ES2879804T3 - Agonistas del receptor de TRAIL para el tratamiento de enfermedades fibróticas - Google Patents

Abstract

Agonista del receptor ligando inductor de la apoptosis relacionado con TNF (TRAIL)-R1/DR4 o TRAIL- R2/DR5 proapoptótico en una cantidad eficaz para su uso en un método para aliviar uno o más síntomas de enfermedad fibrótica en un sujeto, en el que el agonista del receptor TRAIL-R1/DR4 o TRAIL-R2/DR5 se selecciona del grupo que consiste en: TRAIL de longitud completa que comprende los aminoácidos 1 a 281 de SEQ ID NO: 1, TRAIL de longitud completa que comprende los aminoácidos 1 a 281 de SEQ ID NO: 1 pegilado en el extremo N-terminal, fragmentos funcionales de TRAIL que comprenden al menos los aminoácidos 114 a 281 de SEQ ID NO: 1 y fragmentos funcionales de TRAIL que comprenden al menos los aminoácidos 114 a 281 de SEQ ID NO: 1 pegilados en el extremo N-terminal; e induce la apoptosis en células estrelladas hepáticas, células estrelladas pancreáticas, miofibroblastos activados, células endoteliales activadas o células epiteliales activadas que producen o inducen una cantidad en exceso de matriz extracelular que da como resultado fibrosis de un órgano o tejido, o cirrosis.

Description

DESCRIPCIÓN

Agonistas del receptor de TRAIL para el tratamiento de enfermedades fibróticas

Referencia a lista de secuencias

Esta solicitud contiene una lista de secuencias que se ha presentado en formato ASCII a través de la EFS-Web y se incorpora en el presente documento como referencia en su totalidad. La copia ASCII, creada el 9 de abril de 2015, se denomina THER_100_ST25.txt y tiene un tamaño de 4.814 bytes.

Campo de la invención

La invención se refiere, en general, a composiciones y a usos de las mismas en métodos para el tratamiento de enfermedad fibrótica, en particular a agentes proapoptóticos de TRAIL y a usos de los mismos para el tratamiento de cirrosis y fibrosis hepáticas, así como sus complicaciones, y fibrosis de otros órganos, tales como el páncreas, por ejemplo, mediante la regulación por disminución simultánea de las actividades de múltiples moléculas fibrógenas eliminando los originadores de la fibrogénesis, las células estrelladas activadas.

Antecedentes de la invención

Las enfermedades fibróticas, especialmente en el pulmón, el hígado, el páncreas, la piel y el riñón, representan hasta el 45% de las muertes en el mundo (Friedman, SL, et al., Science Translational Medicine, 5(167):167sr1 (2013)). Con respecto a la enfermedad hepática, no existen agentes antifibróticos para la cirrosis y fibrosis hepáticas disponibles para su uso en seres humanos. Existe una urgencia clínica de las terapias contra la fibrosis hepática debido a la creciente prevalencia de enfermedad de cirrosis y fibrosis virales, relacionadas con la obesidad y relacionadas con el alcohol, así como la escasez de donaciones de hígado para los trasplantes. En 1985, se identificaron las células estrelladas hepáticas (HSC) como las principales responsables del desarrollo de fibrosis hepática mediante la sobreexpresión de los componentes de la matriz extracelular (Friedman SL, et al., PNAS, 82(24):8681-5 (1985)). Las células estrelladas pancreáticas (PSC) son células similares a miofibroblastos que desempeñar un papel fundamental en el desarrollo de fibrosis pancreática, pancreatitis y cáncer de páncreas (Omary, M. B., et al., J. Clin. Invest. 117(1):50-59 (2007)). En respuesta a la inflamación o lesión pancreática, las PSC quiescentes se activan para dar células similares a miofibroblastos y expresan a -actina de músculo liso, muy similar a las HSC.

Los tratamientos existentes para la fibrosis hepática presentan varios inconvenientes. Algunos tratamientos afectan a las HSC. Varios hepatoprotectores que atenúan o neutralizan las respuestas inflamatorias aguas arriba y, por tanto, la activación de HSC, se han estudiado in vitro e in vivo. Se evaluó la vitamina E en ensayos clínicos en esteatohepatitis no alcohólica (NASH) y se demostró que se atenuaba la lesión hepática histológica, aunque no se demostró un efecto antifibrótico (Sanyal, AJ., et al., New Eng, J. Mede, 362(18):1675-85 (2010)).

Se notifica que el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) modula la proliferación de HSC, la síntesis de colágeno y la expresión de TFG-p. La administración de HGF mediante terapia génica o inyección de una proteína recombinante impidió la evolución de fibrosis hepática experimental. Sin embargo, existen preocupación de usar HGF o miméticos de HGF que estimulen el crecimiento de hepatocitos y aumenten el riesgo potencial de oncogénesis (Fallowfield, JA., American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology, 300(5):G709-G15 (2011)).

También se han investigado agentes que impedirían la activación o proliferación de HSC. La activación de HSC está asociada con un bajo nivel de expresión de PPAR-r. La regulación por incremento de PPAR-r o la adición de ligandos de PPAR-r revierten la activación de HSC. Algunos ligandos de PPAR-r, las glitazonas, se han sometido a prueba en modelos animales, sin embargo sólo ralentizaron marginalmente la evolución de la fibrosis al principio del transcurso de la enfermedad (Leclercq, IA, et al., Gut, 55(7): 1020-9 (2006)).

También se sabe que las estatinas, inhibidores de la HMG-CoA reductasa, inhiben la proliferación de HSC in vitro y proporcionan efectos beneficiosos sobre la hipertensión portal y sobre la inflamación inducida por angiostensina II en modelos de fibrosis hepática. Por ejemplo, el tratamiento temprano con atorvastatina atenuó la activación de HSC y la deposición de colágeno después de la ligadura de colédoco en ratas; sin embargo, la atorvastatina no fue eficaz cuando el tratamiento se inició una vez que se había establecido la fibrosis (Trebicka, J., et al., Journal of Hepatology, 53(4):702-12 (2010)), lo que indica que fue útil sólo como producto preventivo, no como terapéutico. El sistema de renina-angiotensina desempeña papeles importantes en la fibrogénesis hepática y la hipertensión portal. Los estudios indican que los inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina y los antagonistas de AT1R, los sartanes, pueden reducir la fibrosis (Yang, L., et al., Journal of Hepatology, 43(2):317-23 (2005)). El tratamiento de pacientes con virus de la hepatitis C (VHC) crónica con el antagonista de AT1R, losartán, ralentizó la evolución de la fibrosis y los genes profibrógenos (Colmenero, J., et al., American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology, 297(4):G726-34 (2009)).

El TGF-p es el efector clave en la patogénesis de la fibrosis hepática. Se ha pensado que la reducción o inhibición de la síntesis y señalización de TGF-p es una diana terapéutica importante. Diversas estrategias para inhibir los efectos de TGF-p incluyen usar anticuerpos neutralizantes de TFG-p, receptores señuelo, ARNip y oligonucleótidos. Algunas moléculas relacionadas con TGF-p mostraron efectos antifibróticos en modelos animales, sin embargo, sería difícil seleccionar como diana las HSC porque los receptores de TGF-p se expresan extensamente en todos los tipos de células y tales inhibidores podrían desencadenar enfermedades autoinmunitarias o la desdiferenciación celular.

La pancreatitis crónica (PC) es una enfermedad caracterizada por la destrucción progresiva e irreversible de la estructura y función del páncreas (Braganza, J.M., et al., Lancet, 377(9772):1184-97 (2011)). La PC está acompañada por fibrosis pancreática y dolor abdominal constante. La gestión de PC y dolor asociado a PC supone un desafío puesto que, en la actualidad, la PC es un estado incurable. No han surgido agentes en seres humanos, lo que ha dado como resultado una población de pacientes con PC significativamente desatendidos. La PC se reconoce por fibrosis significativa. La fibrogénesis pancreática está orquestada principalmente por las PSC. Durante la enfermedad o el daño pancreático, las PSC quiescentes experimentan activación y se transforman en miofibroblastos proliferativos, fibrógenos y contráctiles que facilitan la deposición de colágeno y conducen a tejido fibrótico. Por tanto, las PSC activadas son una diana principal para las terapias antifibróticas y analgésicas dirigidas al páncreas (Omary, M. B., et al., J. Clin. Invest. 117(1):50-59 (2007)). Sin embargo, al igual que las HSC, la falta de métodos para seleccionar como diana y afectar específicamente a las PSC activadas in vivo obstaculiza esta estrategia.

Durante la fibrogénesis y tras la activación de las HSC o PSC, muchas moléculas asociadas con la fibrosis están altamente reguladas por incremento y contribuyen al desarrollo de fibrosis y sus complicaciones. Estas moléculas incluyen, pero no se limitan a, PDGF, TGFp, CTGF, MMP, TIMP y colágenos (Friedman, S.L., Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 7(8):425-36 (2010)). Una estrategia antifibrótica habitual es inhibir la regulación de una de las numerosas moléculas asociadas con la fibrosis in vivo. La inhibición de una molécula asociada a la fibrosis proporcionaría cierta eficacia antifibrótica; sin embargo, puesto que la fibrogénesis es un proceso complicado asociado con múltiples rutas en las que participan muchas moléculas fibrógenas, tales métodos no serían lo bastante eficaces para detener o revertir la fibrosis. La regulación por disminución o inhibición simultánea de múltiples moléculas asociadas con la fibrosis demostrará una fuerte eficacia antifibrótica, sin embargo, es difícil seleccionar como diana múltiples moléculas simultáneamente en condiciones fisiológicas, particularmente utilizando una sola molécula de fármaco. Tamir et al, 2003, Heptology, 37(1): 87-95, notificaron que las células estrelladas activadas expresan el receptor 2/receptor de muerte 5 del ligando inductor de la apoptosis relacionado con TNF (TRAIL) y experimentan apoptosis mediada por TRAIL. Los autores propusieron que los agonistas selectivos de TRAIL-R2/DR5 (por ejemplo, el anticuerpo monoclonal TRA 8) pueden inducir potencialmente la apoptosis de células estrelladas humanas activadas sin daño colateral asociado a los hepatocitos.

Park et al, 2009, Cellular Signalling, 21: 1495-1503 notificaron que TRAIL inhibió la fosforilación de FoxO dependiente de PI3K/Akt, reubicó las proteínas FoxO en el núcleo desde el citosol en células LX-2 estrelladas hepáticas humanas activadas y que las proteínas FoxO acumuladas en el núcleo condujeron a la regulación por disminución de la expresión de c-FLIP^l/s, lo que da como resultado la activación de moléculas de señalización relacionadas con la apoptosis, incluida la activación de caspasa-8, caspasa-3 y Bid, así como la liberación de citocromo C mitocondrial.

Por tanto, un objeto de la invención es proporcionar una composición, y usos de la misma, en métodos para el tratamiento de enfermedad fibrótica, incluyendo fibrosis hepática y fibrosis pancreática.

Otro objeto de la invención es proporcionar composiciones, y usos de las mismas, en métodos para la regulación por disminución o inhibición simultánea de múltiples moléculas asociadas con la fibrosis en condiciones fisiológicas. Otro objeto de la invención es proporcionar composiciones, y usos de las mismas, en métodos para la reducción, inhibición o reversión de la fibrosis hepática y otras enfermedades tales como cirrosis y sus complicaciones.

Sumario de la invención

Los aspectos de la presente invención se definen por las reivindicaciones adjuntas.

Se ha descubierto que los agentes proapoptóticos, tales como ligandos y agonistas de receptores de TRAIL agonistas pueden inducir o aumentar la apoptosis de células que provocan fibrosis y enfermedades subyacentes tales como enfermedades del hígado, del páncreas, del pulmón y de la piel caracterizadas por fibrosis, cirrosis o complicaciones de las mismas. Las composiciones y los métodos dados a conocer en el presente documento pueden usarse para eliminar selectivamente células estrelladas hepáticas (HSC) activadas, los originadores de cirrosis y fibrosis hepáticas, y células estrelladas pancreáticas (PSC) activadas, los originadores de fibrosis pancreática y pancreatitis, y pueden ser eficaces para reducir simultáneamente las regulaciones de múltiples moléculas asociadas con la fibrosis inducidas por células estrelladas activadas. De manera global, esto reducirá o revertirá la fibrosis o impedirá complicaciones adicionales relacionadas con la fibrosis.

Las composiciones para su uso en la presente invención comprenden un agonista de receptor ligando inductor de la apoptosis relacionado con TNF (TRAIL)-R1/DR4 o TRAIL-R2/DR5 proapoptótico, en las que el agonista de receptor TRAIL-R1/DR4 o TRAIL-R2/DR5 se selecciona del grupo que consiste en: TRAIL de longitud completa que comprende los aminoácidos 1 a 281 de SEQ ID NO: 1, TRAIL de longitud completa que comprende los aminoácidos 1 a 281 de SEQ ID NO: 1 pegilado en el extremo N-terminal, fragmentos funcionales de TRAIL que comprenden al menos los aminoácidos 114 a 281 de SEQ ID NO: 1 y fragmentos funcionales de TRAIL que comprenden al menos los aminoácidos 114 a 281 de SEQ ID NO: 1 pegilados en el extremo N-terminal, y normalmente son eficaces para seleccionar como diana receptores de TRAIL agonistas tales como TRAIL-R1/DR4 y TRAIL-R2/DR5, que se expresan selectivamente en hSc y PSC activadas en condiciones fisiológicas.

Los agonistas según la reivindicación 1 pueden incluir, pero no se limitan a, TRAIL humano recombinante (hr), análogos de TRAIL modificados por ingeniería, proteínas TRAIL de acción prolongada modificadas, por ejemplo, con polímeros tales como polietilenglicol, copolímeros y análogos ramificados, y biopolímeros tales como ácido hialurónico. Las formulaciones de acción prolongada basadas en TRAIL incluyen sistemas poliméricos; y/o proteínas de fusión de TRAIL. Estos agonistas, solos o en combinación con otros agentes terapéuticos, pueden reducir o bloquear el desarrollo de, o pueden revertir, la fibrosis existentes en diversos órganos.

Un método a modo de ejemplo para el tratamiento de enfermedad fibrótica, tal como se describe en el presente documento, incluye administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz del agente proapoptótico según la reivindicación 1 para inducir la apoptosis en células estrelladas hepáticas, células estrelladas pancreáticas, fibromioblastos, células fibromioblásticas, células endoteliales activadas o células epiteliales activadas que producen o inducen una cantidad en exceso de matriz extracelular que da como resultado cicatrización no deseada del hígado, del páncreas o de otros órganos. El TRAIL según la reivindicación 1 puede ser, por ejemplo, una forma nativa o modificada por ingeniería genética (recombinante) de la proteína. En algunas realizaciones, el TRAIL es TRAIL humano que comprende los aminoácidos 1 a 281 de SEQ ID NO: 1, o un fragmento funcional o una variante del mismo que comprende al menos los aminoácidos 114 a 281 de SEQ ID NO: 1. En otras realizaciones, el TRAIL es TRAIL de longitud completa que comprende los aminoácidos 1 a 281 de SEQ ID NO: 1 pegilado en el extremo N-terminal, o un fragmento funcional de TRAIL que comprende al menos los aminoácidos 114 a 281 de SEQ ID NO: 1 pegilado en el extremo N-terminal. Por ejemplo, el fragmento funcional puede ser un fragmento de un TRAIL humano de 281 aminoácidos que tiene una secuencia de los aminoácidos 114 a 281, u opcionalmente 95 a 281, de la forma humana de longitud completa de 281 aminoácidos (1-281).

En algunas realizaciones, el TRAIL pegilado incluye un TRAIL trimérico que incluye un motivo de cremallera de aminoácidos, más preferiblemente un motivo de cremallera de isoleucinas, que favorece la formación del trímero en los extremos N-terminales del mismo y un PEG o un derivado del mismo, en el que el PEG está unido al extremo N-terminal de al menos un monómero del TRAIL trimérico. El PEG o el derivado del mismo puede ser una forma lineal, ramificada o trimérica de PEG. Los derivados de PEG a modo de ejemplo incluyen succinimidilpropionato de metoxipolietilenglicol, N-hidroxisuccinimida de metoxipolietilenglicol, aldehído de metoxipolietilenglicol, maleimida de metoxipolietilenglicol y polietilenglicol de ramificación múltiple. En algunas realizaciones, el PEG o el derivado del mismo tiene un peso molecular de entre 1.000 y 100.000 Da, preferiblemente de entre 5.000 y 50.000 Da.

Un aspecto clave de esta tecnología es seleccionar como diana simultáneamente múltiples moléculas asociadas con la fibrosis eliminando específicamente una célula originadora de la fibrosis, tal como células estrelladas pancreáticas y células estrelladas hepáticas activadas, en condiciones fisiológicas. Esto proporciona un medio para el tratamiento de estados patológicos que inducen una cantidad en exceso de matriz extracelular que da como resultado cicatrización no deseada. Los estados representativos incluyen cirrosis y fibrosis hepáticas, así como pancreatitis y fibrosis crónicas de otros órganos tales como los pulmones, la piel, el corazón y los riñones. Esto también reduce la cantidad de ascitis, una complicación importante de la cirrosis, y el dolor, una complicación importante de la pancreatitis crónica.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es un gráfico de barras que muestra que los agonistas de TRAIL, PEG-TRIAL y anticuerpo agonista de TRAIL, inducen la apoptosis de células originadoras de la fibrogénesis, células estrelladas hepáticas (HSC) primarias humanas activadas. Las HSC altamente activadas (en el día 7 y 14) son más sensibles a la apoptosis inducida por TRAIL. La apoptosis se expresó como muerte celular inducida (%), calculada como el porcentaje en relación con las células sin tratar y medida mediante ensayos de muerte celular. *P <0,05 frente a en el día 1, **P <0,01 frente a en el día 1.

