina humana podrían fusionarse en el extremo N-terminal o en el extremo C-terminal del péptido NTP por un experto en la técnica. La siguiente proteína de fusión con Fc podría purificarse mediante el uso de una columna de afinidad de proteína A. Se sabe que Fc exhibe una vida media farmacocinética prolongada in vivo y se encontró que las proteínas fusionadas a Fc exhiben una vida media in vivo sustancialmente mayor que la contraparte no fusionada. También, la fusión a la región Fc permite la dimerización/multimerización de la molécula que puede ser útil para la bioactividad de algunas moléculas.

La secuencia flanqueante 5' puede ser homóloga (es decir, de la misma especie y/o cepa que la célula huésped), heteróloga (es decir, de una especie distinta a la especie o cepa de la célula huésped), híbrida (es decir, una combinación de secuencias flanqueantes 5' de más de una fuente), sintética, o puede ser la secuencia flanqueante 5' del gen del péptido o de la proteína nativa. Como tal, la fuente de la secuencia flanqueante 5' puede ser cualquier organismo procariota o eucariota unicelular, cualquier organismo vertebrado o invertebrado, o cualquier planta, siempre que la secuencia flanqueante 5' sea funcional y pueda activarse por la maquinaria de la célula huésped.

Las secuencias flanqueantes 5' útiles en los vectores de esta modalidad pueden obtenerse mediante cualquiera de varios métodos bien conocidos en la técnica. Típicamente, las secuencias flanqueantes 5' útiles en la presente descripción distintas de la secuencia flanqueante del gen de la proteína o del péptido se identificaron previamente mediante mapeo y/o mediante digestión con endonucleasas de restricción y, por tanto, pueden aislarse de la fuente de tejido adecuada mediante el uso de las endonucleasas de restricción apropiadas. En algunos casos, puede conocerse la secuencia de nucleótidos completa de la secuencia flanqueante 5'. Aquí, la secuencia flanqueante 5' puede sintetizarse mediante el uso de los métodos descritos anteriormente para la síntesis o clonación de ácidos nucleicos. Cuando se conoce toda o solo una parte de la secuencia flanqueante 5', puede obtenerse mediante el uso de PCR y/o de tamizaje de una biblioteca genómica con oligonucleótidos adecuados y/o fragmentos de secuencia flanqueante 5' de la misma u otra especie.

Cuando no se conoce la secuencia flanqueante 5', un fragmento de ADN que contiene una secuencia flanqueante 5' puede aislarse de un fragmento más grande de ADN que puede contener, por ejemplo, una secuencia codificante o incluso otro gen o genes. El aislamiento puede lograrse mediante digestión con endonucleasas de restricción mediante el uso de una o más enzimas cuidadosamente seleccionadas para aislar el fragmento de ADN apropiado. Después de la digestión, el fragmento deseado puede aislarse mediante purificación en gel de agarosa, columna Qiagen® u otros métodos conocidos por el experto en la técnica. La selección de enzimas adecuadas para lograr este propósito será fácilmente evidente para un experto en la técnica.

El origen del elemento de replicación es típicamente una parte de los vectores de expresión procariotas adquiridos comercialmente y ayuda en la amplificación del vector en una célula huésped. La amplificación del vector hasta un cierto número de copias puede, en algunos casos, ser importante para la expresión óptima de la proteína o péptido. Si el vector de elección no contiene un origen de sitio de replicación, uno puede sintetizarse químicamente con base en una secuencia conocida y ligarse en el vector. El elemento de terminación de la transcripción se encuentra típicamente 3' del extremo de la secuencia codificante de la proteína o péptido y sirve para terminar la transcripción de la proteína o péptido. Usualmente, el elemento de terminación de la transcripción en las células procariotas es un fragmento rico en GC seguido de una secuencia de poli T. Si bien el elemento puede clonarse de una biblioteca o comprarse comercialmente como parte de un vector, también puede sintetizarse fácilmente mediante el uso de métodos para la síntesis de ácidos nucleicos como los descritos anteriormente.

Un elemento de gen marcador seleccionable codifica una proteína necesaria para la supervivencia y el crecimiento de una célula huésped cultivada en un medio de cultivo selectivo. Los genes marcadores de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, tetraciclina, o kanamicina para células huésped procariotas, (b) complementan las deficiencias auxotróficas de la célula; o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles en medios complejos. Los marcadores seleccionables preferidos son el gen de resistencia a la kanamicina, el gen de resistencia a la ampicilina, y el gen de resistencia a la tetraciclina.

El elemento de unión al ribosoma, comúnmente llamado secuencia de Shine-Dalgarno (procariotas) o secuencia de Kozak (eucariotas), suele ser necesario para el inicio de la traducción del ARNm. El elemento se localiza típicamente 3' con respecto al promotor y 5' con respecto a la secuencia codificante de la proteína o péptido que va a sintetizarse. La secuencia de Shine-Dalgarno es variada pero típicamente es una polipurina (es decir, que tiene un alto contenido de AG). Se identificaron muchas secuencias de Shine-Dalgarno, cada una de las cuales puede sintetizarse fácilmente mediante el uso de los métodos expuestos anteriormente y usarse en un vector procariota.

En aquellos casos en los que es deseable que un péptido NTP se secrete a partir de la célula huésped, puede usarse una secuencia señal para dirigir el péptido fuera de la célula huésped donde se sintetiza, y la parte carboxi terminal de la proteína puede eliminarse para evitar el anclaje a la membrana. Típicamente, la secuencia señal se coloca en la región codificante del gen o ADNc del péptido NTP, o directamente en el extremo 5' de la región codificante del gen del péptido. Se identificaron muchas secuencias señal, y cualquiera de ellas que sea funcional en la célula huésped seleccionada puede usarse junto con el gen del péptido o el ADNc. Por lo tanto, la secuencia señal puede ser homóloga o heteróloga al gen del péptido o al ADNc, y puede ser homóloga o heteróloga al gen del péptido o al ADNc. Adicionalmente, la secuencia señal puede sintetizarse químicamente mediante el uso de los métodos expuestos anteriormente. En la mayoría de los casos, la secreción del polipéptido de la célula huésped a través de la presencia de un péptido señal dará como resultado la eliminación de la metionina amino terminal del polipéptido.

En muchos casos, la transcripción del gen del péptido NTP o del ADNc aumenta por la presencia de uno o más intrones en el vector; esto es particularmente cierto cuando el péptido se produce en células huésped eucariotas, especialmente células huésped de mamíferos. Los intrones usados pueden ser de origen natural dentro del gen del péptido, especialmente cuando el gen usado es una secuencia genómica de longitud completa o un fragmento de esta. Cuando el intrón no se produce naturalmente dentro del gen (como para la mayoría de los ADNc), el intrón o intrones pueden obtenerse de otra fuente. La posición del intrón con respecto a la secuencia flanqueante y el gen del péptido generalmente es importante, ya que el intrón debe transcribirse para que sea efectivo. Como tal, cuando el gen del péptido insertado en el vector de expresión es una molécula de ADNc, la posición preferida para el intrón es 3' con respecto al sitio de inicio de la transcripción y 5' con respecto a la secuencia de terminación de la transcripción poliA. Preferentemente, para el ADNc del péptido, el intrón o intrones se ubican en un lado o en el otro (es decir, 5' o 3') del ADNc de manera que no interrumpa esta secuencia codificante. Cualquier intrón de cualquier fuente, que incluye cualquier organismo viral, procariota y eucariota (vegetal o animal), puede usarse para practicar esta modalidad, siempre que sea compatible con la(s) célula(s) huésped en la que se inserta. También se incluyen en la presente descripción los intrones sintéticos. Opcionalmente, puede usarse más de un intrón en el vector.

Cuando uno o más de los elementos expuestos anteriormente no estén ya presentes en el vector que se va a usar, pueden obtenerse individualmente y ligarse en el vector. Los métodos usados para obtener cada uno de los elementos se conocen bien por el experto en la técnica y son comparables a los métodos expuestos anteriormente (es decir, síntesis del ADN, selección de bibliotecas, y similares).

Los vectores finales usados para practicar esta modalidad pueden construirse a partir de vectores de partida tales como un vector disponible comercialmente. Tales vectores pueden contener o no algunos de los elementos que se incluirán en el vector completo. Si ninguno de los elementos deseados está presente en el vector de partida, cada elemento puede ligarse individualmente en el vector mediante el corte del vector con la(s) endonucleasa(s) de restricción apropiada(s) de tal manera que los extremos del elemento a ligar y los extremos del vector son compatibles para el ligamiento. En algunos casos, puede ser necesario hacer romos los extremos que se van a ligar para obtener un ligamiento satisfactorio. La generación de extremos romos se logra mediante el rellenado primero de los "extremos pegajosos" mediante el uso de la ADN polimerasa Klenow o la ADN polimerasa de T4 en presencia de los cuatro nucleótidos. Este procedimiento se conoce bien en la técnica y se describe, por ejemplo, en Sambrook y otros, supra. Alternativamente, dos o más de los elementos que van a insertarse en el vector pueden primero ligarse entre sí (si se van a colocar adyacentes entre sí) y después ligarse al vector.

Un método adicional para construir el vector es realizar todas los ligamientos de los diversos elementos simultáneamente en una mezcla de reacción. En este caso, se generarán muchos vectores sin sentido o no funcionales debido al ligamiento o inserción inadecuados de los elementos, sin embargo, el vector funcional puede identificarse y seleccionarse mediante digestión con endonucleasas de restricción.

Los vectores preferidos para poner en práctica esta modalidad son aquellos que son compatibles con células huésped bacterianas, de insectos, y de mamíferos. Tales vectores incluyen, entre otros, pCRII, pCR3, y pcDNA3.1 (Invitrogen Company, San Diego, CA), pBSII (Stratagene Company, La Jolla, CA), pET15b (Novagen, Madison, Wisconsin), PGEX (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), pEGFP-N2 (Clontech, Palo Alto, California), pETL (BlueBachl; Invitrogen), y pFastBacDual (Gibco/BRL, Grand Island, N.Y.).

Una vez que se construyó el vector y se insertó una molécula de ácido nucleico que codifica proteína o péptido de longitud completa o truncada en el sitio apropiado del vector, el vector completo puede insertarse en una célula huésped adecuada para la amplificación y/o expresión de polipéptidos. Las células huésped pueden ser células huésped procariotas (tal como E. coli) o células huésped eucariotas (tal como una célula de levadura, una célula de insecto, o una célula de vertebrado). La célula huésped, cuando se cultiva en condiciones apropiadas, puede sintetizar proteína o péptido que posteriormente puede recolectarse del medio de cultivo (si la célula huésped lo secreta en el medio) o directamente de la célula huésped que lo produce (si no se secreta).

Después de la recolección, el péptido NTP puede purificarse mediante el uso de métodos tales como cromatografía de tamiz molecular, cromatografía de afinidad, y similares. La selección de la célula huésped para la producción de proteínas o péptidos dependerá en parte de si el péptido debe glicosilarse o fosforilarse (en cuyo caso se prefieren las células huésped eucariotas) y la manera en que la célula huésped puede plegar el péptido en su estructura terciaria nativa (por ejemplo, orientación adecuada de puentes disulfuro, etc.) de manera que el péptido que tiene actividad biológica prepare la proteína biológicamente activa, el péptido puede plegarse después de la síntesis mediante el uso de condiciones químicas apropiadas como se describe más abajo. Las células o líneas celulares adecuadas pueden ser células de mamífero, tales como células de ovario de hámster chino (CHO), células de riñón embrionario humano (HEK) 293, células 293T, o células 3T3. La selección de células huésped de mamífero adecuadas y los métodos para la transformación, cultivo, amplificación, cribado y producción y purificación de productos se conocen en la técnica. Otras líneas celulares de mamíferos adecuadas son las líneas celulares COS-1 y COS-7 de mono, y la línea celular CV-1. Otras células huésped de mamífero ejemplares incluyen líneas celulares de primates y líneas celulares de roedores, que incluyen líneas celulares transformadas. También son adecuadas las células diploides normales, las cepas celulares derivadas del cultivo in vitro de tejido primario, así como también los explantes primarios. Las células candidatas pueden ser genotípicamente deficientes en el gen de selección o pueden contener un gen de selección de acción dominante. Otras líneas celulares de mamíferos adecuadas incluyen, pero no se limitan a, células N2A de neuroblastoma de ratón, HeLa, células L-929 de ratón, líneas 3T3 derivadas de ratones Swiss, Balb-c o NIH, líneas celulares de hámster BHK o HaK.

Similarmente útiles como células huésped adecuadas para las presentes modalidades son las células bacterianas. Por ejemplo, las diversas cepas de E. coli (por ejemplo, HB101, DH5.alpha., DH10, y MC1061) se conocen bien como células huésped en el campo de la biotecnología. También pueden emplearse en este método diversas cepas de B. subtilis, Pseudomonas spp., otras Bacillus spp., Streptomyces spp., y similares. Muchas cepas de células de levadura conocidas por los expertos en la técnica también están disponibles como células huésped para la expresión de los polipéptidos de las presentes modalidades.

Adicionalmente, cuando se desee, pueden usarse sistemas de células de insectos en los métodos de las presentes modalidades. Tales sistemas se describen, por ejemplo, en Kitts y otros, (Biotechniques, 14:810-817), Lucklow (Curr. Opin. Biotechnol., 4:564-572) y Lucklow y otros, (J. Virol., 67:4566-4579). Las células de insecto preferidas son Sf-9 y Hi5 (Invitrogen, Carlsbad, CA).

La inserción (también denominada transformación o transfección) del vector en la célula huésped seleccionada puede lograrse mediante el uso de métodos tales como cloruro de calcio, electroporación, microinyección, lipofección, o el método DEAE-dextrano. El método seleccionado dependerá en parte del tipo de célula huésped que se use. Estos métodos y otros métodos adecuados se conocen bien por el experto en la técnica y se exponen, por ejemplo, en Sambrook y otros, supra.

Las células huésped que contienen el vector (es decir, transformadas o transfectadas) pueden cultivarse mediante el uso de medios estándar que se conocen bien por el experto en la técnica. El medio normalmente contendrá todos los nutrientes necesarios para el crecimiento y supervivencia de las células. Los medios adecuados para cultivar células de E. coli son, por ejemplo, caldo Luria (Lb ) y/o caldo Terrific (TB). Los medios adecuados para cultivar células eucariotas son RPMI 1640, MEM, DMEM, todos los cuales pueden complementarse con suero y/o factores de crecimiento según lo requiera la línea celular particular que se cultiva. Un medio adecuado para cultivos de insectos es el medio de Grace complementado con levadura, hidrolizado de lactoalbúmina, y/o suero de ternero fetal según sea necesario. Típicamente, un antibiótico u otro compuesto útil para el crecimiento selectivo de las células transformadas solo se añade como complemento al medio. El compuesto a usar vendrá dictado por el elemento marcador seleccionable presente en el plásmido con el que se transformó la célula huésped. Por ejemplo, cuando el elemento marcador seleccionable es la resistencia a la kanamicina, el compuesto añadido al medio de cultivo será la kanamicina.

La cantidad de péptido NTP producido en la célula huésped puede evaluarse mediante el uso de métodos estándar conocidos en la técnica. Tales métodos incluyen, sin limitación, análisis de transferencia Western, electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS, electroforesis en gel no desnaturalizante, separación por HPLC, espectroscopía de masas, inmunoprecipitación, y/o ensayos de actividad tales como ensayos de cambio de gel de unión a ADN.

Si la proteína o péptido se diseñó para secretarse por las células huésped, la mayoría de la proteína o péptido puede encontrarse en el medio de cultivo celular. Las proteínas preparadas de esta manera típicamente no poseerán una metionina amino terminal, ya que se elimina durante la secreción de la célula. Sin embargo, si la proteína o el péptido no se secreta de las células huésped, estará presente en el citoplasma y/o el núcleo (para las células huésped eucariotas) o en el citosol (para las células huésped de bacterias gram negativas) y puede tener una metionina amino terminal.

Para un péptido NTP situado en el citoplasma y/o núcleo de la célula huésped, las células huésped típicamente se rompen primero mecánicamente o con detergente para liberar el contenido intracelular en una solución tamponada. Después el péptido puede aislarse de esta solución.

La purificación de péptidos NTP a partir de la solución puede lograrse mediante el uso de una variedad de técnicas. Si el péptido NTP se sintetizó de manera que contenga una etiqueta como hexaHistidina (por ejemplo, Péptido/hexaHis) u otro péptido pequeño como FLAG (Sigma-Aldritch, St. Louis, MO) o péptido de unión a calmodulina (Stratagene, La Jolla, California) en su extremo carboxilo o amino, puede purificarse esencialmente en un proceso de una etapa mediante el pase de la solución a través de una columna de afinidad donde la matriz de la columna tiene una alta afinidad por la etiqueta o por la proteína directamente (es decir, un anticuerpo monoclonal que reconoce específicamente el péptido). Por ejemplo, la polihistidina se une con gran afinidad y especificidad al níquel, zinc y cobalto; por lo tanto, la cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados que emplea una resina de afinidad a base de níquel (como se usa en el sistema QIAexpress de Qiagen o el sistema Xpress de Invitrogen) o una resina de afinidad a base de cobalto (como se usa en el sistema Talon de BD Biosciences-CLONTECH) puede usarse para la purificación de péptido/poliHis. (Ver, por ejemplo, Ausubel y otros, Eds., Current Protocols in Molecular Biology, Sección 10.11.8, John Wiley & Sons, Nueva York).

Cuando el péptido NTP se prepara sin una etiqueta unida y no hay anticuerpos disponibles, pueden usarse otros procedimientos de purificación bien conocidos. Tales procedimientos incluyen, sin limitación, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de hidroxiapatita, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de tamiz molecular, HPLC, electroforesis en gel nativo en combinación con elución en gel, y enfoque isoeléctrico preparativo (máquina/técnica Isoprime, Hoefer Scientific). En algunos casos, pueden combinarse dos o más de estas técnicas para lograr una mayor pureza.