La figura 2 es una ilustración de un diseño experimental que muestra el programa de inyecciones de CCl4, CCl4 y TRAIL, CCl4 y PEG-TRAIL, respectivamente, en semanas de tratamiento. El programa del grupo 1 se usó para examinar si p EG-TRAIL impide la fibrogénesis, el programa del grupo 2 se usó para examinar si p EG-TRAIL revierte la fibrosis hepática y el programa del grupo 3 se usó para investigar si PEG-TRAIL mejora la cirrosis hepática.

La figura 3 es un gráfico de barras que muestra los niveles de expresión relativa de proteínas de alfa-SMA (a -SMA), un marcador de la activación de células estrelladas, en inmunotransferencias de tipo Western de tejidos hepáticos aislados tratados con vehículo, CCl4 solo y CCl4 con PEG-TRAIL. Los niveles de a -SMA aumentaron significativamente cuando las ratas se trataron con CCl4, sin embargo, PEG-TRAIL redujo la expresión de a -SMA.

***P < 0,001 frente a vehículo, *P < 0,05 frente a CCI4.

Las figuras 4A y 4B son gráficos de puntos de la deposición cuantificada de colágeno (tinción con rojo sirio, figura 4A) y área positiva para a -SMA (figura 4B) en 20 campos de cada muestra de hígado.

La figura 5 es un gráfico de puntos del volumen de ascitis (ml) en ratones del grupo 3 (figura 2) tratados con vehículo, CCl4 vehículo y CCl4 PEG-TRAIL.

La figura 6 es un gráfico de barras que muestra los niveles de expresión relativa de proteínas de a -SMA, un marcador de la activación de células estrelladas, PDGFRp, un marcador de la fibrosis, en inmunotransferencias de tipo Western de tejidos pancreáticos aislados de ratas sanas (barras blancas) y de ratas con pancreatitis crónica (PC) inducida por alcohol tratadas con etanol/ceruleína/dieta Lieber Decarli (LD) (barras negras) y etanol/ceruleína/LD con PEG-TRAIL (barras grises). Los niveles de a -SMA y PDGFRp aumentaron significativamente cuando las ratas se trataron con etanol/ceruleína/LD, sin embargo, PEG-TRAIL redujo la expresión de a -SMA y PDGFRp. #P < 0,05 frente a vehículo, ***P < 0,001 frente a CP vehículo, *P < 0,05 frente a CP vehículo.

Descripción detallada de la invención

I. Definiciones

Tal como se usa en el presente documento, el término “tratar” incluye inhibir, aliviar, prevenir o eliminar uno o más síntomas o efectos secundarios asociados con la enfermedad, el estado o trastorno que está tratándose.

El término “reducir”, “inhibir”, “aliviar” o “disminuir” se usan en relación con un control. Un experto en la técnica identificaría fácilmente el control apropiado para su uso para cada experimento. Por ejemplo, una respuesta disminuida en un sujeto o una célula que se trata con un compuesto se compara con una respuesta en un sujeto o una célula que no se trata con el compuesto.

Tal como se usa en el presente documento, el término “cantidad eficaz” o “cantidad terapéuticamente eficaz” significa una dosificación suficiente para tratar, inhibir o aliviar uno o más síntomas de un estado patológico que está tratándose o para proporcionar de otro modo un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. La dosificación precisa variará según una variedad de factores, tales como las variables dependientes del sujeto (por ejemplo, edad, salud del sistema inmunitario, etc.), la enfermedad o el trastorno y el tratamiento que está administrándose. El efecto de la cantidad eficaz puede ser en relación con un control. Tales controles se conocen en la técnica y se comentan en el presente documento, y pueden ser, por ejemplo, el estado del sujeto antes de o en ausencia de administración del fármaco, o de una combinación de fármacos, o en el caso de combinaciones de fármacos, el efecto de la combinación puede compararse con el efecto de la administración de sólo uno de los fármacos.

Tal como se usa en el presente documento, el término “terapia de combinación” se refiere al tratamiento de una enfermedad o un síntoma de la misma, o un método para conseguir un cambio fisiológico deseado, incluyendo la administración de una cantidad eficaz de dos o más componentes o agentes químicos para tratar la enfermedad o un síntoma de la misma, o para producir el cambio fisiológico, en el que los componentes o agentes químicos se administran juntos, tal como parte de la misma composición, o se administran por separado e independientemente al mismo tiempo o en momentos diferentes (es decir, la administración de cada componente o agente está separada por un periodo finito de tiempo entre sí).

Tal como se usa en el presente documento, el término “pauta posológica” se refiere a la administración del fármaco con respecto a la formulación, la vía de administración, la dosis del fármaco, el intervalo de administración de dosis y la duración del tratamiento.

Tal como se usa en el presente documento, el término “polipéptidos” incluye proteínas y fragmentos de las mismas. Los polipéptidos se dan a conocer en el presente documento como secuencias de residuos de aminoácido. Estas secuencias se escriben de izquierda a derecha en la dirección desde el extremo amino hasta el extremo carboxilo. Según la nomenclatura convencional, las secuencias de residuos de aminoácido se denominan o bien mediante un código de tres letras o bien mediante un código de una única letra tal como se indica a continuación: alanina (Ala, A), arginina (Arg, R), asparagina (Asn, N), ácido aspártico (Asp, D), cisteína (Cys, C), glutamina (Gln, Q), ácido glutámico (Glu, E), glicina (Gly, G), histidina (His, H), isoleucina (Ile, I), leucina (Leu, L), lisina (Lys, K), metionina (Met, M), fenilalanina (Phe, F), prolina (Pro, P), serina (Ser, S), treonina (Thr, T), triptófano (Trp, W), tirosina (Tyr, Y) y valina (Val, V).

Tal como se usa en el presente documento, el término “variante” se refiere a un polipéptido o polinucleótido que difiere de un polipéptido o polinucleótido de referencia, pero que conserva las propiedades esenciales. Una variante típica de un polipéptido difiere de otro polipéptido de referencia en cuanto a la secuencia de aminoácidos. Generalmente, las diferencias son limitadas, de modo que las secuencias del polipéptido de referencia y la variante son, en general, muy similares y, en muchas regiones, idénticas. Una variante y un polipéptido de referencia pueden diferir en cuanto a la secuencia de aminoácidos en una o más modificaciones (por ejemplo, sustituciones, adiciones y/o deleciones). Un residuo de aminoácido sustituido o insertado puede estar codificado o no por el código genético.

Una variante de un polipéptido puede producirse de manera natural, tal como una variante alélica, o puede ser una variante que no se sabe que se produce de manera natural.

Las modificaciones y los cambios pueden realizarse en la estructura de los polipéptidos de en la divulgación y aun así obtener una molécula que tenga características similares a las del polipéptido (por ejemplo, una sustitución conservadora de aminoácido). Por ejemplo, determinados aminoácidos pueden sustituirse por otros aminoácidos en una secuencia sin pérdida apreciable de actividad. Debido a que es la capacidad interactiva y la naturaleza de un polipéptido lo que define la actividad funcional biológica de ese polipéptido, determinadas sustituciones de la secuencia de aminoácidos pueden realizarse en una secuencia de polipéptido y, aún así, obtener un polipéptido con propiedades similares.

En la realización de tales cambios, puede considerarse el índice hidropático de los aminoácidos. La importancia del índice hidropático de los aminoácidos para conferir una función biológica interactiva en un polipéptido se entiende generalmente en la técnica. Se sabe que determinados aminoácidos pueden sustituirse por otros aminoácidos que tengan una puntuación o índice hidropático similar y aun así dar como resultado un polipéptido con actividad biológica similar. A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático basándose en sus características de hidrofobicidad y carga. Estos índices son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cisteína (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina (-4,5).

Se cree que el carácter hidropático relativo del aminoácido determina la estructura secundaria del polipéptido resultante, que a su vez define la interacción del polipéptido con otras moléculas, tales como enzimas, sustratos, receptores, anticuerpos y antígenos. En la técnica se sabe que un aminoácido puede sustituirse por otro aminoácido que tenga un índice hidropático similar y aun así obtener un polipéptido funcionalmente equivalente. En tales cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos están dentro de ± 2, se prefieren particularmente aquellos dentro de ± 1 y se prefieren incluso más particularmente aquellos dentro de ± 0,5.

La sustitución de aminoácidos similares también puede realizarse basándose en la hidrofilicidad. Se han asignado los siguientes valores de hidrofilicidad a los residuos de aminoácido: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 ± 1); glutamato (+3,0 ± 1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamnina (+0,2); glicina (0); prolina (-0,5 ± 1); treonina (-0,4); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (2,3); fenilalanina (-2,5); triptófano (-3,4). Se entiende que un aminoácido puede sustituirse por otro que tenga un valor de hidrofilicidad similar y aun así obtener un polipéptido biológicamente equivalente y, en particular, inmunológicamente equivalente. En tales cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad están dentro de ± 2, se prefieren particularmente aquellos dentro de ± 1 y se prefieren incluso más particularmente aquellos dentro de ±0,5.

Tal como se indicó anteriormente, las sustituciones de aminoácidos se basan generalmente en la similitud relativa de los sustituyentes de la cadena lateral del aminoácido, por ejemplo, su hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga, tamaño y similares. Las sustituciones a modo de ejemplo que tienen en cuenta varias de las características anteriores las conocen bien los expertos en la técnica e incluyen (residuo original: sustitución a modo de ejemplo): (Ala: Gly, Ser), (Arg: Lys), (Asn: Gln, His), (Asp: Glu, Cys, Ser), (Gln: Asn), (Glu: Asp), (Gly: Ala), (His: Asn, Gln), (Ile: Leu, Val), (Leu: Ile, Val), (Lys: Arg), (Met: Leu, Tyr), (Ser: Thr), (Thr: Ser), (Tip: Tyr), (Tyr: Trp, Phe) y (Val: Ile, Leu). En particular, las realizaciones de los polipéptidos pueden incluir variantes que tengan aproximadamente el 50%, el 60%, el 70%, el 80%, el 90% y el 95% de identidad de secuencia con respecto al polipéptido de interés.

“Identidad”, tal como se conoce en la técnica, es una relación entre dos o más secuencias de polipéptido, tal como se determina comparando las secuencias. En la técnica, “identidad” también significa el grado de parentesco de secuencia entre polipéptidos tal como se determina por la coincidencia entre las cadenas de tales secuencias. “ Identidad” también puede significar el grado de parentesco de secuencia de un polipéptido en comparación con la longitud completa de un polipéptido de referencia. La “identidad” y la “similitud” pueden calcularse fácilmente mediante métodos conocidos, incluyendo, pero sin limitarse a, aquellos descritos en (Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., Ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., Ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, parte I, Griffin, A. M. y Griffin, H. G., Eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., Eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991; y Carillo, H., y Lipman, D., SIAM J Applied Math., 48: 1073 (1988).

Los métodos preferidos para determinar la identidad se diseñan para proporcionar la mayor coincidencia entre las secuencias analizadas. Los métodos para determinar la identidad y la similitud están codificados en programas informáticos disponibles para el público. El porcentaje de identidad entre dos secuencias puede determinarse usando un software de análisis (es decir, el paquete de software de análisis de secuencias de Genetics Computer Group, Madison Wis.) que incorpora el algoritmo de Needelman y Wunsch, (J. Mol. Biol., 48: 443-453, 1970) (por ejemplo, NBLAST y XBLAST). Se usan los parámetros por defecto para determinar la identidad de los polipéptidos de la presente divulgación.

A modo de ejemplo, una secuencia de polipéptido puede ser idéntica a la secuencia de referencia, es decir ser el 100% idéntica, o puede incluir hasta un determinado número entero de alteraciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de referencia, de manera que el % de identidad es inferior al 100%. Tales alteraciones se seleccionan de: al menos una deleción, sustitución, incluyendo sustitución conservadora y no conservadora, o inserción de aminoácidos, y en las que dichas alteraciones pueden producirse en las posiciones amino-terminal o carboxilo-terminal de la secuencia de polipéptido de referencia o en cualquier parte entre esas posiciones terminales, intercaladas o bien individualmente entre los aminoácidos en la secuencia de referencia o en bien en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. El número de alteraciones de aminoácidos para un % de identidad dado se determina multiplicando el número total de aminoácidos en el polipéptido de referencia por el porcentaje numérico del porcentaje de identidad respectivo (dividido entre 100) y luego restando ese producto de dicho número total de aminoácidos en el polipéptido de referencia.

Tal como se usa en el presente documento, el término “unido operativamente” se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes están configurados para realizar su función habitual. Por ejemplo, las secuencias o los promotores de control unidos operativamente a una secuencia codificante pueden efectuar la expresión de la secuencia codificante, y una secuencia de localización en orgánulos unida operativamente a la proteína ayudará en la localización de la proteína unida en los orgánulos específicos.

Tal como se usa en el presente documento, el término “tipo de células” es una manera de agrupar o clasificar las células en la técnica. El término tipo de células se refiere a la agrupación de células basándose en su carácter biológico determinado en parte a través de la función biológica, ubicación, morfología, estructura, expresión de polipéptidos, nucleótidos o metabolitos comunes.

Tal como se usa en el presente documento, el término “estado celular” se refiere al estado de un tipo de células. Las células son dinámicas a lo largo de su vida y pueden conseguir diversos estados de diferenciación, función, morfología y estructura. Tal como se usa en el presente documento, el estado celular se refiere a un tipo de células específico a lo largo de su vida.

Tal como se usa en el presente documento, el término “marcador de superficie celular” se refiere a cualquier molécula, tal como un resto, un péptido, una proteína, un hidrato de carbono, un ácido nucleico, un anticuerpo, un antígeno y/o un metabolito, presentada en la superficie o en la proximidad de una célula suficiente para identificar la célula como única en cualquier tipo o estado.

II. Composiciones para el tratamiento de enfermedad hepática y pancreática con ligandos y agonistas de receptores de TRAIL agonistas

Se ha descubierto que los ligandos y agonistas de receptores de TRAIL agonistas, tal como se describen en el presente documento, que incluyen los agonistas del receptor TRAIL-R1/DR4 o TRAIL-R2/DR5 según la reivindicación 1, pueden formularse de tal manera que el ligando o agonista sea eficaz para el tratamiento de fibrosis y/o complicaciones asociadas con la fibrosis.

En realizaciones preferidas de la presente divulgación, el ligando o agonista (incluyendo los agonistas según la reivindicación 1) no requiere un vehículo de administración, tal como una partícula o matriz, para ser eficaz. Por ejemplo, aunque se proporcionan formulaciones que incluyen partículas y otros vehículos de administración, en algunas realizaciones, el ligando es estable en circulación y eficaz durante al menos un día, preferiblemente al menos dos días, sin la ayuda de una matriz o partícula de liberación con el tiempo u otro portador de liberación con el tiempo o degradable.

Los ligandos y agonistas, tal como se describen en el presente documento, incluyendo los agonistas del receptor TRAIL-R1/DR4 o TRAIL-R2/DR5 según la reivindicación 1, son normalmente conjugados de TRAIL que incluyen un péptido, imitador o imitador de TRAIL, preferiblemente TRAIL o un fragmento, una variante o fusión del mismo, tal como los agonistas según la reivindicación 1, unidos a un molécula de conjugado que aumenta la semivida in vivo del conjugado de TRAIL en comparación con el fragmento, la variante o fusión de TRAIL en ausencia de la molécula de conjugado.

Las formulaciones de conjugados de TRAIL y las pautas posológicas pueden seleccionar como diana y eliminar los originadores de células estrelladas pancreáticas (PSC) y células estrelladas hepáticas (HSC) activadas inductoras de la fibrosis que contribuyen a la fibrogénesis, y no las células estrelladas quiescentes. Mediante la eliminación de tales células originadoras, pueden regularse por diminución o inhibirse simultáneamente múltiples moléculas asociadas con la fibrosis secretadas o inducidas por la activación de células estrelladas. Por ejemplo, las administraciones sistémicas de PEG-TRAIL eliminaron la población de PSC o HSC activadas y redujeron y/o normalizaron las moléculas fibrógenas altamente reguladas por incremento a niveles de proteína y ARNm, incluyendo a -SMA, colágeno 1, colágeno 3, PDGFR, TGFp, MMP-2, MMP-3, TIMP-1, TIMP-3, BMP-7. Tal como se comenta con más detalle a continuación, las composiciones dadas conocer se administran normalmente a un sujeto que lo necesita en una cantidad eficaz para seleccionar como diana y eliminar células originadoras de la fibrosis y para reducir simultáneamente una o más moléculas asociadas con la fibrosis.

A. Péptidos y análogos de TRAIL

Tal como se describe en el presente documento, los conjugados de TRAIL incluyen un dominio de TRAIL, que es normalmente un péptido, análogo o imitador de TRAIL, preferiblemente TRAIL o un fragmento, una variante o fusión del mismo, al que se une una molécula de conjugado. La presente invención se refiere, en particular, al agonista del receptor TRAIL-R1/DR4 o TRAIL-R2/DR5 según la reivindicación 1.

TRAIL TRAIL/Apo2L (TNFSF10) se identificó originalmente en búsquedas de bases de datos EST para genes con homología con ligandos conocidos de la superfamilia de TNF (Benedict et al., J. Exp. Med., 209(11): 1903-1906 (2012)). En seres humanos, TRAIL se une a dos receptores de muerte (DR) proapoptóticos, TRAIL-R1 y TRAIL-R2 (TNFRSF10A y 10B), así como a otros dos receptores de membrana que no inducen la muerte y, en su lugar, pueden actuar como señuelos para la señalización de la muerte. La unión de TRAIL a su DR relacionados induce la formación de un complejo de señalización inductor de la muerte, que en última instancia conduce a la activación de caspasas y al inicio de la apoptosis (Benedict et al., J. Exp. Med., 209(11):1903-1906 (2012)).