Si se prevé que el péptido NTP se encontrará principalmente intracelularmente, el material intracelular (incluidos los cuerpos de inclusión para bacterias gram negativas) puede extraerse de la célula huésped mediante el uso de cualquier técnica estándar conocida por el experto en la técnica. Por ejemplo, las células huésped pueden lisarse para liberar el contenido del periplasma/citoplasma mediante prensa francesa, homogeneización y/o ultrasonidos seguida de centrifugación. Si el péptido forma cuerpos de inclusión en el citosol, los cuerpos de inclusión a menudo pueden unirse a las membranas celulares internas y/o externas y, por lo tanto, se encontrarán principalmente en el material de sedimento después de la centrifugación. Después el material de la pastilla puede tratarse a pH extremos o con un agente caotrópico como un detergente, guanidina, derivados de guanidina, urea o derivados de urea en presencia de un agente reductor como ditiotreitol a pH alcalino o tris carboxietilfosfina a pH ácido hasta liberar, separar, y solubilizar los cuerpos de inclusión. El péptido en su forma ahora soluble puede analizarse mediante el uso de electroforesis en gel, inmunoprecipitación o similares. Si se desea aislar el péptido, el aislamiento puede lograrse mediante el uso de métodos estándar como los que se exponen más abajo y en Marston y otros Meth. Enz., 182:264-275.

En algunos casos, el péptido NTP puede no ser biológicamente activo tras el aislamiento. Pueden usarse varios métodos para replegar o convertir el polipéptido en su estructura terciaria y generar enlaces disulfuro para restaurar la actividad biológica. Tales métodos incluyen exponer el polipéptido solubilizado a un pH normalmente superior a 7 y en presencia de una concentración particular de un caótropo. La selección del caótropo es muy similar a las opciones usadas para la solubilización de cuerpos de inclusión, pero normalmente a una concentración más baja y no es necesariamente el mismo caótropo que se usa para la solubilización. En la mayoría de los casos, la solución de replegamiento/oxidación también contendrá un agente reductor o el agente reductor más su forma oxidada en una proporción específica para generar un potencial redox particular que permita que se produzca una mezcla de disulfuro en la formación del puente de cisteína de la proteína. Algunas de las parejas redox comúnmente usadas incluyen cisteína/cistamina, glutatión (GSH)/ditiobis GSH, cloruro cúprico, ditiotreitol (DTT)/ditiano DTT, 2-mercaptoetanol (bME)/ditio-b (ME). En muchos casos es necesario un codisolvente para aumentar la eficacia del replegamiento y los reactivos más comunes usados para este propósito incluyen glicerol, polietilenglicol de varios pesos moleculares, y arginina.

Si los cuerpos de inclusión de péptidos NTP no se forman en un grado significativo en la célula huésped, el péptido NTP se encontrará principalmente en el sobrenadante después de la centrifugación del homogeneizado celular, y el péptido NTP puede aislarse del sobrenadante mediante el uso de métodos como los establecidos más abajo.

En aquellas situaciones en las que es preferible aislar parcialmente o completamente el péptido NTP, la purificación puede lograrse mediante el uso de métodos estándar que se conocen bien por el experto en la técnica. Tales métodos incluyen, sin limitación, separación por electroforesis seguida de electroelución, varios tipos de cromatografía (inmunoafinidad, tamiz molecular, y/o intercambio iónico), y/o cromatografía líquida de alta presión. En algunos casos, puede ser preferible usar más de uno de estos métodos para una purificación completa.

En adición a preparar y purificar péptidos NTP mediante el uso de técnicas de ADN recombinante, los péptidos NTP y sus fragmentos, variantes, homólogos, proteínas de fusión, miméticos de péptidos, y derivados pueden prepararse mediante métodos de síntesis química (como la síntesis de péptidos en fase sólida) mediante el uso de técnicas conocidas. en la técnica tales como los expuestos por Merrifield y otros, J. Am. Chem. Soc. 85:2149, Houghten y otros, Proc Natl Acad. Sci. USA, 82:5132, y Stewart y Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, III. Tales péptidos pueden sintetizarse con o sin una metionina en el extremo amino. Los péptidos NTP sintetizados químicamente pueden oxidarse mediante el uso de los métodos expuestos en estas referencias para formar puentes disulfuro. Se espera que los péptidos NTP tengan una actividad biológica comparable a la de los péptidos producidos de forma recombinante o purificados a partir de fuentes naturales y, por lo tanto, pueden usarse indistintamente con péptidos recombinantes o naturales.

Las composiciones de péptidos NTP químicamente modificadas en las que el péptido se une a un polímero se incluyen dentro del alcance de las presentes modalidades. El polímero seleccionado es típicamente soluble en agua de modo que la proteína a la que se une no precipite en un entorno acuoso, tal como un entorno fisiológico. El polímero seleccionado se modifica habitualmente para que tenga un solo grupo reactivo, tal como un éster activo para acilación o un aldehído para alquilación, de modo que el grado de polimerización pueda controlarse como se prevé en los presentes métodos. El polímero puede ser de cualquier peso molecular, y puede ser ramificado o no ramificado. Dentro del alcance de los polímeros peptídicos se incluye una mezcla de polímeros.

En algunos casos, puede ser deseable preparar variantes de ácidos nucleicos y/o aminoácidos de los péptidos NTP de origen natural. Las variantes de ácido nucleico pueden producirse mediante el uso de mutagénesis dirigida al sitio, amplificación por PCR, u otros métodos apropiados, donde los cebadores tienen las mutaciones puntuales deseadas (ver Sambrook y otros, supra, y Ausubel y otros, supra, para descripciones de técnicas de mutagénesis). La síntesis química mediante el uso de métodos descritos por Engels y otros, supra, también puede usarse para preparar tales variantes. También pueden usarse otros métodos conocidos por los expertos en la técnica.

Las variantes de ácido nucleico preferidas son aquellas que contienen sustituciones de nucleótidos que representan la preferencia de codón en la célula huésped que va a usarse para producir péptidos NTP. Tal optimización de codones puede determinarse mediante algoritmos informáticos que incorporan tablas de frecuencia de codones como Ecohigh. Cod para la preferencia de codones de genes bacterianos altamente expresados como lo proporciona el paquete de la Universidad de Wisconsin Versión 9.0, Genetics Computer Group, Madison, Wis. Otras tablas de frecuencia de codones útiles incluyen Celegans_high.cod, Celegans_low.cod, Drosophila_high.cod, Human_high.cod, Maize_high.cod, y Yeast_high.cod. Otras variantes preferidas son aquellas que codifican cambios de aminoácidos conservadores como se describe anteriormente (por ejemplo, en donde la carga o polaridad de la cadena lateral de aminoácidos de origen natural no se altera sustancialmente por sustitución con un aminoácido diferente) en comparación con el tipo salvaje y/o aquellos diseñados para generar un(os) nuevo(s) sitio(s) de glicosilación y/o fosforilación, o aquellos diseñados para eliminar un(os) sitio(s) de glicosilación y/o fosforilación existentes.

Los péptidos y fragmentos de NTP, homólogos, variantes, proteínas de fusión, miméticos de péptidos, derivados y sales de estos también pueden prepararse mediante el uso de técnicas de síntesis de péptidos convencionales conocidas por el experto en la técnica. Estas técnicas incluyen métodos de acoplamiento químico (cf. Wunsch, E: "Methoden der organischen Chemie", volumen 15, Banda 1+2, Synthese von Peptiden, thime Verlag, Stuttgart (1974), y Barrany, G.; Marrifield, RB: "The Peptides", ed. E. Gross, J. Meienhofer, volumen 2, capítulo 1, pág. 1 - 284, Academic Press (1980)), métodos de acoplamiento enzimático (cf. Widmer, F. Johansen, JT, Carlsberg Res. Commun., vol. 44, pág. 37-46 (1979); Kullmann, W.: "Enzymatic Peptide Synthesis", CRC Press Inc. Boca Raton, Fla. (1987); y Widmer, F., Johansen, J.T. en "Synthetic Peptides in Biology and Medicines", ed. Alitalo, K., Partanen, P., Vatieri, A., pág. 79-86, Elsevier, Amsterdam (1985)), o una combinación de métodos químicos y enzimáticos si esto es ventajoso para el diseño y la economía del proceso. Mediante el uso de las pautas proporcionadas en la presente descripción, los expertos en la técnica son capaces de variar la secuencia peptídica del péptido NTP para producir un homólogo que tenga la misma o similar actividad biológica (bioactividad) que el péptido nTp original o nativo.

Existen ventajas para usar un mimético de un péptido NTP dado en lugar del péptido en sí. En general, los miméticos de péptidos son más biodisponibles, tienen una duración de acción más prolongada y pueden ser más baratos de producir que las proteínas y péptidos nativos.

Los miméticos de péptidos de péptidos NTP pueden desarrollarse mediante el uso de técnicas de química combinatoria y otras técnicas conocidas en la técnica (ver, por ejemplo, Proceedings of the 20th European Peptide Symposium, ed. G. Jung, E. Bayer, pág. 289-336, y referencias allí). Ejemplos de métodos conocidos en la técnica para modificar estructuralmente un péptido para crear un péptido mimético incluyen la inversión de los centros quirales de la cadena principal que conducen a estructuras de residuos de D-aminoácidos que pueden, particularmente en el extremo N, conducir a una mayor estabilidad para la degradación proteolítica sin afectar negativamente la actividad. Se proporciona un ejemplo en el documento “Tritriated D-ala.sup.1-Peptide T Binding”, Smith CS y otros, Drug Development Res. 15, pág. 371-379 (1988).