Tal como se describe en el presente documento, un conjugado de TRAIL incluye un péptido de TRAIL, o un fragmento de unión al receptor de TRAIL agonista o una variante del mismo. La presente invención se refiere, en particular, a TRAIL de longitud completa que comprende los aminoácidos 1 a 281 de SEQ ID NO: 1 o a fragmentos funcionales de TRAIL que comprenden al menos los aminoácidos 114 a 281 de SEQ ID NO: 1, y formas pegiladas de los mismos, que están pegilados en el extremo N-terminal.

Las secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos para el TRAIL humano se conocen en la técnica. Por ejemplo, una secuencia de aminoácidos para el TRAIL humano es MAMMEVQGGPSLGQTCVLIVIFTVLLQSLCVAVTYVYFTNELKQMQDKYSKSGIACFLKEDDSYWDPNDEESMNSPC WQVKWQLRQLVRKMILRTSEETISTVQEKQQNISPLVRERGPQRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSW ESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSK DAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVG (SEQ ID NO: 1, (n.° de registro P50591 de la base de datos UniProtKB (TNF10_HUMAN)). En algunas realizaciones, el conjugado de TRAIL incluye un péptido de TRAIL que incluye o tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

Preferiblemente, el TRAIL es un TRAIL soluble. El TRAIL de longitud completa endógeno incluye un dominio citoplásmico, un dominio transmembrana y un dominio extracelular. Normalmente, el TRAIL soluble es un fragmento de TRAIL de longitud completa sin el dominio citoplásmico ni el dominio transmembrana. Por tanto, el TRAIL soluble puede ser el dominio extracelular de TRAIL (por ejemplo, el dominio extracelular de SEQ ID NO: 1) o un fragmento funcional del mismo que comprende al menos los aminoácidos 114 a 281 de SEQ ID NO: 1. Un dominio extracelular consenso para el TRAIL de SEQ ID NO: 1 es los aminoácidos 39-281 de SEQ ID NO: 1. Por tanto, en algunas realizaciones, el conjugado de TRAIL incluye un péptido de TRAIL que incluye o tiene los aminoácidos 39-281, 41­ 281, 91-281, 92-281, 95-281 ó 114-281 de SEQ ID NO: 1.

En algunas realizaciones descritas, el conjugado de TRAIL incluye una variante o un fragmento funcional de SEQ ID NO: 1 que puede actuar como agonista de la señalización a través de TRAIL-R1 y/o TRAIL-R2. El fragmento o la variante de SEQ ID NO: 1 puede tener el 50, el 60, el 70, el 75, el 80, el 85, el 90, el 95, el 96, el 97, el 98, el 99 o más del 99% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1. Sin embargo, según la reivindicación 1, el agonista comprenderá al menos los aminoácidos 114 a 281 de SEQ ID NO: 1.

Preferiblemente, el fragmento funcional o la variante del mismo incluye el dominio extracelular de SEQ ID NO: 1 o un fragmento funcional del mismo. Se cree que el aminoácido 150 C-terminal de TRAIL incluye el dominio de unión al receptor. Por tanto, en algunas realizaciones, el fragmento es los aminoácidos 95-281 o los aminoácidos 114-281 de SEQ ID NO: 1.

Las variantes descritas en el presente documento pueden tener una o más sustituciones, deleciones o adiciones, o cualquier combinación de las mismas, en relación con SEQ ID NO: 1, aunque, según la reivindicación 1, el agonista comprenderá al menos los aminoácidos 114 a 281 de SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la variante es una secuencia alternativa, una variante de corte y empalme o una variante con sustituciones, adiciones o deleciones que se produce de manera natural, o el dominio extracelular o un fragmento funcional del mismo o una secuencia alternativa, una variante de corte y empalme o una variante con sustituciones, adiciones o deleciones. Las variantes y secuencias alternativas que se producen de manera natural se dan a conocer en el n.° de registro P50591 de la base de datos UniProtKB (Tn F10_HUMAN), versión 140 (modificada por última vez el 22 de enero de 2014).

Análogos de TRAIL

TRAIL puede interaccionar con sus receptores como un trímero. Por tanto, en algunas realizaciones, el ligando o agonista usado en los métodos dados a conocer en el presente documento es, o puede formar, un multímero, preferiblemente un trímero. El trímero puede ser un homotrímero o un heterotrímero.

Todas las proteínas de TRAIL descritas en el presente documento pueden elaborarse usando técnicas convencionales para el aislamiento de proteínas naturales o recombinantes, y modificarse químicamente tal como se describe en el presente documento.

El conjugado de TRAIL descrito en el presente documento puede incluir un análogo de TRAIL, o un fragmento de unión al receptor de TRAIL agonista o una variante del mismo, aunque, según la reivindicación 1, el agonista comprenderá al menos los aminoácidos 114 a 281 de SEQ ID NO: 1. Los análogos de TRAIL se conocen en la técnica. En realizaciones preferidas, los análogos tienen afinidad o especificidad aumentada por uno o más receptores de TRAIL agonistas (por ejemplo, TRAILR1 (DR4) y/o TRAIL-R2 (DR5)), afinidad o especificidad reducida por uno o más receptores de TRAIL antagonistas o señuelo (por ejemplo, los receptores DcR1 y DcR2), o una combinación de las mismas, en comparación con TRAIL silvestre o endógeno.

Proteínas de fusión de TRAIL

El conjugado de TRAIL descrito en el presente documento puede ser una proteína de fusión de TRAIL. Los polipéptidos de fusión de TRAIL tienen una primera pareja de fusión que incluye la totalidad o una parte de un dominio extracelular de la proteína TRAIL fusionado (i) directamente con un segundo polipéptido o (ii) opcionalmente, con una secuencia peptídica ligadora que se fusiona con el segundo polipéptido. Las proteínas de fusión contienen opcionalmente un dominio que funciona para dimerizar o multimerizar dos o más proteínas de fusión. El dominio de ligador peptídico/polipeptídico puede ser o bien un dominio independiente o bien, alternativamente, puede estar contenido dentro de uno de los otros dominios (polipéptido de TRAIL o segundo polipéptido) de la proteína de fusión. De manera similar, el dominio que funciona para dimerizar o multimerizar las proteínas de fusión puede ser o bien un dominio independiente o bien, alternativamente, puede estar contenido dentro de uno de los otros dominios (polipéptido de TRAIL, segundo polipéptido o dominio de ligador peptídico/polipeptídico) de la proteína de fusión. En una realización descrita en el presente documento, el dominio de dimerización/multimerización y el dominio de ligador peptídico/polipeptídico son iguales.

Las proteínas de fusión dadas a conocer en el presente documento pueden tener la fórmula I:

N-R1-R2-R3-C

en la que “N” representa el extremo N-terminal de la proteína de fusión, “C” representa el extremo C-terminal de la proteína de fusión, “R1” es un polipéptido de TRAIL, “R2” es un dominio de ligador peptídico/polipeptídico opcional y “R3” es un segundo polipéptido. Alternativamente, R3 puede ser el polipéptido de TRAIL y R1 puede ser el segundo polipéptido.

Las proteínas de fusión pueden dimerizarse o multimerizarse. La dimerización o multimerización puede producirse entre o en medio de dos o más proteínas de fusión a través de los dominios de dimerización o multimerización. Alternativamente, la dimerización o multimerización de proteínas de fusión puede producirse mediante reticulación química. Los dímeros o multímeros que se forman pueden ser homodiméricos/homomultiméricos o heterodiméricos/heteromultiméricos.

La presencia del segundo polipéptido puede alterar la solubilidad, estabilidad, afinidad y/o valencia del polipéptido de fusión de TRAIL. Tal como se usa en el presente documento, “valencia” se refiere al número de sitio de unión disponible por molécula. En algunas realizaciones, el segundo polipéptido contiene uno o más dominios de una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que tiene preferiblemente una secuencia de aminoácidos correspondiente a las regiones bisagra, CH2 y CH3 de una cadena Cy1 de inmunoglobulina humana o a las regiones bisagra, CH2 y CH3 de una cadena Cy2a de inmunoglobulina murina. En una proteína de fusión dimérica particular, el dímero procede de la unión covalente de un residuo de Cys en la región bisagra de dos de las cadenas pesadas de Ig que son los mismos residuos de Cys que están unidos por disulfuro en las cadenas pesadas de Ig normales dimerizadas.

En una realización particular descrita en el presente documento, la proteína de fusión de TRAIL es un imitador de TRAIL que incluye tres subsecuencias promotoras de TRAIL combinadas en una cadena de polipéptido, denominado dominio de unión al receptor de TRAIL de cadena sencilla (scTRAIL-RBD), tal como se describe en Gieffers, Molecular Cancer Therapeutics, 12(12):273547 (2013). Dos de los denominados scTRAIL-RBD, cada uno con tres sitios de unión al receptor, pueden acercarse, lo que da como resultado una proteína de fusión multimérica con un modo de unión hexavalente. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, la multimerización se logra fusionando la parte Fc de una muteína de inmunoglobulina G1 humana (IgG1) de manera C-terminal con el polipéptido scTRAIL-RBD, creando de ese modo seis sitios de unión al receptor por molécula de fármaco.

Forzar la dimerización de scFv-scTRAIL basándose en la modificación del ligador scFv para un scTRAIL seleccionado como diana compuesto predominantemente por dímeros (DbscTRAIL) excede la actividad de scTRAIL no seleccionado como diana en aproximadamente 100 veces para algunos tipos de células diana (Siegemund, anteriormente). La actividad aumentada de DbscTRAIL también se demostró en células negativas para la diana, lo que indica que, además de la selección como diana, la oligomerización equivalente a un ensamblaje al menos dimérico de TRAIL convencional por sí mismo potencia la señalización de la apoptosis. Por tanto, en realizaciones preferidas descritas en el presente documento, las proteínas de fusión de TRAIL tienen un dominio de multimerización, tal como un dominio de dimerización o trimerización, o una combinación de los mismos, que puede dar lugar a, por ejemplo, una molécula dimérica, trimérica o hexamérica.

Otra proteína de fusión que facilita la formación de trímeros incluye un fragmento de unión al receptor de TRAIL fusionado de manera amino-terminal con un dominio de cremallera de leucinas o isoleucinas trimerizante.

Las proteínas de fusión de TRAIL y los resultados de usar las proteínas de fusión en ensayos funcionales también se describen en Wahl, Hepatology, 57(2):625-36 (2013).

Métodos para producir polipéptidos

Los polipéptidos de TRAIL, los fragmentos, las variantes y fusiones de los mismos dados a conocer pueden fabricarse usando técnicas convencionales que se conocen en la técnica. Por ejemplo, pueden obtenerse polipéptidos aislados mediante síntesis química o mediante producción recombinante en una célula huésped. Para producir de manera recombinante un polipéptido, puede usarse un ácido nucleico que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína de fusión para transformar, transducir o transfectar una célula huésped bacteriana o eucariota (por ejemplo, una célula de insecto, levadura o mamífero). En general, los constructos de ácido nucleico incluyen una secuencia reguladora unida operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica para los polipéptidos. Normalmente, las secuencias reguladoras (también denominadas en el presente documento secuencias de control de la expresión) no codifican para un producto génico, sino que en su lugar afectan a la expresión de las secuencias de ácido nucleico a las que están unidas operativamente.

Los sistemas procariotas y eucariotas útiles para expresar y producir polipéptidos se conocen bien en la técnica e incluyen, por ejemplo, cepas de Escherichia coli tales como BL-21 y células de mamífero cultivadas tales como células ^c H^o .

En células huésped eucariotas, pueden utilizarse varios sistemas de expresión basados en virus para expresar los polipéptidos. Los sistemas de expresión basados en virus se conocen bien en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, vectores baculovirales, de SV40, retrovirales o virales basados en el virus de la vaccinia.

Las líneas de células de mamífero que expresan de manera estable los polipéptidos pueden producirse usando vectores de expresión con elementos de control apropiados y un marcador seleccionable. Por ejemplo, los vectores de expresión eucariotas pCR3.1 (Invitrogen Life Technologies) y p91023(B) (véase Wong et al. (1985) Science 228:810815) son adecuados para la expresión de polipéptidos variantes en, por ejemplo, células de ovario de hámster chino (CHO), células COS-1, células 293 de riñón embrionario humano, células NIH3T3, células BHK21, células MDCK y células endoteliales vasculares humanas (HUVEC). Los sistemas de expresión adecuados adicionales incluyen GS Gene Expression System™ disponible de Lonza Group Ltd.

Tras la introducción de un vector de expresión mediante electroporación, lipofección, coprecipitación con fosfato de calcio o cloruro de calcio, DEAE-dextrano u otro método de transfección adecuado, pueden seleccionarse líneas celulares estables (por ejemplo, mediante selección metabólica o resistencia antibiótica a G418, kanamicina o higromicina). Las células transfectadas pueden cultivarse de tal manera que se exprese el polipéptido de interés y pueda recuperarse el polipéptido, por ejemplo, a partir del sobrenadante de cultivo celular o a partir de células lisadas. Alternativamente, una proteína de fusión puede producirse (a) mediante ligación de secuencias amplificadas en un vector de expresión de mamífero tal como pcDNA3 (Invitrogen Life Technologies) y (b) mediante transcripción y traducción in vitro usando extracto de germen de trigo o lisado de reticulocitos de conejo.

Los polipéptidos pueden aislarse usando, por ejemplo, métodos cromatográficos tales como cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrófoba, intercambio iónico con DEAE, filtración en gel y cromatografía de hidroxiapatita. En algunas realizaciones, los polipéptidos pueden modificarse por ingeniería para contener un dominio adicional que contenga una secuencia de aminoácidos que permita la captura de los polipéptidos sobre una matriz de afinidad. Por ejemplo, un polipéptido de fusión con Fc en un sobrenadante de cultivo celular o un extracto citoplásmico puede aislarse usando una columna con proteína A. Además, puede usarse una etiqueta, tal como c-myc, hemaglutinina, polihistidina o Flag™ (Kodak) para ayudar en la purificación del polipéptido. Tales etiquetas pueden insertarse en cualquier parte dentro del polipéptido, incluyendo en el extremo carboxilo o amino. Otras fusiones que pueden ser útiles incluyen enzimas que ayudan en la detección del polipéptido, tales como la fosfatasa alcalina. La cromatografía de inmunoafinidad también puede usarse para purificar polipéptidos. Los polipéptidos pueden modificarse por ingeniería adicionalmente para contener una señal secretora (si aún no hay presente ninguna señal secretora) que provoque la secreción del polipéptido por las células en las que se produce. A continuación, los polipéptidos secretados pueden aislarse de manera conveniente a partir de los medios celulares.

B. Composición de anticuerpos y métodos de fabricación

Pueden usarse polipéptidos de receptor de TRAIL purificado, fragmentos, fusiones o antígenos o epítopos de los mismos para preparar un anticuerpo que se una específicamente a un receptor de TRAIL. Los anticuerpos pueden prepararse usando cualquier método adecuado conocido en la técnica. Posteriormente, los anticuerpos pueden examinarse para determinar la actividad funcional (por ejemplo, actividad agonista o antagonista) usando métodos conocidos en la técnica.

Los anticuerpos pueden generarse en cultivo celular, en fago o en diversos animales. En una realización, un anticuerpo es un anticuerpo de mamífero. Pueden usarse técnicas con fagos para aislar un anticuerpo inicial o para generar variantes con características de especificidad o avidez alteradas. Tales técnicas son rutinarias y se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, el anticuerpo se produce por medios recombinantes conocidos en la técnica. Por ejemplo, un anticuerpo recombinante puede producirse transfectando una célula huésped con un vector que comprende una secuencia de ADN que codifica para el anticuerpo. Pueden usarse uno o más vectores para transfectar la secuencia de ADN que expresa al menos una región VL y una VH en la célula huésped. Las descripciones a modo de ejemplo de medios recombinantes para la generación y producción de anticuerpos incluyen Delves, Antibody Production: Essential Techniques (Wiley, 1997); Shephard, et al., Monoclonal Antibodies (Oxford University Press, 2000); Goding, Monoclonal Antibodies: Principles And Practice (Academic Press, 1993); Current Protocols In Immunology (John Wiley & Sons, edición más reciente).

Los anticuerpos dados a conocer pueden modificarse por medios recombinantes para aumentar la mayor eficacia del anticuerpo en la mediación de la función deseada. Los anticuerpos pueden modificarse mediante sustituciones usando medios recombinantes. Normalmente, las sustituciones serán sustituciones conservadoras. Por ejemplo, al menos un aminoácido en la región constante del anticuerpo puede reemplazarse por un residuo diferente. Véanse, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 5.624.821, la patente estadounidense n.° 6.194.551, el documento WO 9958572; y Angal, et al., Mol. Immunol. 30:105-08 (1993). La modificación en aminoácidos incluye deleciones, adiciones y sustituciones de aminoácidos. En algunos casos, tales cambios se realizan para reducir actividades no deseadas, por ejemplo, citotoxicidad dependiente del complemento. Con frecuencia, los anticuerpos se marcan mediante la unión, ya sea covalente o no covalente, de una sustancia que proporciona una señal detectable. Se conocen una amplia variedad de marcadores y técnicas de conjugación y se notifican extensamente tanto en la bibliografía científica como en la bibliografía de patentes. Estos anticuerpos pueden analizarse para determinar la unión a receptores de TRAIL. Véase, por ejemplo, Antibody Engineering: A Practical Approach (Oxford University Press, 1996).

Los anticuerpos adecuados con las actividades biológicas deseadas pueden identificarse mediante ensayos in vitro, incluyendo, pero sin limitarse a: proliferación, migración, adhesión, crecimiento en agar blando, angiogénesis, comunicación célula-célula, apoptosis, transporte, transducción de señales, y los siguientes ensayos in vivo, tales como la inhibición del crecimiento tumoral.

Los anticuerpos que pueden usarse en las composiciones y los métodos dados a conocer incluyen inmunoglobulina completa (es decir, un anticuerpo intacto) de cualquier clase, fragmentos de la misma y proteínas sintéticas que contienen al menos el dominio variable de unión al antígeno de un anticuerpo. Los dominios variables difieren en la secuencia entre anticuerpos y se usan en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular por su antígeno particular. Sin embargo, habitualmente, la variabilidad no se distribuye de manera uniforme a lo largo de los dominios variables de los anticuerpos. Normalmente se concentra en tres segmentos denominados regiones determinantes de la complementariedad (CDR) o regiones hipervariables tanto en los dominios variables de cadena ligera como en los de cadena pesada. Las porciones más altamente conservadas de los dominios variables se denominan región de marco (FR). Los dominios variables de las cadenas pesada y ligera nativas comprenden cada uno cuatro regiones FR, que adoptan en gran medida una configuración de lámina beta, conectadas por tres CDR, que forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de la lámina beta. Las CDR en cada cadena se mantienen juntas en estrecha proximidad por las regiones FR y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno de los anticuerpos.

También se dan a conocer fragmentos de anticuerpos que tienen actividad biológica. Los fragmentos, estén unidos o no a otras secuencias, incluyen inserciones, deleciones, sustituciones u otras modificaciones seleccionadas de regiones particulares o residuos de aminoácidos específicos, siempre que la actividad del fragmento no se vea alterada o deteriorada significativamente en comparación con el anticuerpo o fragmento de anticuerpo sin modificar.

Las técnicas también pueden adaptarse para la producción de anticuerpos de cadena sencilla específicos para una proteína antigénica de la presente divulgación. Los expertos en la técnica conocen bien métodos para la producción de anticuerpos de cadena sencilla. Un anticuerpo de cadena sencilla puede crearse fusionando juntos los dominios variables de las cadenas pesada y ligera usando un ligador peptídico corto, reconstituyendo de ese modo un sitio de unión al antígeno en una molécula individual. Se han desarrollado fragmentos variables de anticuerpo de cadena sencilla (scFv) en los que el extremo C-terminal de un dominio variable está anclado al extremo N-terminal del otro dominio variable a través de un péptido o ligador de 15 a 25 aminoácidos sin alterar significativamente la unión al antígeno o la especificidad de la unión. El ligador se elige para permitir la unión de la cadena pesada y la cadena ligera en su orientación conformacional apropiada.

Los fragmentos variables de cadena sencilla divalentes (di-scFv) pueden modificarse por ingeniería uniendo dos scFv. Esto puede realizarse produciendo una única cadena de péptido con dos regiones VH y dos VL, lo que da lugar a scFv en tándem. Los scFv también pueden diseñarse con péptidos ligadores que son demasiado cortos como para que las dos regiones variables se plieguen juntas (aproximadamente cinco aminoácidos), forzando la dimerización de los scFv. Este tipo se conoce como diacuerpos. Se ha demostrado que los diacuerpos tienen constantes de disociación hasta 40 veces inferior a los scFv correspondientes, lo que significa que tienen una afinidad mucho mayor por su diana. Los ligadores aún más cortos (uno o dos aminoácidos) conducen a la formación de trímeros (triacuerpos o tricuerpos). También se han producido tetracuerpos. Muestran una afinidad incluso mayor por sus dianas que los diacuerpos.

Un anticuerpo monoclonal se obtiene a partir de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, es decir, los anticuerpos individuales dentro de la población son idénticos excepto por posibles mutaciones que se producen de manera natural que pueden estar presentes en un pequeño subconjunto de las moléculas de anticuerpo. Los anticuerpos monoclonales incluyen anticuerpos “quiméricos”, en los que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o pertenecientes a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que la parte restante de la(s) cadena(s) es idéntica u homóloga a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de tales anticuerpos, siempre que muestren la actividad antagonista deseada.

Los anticuerpos monoclonales pueden elaborarse usando cualquier procedimiento que produzca anticuerpos monoclonales. En un método de hibridoma, normalmente se inmuniza a un ratón u otro animal huésped apropiado con un agente de inmunización para obtener linfocitos que producen o pueden producir anticuerpos que se unirán específicamente al agente de inmunización. Alternativamente, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro.

Los anticuerpos también pueden elaborarse mediante métodos de ADN recombinante. El ADN que codifica para los anticuerpos dados a conocer puede aislarse y secuenciarse fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos que pueden unirse específicamente a genes que codifican para las cadenas pesada y ligera de anticuerpos murinos). También pueden generarse y examinarse bibliotecas de anticuerpos o fragmentos de anticuerpo activos usando técnicas de presentación en fagos.

Anticuerpos humanos y humanizados

Muchos anticuerpos no humanos (por ejemplo, aquellos derivados de ratones, ratas o conejos) son naturalmente antigénicos en seres humanos y, por tanto, pueden dar lugar a respuestas inmunitarias no deseables cuando se administran a seres humanos. Por tanto, el uso de anticuerpos humanos o humanizados en los métodos sirve para reducir la posibilidad de que un anticuerpo administrado a un ser humano provoque una respuesta inmunitaria no deseable.

Pueden emplearse animales (por ejemplo, ratones) transgénicos que pueden producir, tras la inmunización, un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la deleción homocigótica del gen de la región de unión a la cadena pesada (J(H)) del anticuerpo en ratones mutantes de la línea germinal y quiméricos da como resultado la completa inhibición de la producción de anticuerpo endógeno. La transferencia de la matriz de genes de inmunoglobulina de la línea germinal humana en tales ratones mutantes de la línea germinal dará como resultado la producción de anticuerpos humanos tras la exposición al antígeno. Opcionalmente, los anticuerpos se generan en otras especies y se “humanizan” para su administración a seres humanos. Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de unión al antígeno de anticuerpos) que contienen una mínima secuencia derivada de inmunoglobulina no humana. Los anticuerpos humanizados incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de una región determinante de la complementariedad (CDR) del anticuerpo receptor se reemplazan por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como ratón, rata o conejo, que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región de marco de Fv de la inmunoglobulina humana se reemplazan por residuos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados también pueden contener residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en las secuencias de la región de marco o CDR importadas. En general, el anticuerpo humanizado contendrá sustancialmente todos de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables, en el que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. De manera óptima, el anticuerpo humanizado también contendrá al menos una porción de una región constante (Fc) de inmunoglobulina, normalmente la de una inmunoglobulina humana.

Los métodos para humanizar anticuerpos no humanos se conocen bien en la técnica. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácido introducidos en el mismo a partir de una fuente que no es humana. Estos residuos de aminoácido no humanos se denominan a veces residuos “de importación”, que normalmente se toman de un dominio variable “de importación”. En general, las técnicas de humanización de anticuerpos implican el uso de tecnología de ADN recombinante para manipular la secuencia de ADN que codifica para una o más cadenas de polipéptido de una molécula de anticuerpo. La humanización puede realizarse esencialmente sustituyendo las CDR o secuencias de CDR de roedor por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, una forma humanizada de un anticuerpo no humano (o un fragmento del mismo) es un anticuerpo o fragmento quimérico, en el que se ha sustituido menos de sustancialmente un dominio variable humano intacto por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son normalmente anticuerpos humanos en los que algunos residuos de las CDR y posiblemente algunos residuos de las FR se sustituyen por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedor.

La elección de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, para su uso en la elaboración de los anticuerpos humanizados es muy importante con el fin de reducir la antigenicidad. Según el método del “mejor ajuste”, la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se examina contra toda la biblioteca de secuencias de dominios variables humanos conocidos. A continuación, se acepta la secuencia humana que es más parecida a la del roedor como la región de marco (FR) humano para el anticuerpo humanizado. Otro método usa una región de marco particular derivada de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. La misma región de marco puede usarse para varios anticuerpos humanizados diferentes.

También es importante que los anticuerpos sean humanizados con retención de alta afinidad por el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para conseguir este objetivo, los anticuerpos humanizados se preparan preferiblemente mediante un procedimiento de análisis de las secuencias originales y diversos productos humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias originales y humanizadas. Los modelos tridimensionales de inmunoglobulinas están disponibles comúnmente y son familiares para los expertos en la técnica. Hay disponibles programas informáticos que ilustran y visualizan estructuras conformacionales tridimensionales probables de secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. La inspección de estas visualizaciones permite el análisis del posible papel de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de los residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antígeno. De esta manera, los residuos de la FR pueden seleccionarse y combinarse a partir de la secuencia consenso y de importación, de modo que se consigue la característica de anticuerpo deseada, tal como la afinidad aumentada por el/los antígeno(s) diana. En general, los residuos de la CDR están implicados directamente, y de lo más sustancialmente, en la influencia sobre la unión al antígeno.

Anticuerpos de cadena sencilla

Los expertos en la técnica conocen bien métodos para la producción de anticuerpos de cadena sencilla. Un anticuerpo de cadena sencilla se crea fusionando juntos los dominios variables de las cadenas pesada y ligera usando un ligador peptídico corto, reconstituyendo de ese modo un sitio de unión al antígeno en una molécula individual. Se han desarrollado fragmentos variables de anticuerpo de cadena sencilla (scFv) en los que el extremo C-terminal de un dominio variable está anclado al extremo N-terminal del otro dominio variable a través de un péptido o ligador de 15 a 25 aminoácidos sin alterar significativamente la unión al antígeno o la especificidad de la unión. El ligador se elige para permitir la unión de la cadena pesada y la cadena ligera en su orientación conformacional apropiada. Estos Fv carecen de la región constante (Fc) presente en las cadenas pesada y ligera del anticuerpo nativo.

Anticuerpos monovalentes

Los métodos in vitro también son adecuados para preparar anticuerpos monovalentes. La digestión de anticuerpos para producir fragmentos de los mismos, particularmente, fragmentos Fab, puede lograrse usando técnicas de rutina conocidas en la técnica. Por ejemplo, la digestión puede realizarse usando papaína. La digestión de anticuerpos con papaína produce normalmente dos fragmentos de unión al antígeno idénticos, denominados fragmentos Fab, cada uno con un único sitio de unión al antígeno, y un fragmento de Fc residual. El tratamiento con pepsina produce un fragmento, denominado fragmento F(ab')2, que tiene dos sitios de combinación de antígeno y aun así puede reticular el antígeno.

Los fragmentos Fab producidos en la digestión de anticuerpos también contienen los dominios constantes de la cadena ligera y el primer dominio constante de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la adición de algunos residuos en el extremo carboxilo-terminal del dominio de cadena pesada, incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. El fragmento F(ab')2 es un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab' unidos por un puente disulfuro en la región bisagra. En el presente documento, Fab'-SH es la denominación para Fab' en el que el/los residuo(s) de cisteína de los dominios constantes portan un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo se produjeron originalmente como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas bisagra entre los mismos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo.

Anticuerpos híbridos

Los anticuerpos pueden ser un anticuerpo híbrido. En los anticuerpos híbridos, un par de cadenas pesada y ligera es homólogo al hallado en un anticuerpo generado contra un epítopo, mientras que el otro par de cadenas pesada y ligera es homólogo a un par hallado en un anticuerpo generado contra otro epítopo. Esto da como resultado la propiedad de valencia multifuncional, es decir, un anticuerpo bivalente tiene la capacidad de unirse simultáneamente a al menos dos epítopos diferentes. Tales híbridos pueden formarse mediante la fusión de hibridomas que producen los anticuerpos componentes respectivos o mediante técnicas recombinantes. Por supuestos, tales híbridos también pueden formarse usando cadenas quiméricas.

Método de elaboración de anticuerpos usando química de proteínas

Un método para producir proteínas que comprenden los anticuerpos es unir dos o más péptidos o polipéptidos juntos mediante técnicas de química de proteínas. Por ejemplo, los péptidos o polipéptidos pueden sintetizarse químicamente usando equipos de laboratorio disponibles en la actualidad usando la química o bien de Fmoc (9fluorenilmetiloxicarbonilo) o bien de Boc (terc-butiloxicarbonoílo) (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). Un experto en la técnica puede apreciar fácilmente que un péptido o polipéptido correspondiente al anticuerpo, por ejemplo, puede sintetizarse mediante reacciones químicas convencionales. Por ejemplo, un péptido o polipéptido puede sintetizarse y no escindirse de su resina de síntesis, mientras que el otro fragmento de un anticuerpo puede sintetizarse y posteriormente escindirse de la resina, exponiendo de ese modo un grupo terminal que está funcionalmente bloqueado en el otro fragmento. Mediante reacciones de condensación de péptidos, estos dos fragmentos pueden unirse covalentemente a través de un enlace peptídico en sus extremos carboxilo-terminal y amino-terminal, respectivamente, para formar un anticuerpo o un fragmento del mismo. Alternativamente, el péptido o polipéptido se sintetiza independientemente in vivo tal como se describió anteriormente. Una vez aislados, estos péptidos o polipéptidos independientes pueden unirse para formar un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo a través de reacciones de condensación de péptidos similares.

Por ejemplo, la unión enzimática de segmentos de péptidos clonados o sintéticos permite la unión de fragmentos de péptidos relativamente cortos para producir fragmentos de péptidos, polipéptidos o dominios de proteína completa más grandes. Alternativamente, puede utilizarse unión química nativa de péptidos sintéticos para construir de manera sintética péptidos o polipéptidos grandes a partir de fragmentos de péptidos más cortos. Este método consiste en una reacción química en dos etapas. La primera etapa es la reacción quimioselectiva de un péptido-alfatioéster sintético desprotegido con otro segmento de péptido desprotegido que contiene un residuo de Cys aminoterminal para dar un producto intermedio unido a tioéster como producto covalente inicial. Sin ningún cambio en las condiciones de reacción, este producto intermedio se somete a una reacción intramolecular rápida espontánea para formar un enlace peptídico nativo en el sitio de unión.

C. Conjugados y complejos

Los conjugados de TRAIL dados a conocer también incluyen una segunda molécula de conjugado que está unida al dominio de TRAIL o a la porción de anticuerpo que no se une al receptor de TRAIL.

Poli(óxidos de alquileno) tales como PEG

El uso de polímeros hidrófilos, tales como poli(óxidos de alquileno), o copolímeros de los mismos, tales como PLURONIC® comercializados por BASF, pueden unirse covalentemente a las moléculas para mejorar los perfiles farmacocinéticos y farmacodinámicos de TRAIL (Kim, et al., Bioconjugate Chem., 22 (8), págs 1631-1637 (2011)). Los estudios muestran que los análogos de TRAIL derivatizados con PEG mantienen una actividad antineoplásica, al tiempo que muestran mayores estabilidades metabólicas en plasma, perfiles farmacocinéticos prolongados y mayores semividas en circulación (Chae, et al., Molecular cancer therapeutics 9(6):1719-29 (2010); Kim, et al., Bioconjugate chemistry, 22(8):1631-7 (2011); Kim, et al., Journal of pharmaceutical sciences 100(2):482-91 (2011); Kim, et al., Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society 150(1):639 (2011)).

Por tanto, en algunas realizaciones, el dominio de TRAIL se derivatiza con una o más unidades de etilenglicol (EG), más preferiblemente 2 o más unidades de EG (es decir, polietilenglicol (PEG)), o un derivado del mismo. Los derivados de PEG incluyen, pero no se limitan a, succinimidilpropionato de metoxipolietilenglicol, N-hidroxisuccinimida de metoxipolietilenglicol, aldehído de metoxipolietilenglicol, maleimida de metoxipolietilenglicol y polietilenglicol de ramificación múltiple.

El número preciso de unidades de EG o derivado depende de la actividad, la estabilidad en plasma y el perfil farmacocinético deseados. Por ejemplo, Kim et al. (anteriormente) notificaron que 2, 5, 10, 20 y 30K-PEG-TRAIL dieron como resultado mayores semividas en circulación de 3,9, 5,3, 6,2, 12,3 y 17,7 h, respectivamente, en ratones, frente a 1,1 h para TRAIL. En algunas realizaciones, el peso molecular del PEG es de entre aproximadamente 1 y 100 kDa, preferiblemente de entre aproximadamente 1 y 50 kDa. Por ejemplo, el PEG puede tener un peso molecular de “N” kDa, en el que N es cualquier número entero de entre 1 y 100. El PEG puede tener un peso molecular de “N” Da, en el que N es cualquier número entero de entre 1.000 y 1.000.000. En una realización particular, el peso molecular del PEG es “N” Da, en el que “N” está entre 1.000 y 50.000, o más preferiblemente entre 5.000 y 50.000.

El agente proapoptótico puede conjugarse con PEG lineal o ramificado. Algunos estudios han demostrado que las proteínas derivatizadas con PEG ramificado tienen semividas en circulación in vivo prolongadas en comparación con las proteínas con PEG lineal, que se cree que se deben en parte a un mayor volumen hidrodinámico de proteínas con PEG ramificado, Fee, et al., Biotechnol Bioeng., 98(4):725-3 (2007).

Los ligandos peptídicos pueden derivatizarse en el extremo C-terminal, o preferiblemente en el extremo N-terminal, usando métodos que se conocen en la técnica.

El conjugados de TRAIL-PEG pueden representarse por la siguiente fórmula:

X-L-(PEG)ⁿ,

en la que

X representa una proteína TRAIL,

L representa un conector,

PEG representa una cadena de polietilenglicol ramificado, y

n es un número entero seleccionado de 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8.

En determinadas realizaciones, n es 2.

El poli(óxido de alquileno) se acopla a la proteína a través de un conector. El conector puede ser un poli(óxido de aquileno), y preferiblemente conecta dos polímeros de poli(óxido de alquileno) con la proteína.

En una realización particular, el conjugado de TRAIL es un conjugado de PEG que incluye un dominio de TRAIL que incluye una forma truncada de un TRAIL humano, por ejemplo, desde arginina-114 hasta glicina-281 de la forma de longitud completa (1-281) de TRAIL humano, y PEG que tiene un peso molecular de entre 1.000 y 100.000 Dalton, y preferiblemente de entre 5.000 y 50.000 Dalton.