Un segundo método consiste en alterar la estructura cíclica para la estabilidad, como las imidas y lactamas entre cadenas de N a C (Ede y otros en Smith y Rivier (Eds.) "Peptides: Chemistry and Biology", Escom, Leiden (1991), pág. 268-270). Un ejemplo de esto se da en compuestos similares a timopentina conformacionalmente restringidos, tales como los descritos en la patente de Estados Unidos núm. 4,457,489 (1985), Goldstein, G. y otros.

Un tercer método consiste en sustituir enlaces peptídicos en el péptido NTP por enlaces pseudopeptídicos que confieren resistencia a la proteólisis. Se describieron varios enlaces pseudopeptídicos que, en general, no afectan a la estructura del péptido ni a la actividad biológica. Un ejemplo de este enfoque es la sustitución de enlaces pseudopeptídicos retroinversos ("Biologically active retroinverso analogues of thymopentin ", Sisto A. y otros en Rivier, J. E. y Marshall, G.R. (eds) "Peptides, Chemistry, Structure and Biology", Escom, Leiden (1990), pág. 722-773) y Dalpozzo, y otros (1993), Int. J. Peptide Protein Res., 41:561-566). De acuerdo con esta modificación, las secuencias de aminoácidos de los péptidos pueden ser idénticas a las secuencias de los péptidos descritos anteriormente, excepto que uno o más de los enlaces peptídicos se reemplazan por un enlace pseudopeptídico retroinverso. Preferentemente, el enlace peptídico más N-terminal está sustituido, ya que tal sustitución conferirá resistencia a la proteólisis por exopeptidasas que actúan sobre el N-terminal.

La síntesis de péptidos con uno o más enlaces pseudopeptídicos retroinversos reducidos es conocida en la técnica (Sisto (1990) y Dalpozzo, y otros (1993), citado anteriormente). Por tanto, los enlaces peptídicos pueden sustituirse por enlaces no peptídicos que permiten que el mimético peptídico adopte una estructura similar y, por tanto, una actividad biológica, al péptido original. También pueden realizarse modificaciones adicionales mediante el reemplazo de grupos químicos de los aminoácidos con otros grupos químicos de estructura similar. Otro enlace pseudopeptídico adecuado que se sabe que mejora la estabilidad a la escisión enzimática con poca o ninguna pérdida de actividad biológica es el enlace pseudopeptídico isóstero reducido (Couder, y otros (1993), Int. J. Peptide Protein Res., 41:181-184). Por tanto, las secuencias de aminoácidos de estos péptidos pueden ser idénticas a las secuencias de un péptido, excepto que uno o más de los enlaces peptídicos se reemplazan por un enlace pseudopeptídico isóstero. Preferentemente, el enlace peptídico más N-terminal está sustituido, ya que tal sustitución conferiría resistencia a la proteólisis por exopeptidasas que actúan sobre el N-terminal. La síntesis de péptidos con uno o más enlaces pseudopeptídicos isóstero reducidos es conocida en la técnica (Couder, y otros (1993), citado anteriormente). Otros ejemplos incluyen la introducción de enlaces cetometileno o metilsulfuro para reemplazar enlaces peptídicos.

Los derivados peptoides de péptidos NTP representan otra clase de miméticos de péptidos que retienen los determinantes estructurales importantes para la actividad biológica, pero eliminan los enlaces peptídicos, lo que confiere resistencia a la proteólisis (Simon, y otros, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:9367-9371. Los peptoides son oligómeros de glicinas N-sustituidas. Se describieron varios grupos N-alquilo, cada uno de los cuales corresponde a la cadena lateral de un aminoácido natural (Simon, y otros (1992)). Algunos o todos los aminoácidos del péptido se reemplazan con la glicina N-sustituida correspondiente al aminoácido reemplazado.

El desarrollo de miméticos de péptidos puede auxiliarse mediante la determinación de la estructura terciaria del péptido original mediante espectroscopia de RMN, cristalografía y/o modelado molecular asistido por ordenador. Estas técnicas ayudan en el desarrollo de nuevas composiciones de mayor potencia y/o mayor biodisponibilidad y/o mayor estabilidad que el péptido original (Dean (1994), BioEssays, 16: 683-687; Cohen y Shatzmiller (1993), J. Mol Graph., 11: 166-173; Wiley y Rich (1993), Med. Res. Rev., 13: 327-384; Moore (1994), Trends Pharmacol. Sci. 15: 124-129; Hruby (1993), Biopolymers, 33: 1073-1082; Bugg y otros (1993), Sci. Am., 269: 92-98).

Una vez que se identifica un compuesto mimético de péptido potencial, puede sintetizarse y ensayarse mediante el uso de los métodos descritos en los ejemplos siguientes para evaluar su actividad. Los compuestos miméticos de péptidos obtenidos mediante los métodos anteriores, que tienen la actividad biológica de los péptidos y una estructura tridimensional similar, se incluyen en esta modalidad. Será fácilmente evidente para un experto en la técnica que puede generarse un péptido mimético a partir de cualquiera de los péptidos que portan una o más de las modificaciones descritas anteriormente. Además, resultará evidente que los miméticos de péptidos de esta modalidad pueden usarse adicionalmente para el desarrollo de compuestos no peptídicos aún más potentes, en adición a su utilidad como compuestos terapéuticos.

Actualmente existen varias organizaciones que son capaces de sintetizar los péptidos descritos en la presente descripción. Por ejemplo, dada la secuencia de un péptido NTP, la organización puede sintetizar el péptido y enviar el péptido sintetizado con la documentación adjunta y la prueba de la identidad del péptido.

Las presentes modalidades se dirigen a métodos para tratar mamíferos con afecciones que requieren la eliminación de células, tales como tumores benignos y malignos, hiperplasia glandular (por ejemplo, de próstata), vello facial no deseado, verrugas, y tejido graso no deseado, o la inhibición o prevención de células no deseadas. proliferación, tal como la estenosis de un stent. Tal método comprende administrar a un mamífero que lo necesite, o recubrir un dispositivo tal como un stent con una cantidad terapéuticamente efectiva de péptido NTP, ya sea solo o en combinación con un agente activo adicional. El método se lleva a cabo, preferentemente, más de una vez y/o se lleva a cabo en mamíferos sin tratamiento previo, y el método da como resultado una reducción inesperadamente superior en la necesidad de una intervención quirúrgica invasiva posterior, en comparación con los mamíferos tratados una vez, con los mamíferos que reciben un placebo, y al fracaso del tratamiento en mamíferos que recibieron el mismo tratamiento o se trataron con un placebo.

El agente activo adicional puede ser uno o más agentes activos seleccionados de (i) agentes activos contra el cáncer (tales como agentes alquilantes, inhibidores de topoisomerasa I, inhibidores de topoisomerasa II, antimetabolitos de ARN/ADN, y agentes antimitóticos); (ii) agentes activos para tratar crecimientos benignos tales como agentes activos antiacné y antiverrugas (ácido salicílico); (iii) compuestos antiandrógenos, (acetato de ciproterona (1a, 2p-metilen-6-cloro-17 a-acetoxi-6-deshidroprogesterona)) Tamoxifeno, inhibidores de aromatasa); (iv) bloqueadores de los receptores alfal-adrenérgicos (tamsulosina, terazosina, doxazosina, prazosina, bunazosina, indoramina, alfulzosina, silodosina); (v) inhibidores de la 5 a-reductasa (finasterida, dutasterida); (vi) inhibidores de la fosfodiesterasa tipo 5 (PDE5) (tadalafil) y combinaciones de estos. Preferentemente, el agente activo adicional se selecciona del grupo que consiste en tamsulosina, finasterida, terazosina, doxazosina, prazosina, tadalafil, alfuzosina, silodosina, dutasterida, combinaciones de dutasterida y tamsulosina, y mezclas y combinaciones de estos.

La afección puede ser, por ejemplo, tumores de pulmón, mama, estómago, páncreas, próstata, vejiga, hueso, ovario, piel, riñón, seno, colon, intestino, estómago, recto, esófago, sangre, cerebro y sus revestimientos, médula espinal y sus cubiertas, músculo, tejido conectivo, suprarrenal, paratiroides, tiroides, útero, testículos, pituitaria, órganos reproductivos, hígado, vesícula biliar, ojos, oídos, nariz, garganta, amígdalas, boca, ganglios linfáticos y sistema linfoide, y otros órganos.

Como se usa en la presente descripción, el término "tumor maligno" pretende abarcar todas las formas de carcinomas, sarcomas y melanomas humanos que se presentan en las formas poco diferenciadas, moderadamente diferenciadas, y bien diferenciadas.

Esta modalidad satisface una necesidad en la técnica de tratamientos que puedan eliminar tumores benignos con menos riesgo y menos de los efectos secundarios indeseables de la cirugía. Es particularmente necesario un método para extirpar tumores benignos en áreas quirúrgicamente peligrosas tales como en lugares profundos del cuerpo (por ejemplo, cerebro, corazón, pulmones, y otros).