Los conjugados de PEG-TRAIL modificados en el extremo N-terminal pueden obtenerse haciendo reaccionar una amina N-terminal del dominio de TRAIL con un grupo aldehído del PEG en presencia de un agente reductor. PEG y TRAIL pueden hacerse reaccionar a una razón molar (PEG/TRAIL) de 2 a 10, o preferiblemente de 5 a 7,5.

En realizaciones preferidas, el conjugado de TRAIL incluye un motivo de cremallera de aminoácidos, por ejemplo, un motivo de cremallera de isoleucinas, que permite la formación del trímero entre tres monómeros de conjugado de TRAIL.

Las cadenas de PEG tienen preferiblemente, pero no necesariamente, el mismo peso molecular. Los intervalos de peso molecular a modo de ejemplo para cada cadena de PEG es de entre aproximadamente 10 kDa y 60 kDa, y preferiblemente de entre aproximadamente 20 kDa y 40 kDa. PEG40 es un resto de PEG ramificado que se sintetizó y tiene un peso molecular de 40 kDa: 20 20 kDa (cada cadena de PEG).

Un resto de PEG trimérico puede consistir en una cadena de PEG ramificada unida a un brazo de conector. Una descripción visual del resto de PEG trimérico se proporciona inmediatamente a continuación.

Se sintetizaron los siguientes PEG triméricos: YPEG42, YPEG43.5, YPEG45, YPEG50 e YPEG60.

• YPEG42 es un resto de PEG trimérico que tiene un peso molecular de 42 kDa: (20 20 kDa) (PEG ramificado) 2 kDa (brazo de conector).

• YPEG43.5 es un resto de PEG trimérico que tiene un peso molecular de 43,5 kDa: (20 20 kDa) (PEG ramificado) 3,5 kDa (brazo de conector).

• YPEG45 es un resto de PEG trimérico que tiene un peso molecular de 45 kDa: (20 20 kDa) (PEG ramificado) 5 kDa (brazo de conector).

• YPEG50 es un resto de PEG trimérico que tiene un peso molecular de 50 kDa: (20 20 kDa) (PEG ramificado) 10 kDa (brazo de conector).

• YPEG60 es un resto de PEG trimérico que tiene un peso molecular de 60 kDa: (20 20 kDa) (PEG ramificado) 20 kDa (brazo de conector).

Resto de conector

La proteína o el péptido se une covalentemente al resto de PEG ramificado a través de un conector. El conector es un polímero, y generalmente tiene una longitud atómica de al menos 800 angstroms. Normalmente, el conector tiene una longitud atómica de desde aproximadamente 800 hasta aproximadamente 2.000 angstrom, desde aproximadamente 800 hasta aproximadamente 1.500 angstrom, desde aproximadamente 800 hasta aproximadamente 1.000 angstrom o desde aproximadamente 900 hasta aproximadamente 1.000 angstrom. Debe apreciarse que las distancias atómicas enumeradas anteriormente se refieren a polímeros completamente extendidos, y que cuando está en estado sólido o en disolución, el conector puede plegarse o enrollarse de maneras tales que la distancia real entre el PEG ramificado y la proteína o el péptido es inferior a las longitudes atómicas enumeradas anteriormente.

En determinadas realizaciones, el conector es un derivado de poli(etilenglicol) con un peso molecular de entre aproximadamente 1 kDa y 30 kDa, preferiblemente desde aproximadamente 2 kDa hasta 20 kDa. Un conector también puede ser un aminoácido natural o no natural de al menos 80 unidades de longitud.

Los PEG alternativos para el conector incluyen polímeros biocompatibles solubles en agua sintéticos o naturales, tales como poli(óxido de etileno), poli(alcohol vinílico), poliacrilamida, proteínas tales como ácido hialurónico y sulfato de condroitina, celulosas tales como hidroximetilcelulosa, poli(alcohol vinílico) y poli((met)acrilatos de hidroxialquilo). Las proteínas y los péptidos pueden unirse covalentemente al conector usando químicas convencionales. Los grupos amina primaria, tales como los hallados en el extremo N-terminal o en residuos de lisina, reaccionarán con aldehídos y sus equivalentes en condiciones reductoras para dar aminas (Molineux, Current pharmaceutical design, 10(11):1235-1244 (2004)). Los grupos mercapto (-SH), tales como los hallados en residuos de cisteína, pueden someterse a adición conjugada con una variedad de aceptores de Michael, incluyendo derivados del ácido acrílico y metacrílico, así como maleimidas (Gong et al., British Journal of Pharmacology, 163(2):399-412 (2011)). Otros grupos nucleófilos adecuados hallados en péptidos y proteínas incluyen enlaces disulfuro (Brocchini, et al., Nature protocols, 1:2241-2252 (2006)) y residuos de histidina (Cong, et al., Bioconjugate Chemistry, 23(2):248-263 (2012)). El conector puede unirse covalentemente a la proteína o al péptido usando químicas convencionales. Por ejemplo, el polímero conector puede derivatizarse en un extremo con un grupo electrófilo, tal como un aldehído, epóxido, halógeno (cloro, bromuro, yodo), éster de sulfonato (tosilato, mesilato), aceptor de Michael o carboxilatos activados, y después hacerse reaccionar con un grupo nucleófilo amina o tiol en la proteína o el péptido. Los aceptores de Michael adecuados incluyen derivados del ácido acrílico y metacrílico, tales como acrilamidas, metacrilamidas, acrilatos y metacrilatos, así como maleimidas. Los carboxilatos activados adecuados incluyen ésteres de NHS (N-hidroxilsuccinato) y carbonato de nitrofenilo. En otras realizaciones, los péptidos y las proteínas que contienen residuos de arginina pueden unirse covalentemente con un conector que contiene un grupo funcional 1,3-dicetona reactivo.

Los conjugados pueden prepararse uniendo en primer lugar el conector con el péptido o la proteína, seguido por la unión del conector con el polietilenglicol ramificado, o uniendo en primer lugar el conector con el polietilenglicol ramificado, seguido por la unión del conector con el péptido o la proteína. La secuencia óptima de formación de enlaces se determina por las transformaciones químicas específicas implicadas.

Macromoléculas

En otras realizaciones, TRAIL puede derivatizarse como un TRAIL de acción prolongada con una semivida prolongada usando biopolímeros o polipéptidos a través de métodos notificados; por ejemplo, pero sin limitarse a, usando ácido hialurónico químicamente conjugado (Yang et al., Biomaterials 32(33);8722-8729 (2011), polipéptidos de formación de depósitos (Amiram et al., Proc Natl Acad Sci USA, 110(8);27922792 (2013), la solicitud estadounidense publicada n.° US 2013-0178416 A1) y TRAIL unido a polipéptidos recombinantes extendidos (solicitud estadounidense publicada n.° US 2010-0239554 A1).

Complejos

El dominio de TRAIL puede formar un complejo con un resto con carga negativa. En algunas realizaciones, el resto con carga negativa puede facilitar la carga del ligando o agonista en una nanopartícula para administración prolongada, sostenida o de liberación con el tiempo. En algunas realizaciones, el resto con carga negativa por sí mismo media la administración prolongada, sostenida o de liberación con el tiempo del ligando o agonista. Preferiblemente, el resto con carga negativa no reduce sustancialmente la capacidad del ligando o agonista de inducir o potenciar la apoptosis en células inmunitarias o sinoviocitos.

Se desarrolló la formación de un complejo entre TRAIL con carga positiva y el sulfato de condroitina con carga negativa (SC) (SC/TRAIL) y se demostró que facilita la carga de TRAIL en microesferas (MS) de poli(lactida-coglicolida) (PLGA), sin comprometer la actividad del TRAIL (Kim, et al., Journal of Pharmacy and Pharmacology, 65(1): 11-21 (2013). Se formó un nanocomplejo de aproximadamente 200 nm en una razón en peso de TRAIL con respecto a SC de 2 (TC2) a pH 5,0. El complejo tenía una eficiencia de carga >95% mayor en las MS de PLGA preparadas mediante el método de emulsión múltiple que la de TRAIL nativo. Por tanto, en algunas realizaciones, el ligando o agonista, particularmente péptidos de TRAIL, y variantes, fragmentos funcionales y proteínas de fusión de los mismos, o conjugados de los mismos tales como conjugados de PEG, forman un complejo con sulfato de condroitina y, opcionalmente, se cargan en micro o nanopartículas, por ejemplo, partículas a base de PLGA.

En otras realizaciones, el ligando o agonista, particularmente péptidos de TRAIL, y variantes, fragmentos funcionales y proteínas de fusión de los mismos, o conjugados de los mismos tales como conjugados de PEG, forman un complejo con ácido hialurónico (HA). Se ha demostrado que los nanocomplejos de PEG-TRAIL y HA preparados mezclando PEG-TRAIL con carga positiva y HA con carga negativa presentan administración sostenida in vivo, con una pérdida insignificante de actividad biológica en comparación con el PEG-TRAIL (Kim, et al., Biomaterials, 31(34):9057-64 (2010)). La administración se potenció adicionalmente administrando las nanopartículas en una disolución que contenía HA al 1%.

D. Restos de direccionamiento

El conjugado de TRAIL, las composiciones que incluyen el agente de conjugado de TRAIL y los vehículos de administración para el agente de conjugado de TRAIL pueden incluir un resto de direccionamiento. En algunas realizaciones, el resto de direccionamiento aumenta el direccionamiento al o la acumulación del agente proapoptótico en el órgano de interés o las células diana.

En una realización preferida, el resto de direccionamiento aumenta el direccionamiento al o la acumulación del agente proapoptótico en el hígado y el páncreas, y más preferiblemente a células estrelladas hepáticas y células estrelladas pancreáticas. Las composiciones y los métodos para el direccionamiento al hígado se conocen en la técnica, véanse, por ejemplo, la solicitud estadounidense publicada n.° 2013/0078216, que describe composiciones y métodos para seleccionar como diana hepatocitos, y Poelstra, et al., J. Control Release, 161(2): 188-97 (2012), que identifican células diana para cada enfermedad hepática y revisa las estrategias para la administración de fármacos a estas células. El uso de proteínas, virus, polímeros y liposomas pueden emplearse todos ellos para potenciar el direccionamiento al hígado, o más preferiblemente a células estrelladas hepáticas. En algunas realizaciones, las moléculas con direccionamiento al hígado se fusionan con o se conjugan al propio agente proapoptótico, o a una composición que incluye el agente proapoptótico, o vehículos de administración que portan el agente proapoptótico (por ejemplo, un portador tal como una micro o nanopartícula, un liposoma, etc.).

La molécula puede seleccionar como diana una proteína expresada en el hígado o en el páncreas, o preferiblemente en la superficie de o en el microentorno alrededor de células estrelladas hepáticas o células estrelladas pancreáticas. El resto diana puede seleccionar como diana una proteína usada en la técnica para identificar células estrelladas hepáticas o células estrelladas pancreáticas. Preferiblemente, los agentes proapoptóticos, las composiciones de los mismos y los vehículos para su administración para el tratamiento de enfermedades hepáticas y fibrosis hepática (1) se dirigen específicamente a HSC activadas, y preferiblemente no se unen a los miofibroblastos presentes en otros tejidos o HSC quiescentes; (2) pueden alcanzar regiones con fibrogénesis activa; (3) se toleran bien por el sistema inmunitario y no se captan inespecíficamente por el sistema reticuloendotelial.

Las estrategias de direccionamiento a modo de ejemplo incluyen manosa-6-fosfato acoplado a albúmina sérica humana (M6P-ASH), que se une al receptor de factor de crecimiento II similar a insulina/manosa-6-fosfato, y un péptido cíclico acoplado a ASH (pCVI-ASH) que reconoce el receptor de colágeno de tipo VI (Beljaars, Hepatology, 29:1486-1493 (1999), y Beljaars, et al., J Biol Chem., 275:12743-12751 (2000)). La estructura de estas proteínas permite el acoplamiento de entidades químicas adicionales, lo que posibilita una administración selectiva de agentes antifibróticos a las HSC. En otra realización particular, la diana es la reelina, una glicoproteína de matriz extracelular secretada grande expresada por células estrelladas hepáticas y usada histológicamente para distinguirlas de otros miofibroblastos.

El resto de direccionamiento puede ser, por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo tal como dominios variables únicos de inmunoglobulina (anticuerpo) (dAc) que se une a un antígeno expresado en el hígado, o más preferiblemente en la superficie de células hepáticas o en el microentorno alrededor de las células estrelladas hepáticas. Los anticuerpos, o un fragmento de unión al antígeno de los mismos, son útiles para dirigir el conjugado a un tipo de células o estado celular. En una realización, el ligando o agonista, la composición que incluye el ligando o agonista o el vehículo de administración posee un dominio de unión al anticuerpo, por ejemplo, de proteínas que se sabe que se unen a anticuerpos tales como proteína A y proteína G de Staphylococcus aureus. En la técnica se conocen otros dominios que se sabe que se unen a anticuerpos, y pueden sustituirse. Los dominios de unión al anticuerpo pueden facilitar la unión del anticuerpo de direccionamiento al ligando o agonista, o a una composición que incluye el ligando o agonista o a un vehículo de administración. En determinadas realizaciones, el anticuerpo es policlonal, monoclonal, lineal, humanizado, quimérico o un fragmento del mismo. Los fragmentos de anticuerpo representativos son aquellos fragmentos que se unen a la porción de unión al anticuerpo del vector no viral, e incluyen Fab, Fab', F(ab'), diacuerpos de Fv, anticuerpos lineales, anticuerpos de cadena sencilla y anticuerpos biespecíficos conocidos en la técnica. En realizaciones preferidas, el anticuerpo de direccionamiento o un fragmento del mismo es específico para un marcador de superficie de células estrelladas hepáticas, y se producen para reducir la posible inmunogenicidad con respecto a un huésped humano que se conoce en la técnica. Por ejemplo, pueden utilizarse ratones transgénicos que contienen toda la agrupación de genes de inmunoglobulina humana que pueden producir anticuerpos “humanos”. En una realización, los fragmentos de tales anticuerpos humanos se emplean como señales de direccionamiento. En una realización preferida, los anticuerpos de cadena sencilla modelados sobre anticuerpos humano se preparan en un cultivo procariota.

E. Moléculas pequeñas y moléculas peptídicas

En divulgaciones adicionales proporcionadas en el presente documento, el agente proapoptótico puede ser una molécula pequeña o molécula peptídica que reconoce TRAIL-R1 y/o R2. Las moléculas pequeñas a modo de ejemplo se conocen en la técnica y se comentan en Wang, et al., Nature Chemical Biology, 9:84-89 (2013). La actividad se descubrió inicialmente a través de un examen químico de alto rendimiento para seleccionar los compuestos que fomentan la muerte celular en combinación con un mimético de molécula pequeña de Smac, el antagonista para el inhibidor de la proteína de apoptosis. Estudios de la relación estructura-actividad produjeron un análogo más potente denominado bioymifi, que puede actuar como único agente para inducir la agrupación y la agregación de DR5, lo que conduce a la apoptosis.

Los péptidos imitadores de TRAIL monovalentes, divalentes y trivalentes se describen en Pavet, et al., Cancer Research, 70:1101-1110, (2010). Por tanto, en algunas realizaciones, el ligando o agonista de un receptor de TRAIL agonista es uno o más de los imitadores.

Se espera que las dosificaciones estén en el mismo intervalo que los compuestos descritos anteriormente.

F. Conjugados de ligando

En una realización alternativa, pueden conjugarse biopolímeros o polisacáridos con el ligando o agonista. Por ejemplo, se conjuga el HA con el ligando o agonista como en Yang, et al., Biomaterials, 32(33):8722-9 (2011). Yang describe una reacción de acoplamiento entre un HA modificado con aldehído y el grupo N-terminal de IFNa , que puede usarse para acoplar el HA con los agentes proapoptóticos dados a conocer en el presente documento. El contenido de IFNa puede controlarse en el intervalo de 2-9 moléculas por cadena de HA individual con una eficiencia de bioconjugación superior al 95%. Los conjugados muestran actividad y semivida in vivo mejoradas y administración aumentada de IFNa al hígado a través de la selección como diana de CD44 sobreexpresado, el receptor de HA, en el hígado. El HA puede usarse como ligando que selecciona como diana enfermedades hepáticas y HSC activadas después de acoplarse a agentes proapoptóticos (Kim, et al., ACS Nano, 4(6):3005-14 (2010)).

En algunas realizaciones, el agente proapoptótico se modifica para mejorar la purificación, la retirada de etiquetas, facilitar la unión de moléculas pequeñas o una combinación de los mismos. Aplicados en tándem, los polipéptidos similares a elastina y la Sortasa A (SrtA) transpeptidasa proporcionan un método para la purificación sin cromatografía de proteínas recombinantes y la conjugación específica del sitio opcional de la proteína con una molécula pequeña (Bellucci, et al., Angewandte Chemie International Edition, 52(13):3703-3708 (2013)). Este sistema proporciona un mecanismo eficiente para generar proteínas bioactivas con rendimiento y purezas altos. En la técnica se conocen otras etiquetas y marcadores, e incluyen, por ejemplo, etiquetas SUMO, etiquetas His, que normalmente incluyen seis o más residuos de histidina, normalmente consecutivos; etiquetas FLAG, que normalmente incluyen la secuencia DYKDDDDK (SEQ ID NO:2); hemaglutinina (HA), por ejemplo, YPYDVP (SEQ ID NO:3); etiqueta MYC, por ejemplo, ILKKATAYIL (SEQ ID NO:4) o EQKLISEEDL (SEQ ID NO:5). En la técnica se conocen métodos de uso de etiquetas de purificación para facilitar la purificación de proteínas, e incluyen, por ejemplo, una etapa de cromatografía en la que la etiqueta se une de manera reversible a una resina de cromatografía.

Las etiquetas de purificación pueden estar en el extremo N-terminal o C-terminal de la proteína de fusión. Las etiquetas de purificación pueden separarse del polipéptido de interés in vivo (por ejemplo, durante la expresión) o ex vivo después del aislamiento de la proteína. Por tanto, las etiquetas de purificación también pueden usarse para retirar la proteína de fusión de un listado celular tras la expresión.

La proteína de fusión también puede incluir una secuencia de aminoácidos de potenciación de la expresión o solubilidad. Las secuencias de aminoácidos de potenciación de la expresión o solubilidad a modo de ejemplo incluyen proteína de unión a maltosa (MBP), glutatión S-transferasa (GST), tiorredoxina (TRX), NUS A, ubiquitina (Ub) y un pequeño modificador relacionado con ubiquitina (SUMO).

En algunas realizaciones, la proteína de fusión incluye uno o más ligadores o espaciadores. En algunas realizaciones, el ligador o espaciados es uno o más polipéptidos. En algunas realizaciones, el ligador incluye una secuencia de diaminoácidos de glicina-ácido glutámico. Los ligadores pueden usarse para unir o conectar dos dominios, regiones o secuencias de la proteína de fusión.

G. Formulaciones

En la mayoría de los casos, los agonistas de TRAIL se administran por vía sistémica, lo más preferiblemente mediante inyección, o mediante implantes, matrices de liberación controlada o recubrimientos.

Se proporcionan composiciones farmacéuticas que incluyen agente(s) activo(s) con o sin un vehículo de administración. Las composiciones farmacéuticas pueden ser para su administración por las vías de administración parenteral (inyección intramuscular, intraperitoneal, intravenosa (i.v.) o subcutánea), enteral o transmucosa (nasal, vaginal, rectal o sublingual) o usando insertos bioerosionables, y pueden formularse en formas de dosificación apropiadas para cada vía de administración.

En determinadas realizaciones, las composiciones se administran localmente, por ejemplo, mediante inyección directamente en un sitio que va a tratarse (por ejemplo, en el hígado). En algunas realizaciones, las composiciones se inyectan o administran de otro modo directamente en la vasculatura sobre un tejido vascular en o adyacente al sitio de tratamiento previsto (por ejemplo, adyacente al hígado). Normalmente, la administración local provoca una concentración localizada aumentada de las composiciones que es mayor que la que puede conseguirse mediante administración sistémica.

Los agente(s) activo(s) y las composiciones farmacéuticas de los mismos pueden administrarse en una disolución acuosa mediante inyección parenteral. La formulación también puede estar en forma de una suspensión o emulsión. En general, se proporcionan composiciones farmacéuticas que incluyen cantidades eficaces del/de los agente(s) activo(s) y opcionalmente incluyen diluyentes, conservantes, solubilizadores, emulsionantes, adyuvantes y/o portadores farmacéuticamente aceptables. Tales composiciones incluyen diluyentes: agua estéril, solución salina tamponada de diversos contenidos de tampón (por ejemplo, Tris-HCl, acetato, fosfato), pH y fuerza iónica; y, opcionalmente, aditivos tales como detergentes y agentes solubilizantes (por ejemplo, TWEEN® 20, TWEEN® 80 también denominados polisorbato 20 u 80), antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, metabisulfito de sodio) y conservantes (por ejemplo, timersol, alcohol bencílico) y sustancias de carga (por ejemplo, lactosa, manitol). Los ejemplos de disolventes o vehículos no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales, tales como aceite de oliva y aceite de maíz, gelatina y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. Las formulaciones pueden liofilizarse y volver a disolverse/suspenderse inmediatamente antes de su uso. La formulación puede esterilizarse, por ejemplo, mediante filtración a través de un filtro de retención de bacterias, incorporación de agentes esterilizantes en las composiciones, irradiación de las composiciones o calentamiento de las composiciones.

Los agentes activos pueden formularse para administración pulmonar o mucosa, por ejemplo, para el tratamiento de isquemia pulmonar. En una realización, los compuestos se formulan para administración pulmonar, tal como administración intranasal o inhalación oral. Las vías respiratorias son la estructura implicada en el intercambio de gases entre la atmósfera y el torrente sanguíneo. Los pulmones son estructuras ramificadas que en última instancia terminan en los alvéolos donde tiene lugar el intercambio de gases. El área de superficie alveolar es la más grande en el sistema respiratorio y es donde se produce la absorción de fármacos. Los alvéolos están cubiertos por un epitelio delgado sin cilios o una capa de moco y secretan fosfolípidos tensioactivos. Las vías respiratorias abarcan las vías respiratorias altas, que incluyen la orofaringe y la laringe, seguidas por las vías respiratorias bajas, que incluyen al tráquea, seguidas por bifurcaciones en los bronquios y bronquiolos. Las vías respiratorias altas y bajas se denominan vías respiratorias conductoras. Los bronquiolos terminales se dividen luego en bronquiolos respiratorios, que luego conducen a la zona respiratoria final, los alvéolos o el pulmón profundo. El pulmón profundo, o los alvéolos, es la diana principal de los aerosoles terapéuticos inhalados para la administración sistémica de fármacos.

Se ha observado la administración pulmonar de composiciones terapéuticas compuestas por fármacos de bajo peso molecular, por ejemplo, antagonistas beta-androgénicos para tratar el asma. Otros agentes terapéuticos que son activos en los pulmones se han administrado por vía sistémica y dirigido a través de la absorción pulmonar. La administración nasal se considera como una técnica prometedora para la administración de productos terapéuticos por los siguientes motivos: la nariz tiene un gran área de superficie disponible para la absorción de fármacos debido a la cobertura de la superficie epitelial por numerosos microvellosidades, la capa subepitelial está altamente vascularizada, la sangre venosa de la nariz pasa directamente a la circulación sistémica y, por tanto, evita la pérdida de fármaco por el metabolismo de primer paso en el hígado, ofrece dosis más bajas, obtención más rápida de niveles terapéuticos en sangre, aparición más rápida de actividad farmacológica, menos efectos secundarios, alto flujo sanguíneo total por cm3, membrana basal endotelial porosa y es fácilmente accesible.

El término aerosol, tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier preparación de una fina niebla de partículas, que puede estar en disolución o suspensión, independientemente de que si se produzca usando un propelente o no. Los aerosoles pueden producirse usando técnicas convencionales, tales como ultrasonicación o tratamiento a alta presión.

Los portadores para formulaciones pulmonares pueden dividirse en aquellos para formulaciones de polvo seco y para administración como disoluciones. En la técnica se conocen aerosoles para la administración de agentes terapéuticos a las vías respiratorias. Para la administración a través de las vías respiratorias altas, la formulación puede formularse en una disolución, por ejemplo, agua o solución salina isotónica, tamponada o no tamponada, o como una suspensión para administración intranasal como gotas o como pulverización. Preferiblemente, tales disoluciones o suspensiones son isotónicas con respecto a las secreciones nasales y tienen aproximadamente el mismo pH que oscila, por ejemplo, entre aproximadamente pH 4,0 y aproximadamente pH 7,4 o entre pH 6,0 y pH 7,0. Los tampones deben ser fisiológicamente compatibles, e incluyen, simplemente a modo de ejemplo, tampones fosfato. Por ejemplo, se describe que un descongestivo nasal representativo está tamponado a un pH de aproximadamente 6,2. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente un pH y contenido de solución salina adecuados para una disolución acuosa inocua para administración nasal y/o a las vías respiratorias altas.

Preferiblemente, la disolución acuosa es agua, disoluciones acuosas fisiológicamente aceptables que contienen sales y/o tampones, tales como solución salina tamponada con fosfato (PBS), o cualquier otra disolución acuosa aceptable para su administración a un animal o ser humano. Un experto en la técnica conoce bien tales disoluciones, e incluyen, pero no se limitan a, agua destilada, agua desionizada, agua pura o ultrapura, solución salina, solución salina tamponada con fosfato (PBS). Otros vehículos acuosos adecuados incluyen, pero no se limitan a, disolución de Ringer y cloruro de sodio isotónico. Las suspensiones acuosas pueden incluir agentes de suspensión tales como derivados de celulosa, alginato de sodio, polivinilpirrolidona y goma tragacanto, y un agente humectante tal como lecitina. Los conservantes adecuados para suspensiones acuosas incluyen p-hidroxibenzoato de etilo y n-propilo.

En otra realización, pueden usarse para las formulaciones disolventes que son disolventes residuales de clase 3 orgánicos (es decir, no acuosos) de baja toxicidad, tales como etanol, acetona, acetato de etilo, tetrahidrofurano, etil éter y propanol. El disolvente se selecciona basándose en su capacidad para aerosolizar fácilmente la formulación. El disolvente no debe reaccionar de manera perjudicial con los compuestos. Debe usarse un disolvente apropiado que disuelva los compuestos o que forme una suspensión de los compuestos. El disolvente debe ser lo suficientemente volátil como para permitir la formación de un aerosol de la disolución o suspensión. Pueden añadirse disolventes o agentes de aerosolización adicionales, tales como freones, según se desee, para aumentar la volatilidad de la disolución o suspensión.

En una realización, las composiciones pueden contener cantidades minoritarias de polímeros, tensioactivos u otros excipientes bien conocidos por los expertos en la técnica. En este contexto, “cantidades minoritarias” significa que no están presentes excipientes que puedan afectar a o media la captación de los compuestos en los pulmones y que los excipientes que estén presentes están presentes en una cantidad que no afecta de manera adversa a la captación de los compuestos en los pulmones. Los polvos lipídicos secos pueden dispersarse directamente en etanol debido a su carácter hidrófobo. Para los lípidos almacenados en disolventes orgánicos, tales como cloroformo, se coloca la cantidad de disolución deseada en un vial y se evapora el cloroformo bajo una corriente de nitrógeno para formar una película delgada seca sobre la superficie de un vial de vidrio. La película se hincha fácilmente cuando se reconstituye con etanol. La suspensión se somete a sonicación para dispersar completamente las moléculas lipídicas en el disolvente orgánico. También pueden prepararse suspensiones no acuosas de lípidos en etanol absoluto usando un nebulizador reutilizable PARI Lc Jet+ (PARI Respiratory Equipment, Monterey, cA). Las formulaciones de polvo seco (“DPF”) con un tamaño de partícula grande presentan características de fluidez mejoradas, tales como menos agregación, aerosolización más fácil y fagocitosis potencialmente menor. Los aerosoles de polvo seco para terapia de inhalación se producen generalmente con diámetros medios principalmente en el intervalo de menos de 5 micrómetros, aunque un intervalo preferido es de entre uno y diez micrómetros de diámetro aerodinámico. Las partículas de “portador” grandes (que no contienen fármaco) se han administrado conjuntamente con aerosoles terapéuticos para ayudar a conseguir una aerosolización eficiente, de entre otros posibles beneficios.

III. Uso en métodos de tratamiento

Las composiciones se administran normalmente mediante inyección, aunque en algunas realizaciones pueden administrarse por vía tópica (como durante la cirugía) o a una superficie mucosa (por vía rectal, vaginal, oral o pulmonar). Estas pueden administrarse en disolución, en implantes o geles, o como polvos secos en forma seca o redisueltos o resuspendidos.

Los ejemplos a continuación ilustran que los agonistas de TRAIL-R1 (DR4) y/o TRAIL-R2 (DR5) pueden seleccionar como diana y destruir específicamente las células activadas, tales como células estrelladas hepáticas y células estrelladas pancreáticas, lo que conduce a apoptosis inducida por TRAIL. De manera importante, mediante la eliminación de tales células estrelladas activadas, se regularon por disminución simultáneamente moléculas altamente reguladas por incremento asociadas con la fibrosis en modelos de fibrosis in vivo. Esto demuestra que los compuestos pueden usarse para el tratamiento de estados patológicos en los que se dan a conocer los fibroblastos activados, las células miofibroblásticas, los miofibroblastos y las células endoteliales y epiteliales activadas que producen o inducen una cantidad en exceso de matriz extracelular que da como resultado fibrosis o cicatrización no deseada. La cicatrización o fibrosis puede ser en el hígado, el páncreas, los pulmones, el corazón, los riñones, el intestino, la piel o las arterias.

También se proporcionan métodos para seleccionar como diana específicamente y reducir, inhibir y/o eliminar de los órganos los fibroblastos activados, las células miofibroblásticas, los miofibroblastos y las células endoteliales y epiteliales que producen un exceso de matriz extracelular.

Tal como se comenta con más detalle a continuación, los métodos incluyen normalmente administrar a un sujeto con fibrosis o que probablemente desarrolle fibrosis una cantidad eficaz de un agente proapoptótico para reducir la fibrosis, normalmente induciendo o aumentando la apoptosis de las células subyacentes de la fibrosis, cirrosis o complicaciones de las mismas, tales como ascitis o dolor. Tal como se usa en el presente documento, “reducir” puede ser reducir el tamaño, la rigidez (como en el tejido cicatricial) o una combinaciones de factores entendidos por los expertos en la técnica.

A. Enfermedad hepática

En una de las realizaciones preferidas, la composición y los métodos se usan para tratar la enfermedad hepática. La fibrosis hepática se caracteriza por una producción en exceso de matriz extracelular, predominantemente colágeno de tipo I, que actúa como respuesta inflamatoria a daño hepático crónico. Las principales causas de la fibrosis hepática en países industrializados incluyen infección por el virus de la hepatitis C (VHC) crónica, alcoholismo y esteatohepatitis no alcohólica (NASH) (Bataller, et al., Clin. Inves., 115(2):209-18 (2005)). La fibrosis hepática progresiva conduce eventualmente a cirrosis y distorsión de la vasculatura, lo que conduce adicionalmente a insuficiencia hepática, hipertensión portal (PHT), carcinoma hepatocelular (CHC) y muerte prematura. La PHT también puede desencadenar complicaciones adicionales tales como hemorragia gastrointestinal, ascitis, encefalofatía y niveles reducidos de plaquetas o recuento disminuido de leucocitos. Un tratamiento de la cirrosis y fibrosis hepáticas podría proporcionar unas mejores normas asistenciales y reducir las complicaciones directamente relacionadas con la cascada fibrótica. Después de eliminar el factor causante de la lesión en el hígado, puede ralentizarse o retroceder la progresión de la cascada fibrótica. No fue hasta 1985, con la identificación de que las células estrelladas hepáticas (HSC) son las principales responsables de la sobreexpresión de ECM en el hígado, que pudieron estudiarse posibles productos terapéuticos.

Durante la enfermedad o el daño hepático crónico, las HSC quiescentes experimentan activación y se transforman desde células ricas en vitamina A con forma de estrella en células deficientes en vitamina A similares a mioblastos altamente proliferativas que adquieren propiedades fibrógenas (Bataller, et al., Clin. Inves., 115(2):209-18 (2005); Friedman, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. uSa ; 82(24):8681-5 (1985); Senoo, Medical electron microscopy: official Journal of the Clinical Electron Microscopy Society of Japan 37(1):3-15 (2004)). Las HSC activadas expresan alfaactina de músculo liso (alfa-SMA) y secretan colágeno de tipo I (Friedman, et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America; 82(24):86815 (1985); Rockey, et al., Journal of submicroscopic cytology and pathology, 24(2): 193-203 (1992); Ramadori, et al., Virchows Archiv B, Cell pathology including molecular pathology 59(6):349-57 (1990)). La identificación de HSC activadas, previamente conocidas como lipocitos, células Ito o células preisinusoidales, como el tipo de células fibrógenas principal en lesión hepática junto con el reconocimiento de citocinas clave implicadas en el proceso han proporcionado numerosas estrategias para agentes antifibróticos (Bataller, et al., Clin. Invest., 115(2):209-18 (2005)).

Las terapias han intentado reducir la acumulación de HSC activadas para impedir el exceso de ECM, lo que ha demostrado ser eficaz en modelos experimentales (Wynn, et al., Nature medicine, 18(7):1028-40 (2012); Cohen, et al., Ther. adv. gastroent., 4(6):391-417 (2011); Kisseleva, et al., Best practice & research Clinical gastroenterology, 25(2):305-17 (2011)). Por ejemplo, los antioxidantes y bloqueadores del sistema renina-angiotensina pueden reducir la acumulación de tejido cicatricial pero sólo han mostrado eficacia en modelos experimentales. En la actualidad se han sugerido muchas estrategias para el tratamiento de cirrosis y fibrosis hepáticas (tabla 1 de Friedman, en: Bruce A Runyon ACT, ed. UpToDatecom, (2011)). La selección como diana de HSC activadas o su activación, proliferación y función es una estrategia antifibrótica importante (Friedman, en: Bruce A Runyon ACT, ed. UpToDatecom, (2011); Breitkopf, et al., Clinical and Experimental Research, 29:121S-31S (2005); Kisseleva, et al., Journal of Gastroenterology and Hepatology, 21:S84-S87 (2006)). Se ha demostrado que la reversión de HSC fomenta la regresión de la fibrosis en modelos animales para muchas formas de lesión hepatocelular (Kisseleva, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 109(24):9448-53 (2012); Troeger, et al., Gastroenterology, 143(4):1073-83 (2012)). Sin embargo, incluso si se termina la fibrogénesis y activación de las HSC, las HSC revertidas tienen una mayor sensibilidad a la estimulación fibrógena recurrente, lo que indica que estas HSC no revierten completamente a un estado quiescente (Troeger, et al., Gastroenterology, 143(4):1073-83 (2012)). Otra manera propuesta es la eliminación de HSC activadas que favorecen la apoptosis con respecto a la reversión (Bataller, et al., Semin Liver Dis, 21(03):437-52 (2001); Friedman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 109(24):9230-1 (2012)).