La condición a tratar también puede ser una hiperplasia, hipertrofia, o crecimiento excesivo de un tejido seleccionado del grupo que consiste en pulmón, mama, estómago, páncreas, próstata, vejiga, hueso, ovario, piel, riñón, seno, colon, intestino, estómago, recto, esófago, sangre, cerebro y sus revestimientos, médula espinal y sus revestimientos, músculo, tejido conectivo, suprarrenal, paratiroides, tiroides, útero, testículos, pituitaria, órganos reproductivos, hígado, vesícula biliar, ojo, oído, nariz, garganta, amígdalas, boca y ganglios linfáticos y sistema linfoide.

Otras afecciones que pueden tratarse mediante el uso del método de las modalidades son tejido alterado por virus, bacterias o parásitos seleccionado del grupo que consiste en pulmón, mama, estómago, páncreas, próstata, vejiga, hueso, ovario, piel, riñón, seno, colon, intestino, estómago, recto, esófago, sangre, cerebro y sus revestimientos, médula espinal y sus revestimientos, músculo, tejido conectivo, suprarrenal, paratiroides, tiroides, útero, testículos, pituitaria, órganos reproductivos, hígado, vesícula biliar, ojo, oído, nariz, garganta, amígdalas, boca, y ganglios linfáticos y sistema linfoide.

La afección a tratar también puede ser una malformación o trastorno de un tejido seleccionado del grupo que consiste en pulmón, mama, estómago, páncreas, próstata, vejiga, hueso, ovario, piel, riñón, seno, colon, intestino, estómago, recto, esófago, sangre, cerebro y sus revestimientos, médula espinal y sus revestimientos, músculo, tejido conectivo, suprarrenal, paratiroides, tiroides, útero, testículos, pituitaria, órganos reproductivos, hígado, vesícula biliar, ojo, oído, nariz, garganta, amígdalas, boca, y ganglios linfáticos y sistema linfoide.

En particular, la afección a tratar puede ser hipertrofia amigdalar, hiperplasia prostática, psoriasis, eccema, dermatosis o hemorroides. La afección a tratar puede ser una enfermedad vascular, como aterosclerosis o arteriosclerosis, o un trastorno vascular, como venas varicosas, estenosis o reestenosis de una arteria o un stent. La afección a tratar también puede ser una modificación cosmética de un tejido, como piel, ojos, oídos, nariz, garganta, boca, músculo, tejido conectivo, cabello, o tejido mamario.

Las composiciones terapéuticas de péptidos NTP pueden comprender una cantidad terapéuticamente efectiva de un péptido NTP mezclado con un portador farmacéuticamente aceptable. En algunas modalidades alternativas, el agente activo adicional puede administrarse en la misma composición con el péptido NTP, y en otra modalidad, la composición que comprende el péptido NTP se administra como una inyección, mientras que el agente activo adicional se formula en una medicación oral (gel, cápsula, tableta, líquido, etc.). El material portador puede ser agua para inyección, preferentemente, complementado con otros materiales comunes en soluciones para administración a mamíferos. Típicamente, un péptido NTP para uso terapéutico se administrará en forma de una composición que comprende péptido purificado junto con uno o más portadores, excipientes, o diluyentes fisiológicamente aceptables. La solución salina tamponada neutra o la solución salina mezclada con albúmina de suero son portadores apropiados ejemplares. Preferentemente, el producto se formula como un liofilizado mediante el uso de excipientes apropiados (por ejemplo, sacarosa). Pueden incluirse otros portadores, diluyentes, y excipientes estándar según se desee. Las composiciones de las modalidades también pueden comprender tampones conocidos por los expertos en la técnica con un intervalo apropiado de valores de pH, que incluyen tampón Tris de aproximadamente pH 7,0-8,5, o tampón acetato de aproximadamente pH 4,0-5,5, que puede incluir, además, sorbitol o un sustituto adecuado de este.

El uso de péptidos NTP conjugados o enlazados o unidos a un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, molécula similar a un anticuerpo, o una molécula con una alta afinidad por un marcador tumoral específico, tal como un receptor celular, péptido señal o enzima sobreexpresada, para dirigirse a los elementos celulares no deseados en un mamífero sin experiencia también se incluye en el alcance de las modalidades. El anticuerpo, fragmento de anticuerpo, molécula similar a anticuerpo o molécula con una alta afinidad por un marcador tumoral específico se usa para dirigir el péptido conjugado a un objetivo celular o tisular específico. Por ejemplo, un tumor con un antígeno de superficie distintivo o un antígeno expresado puede dirigirse por el anticuerpo, fragmento de anticuerpo, o molécula de unión de tipo anticuerpo y las células tumorales pueden destruirse por el péptido. Un enfoque de este tipo que usa el direccionamiento de anticuerpos tiene las ventajas anticipadas de disminuir la dosis, aumentar la probabilidad de unión y captación por las células objetivo, y mayor utilidad para direccionar y tratar tumores metastásicos y tumores de tamaño microscópico.

Esta modalidad también abarca el uso de péptidos NTP conjugados o enlazados o unidos a una proteína u otra molécula para formar una composición que, tras la escisión en o cerca del/(de los) sitio(s) del tumor u otras células no deseadas por una enzima o proteasa específica de tumor o sitio o por un conjugado de anticuerpo que se dirige al tumor u otras células no deseadas, libera el péptido en o cerca del/(de los) sitio(s) del tumor u otras células no deseadas.

Esta modalidad también abarca el uso de péptidos NTP conjugados o enlazados o unidos a una proteína u otra molécula para formar una composición que libere el péptido o algún fragmento biológicamente activo del péptido al exponer el tejido a tratarse a la luz (como en terapias láser u otra terapia fotodinámica o fotoactivada), otras formas de radiación electromagnética tales como radiación infrarroja, radiación ultravioleta, radiación de rayos X, o rayos gamma, calor localizado, radiación alfa o beta, emisiones ultrasónicas, u otras fuentes de energía localizada.

Las modalidades también abarcan composiciones terapéuticas de péptidos NTP que emplean dendrímeros, fullerenos, y otras moléculas sintéticas, polímeros y macromoléculas donde el péptido y/o su correspondiente molécula de ADN se conjuga, une o encierra en la molécula, polímero o macromolécula, ya sea por sí mismo o junto con otras especies de moléculas tales como un marcador específico de tumor. Por ejemplo, la patente de Estados Unidos núm. 5,714,166, Bioactive and/or Targeted Dendimer Conjugates, proporciona un método para preparar y usar, entre otros, conjugados de polímeros dendríticos compuestos de al menos un dendrímero con un(os) director(es) objetivo(s) y al menos un agente bioactivo conjugado a este.

Esta modalidad también incluye métodos para tratar mamíferos con composiciones terapéuticas de genes y/o péptidos NTP y vehículos de administración de fármacos tales como emulsiones lipídicas, polímeros micelares, microesferas poliméricas, polímeros electroactivos, hidrogeles y liposomas, en combinación con un agente activo adicional.

El uso de péptidos NTP o genes relacionados o equivalentes de genes transferidos a las células no deseadas en un mamífero también se incluye en las modalidades. La sobreexpresión del péptido NTP dentro del tumor puede usarse para inducir la muerte de las células del tumor y reducir así la población de células tumorales. Se prevé que la transferencia de genes o equivalentes de genes del péptido NTP para tratar los elementos celulares no deseados tendrá la ventaja de requerir menos dosis y de transmitirse a la progenie celular de los elementos celulares objetivo, por lo que necesitará una terapia menos frecuente y menos terapia total. Esta modalidad también abarca la transferencia de genes que codifican una proteína de fusión que contiene un péptido NTP a las células no deseadas o células vecinas donde, tras la expresión del gen y la producción y/o secreción de la proteína de fusión, se escinde la proteína de fusión ya sea por enzimas o proteasas nativas o por un profármaco para liberar el péptido NTP en, en o cerca de las células no deseadas.

El uso de conjugados de péptido-anticuerpo recombinantes clonados; conjugados de fragmento de anticuerpopéptido recombinante clonados; y conjugados de proteínas similares a anticuerpos-péptido recombinante clonados para la administración a mamíferos sin tratamiento previo también se incluyen en el alcance de las modalidades. Las ventajas de un péptido NTP clonado combinado con un conjugado de direccionamiento (tal como un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una molécula similar a un anticuerpo, o una molécula con alta afinidad por un receptor específico del cáncer u otro marcador tumoral) son que tal molécula combina las ventajas de direccionamiento descritas anteriormente, en adición a las ventajas para la fabricación y producción estandarizada de la molécula conjugada clonada.

Esta modalidad también abarca el uso de composiciones terapéuticas de genes o equivalentes de genes o péptidos NTP como un componente del recubrimiento de un dispositivo médico tal como un stent para eliminar, inhibir o prevenir la proliferación o acumulación celular no deseada, en combinación con un agente activo adicional.