Esto se valida adicionalmente en un modelo de recuperación espontánea de fibrosis hepática en ratas, donde la apoptosis de HSC activadas fue la contribución vital para la resolución de la fibrosis (Iredale, et al., J Clin Invest, 102(3):538-49 (1998)). Se mostró que las HSC activadas en este modelo son responsables de producir la matriz fibrótica así como de proteger la matriz de la degradación al producir inhibidores tisulares de la metaloproteinasa (TIMP). De manera importante, sin embargo, la bibliografía notifica la ausencia de enfoques terapéuticos para fomentar la apoptosis específicamente en células estrelladas hepáticas, tales como el método dado a conocer en el presente documento.

B. Uso en métodos de tratamiento de enfermedad hepática

Los métodos de tratamiento incluyen normalmente administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de un agente proapoptótico, por ejemplo, uno o más ligandos o agonistas de un receptor de TRAIL agonista, para inducir o aumentar la apoptosis de uno o más tipos de células diana, tales como células estrelladas hepáticas, fibromioblastos, células fibromioblásticas, células endoteliales activadas o células epiteliales activadas que producen o inducen una cantidad en exceso de matriz extracelular que da como resultado cicatrización no deseada del hígado en el sujeto. En una realización preferida, las células diana son células estrelladas hepáticas.

Normalmente, el agente proapoptótico se administra al sujeto en una cantidad eficaz para aumentar la apoptosis de uno o más de los tipos de células diana. Preferiblemente, el nivel de apoptosis es eficaz para reducir o inhibir la aparición o evolución de enfermedad hepática, o uno o más síntomas de la misma. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el agente proapoptótico se administra en una cantidad eficaz para reducir la fibrosis o aumentar la regresión de la fibrosis, reducir la acumulación de tejido cicatricial, reduce la progresión de la cascada fibrótica, reducir la acumulación de matriz extracelular, reducir la cirrosis o una combinación de los mismos.

La apoptosis de células estrelladas hepáticas y la resolución de la fibrosis hepática pueden evaluarse en el sujeto usando varias técnicas. En general, también puede observarse la mejora en la enfermedad hepática que padece el sujeto. El estado del sujeto y la función hepática en el sujeto pueden evaluarse para monitorizar cualquier disminución de la gravedad, o la completa desaparición, de uno o más síntomas asociados con la enfermedad hepática y, en particular, con la fibrosis hepática. Por ejemplo, puede evaluarse si hay cualquier cambio o no en cuanto a ictericia, retención de líquidos, facilidad de formación de hematomas, frecuencia de hemorragias nasales, estado de la piel o las uñas. El bienestar general del sujeto puede mejorar, y esto puede evaluarse como un indicador de recuperación. El sujeto puede mostrar un aumento del apetito, reducción en la incidencia, o gravedad de, náuseas, aumento de peso y/o sensaciones generales de fuerza y energía. El sujeto también puede mostrar una reducción en la incidencia de hospitalización o la necesidad de otra atención médica.

La función hepática del sujeto puede mejorarse o aumentarse. La función hepática puede estabilizarse. Esto puede evaluarse mediante varias maneras. Pueden tomarse biopsias de hígado o muestras de sangre y pueden determinarse los marcadores de la función hepática. Los marcadores de la función hepática que pueden estudiarse incluyen los niveles de ácido hialurónico, péptido de procolágeno IIIN, péptido de procolágeno IC, undulina-colágeno 16, colágeno de tipo IV con dominio 7S, MMP-2 y T ⁱM^p-1.

El hígado del sujeto puede mostrar una disminución de nodulización, necrosis e inflamación, o una combinación de las mismas. En particular, el hígado del sujeto puede mostrar una disminución, o estabilización, de la cantidad de fibrosis en su hígado. La presencia de material fibrótico en el hígado puede disminuirse, y esto puede determinarse mediante tinción de las secciones de biopsias de hígado usando tintes tales como rojo sirio. Pueden determinarse la presencia y la cantidad de componentes de la matriz extracelular fibróticos particulares, tales como, por ejemplo, colágenos y, en particular, los colágenos I y III. También pueden llevarse a cabo análisis bioquímicos para determinar los niveles de TIMP y/o MMP y la reducción de la expresión de TIMP en el sujeto.

La apoptosis de células estrelladas hepáticas en el hígado también puede determinarse a partir de las biopsias de hígado. Puede medirse cualquier cambio, y en particular, cualquier aumento, de la frecuencia de apoptosis de células estrelladas hepáticas. Las células apoptóticas pueden identificarse usando varios métodos bien conocidos. Pueden usarse técnicas tales como tinción de TUNEL (marcaje del extremo de corte de desoxiuridina trisfosfato mediado por desoxinucleotidil transferasa terminal) para identificar las células apoptóticas. La tinción de TUNEL es particularmente útil, ya que puede usarse para identificar células apoptóticas in situ. A través de la tinción conjunta, tal como mediante tinción para determinar células que expresan a -actina de músculo liso, puede comprobarse que las células que experimentan apoptosis son células estrelladas hepáticas.

Pueden emplearse otras técnicas bien conocidas para identificar y/o cuantificar la apoptosis, tales como, por ejemplo, tinción con anexina V, anticuerpos contra ADN monocatenario, ensayos de sustrato de caspasa, PCR mediada por ligación y tinción de permeabilidad de la membrana celular. La fragmentación del ADN puede analizarse mediante electroforesis en gel. También puede usarse la tinción para determinar las características morfológicas asociadas con la apoptosis, tales como la vesiculación de la membrana y la ruptura del núcleo. Puede usarse la tinción con naranja de acridina para identificar células apoptóticas. Las células pueden teñirse con yoduro de propidio para analizar el contenido de ADN. Pueden usarse pruebas tales como la tinción con azul de tripano para comprobar que la célula de membrana está intacta y que son apoptóticas, no necróticas.

El efecto de la administración del agente proapoptótico puede compararse con un control. Los controles adecuados se conocen en la técnica, e incluyen, por ejemplo, un sujeto no tratado compatible o un sujeto compatible al que se le ha administrado un agente terapéutico que no induce ni aumenta la apoptosis de las células diana.

Las composiciones pueden administrarse por vía local o sistémica, tal como se comentó anteriormente. En una realización particular, la composición se administra al sujeto mediante inyección percutánea en el hígado. La inyección puede ser en y/o adyacente a un sitio de fibrosis o cicatrización en el hígado, un sitio de acumulación en exceso de matriz extracelular, un sitio de HSC activadas o en proliferación o un sitio de otro marcador bioquímico, histológico o morfológico de hígado enfermo. Tal como se comenta con más detalle a continuación, las composiciones pueden administrarse solas o en combinación con agentes activos adicionales.

IV. Terapias de combinación

Uno o más de los agentes proapoptóticos dados a conocer en el presente documento, y las composiciones de los mismos, pueden administrarse a sujetos que lo necesitan solos, o en combinación, con uno o más agentes activos adicionales. En algunas realizaciones, el segundo agente activo es un agente que se conoce en la técnica para el tratamiento de una enfermedad fibrótica, particularmente enfermedad fibrótica hepática. En algunas realizaciones, el segundo agente activo es uno que modula las células estrelladas hepáticas, por ejemplo, un agente que reduce la proliferación de células estrelladas hepáticas, reduce la activación o actividad de células estrelladas hepáticas, aumenta la apoptosis de células estrelladas, reduce la deposición de matriz extracelular o componentes de la misma, particularmente colágeno, aumenta la degradación de la matriz extracelular o componentes de la misma, particularmente colágeno, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el segundo agente activo aumenta la eficacia, potencia el efecto o mejora de otro modo el rendimiento o la sensibilidad de las células al ligando o agonista.

En algunas realizaciones, el segundo agente activo no está relacionado con la modulación de células estrelladas hepáticas. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el segundo agente reduce la inflamación hepática. En algunas realizaciones, el segundo agente activo puede ser un agente que trata o reduce uno o más síntomas de fibrosis hepática sin efectuar la proliferación, actividad, activación o apoptosis de células estrelladas hepáticas.

Los agentes terapéuticos adicionales a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, glicirricina, halofuginona, factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), HOE 077, interferón-a , interferón-y, interleucina-10, malotilato, pentoxifilina, fosfatidilcolina, S-adenosil-L-metionina (SAMe), ácidos grasos saturados, Sho-saiko-to, silimarina, inhibidores del factor de crecimiento transformante p (TGF-P), TNP 470, tocoferol, tricostatina A y activador de plasminógeno de tipo urocinasa (uPA) (Bataller, et al., Semin Liver Dis., 21(3) (2001).

A. Segundos agentes activos

1. Antioxidantes

El segundo o posterior agente activo puede ser un antioxidante. Los antioxidantes a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, vitamina E (a -tocoferol), silimarina (un antioxidante flavonoide extraído de Silybum marianum), fosfatidilcolina (PPC), S-adenosil-L-metionina (SAMe), retinoides (palmitato de retinilo) y compuestos fenólicos naturales (resveratrol y quercetina).

2. Agentes que inhiben la migración o interacción de HSC con la matriz extracelular circundante

En algunas realizaciones, el segundo o posterior agente activo es un agente que reduce o inhibe la migración de células estrelladas hepáticas o la interacción entre las células y su microentorno, por ejemplo, la matriz extracelular circundante o subyacente. La estimulación de las HSC con factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF)-BB, factor de crecimiento transformante (TGF)-beta1 y/o factor de crecimiento epitelial (EGF) aumenta la capacidad migratoria y regula por incremento la actividad de la metaloproteinasa de matriz (MMP)-2 (Yang, et al., Gastroenterology, 124(1):147-59 (2003)). Se cree que la migración inducida por PDGF-BB está asociada con un aumento de la proliferación, mientras que la migración inducida por TGF-beta1/EGF parece ser independiente de la proliferación. Yang, et al., (anteriormente) también notifican que COL-3, un inhibidor de MMP-2 y MMP-9, inhibió la migración de HSC inducida por la activación directa de PDGF-BB o TGF-beta1 pero no tuvo ningún efecto sobre la migración inducida por estímulos quimiotácticos sin contacto directo, lo que indica dos mecanismos distintos de la migración inducida por PDGF-BB o TGF-beta1, uno dependiente de MMP y otro independiente de MMP.

Por tanto, en algunas realizaciones, el segundo agente activo es un agente que reduce o inhibe la migración inducida por PDGF-BB, la migración inducida por TGF-beta1 o una combinación de las mismas. Un inhibidor a modo de ejemplo es COL-3, que ha sido objeto en ensayo clínico. Un ensayo en fase 1 incluía la administración a los sujetos de dosis crecientes de COL-3 a partir de 36 mg/m2/d, y se halló una dosis tolerada máxima de 98 mg/m2/d y que se toleraba bien a 70 mg/m2/d.

La migración inducida por PDGF-BB, TGF-beta1 y colágeno I también puede inhibirse por anticuerpos bloqueantes de alfa(1) y/o alfa(2)-integrina y antagonistas de RGD competitivos, y los estudios muestran que la curcumina inhibe la migración e invasión de HSC activadas al reducir la expresión y actividad de MMP-2 (Huang, et al., Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi, 17(11):835-8 (2009). Otras evidencias indican que el interferón-a y y también pueden inhibir las HSC o aumentar su apoptosis (Weng, et al., J Hepatol., 59(4):738-45 (2013) y (Glassner, et al., Lab Invest., 92(7):967-77 (2012)).

3. Agentes que inhiben la inflamación hepática

En algunas realizaciones, el segundo o posterior agente activo es un agente que reduce o inhibe la inflamación hepática. Los antiinflamatorios a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, corticosteroides, colquicina y malotilato.

En algunas realizaciones, el segundo o posterior agente activo es un agente que reduce o inhibe la actividad de una citocina o un factor proinflamatorio. Por ejemplo, el agente puede ser un antagonista del receptor de interleucina-1, o receptores del factor de necrosis tumoral a (TNF-a ) soluble que pueden reducir la necrosis e inflamación en tejido hepático. Además, se ha demostrado que IL-10 regula por disminución respuestas Th1 proinflamatorias. Los pacientes con infección por VHC crónica tratados con interleucina-10 recombinante no sólo mostraron una mejora de la inflamación hepática, sino también la resolución de la deposición inicial de cicatriz fibrosa (Louis, et al., Hepatology, 28:1607-1615 (1998)).

4. Agentes que inhiben la actividad de TGF-p

En algunas realizaciones, el segundo agente activo inhibe la actividad de TGF-p. Los enfoques usados para impedir la unión de TGF-p a sus receptores incluyen el uso de un receptor de TGF-p de tipo II negativo dominante, la expresión del ectodominio del receptor de tipo II fusionado con la porción Fc de IgG humana, la expresión de un receptor de tipo II truncado y la construcción de un receptor de tipo II soluble. HGF, ya sea como proteína recombinante o mediante terapia génica, también es eficaz en la prevención de la evolución de fibrosis hepática en diferentes modelos experimentales, y puede usarse para modular la proliferación de HSC, la formación de colágeno y la expresión de TGF-b, sin los inconvenientes y peligros potenciales de la inhibición sistémica o global prolongada de TGF-p.

En algunas realizaciones, el segundo agente activo es un microARN o un imitador del mismo. Los miembros de la agrupación de miR-17-92 (19a, 19b, 92a) se regulan por disminución significativamente en HSC activadas (Lakner, et al., Hepatology, 56(1):300-10 (2012)). En particular, la regulación negativa de los componentes de señalización de TGF-p por parte del imitador miR 19b se ha demostrado por la expresión disminuida del receptor II de TGF-p (TGF-PRII) y SMAD3, la unión de miR 19b a la región no traducida en 3' de TGF-pRII, la inhibición de la señalización de TGF-p, la expresión disminuida de colágeno de tipo I y el bloqueo de la expresión inducida por TGF-p de ARNm de procolágeno a 1(I) y a 2(I). miR 19b también mitigó el fenotipo de HSC activadas mediante la evaluación morfológica y la expresión disminuida de a -actina de músculo liso. Por tanto, en una realización preferida, el microARN es un miR 19b o un imitador del mismo.

5. Agentes quimioterápicos

Se han investigado ligandos de receptores de TRAIL agonistas para su uso en el tratamiento del cáncer, tanto solos como en combinación con tratamientos contra el cáncer convencionales, tales como agentes quimioterápicos. Algunos informes indica que los fármacos quimioterápicos pueden sensibilizar a las células frente a la apoptosis inducida por TRAIL, y algunos resultados indican que la combinación de los dos agentes es más eficaz que la suma de los efectos de los agentes cuando se usan solos (Cuello, et al., Gynecol Oncol., 81(3):380-90 (2001), Wu, et al., Vitam Horm., 67:365-83 (2004)). Por tanto, en algunas realizaciones, los sujetos y las enfermedades dados a conocer en el presente documento se tratan con una combinación de un ligando o agonista de un receptor de TRAIL agonista y un agente quimioterápico. En algunas realizaciones, los sujetos no padecen cáncer.

Los fármacos quimioterápicos a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, doxorrubicina, 5-fluorouracilo, cisplatino, carboplatino, oxaliplatino, mecloretamina, ciclofosfamida, clorambucilo, vincristina, vinblastina, vinorelbina, vindesina, taxol y derivados del mismo, irinotecán, topotecán, amsacrina, etopósido, fosfato de etopósido, tenipósido, epipodofilotoxinas, trastuzumab (HERCEPTIN®), cetuximab y rituximab (RITUXAN® o MABT^h E^rA®), bevacizumab (A^vASTIN®) y combinaciones de los mismos.

B. Pautas posológicas y regímenes de tratamiento para las terapias de combinación

Los métodos de tratamiento dados a conocer en el presente documento incluyen normalmente el tratamiento de una enfermedad o un síntoma de la misma, o un método para conseguir un cambio fisiológico deseado, que incluye administrar a un animal, tal como un mamífero, especialmente un ser humano, una cantidad eficaz de un agente proapoptótico para tratar una enfermedad hepática o un síntoma de la misma, o para producir el cambio fisiológico. En algunas realizaciones, el agente proapoptótico está en combinación con un agente activo adicional. El agente proapoptótico y el agente activo adicional pueden administrarse juntos, como parte de la misma composición, o administrarse por separado e independientemente al mismo tiempo o en momentos diferentes (es decir, la administración del ligando o agonista y el segundo agente activo está separada por un periodo finito de tiempo entre sí). Por tanto, el término “combinación” o “combinada” se usa para referirse a administración concomitante, simultanea o secuencial del ligando o agonista y el segundo agente activo. Las combinaciones pueden administrarse de manera concomitante (por ejemplo, como una mezcla conjunta), por separado pero simultáneamente (por ejemplo, a través de vías intravenosas independientes en el mismo sujeto; un agente se administra por vía oral mientras que el otro agente se administra mediante infusión o inyección, etc.) o de manera secuencial (por ejemplo, un agente se administra en primer lugar, seguido por el segundo).

En realizaciones preferidas, la administración del agente proapoptótico en combinación con el segundo agente activo consigue un resultado mayor que cuando el agente proapoptótico y el segundo agente activo se administran solos o en aislamiento (es decir, el resultado conseguido por la combinación es más que la adición de los resultados conseguidos por los componentes individuales solos). En algunas realizaciones, la cantidad eficaz de uno o ambos agentes usados en combinación es más baja que la cantidad eficaz de cada agente cuando se administra por separado. En algunas realizaciones, la cantidad de uno o ambos agentes cuando se usan en la terapia de combinación está por debajo de la terapéutica cuando se usan solos.

Un régimen de tratamiento de la terapia de combinación puede incluir una o múltiples administraciones de ligando o agonista. Un régimen de tratamiento de la terapia de combinación puede incluir una o múltiples administraciones del segundo agente activo.

En algunas realizaciones, el agente proapoptótico se administra antes de la primera administración del segundo agente activo. En otras realizaciones, el ligando o agonista se administra después de la primera administración del segundo agente activo.

El ligando o agonista puede administrarse al menos 1, 2, 3, 5, 10, 15, 20, 24 ó 30 horas o días antes o después de la administración del segundo agente activo.