Las formas de dosificación sólidas para administración oral incluyen, pero no se limitan a, cápsulas, comprimidos, píldoras, polvos, y gránulos. En tales formas de dosificación sólidas, el agente activo adicional y/o el péptido NTP pueden mezclarse con al menos uno de los siguientes: (a) uno o más excipientes inertes (o portadores), tales como citrato de sodio o fosfato dicálcico; (b) cargas o extensores, tales como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol, y ácido silícico; (c) aglutinantes, tales como carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarosa y goma arábiga; (d) humectantes, tales como glicerol; (e) agentes desintegrantes, tales como agar-agar, carbonato cálcico, almidón de patata o tapioca, ácido algínico, ciertos silicatos complejos, y carbonato sódico; (f) retardadores de solución, tales como parafina; (g) aceleradores de la absorción, tales como compuestos de amonio cuaternario; (h) agentes humectantes, tales como alcohol acetílico y monoestearato de glicerol; (i) adsorbentes, tales como caolín y bentonita; y (j) lubricantes, tales como talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles sólidos, lauril sulfato de sodio, o mezclas de estos. Para cápsulas, tabletas, y píldoras, las formas de dosificación también pueden comprender agentes tamponantes.

Las formas de dosificación líquidas para administración oral incluyen emulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes, y elixires farmacéuticamente aceptables. En adición a los compuestos activos, las formas de dosificación líquidas pueden comprender diluyentes inertes comúnmente usados en la técnica, tales como agua u otros solventes, agentes solubilizantes, y emulsionantes. Ejemplos de emulsionantes son alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, dimetilformamida, aceites, tales como aceite de semilla de algodón, aceite de cacahuete, aceite de germen de maíz, aceite de oliva, aceite de ricino, y aceite de sésamo, glicerol, alcohol tetrahidrofurfurílico, polietilenglicoles, ésteres de ácidos grasos de sorbitán, o mezclas de estas sustancias, y similares.

Además de tales diluyentes inertes, la composición también puede incluir adyuvantes, tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes y de suspensión, agentes edulcorantes, saborizantes, y perfumantes.

Los niveles de dosificación reales de ingredientes activos en las composiciones de las modalidades pueden variarse para obtener una cantidad de péptido NTP y agente activo adicional que sea efectiva para obtener una respuesta terapéutica deseada para una composición y método de administración particulares. Por tanto, el nivel de dosificación seleccionado depende del efecto terapéutico deseado, la vía de administración, la duración deseada del tratamiento, y otros factores.

Con los mamíferos, incluidos los seres humanos, las cantidades efectivas pueden administrarse sobre la base del área de superficie corporal. La interrelación de las dosis para animales de varios tamaños, especies y seres humanos (basada en mg/M2 de superficie corporal) se describe por EJ Freireich y otros, Cancer Chemother. Rep., 50 (4):219 (1966). El área de superficie corporal puede determinarse aproximadamente a partir de la altura y el peso de un individuo (ver, por ejemplo, Scientific Tables, Geigy Pharmaceuticals, Ardsley, N.Y. pág. 537-538 (1970)). La dosis diaria total del péptido NTP y el agente activo adicional administrada a un huésped puede ser en dosis únicas o divididas. Las composiciones de unidades de dosificación pueden contener cantidades de submúltiplos de estas que puedan usarse para completar la dosis diaria. Sin embargo, se entenderá que el nivel de dosis específico para cualquier paciente en particular dependerá de una variedad de factores que incluyen el peso corporal, salud general, sexo, dieta, tiempo y vía de administración, potencia del fármaco administrado, tasas de absorción y excreción, combinación con otros fármacos y la gravedad de la enfermedad particular que se trata. Se prefiere que la composición se administre solo una vez como inyección o infusión, o en otra modalidad preferida, la composición se administre dos veces. En esta modalidad, el período de tiempo entre la administración de la composición puede variar entre 2 meses y 10 años, o entre 8 meses y 4 años, o más de aproximadamente un año (por ejemplo, entre 1 y 2 años).

Un método para administrar una composición de péptido NTP de acuerdo con las modalidades incluye, pero no se limita a, administrar los compuestos intramuscularmente, oralmente, intravenosamente, intraperitonealmente, intracerebralmente (intraparenquimatosamente), intracerebroventricularmente, intratumoralmente, intralesionalmente, intradérmicamente, intratecalmente, intranasalmente, intraarterialmente, tópicamente, transdérmicamente, a través de un aerosol, infusión, inyección en bolo, dispositivo de implantación, sistema de liberación sostenida, etc.

Otro método de administración de un péptido NTP de las modalidades es por vía transdérmica o transcutánea. El agente activo adicional puede emplearse junto con el péptido NTP, o puede administrarse por separado como se discutió anteriormente, o puede no administrarse en absoluto. Un ejemplo de tal modalidad es el uso de un parche. En particular, puede prepararse un parche con una suspensión fina de péptido en, por ejemplo, dimetilsulfóxido (DMSO), o una mezcla de DMSO con aceite de semilla de algodón y ponerse en contacto con la piel del mamíferos que porta el tumor lejos del sitio de ubicación del tumor dentro de una bolsa de piel. Otros medios o mezclas de estos con otros disolventes y soportes sólidos también funcionarían. El parche puede contener el compuesto peptídico en forma de solución o suspensión. Después el parche puede aplicarse a la piel del paciente, por ejemplo, mediante la inserción en una bolsa de piel del paciente formada mediante plegado y mantenimiento de la piel junta por medio de puntadas, clips u otros dispositivos de sujeción. Esta bolsa debe emplearse de tal manera que se asegure el contacto continuo con la piel sin la interferencia del mamífero. Además de usar una bolsa de piel, puede usarse cualquier dispositivo que garantice la colocación firme del parche en contacto con la piel. Por ejemplo, podría usarse un vendaje adhesivo para mantener el parche en su lugar sobre la piel.

Los péptidos NTP, opcionalmente en combinación con un agente activo adicional, pueden administrarse en una formulación o preparación de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices poliméricas semipermeables en forma de artículos moldeados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Las matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles, polilactidas (patente de Estados Unidos núm. 3,773,919, EP 58,481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma etil-L-glutamato (Sidman y otros, Biopolymers, 22: 547-556), poli(2-hidroxietil-metacrilato) (Langer y otros, J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 y Langer, Chem. Tech., 12: 98-105), etilen vinil acetato (Langer y otros, supra) o ácido poli-D(-)-3-hidroxibutírico (EP 133,988). Las composiciones de liberación sostenida también pueden incluir liposomas, que pueden prepararse mediante cualquiera de varios métodos conocidos en la técnica (por ejemplo, Eppstein y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688-3692; EP 36,676; EP 88,046; y EP 143,949).

Otro método de administración de un péptido NTP de las modalidades es mediante infusión directa o indirecta del péptido NTP en el tumor u otro tejido a tratar. Un ejemplo de tal modalidad es la inyección directa de péptido NTP en el tumor u otro tejido a tratar. El tratamiento puede consistir en una única inyección, múltiples inyecciones en una sola ocasión o una serie de inyecciones durante un período de horas, días o meses con la regresión o destrucción del tumor u otro tejido a tratar que se monitoriza mediante biopsia, imagenología u otros métodos de seguimiento del crecimiento de tejidos. La inyección en el tumor u otro tejido a tratar puede ser mediante un dispositivo insertado en un orificio como la nariz, boca, oído, vagina, recto o uretra o mediante una incisión para llegar al tumor o tejido in vivo y puede realizado junto con un sistema óptico o de imagenología tal como un ultrasonido o un endoscopio de fibra óptica para identificar el lugar apropiado para la(s) inyección/inyecciones. Otro ejemplo de tal modalidad es el uso de un dispositivo que puede proporcionar una infusión constante de péptido NTP al tejido a lo largo del tiempo.

Otro método de administrar un péptido NTP es junto con un procedimiento quirúrgico o similar empleado para extirpar físicamente, extirpar o matar o destruir de otra manera el tumor u otros tejidos o elementos celulares que se requiera o desee eliminar o destruir en donde un péptido NTP de las modalidades se administra en el área o áreas inmediatas que rodean el área o áreas donde se extirpó el tumor u otro tejido para destruir o impedir el crecimiento de las células tumorales u otros elementos celulares no eliminados o destruidos por el procedimiento

Otro método para administrar un péptido NTP de las modalidades es mediante la implantación de un dispositivo dentro del tumor u otro tejido a tratar. En esta modalidad, el agente activo adicional se administrará típicamente mediante una vía de administración diferente a la del péptido NTP. Un ejemplo de tal modalidad es la implantación de una oblea que contiene péptido en el tumor u otro tejido a tratar, y la administración del agente activo adicional mediante administración oral. La oblea libera una dosis terapéutica de péptido NTP en el tejido con el tiempo. Alternativamente o adicionalmente, la composición puede administrarse localmente mediante implantación en el área afectada de una membrana, esponja, u otro material apropiado sobre el que se absorbió el péptido NTP. Cuando se usa un dispositivo de implantación, el dispositivo puede implantarse en cualquier tejido u órgano adecuado, y la administración del péptido puede ser directamente a través del dispositivo mediante bolo, o mediante administración continua, o mediante catéter mediante el uso de infusión continua.

Un método alternativo de administración es introducir una o más copias de un gen que codifica el péptido NTP en la célula a la que se dirige y, si es necesario, inducir la(s) copia(s) del gen para que comiencen a producir el péptido intracelularmente. En esta modalidad, el agente activo adicional se administrará típicamente mediante una vía de administración diferente a la del péptido NTP. Una forma en la que puede aplicarse la terapia génica es usar el gen que codifica el péptido NTP (ya sea ADN genómico, ADNc, y/o ADN sintético que codifica el péptido (o un fragmento, variante, homólogo o derivado de este)) que puede unirse operativamente a un promotor constitutivo o inducible para formar una construcción de ADN de terapia génica. El promotor puede ser homólogo o heterólogo de un gen que codifica un péptido endógeno, siempre que sea activo en el tipo de célula o tejido en el que se insertará la construcción. Otros componentes de la construcción de ADN de terapia génica pueden incluir opcionalmente, según sea necesario, moléculas de ADN diseñadas para la integración específica del sitio (por ejemplo, secuencias flanqueantes endógenas útiles para la recombinación homóloga), potenciador(es), silenciador(es) o promotor específico del tejido, moléculas de ADN capaces de proporcionar una ventaja selectiva sobre la célula parental, moléculas de ADN útiles como marcadores para identificar células transformadas, sistemas de selección negativa, agentes de unión específicos de células (como, por ejemplo, para el direccionamiento celular), factores de intemalización específicos de células, y factores de transcripción para mejorar la expresión de un vector, así como también factores que permiten la fabricación del vector.

Los medios de administración de genes a una célula o tejido in vivo o ex vivo incluyen (pero no se limitan a) inyección directa de ADN desnudo, métodos balísticos, transferencia mediada por liposomas, transferencia mediada por receptor (complejo ligando-ADN), electroporación, y precipitación con fosfato de calcio. Ver las patentes de Estados Unidos núm. 4,970,154, WO 96/40958, patente de Estados Unidos núm. 5,679,559, patente de Estados Unidos núm. 5,676,954, y patente de Estados Unidos núm. 5,593,875. También incluyen el uso de un vector viral tal como un retrovirus, adenovirus, virus adenoasociado, poxvirus, lentivirus, virus del papiloma o virus del herpes simple, uso de un conjugado ADN-proteína y uso de un liposoma. El uso de vectores de terapia génica se describe, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos núm. 5,672,344, patente de Estados Unidos núm. 5,399,346, patente de Estados Unidos núm. 5,631,236, y patente de Estados Unidos núm. 5,635,399.

El gen que codifica el péptido NTP puede administrarse mediante la implantación en pacientes de ciertas células que se modificaron genéticamente ex vivo, mediante el uso de métodos como los descritos en la presente descripción, para expresar y secretar el péptido NTP o fragmentos, variantes, homólogos, o derivados de estos. Tales células pueden ser células animales o humanas, y pueden derivarse del propio tejido del paciente o de otra fuente, humana o no humana. Opcionalmente, las células pueden inmortalizarse o ser células madre. Sin embargo, para disminuir la posibilidad de una respuesta inmunológica, se prefiere que las células se encapsulen para evitar la infiltración de los tejidos circundantes. Los materiales de encapsulación son típicamente recintos poliméricos semipermeables biocompatibles o membranas que permiten la liberación del/de los producto(s) proteico(s) pero evitan la destrucción de las células por el sistema inmunológico del paciente o por otros factores perjudiciales de los tejidos circundantes. Los métodos usados para la encapsulación en membranas de células son familiares para el experto en la técnica, y la preparación de células encapsuladas y su implantación en pacientes puede lograrse sin experimentación indebida. Ver, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos núm. 4,892,538; 5,011,472; y 5,106,627. Un sistema para encapsular células vivas se describe en el documento núm. PCT WO 91/10425. Las técnicas para formular una variedad de otros medios de administración sostenida o controlada, tales como portadores de liposomas, partículas bioerosionables o perlas, también se conocen por los expertos en la técnica y se describen, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos núm. 5,653,975. Las células, con o sin encapsulación, pueden implantarse en tejidos corporales u órganos adecuados del paciente.

En determinadas modalidades, la descripción proporciona un método para reducir la necesidad de una intervención quirúrgica invasiva posterior en mamíferos que padecen BPH que comprende administrar a un mamífero que padece BPH al menos una vez, una cantidad terapéuticamente efectiva de un péptido NTP, específicamente un péptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos en la SEQ ID NO. 66 (lle-Asp-Gln-Gln-Val-Leu-Ser-Arg-lle-Lys-Leu-Glu-lle-Lys-Arg-Cys-Leu). La invención proporciona un péptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos en la s Eq ID NO. 66 (lle-Asp-Gln-Gln-Val-Leu-Ser-Arg-lle-Lys-Leu-Glu-lle-Lys-Arg-Cys-Leu) para el uso en un método para reducir la necesidad de una intervención quirúrgica invasiva posterior en mamíferos que padecen BPH que comprende administrar a un mamífero que padece BPH y que no se trató previamente para BPH (por ejemplo, un mamífero sin tratamiento previo), una cantidad terapéuticamente efectiva del péptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos en la SEQ ID NO. 66 (lle-Asp-Gln-Gln-Val-Leu-Ser-Arg-lle-Lys-Leu-Glu-lle-Lys-Arg-Cys-Leu).

En determinadas modalidades, el péptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos en la SEQ ID NO. 66 se administra en combinación con al menos un agente activo seleccionado del grupo que consiste en (1) un inhibidor de 5a-reductasa y/o un antiestrógeno, (2) un inhibidor de 5a-reductasa y/o un inhibidor de aromatasa, (3) un inhibidor de 5a-reductasa y/o un inhibidor de 17p-HSD, (4) un inhibidor de 5a-reductasa, un antiestrógeno y un inhibidor de aromatasa, (5) un inhibidor de 5a-reductasa, un antiestrógeno y un inhibidor de 17p-HSD, (6) un inhibidor de la 5a-reductasa, un inhibidor de la aromatasa, un antiestrógeno y un inhibidor de 17p-HSD, (7) un inhibidor de la 5a-reductasa, un antiandrógeno y un antiestrógeno, (8), un inhibidor de la 5a-reductasa, un antiandrógeno y un inhibidor de la aromatasa, (9) un inhibidor de la 5a-reductasa, un antiandrógeno y un inhibidor de la 17p-HSD, (10) un inhibidor de la 5a-reductasa, un antiandrógeno, un antiestrógeno y un inhibidor de la aromatasa, (11) un inhibidor de la 5a-reductasa, un antiandrógeno, un inhibidor de la aromatasa y un inhibidor de 17p-HSD, (12) un inhibidor de la 5a-reductasa, un antiandrógeno, un inhibidor de la aromatasa, un antiestrógeno y un inhibidor de 17p-HSD, (13) un inhibidor de 17p-HSD y un antiestrógeno, (14) un inhibidor de 17p-HSD y un inhibidor de aromatasa, (15) un inhibidor de 17p-HSD, un inhibidor de aromatasa y un antiestrógeno, (16) un inhibidor de 17p-HSD, un antiandrógeno y un antiestrógeno, (17) un inhibidor de 17p-HSD, un antiandrógeno y un inhibidor de aromatasa, (18) un inhibidor de 17p-HSD, un antiandrógeno, un antiestrógeno y una inhibidor de aromatasa, (19) un antiestrógeno y un inhibidor de la aromatasa y (20) un antiestrógeno, un inhibidor de la aromatasa y un antiandrógeno, (21) un agonista o antagonista de LHRH, un inhibidor de la 5a-reductasa y un antiestrógeno, (22) un antagonista o agonista de LHRH, un inhibidor de la 5a - reductasa y un inhibidor de la aromatasa, (23) un agonista o antagonista de LHRH, un inhibidor de la 5a reductasa y un inhibidor de 17p-HSD, (24) un agonista o antagonista de LHRH, un inhibidor de 5a-reductasa, un antiestrógeno y un inhibidor de aromatasa, (25) un agonista o antagonista de LHRH, un inhibidor de 5a-reductasa, un antiestrógeno y un inhibidor de 17p-HSD, (26) un agonista o antagonista de LHRH, un inhibidor de 5a-reductasa, un inhibidor de aromatasa, un antiestrógeno y un inhibidor de 17p-HSD, (27) un agonista o antagonista de LHRH, un inhibidor de 5a-reductasa, un antiandrógeno y un antiestrógeno, (28), un agonista o antagonista de LHRH, un inhibidor de 5a-reductasa, un antiandrógeno y un inhibidor de aromatasa, (29) un agonista o antagonista de LHRH, un inhibidor de 5a-reductasa, un antiandrógeno y una 17p-Inhibidor de HSD, (30) un agonista o antagonista de LHRH, un inhibidor de 5a-reductasa, un antiandrógeno, un antiestrógeno y un inhibidor de aromatasa, (31) un agonista o antagonista de LHRH, un inhibidor de 5a - reductasa, un antiandrógeno, un inhibidor de aromatasa y un inhibidor de 17p-HSD, (32) un agonista o antagonista de LHRH, un inhibidor de 5areductasa, un antiandrógeno, un inhibidor de aromatasa, un antiestrógeno y un inhibidor de 17p-HSD, (33) un agonista o antagonista de LHRH, un 17p-Inhibidor de HSD y un antiestrógeno, (34) un agonista o antagonista de LHRH, un inhibidor de 17p-HSD y un inhibidor de aromatasa, (35) un agonista o antagonista de LHRH, un inhibidor de 17p-HSD, un inhibidor de aromatasa y un antiestrógeno, (36) un agonista o antagonista de LHRH, un inhibidor de 17p-HSD, un antiandrógeno y un antiestrógeno, (37) un agonista o antagonista de LHRH, un inhibidor de 17p-HSD, un antiandrógeno y un inhibidor de aromatasa, (38) un agonista o antagonista de LHRH, un inhibidor de 17p-HSD, un antiandrógeno, un antiestrógeno y un inhibidor de aromatasa, (39) un agonista o antagonista de LHRH, un antiestrógeno y un inhibidor de aromatasa y (40) un agonista o antagonista de LHRH, un antiestrógeno, un inhibidor de aromatasa y un antiandrógeno.

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar las presentes modalidades. Debe entenderse, sin embargo, que las modalidades no deben limitarse a las condiciones o detalles específicos descritos en estos ejemplos. En particular, las modalidades incorporan expresamente por referencia los ejemplos contenidos en la solicitud de patente de Estados Unidos pendiente núm. 14/606,683, presentada el 27 de enero de 2015, titulada: METHOD OF TREATING DISORDERS REQUIRING DESTRUCTION OR REMOVAL OF CELLS, solicitud de Estados Unidos núm.

14/738,551, presentada el 12 de junio de 2015, titulada: COMBINATION COMPOSITIONS FOR TREATING DISORDERS REQUIRING REMOVAL OR DESTRUCTION OF UNWANTED CELLULAR PROLIFERATIONS, publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2003/0054990 (ahora abandonada); 2007/0237780 (ahora abandonada); 2003/0054990 (ahora patente de Estados Unidos núm. 7,172,893); 2003/0096350 (ahora patente de Estados Unidos núm. 6,924,266); 2003/0096756 (ahora patente de Estados Unidos núm. 7,192,929); 2003/0109437 (ahora patente de Estados Unidos núm. 7,241,738); 2003/0166569 (ahora patente de Estados Unidos núm. 7,317,077); y 2005/0032704 (ahora patente de Estados Unidos núm. 7,408,021), cada una de las cuales revela que ciertos péptidos especificados en ellas son agentes efectivos para provocar la muerte celular in vivo en tejido muscular normal, tejido conjuntivo subcutáneo, dermis y otros tejidos de roedor.

Ejemplo uno

645 pacientes (Grupo núm. 1) con hiperplasia prostática benigna (BPH) sintomática de moderada a grave se asignaron aleatoriamente de manera prospectiva a un tratamiento enmascarado con una única inyección terapéutica de NX-1207 o placebo (vehículo salino solo), y sus signos y síntomas clínicos de BPH se evaluaron a intervalos semanales, mensuales, trimestrales o más largos, con una duración de unos meses a 5,5 años. Ninguno de estos pacientes recibió ningún procedimiento quirúrgico invasivo previo para tratar su condición de BPH. Se realizó una evaluación prospectiva de todos los sujetos disponibles >=2 años después del inicio para determinar la utilidad del tratamiento con NX-1207 para la prevención o el retraso de la necesidad de procedimientos quirúrgicos (es decir, intervención quirúrgica invasiva posterior) para tratar la condición de BPH del paciente. Los pacientes que recibieron placebo y ningún tratamiento farmacológico progresaron a procedimientos quirúrgicos invasivos dentro de los 2 años posteriores al inicio en el 7,65 % de los pacientes. En comparación, los pacientes que recibieron una única inyección terapéutica de NX-1207 progresaron a procedimientos quirúrgicos invasivos dentro de los 2 años posteriores al inicio en el 5,1 % de los pacientes, lo que representa una tasa de reducción del 33,3 % de procedimientos quirúrgicos invasivos en 2 años, en comparación con el placebo.

Ejemplo dos

352 pacientes (Grupo núm. 2) que se distribuyeron aleatoriamente y se trataron con enmascaramiento del tratamiento con NX-1207 o placebo al mismo tiempo que el Grupo núm. 1 en el Ejemplo 1, en adición al tratamiento inicial, recibieron una segunda inyección de tratamiento de NX-1207 a intervalos >=1 año después de la aleatorización inicial. Ninguno de estos pacientes recibió ningún procedimiento quirúrgico invasivo previo para tratar su condición de BPH. Se realizó una evaluación prospectiva de todos los sujetos disponibles >=2 años después de la línea de base para determinar la utilidad del tratamiento con NX-1207 para la prevención o el retraso de la necesidad de una intervención quirúrgica invasiva para tratar la condición de BPH del paciente. Sorprendentemente, una segunda inyección de NX-1207 condujo a una reducción dramática e inesperada en la necesidad de procedimientos quirúrgicos invasivos a una tasa de solo el 1,6 %. Esta reducción en la necesidad de procedimientos quirúrgicos invasivos fue significativamente menor que con el placebo (7,65 %, p<,001) y también fue significativamente menor que el tratamiento de NX-1207 de inyección única (5,1 %, p <,01).

De acuerdo con este ejemplo, la administración del péptido NTP dos veces a los pacientes dio como resultado una mejora de aproximadamente un 69 % en la reducción de la necesidad de una intervención quirúrgica invasiva posterior, en comparación con los pacientes que recibieron una sola inyección. En adición, la administración del péptido NTP dos veces a los pacientes dio como resultado una mejora de aproximadamente un 80 % en la

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Un péptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 66 (lle-Asp-Gln-Gln-Val-Leu-Ser-Arg-Ne-Lys-Leu-Glu-Ne-Lys-Arg-Cys-Leu para el uso en un método para reducir la necesidad de una intervención quirúrgica invasiva posterior en seres humanos sin tratamiento previo que tienen hiperplasia prostática benigna (BPH) que no tomaron previamente un agente activo adicional, o que no recibieron previamente tratamiento contra BPH, el método comprende: (a) seleccionar seres humanos sin tratamiento previo que tengan BPH que no tomaron previamente un agente activo adicional, o que no recibieron previamente tratamiento contra BPH; y (b) administrar al ser humano sin tratamiento previo una cantidad terapéuticamente efectiva del péptido aislado para tratar BPH, en donde el método reduce las intervenciones quirúrgicas invasivas posteriores para BPH en una cantidad dentro del intervalo de aproximadamente 70 al 100 %, en comparación con los seres humanos que tienen BPH que reciben un placebo.

2. El péptido aislado para el uso de la reivindicación 1, en donde el método comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de al menos uno de los péptidos como se reivindicó en la reivindicación 1 y un portador.

3. El péptido aislado para el uso de la reivindicación 1, en donde el péptido aislado se administra más de una vez.

4. El péptido aislado para el uso de la reivindicación 1, en donde el método comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de al menos uno de los péptidos como se reivindicó en la reivindicación 1 y al menos uno y hasta 25 aminoácidos adicionales que flanquean el extremo N-terminal o C-terminal del péptido aislado de la reivindicación 1.

5. El péptido aislado para el uso de la reivindicación 1, en donde el péptido se administra mediante un método seleccionado del grupo que consiste en oralmente, subcutáneamente, intradérmicamente, intranasalmente, intravenosamente, intramuscularmente, intratecalmente, intranasalmente, intratumoralmente, tópicamente, y transdérmicamente.

6. El péptido aislado para el uso de la reivindicación 3, en donde el método proporciona una reducción en la necesidad de una intervención quirúrgica invasiva posterior, en comparación con la mejora encontrada al tratar a un ser humano que tiene BPH una vez con el péptido aislado, del 60 % al 75 %.

7. El péptido aislado para el uso de la reivindicación 3, en donde el método proporciona una reducción en la necesidad de una intervención quirúrgica invasiva posterior, en comparación con la necesidad de una intervención quirúrgica invasiva posterior en seres humanos sin tratamiento previo que reciben un placebo, del 75 % al 90 %.

8. El péptido aislado para el uso de la reivindicación 1, el método reduce las intervenciones quirúrgicas invasivas posteriores para b Ph en una cantidad dentro del intervalo del 60 % al 100 %, en comparación con el fracaso del tratamiento en seres humanos que tienen BPH que reciben el péptido aislado.

9. Un péptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos en la SEQ ID NO. 66 (lle-Asp-Gln-Gln-Val-Leu-Ser-Arg-lle-Lys-Leu-Glu-lle-Lys-Arg-Cys-Leu para el uso en un método para reducir la necesidad de una intervención quirúrgica invasiva posterior en seres humanos que tienen hiperplasia prostática benigna (BPH), el método comprende: (a) administrar al ser humano el péptido aislado; (b) administrar al ser humano el péptido aislado por segunda vez entre 1 y 2 años después de la administración en (a), en donde el péptido administrado en (a) y (b) reduce las intervenciones quirúrgicas invasivas posteriores en una cantidad dentro del intervalo del 45 % al 100 %, en comparación con los seres humanos que tienen BPH que reciben el péptido solo una vez.