Los ciclos de dosificación o las pautas posológicas de los agentes pueden ser completa o parcialmente solapantes, o pueden ser secuenciales. Por ejemplo, en algunas realizaciones, todas tal(es) administración/administraciones del agente proapoptótico se producen antes o después de la administración del segundo agente activo. Alternativamente, la administración de una o más dosis del agente proapoptótico puede escalonarse temporalmente con la administración del segundo agente terapéutico para formar un tratamiento uniforme o no uniforme, mediante lo cual se administran una o más dosis del agente proapoptótico, seguido por una o más dosis del segundo agente activo, seguido por una o más dosis del agente proapoptótico; o se administran una o más dosis del segundo agente activo, seguido por una o más dosis del agente proapoptótico, seguido por una o más dosis del segundo agente activo; etc., todas según el programa seleccionado o deseado por el investigador o médico que administra la terapia. Puede administrarse una cantidad eficaz de cada uno de los agentes como una única dosificación unitaria (por ejemplo, como unidad de dosificación) o dosis por debajo de la terapéutica que se administran a lo largo de un intervalo finito de tiempo. Tales dosis unitarias pueden administrarse diariamente durante un periodo finito de tiempo, tal como hasta 3 días, o hasta 5 días, o hasta 7 días, o hasta 10 días, o hasta 15 días, o hasta 20 días, o hasta 25 días.

V. Kits

También se dan a conocer kits médicos. Los kits médicos pueden incluir, por ejemplo, un suministro de dosificación de un agente proapoptótico, preferiblemente un ligando o agonista para un receptor de TRAIL agonista, solo o en combinación con un segundo agente terapéutico. Cuando está en combinación con un segundo agentes terapéuticos, los agentes activos pueden suministrarse solos (por ejemplo, liofilizados) o en una composición farmacéutica (por ejemplo, una mezcla conjunta). Los agentes activos pueden estar en una dosificación unitaria o en un concentrado que debe diluirse antes de la administración. En algunas realizaciones, el kit incluye un suministro de portador farmacéuticamente aceptable. El kit también puede incluir dispositivos para la administración de los agentes activos o las composiciones, por ejemplo, jeringas. Los kits pueden incluir instrucciones impresas para administrar el compuesto en un uso tal como se describió anteriormente.

La presente invención se entenderá adicionalmente por referencia a los siguientes ejemplos no limitativos.

Ejemplos

Ejemplo 1: Expresión de TRAIL-R1/DR4 y TRAIL-R2/DR5 por células estrelladas pancreáticas (PSC) y células estrelladas hepáticas (HSC) primarias humanas activadas

Materiales y métodos

Células estrelladas primarias humanas

Se obtuvieron HSC, PSC y medio de células estrelladas (SteCM) primarias humanas de ScienCell Research Laboratories (Carlsbad, CA). Se cultivaron las células en medio SteCM complementado con el 2% de FBS, el 1% de complemento de crecimiento de células estrelladas y el 1% de disolución de penicilina/estreptomicina en placas recubiertas con poli-l-lisina. A continuación, para activar las células estrelladas primarias, se cultivaron las células en placas de cultivo de plástico de 6 pocillos durante 1, 4, 7 y 14 días y se recogieron. Se determinaron la expresión de DR-4, DR-5 y a -SMA en las células estrelladas cultivadas mediante análisis por inmunotransferencia de tipo Western y PCR en tiempo real.

RT-PCR en tiempo real cuantitativa comparativa

Se extrajo ARN total de las células cultivadas con el reactivo TRIzol (Life Technologies, Grand Island, NY) y se sometió a transcripción inversa para dar ADNc usando el sistema de transcripción inversa (Life Technologies, Grand Island, NY). Se realizó PCR en tiempo real cuantitativa comparativa por duplicado para cada muestra con un sistema de PCR en tiempo real StepOnePlus (Life Technologies, Grand Island, NY) usando la mezcla madre SYBR Green (Life Technologies, Grand Island, NY) según las instrucciones del fabricante. Se normalizaron los niveles de expresión de genes diana a la expresión de GAPDH y se calcularon basándose en el método comparativo de umbral de ciclo Ct (2'AACt). Se usaron cebadores de colágeno 1 y a -SMA, TGF-p, Timp-1, TRAILR1/DR-4 y TRAILR2/DR-5 para la PCR.

Análisis por inmunotransferencia de tipo Western

Se lavaron las células cultivadas tres veces con PBS helado y se recogieron en tampón de lisis frío con inhibidores de proteasa (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX). A continuación, se sometieron a sonicación las células y se centrifugaron, y se midió el sobrenadante para determinar la concentración de proteínas. Se usaron anticuerpos antia -SMA (Sigma Aldrich, St. Louis, MO), anti-TGF-p (Cell signaling, Beverly, MA), anti-DR-4 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX) y anti-DR-5 (Abcam, Cambridge, MA) como marcadores de células estrelladas activadas y fibrosis hepática. Se usó anticuerpo anti-PARP-1 escindida (Cell signaling) como marcador para la apoptosis. Se usó anticuerpo anti-p-actina (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) para el control de carga de proteínas.

Resultados

Las PSC y HSC primarias humanas se activan gradualmente desde el momento de la siembra en placa y expresan progresivamente DR4 y DR5. Para determinar la expresión génica de TRAIL-R1/DR4 y TRAIL-R2/DR5, se realizó PCR en tiempo real en las células cultivadas. La expresión génica de DR4 y DR5 aumentaron gradualmente junto con la activación de HSC y PSC. Se evaluó la expresión de ARNm usando PCR en tiempo real. Basándose en el análisis por PCR en tiempo real, a-SMA, un marcador de la activación de células estrelladas, colágeno 1, TGF-p y MMP-2, 9, 13 y Timp-1 se regularon por incremento en células estrelladas activadas tempranas (día 4) y completamente activadas (día 7 y 14), pero no se detectaron durante la fase de quiescencia de las células. Los niveles de proteínas de TRAIL-R1/DR4 y R2/DR5 confirmados mediante el análisis por inmunotransferencia de tipo Western también se indujeron en células estrelladas altamente activadas pero no en células quiescentes. De manera similar, alfaSMA (a-SMA) no se detectó el día 0 en células cultivadas pero se potenció considerablemente después de cultivar las células el día 4 y 7. Los controles de p-actina estaban igualmente presentes el día 0, 4 y 7. Se confirmó la expresión de DR5 y a-SMA durante la activación de HSC (datos no mostrados). Este resultado demuestra que las HSC y PSC inician la expresión de receptores de muerte o sobreexpresan los receptores de muerte existentes durante el proceso de activación.

Ejemplo 2: Las PSC y HSC primarias humanas activadas demuestran una sensibilidad potenciada a la apoptosis inducida por agonistas de TRAIL.

Materiales y métodos

Tinción por inmunofluorescencia de la apoptosis

Se sembraron las células en cubreobjetos de vidrio en placas de cultivo de 35 mm (MatTek corporation, Ashland, MA) y se hicieron crecer durante 1, 4, 7 y 14 días. A continuación, se trataron las células con o sin agonistas de TRAIL, incluyendo 1 microgramo/ml (|ig/ml) de TRAIL, PEG-TRAIL o 50 ng/ml de anticuerpo anti-DR5 (R&D systems, Minneapolis, MN) durante 3 horas en esos días. Se lavaron las células dos veces con PBS frío y se fijaron en paraformaldehído al 4% en PBS durante 10 minutos. Para la detección de la apoptosis, se usó el kit de detección de la apoptosis in situ TdT (TUNEL)-fluoresceína (R&D systems, Gaithersburg, MD) según la instrucción del fabricante. De forma breve, se incubaron las células con proteinasa K durante 15 minutos a temperatura ambiente, a continuación se lavaron dos veces con DW, se sumergieron con tampón de marcaje de TdT y después se incubaron con mezcla de reacción de marcaje de TdT a 37°C durante 1 hora. A continuación, se trataron las células con tampón de parada de TdT para detener la reacción de marcaje y se lavaron dos veces con DW. Finalmente, se añadió disolución de Step-Fluor y se incubaron las células durante 20 minutos a TA y se lavaron dos veces con PBS. Se aplicó el medio de montaje de fluorescencia con DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA) a las muestras. Se visualizaron las muestras bajo un microscopio de fluorescencia usando un filtro de 495 nm para la apoptosis y un filtro de 358 nm para DAPI.

Análisis por inmunotransferencia de tipo Western

Se lavaron las células cultivadas tres veces con PBS helado y se recogieron en tampón de lisis frío con inhibidores de proteasa (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX). A continuación, se sometieron a sonicación las células y se centrifugaron, y se midió el sobrenadante para determinar la concentración de proteínas. Se usó anticuerpo anti-PARP-1 escindida (Cell signaling) como marcador para la apoptosis. Se usó anticuerpo anti-p-actina (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) para el control de carga de proteínas.

Viabilidad celular (ensayo MTT)

Se sembraron HSC y PSC en una placa de fondo plano de 48 pocillos y se cultivaron 1, 4, 7 y 14 días. El día 1, 4, 7 y 14, se incubaron las células con TRAIL, PEG-TRAIL y anticuerpo agonista de TRAIL, un anticuerpo anti-DR5, durante 3 horas a 37°C. En los momentos indicados, se añadieron una concentración final de 5 |ig/ml de disolución de MTT a cada pocillo durante 1 h. Después de la retirada del medio, se añadieron 200 ml de DMSO a cada pocillo para disolver los cristales de formazano. Se determinó la absorbancia a 590 nm usando un lector de microplacas (Bio-Tek Instruments, Inc, Winooski, VT). Se sometieron a ensayo los pocillos por triplicado para cada condición. Resultados

Las PSC y HSC primarias humanas activadas demostraron una sensibilidad potenciada a la apoptosis inducida por TRAIL. Se incubaron las HSC y PSC con TRAIL, PEG-TRAIL y anticuerpo agonista de TRAIL, un anticuerpo anti-DR5, durante 3 horas después de 1, 4, 7 y 14 días de cultivo en medios, respectivamente. Las HSC y PSC altamente activadas (el día 7 y 14) son más susceptibles que las HSC y PSC menos activadas (el día 1 y 4) tal como se muestra por un aumento de la fluorescencia de TUNEL observado en células tratadas con TRAIL después de 7 y 14 días en comparación con células de control, así como en células apoptóticas, tomando imágenes directamente de las placas de cultivo celular con un microscopio de campo brillante (Nikon metrology, Brighton, MI). Además, los niveles de proteínas de PARP-1 escindida, un marcador de la apoptosis, se confirmaron mediante análisis por inmunotransferencia de tipo Western. Cuando los agonistas de TRAIL se trataron en HSC y PSC activadas el día 7 y 14, se observó claramente la expresión de PARP-1 escindida, un marcador de la apoptosis, como una evidencia de la apoptosis inducida por TRAIL en células estrelladas activadas.

Para analizar cuantitativamente las sensibilidades a TRAIL de las HSC y PSC activadas contra agonistas de TRAIL, la sensibilidad a TRAIL se expresó como muerte celular inducida (%), calculada como el porcentaje en relación con las células no tratadas, y medida mediante ensayos MTT tras incubaciones de 3 h. TRAIL, PEG-TRAIL y el anticuerpo agonista de TRAIL indujeron una fuerte apoptosis mediada por TRAIL en HSC y PSC activadas el día 7 y 14 (en el ejemplo 1 se muestra que están altamente activadas en esos puntos de tiempo), pero mostraron efectos marginales en células quiescentes el día 1. En las HSC, cuando se trataron los agonistas de TRAIL el día 7 y el día 14 de activación, TRAIL, PEG-TRAIL y el anticuerpo anti-DR5 indujeron un aumento de 4,5, 4,1, 4,4 veces y 7,5, 6,2, 5,2 veces de la muerte celular en comparación con las células tratadas el día 1 (figura 1). De manera similar, en las PSC, TRAIL, PEG-TRAIL y el anticuerpo anti-DR5 indujeron un aumento de 5,5, 4,7, 5 veces de la muerte celular desde el día 1 hasta el día 14. Estos resultados muestran claramente que las HSC y PSC activadas, originadores de enfermedades hepáticas y pancreáticas fibróticas, pueden seleccionarse como diana específicamente y eliminarse tratándolas con agonistas de TRAIL.

Ejemplo 3: El tratamiento con TRAIL previene la fibrosis hepática.

Materiales y métodos

Fibrosis hepática inducida por CCI4 en ratas (grupo 1)

Se dividieron ratas SD de 6-8 semanas de edad (Hanlim Experimental Animal Laboratory, Seúl, Corea) en 3 grupos (8-10 ratas por grupo); i) vehículo (aceite de oliva), ii) CCl4 al 20% en aceite de oliva y iii) CCl4 en aceite de oliva y TRAIL (grupo 1, figura 2). Se administraron a las ratas CCl4 (CCl4 al 20% en aceite de oliva, 2 ml/kg) tres veces por semana mediante inyección intraperitoneal o aceite de oliva como control durante 4 semanas mientras se trataban simultáneamente con 4 mg/kg de TRAIL administrado por vía intravenosa cada tres días o con la misma cantidad de solución salina para los grupos de control (grupo 1, figura 2).

Histología hepática e inmunohistoquímica de fibrosis hepática

Después del tratamiento, se sacrificaron los animales y se fijaron los tejidos hepáticos recogidos en formalina tamponada al 10%, se incrustaron en parafina, y se cortaron en secciones de 4 |i m de grosor. A continuación, se tiñeron las secciones con hematoxilina y eosina (H&E). Se realizó inmunohistoquímica con anticuerpo contra a -SMA (DakoCytomation, Carpinteria, CA) para detectar las HSC activadas. Se usó el kit Histostain-Plus (Life Technology) para todos los procedimientos de inmunohistoquímica. De forma breve, las secciones de hígado se desparafinizaron, se deshidrataron, se extinguieron en el 3% de disolución de peróxido de hidrógeno y se lavaron en portaobjetos. Se aplicaron los portaobjetos con disolución de bloqueo y se aplicaron secuencialmente a anticuerpo contra a -SMA primario y anticuerpo secundario biotinilado, seguido por un reactivo conjugado con enzima. Se revelaron los portaobjetos con secciones de hígado mediante 3,3'diaminobencidina (DAB) a través de un kit de cromógeno/sustrato (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Para la detección de la deposición de colágeno, se tiñeron las secciones de hígado con disolución de tinción de rojo sirio (Sigma, St. Louis, MO) y se lavaron en agua con ácido acético al 5%. Se visualizaron los tejidos hepáticos teñidos bajo microscopía óptica (Olympus America). Análisis por inmunofluorescencia de la apoptosis de HSC en hígado fibrótico

Se inmunotiñeron las secciones de hígado mediante anticuerpos primarios, anticuerpos contra a -SMA (DakoCytomation) y caspasa-3 (Cell signaling) y anticuerpos secundarios, anticuerpo anti-ratón-Alexa Fluor 488 y anticuerpo anti-conejo-Alexa Fluor 546, y se montaron con medio de montaje de fluorescencia con DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Se visualizaron las secciones bajo un microscopio de fluorescencia y se registraron imágenes.

Resultados

Los análisis por H&E e inmunohistoquímica de a -SMA y la tinción con rojo sirio (marcador de la deposición de colágeno) en los tejidos hepáticos del control, CCl4, CCl4 y TRAIL mostraron que el tratamiento con TRAIL previene e inhibe significativamente la fibrosis hepática. Los tejidos hepáticos de ratas tratadas con CCl4 sin TRAIL revelaron señales fuertes de a -SMA y rojo sirio, lo que indica signos de fibrogénesis en el hígado. En cambio, las ratas tratadas simultáneamente con CCl4 y TRAIL mostraron una reducción significativa de la fibrosis tal como se evidencia por a -SMA y colágeno reducidos en el hígado (datos no mostrados). Este resultado indica que los agonistas de TRAIL, al igual que TRAIL, previenen eficazmente la inducción de fibrosis hepática in vivo.

Para confirmar si tal efecto preventivo está inducido por la apoptosis inducida por TRAIL en HSC activadas, se realizaron análisis por inmunofluorescencia para a -SMA, caspasa-3 (marcador de la apoptosis) y DAPI (núcleo) en tejidos hepáticos de ratas tratadas con CCl4 y solución salina, CCl4 y TRAIL y grupos de control. Se detectó a -SMA (Alexa Fluor 488, verde) tanto en el grupo de CCl4 y solución salina como en el grupo tratado con CCl4 y TRAIL, mientras que no se detectó caspasa-3 (Alexa Fluor 546, rojo) en tejidos hepáticos normales tratados con TRAIL y tejidos hepáticos fibróticos tratados con CCI4. En cambio, cuando TRAIL se trató en tejidos hepáticos fibróticos, se observaron fuertes señales apoptóticas de caspasa-3. En particular, la caspasa-3 expresada se localiza conjuntamente con a-SMA, un marcador de HSC activadas, y se confirma que TRAIL induce específicamente la apoptosis en HSC activadas.

Ejemplo 4: El tratamiento con TRAIL pegilado revierte la fibrosis hepática.

Materiales y métodos

Fibrosis hepática inducida por CCI4 en ratas (grupo 2)

Se dividieron ratas SD de 6-8 semanas de edad (Hanlim Experimental Animal Laboratory) en 3 grupos (8-10 ratas por grupo); i) vehículo (aceite de oliva), ii) CCl4 al 20% en aceite de oliva y iii) CCl4 en aceite de oliva y PEG-TRAIL. Se administraron a las ratas CCl4 (2 ml/kg) tres veces por semana mediante inyección intraperitoneal o aceite de oliva como grupos de control durante 4 semanas. Después de la inducción de fibrosis hepática durante un total de 4 semanas, se trataron la rata con 4 mg/kg de PEG-TRAIL administrado por vía intravenosa cada dos días durante 2 semanas mientras continuaban las inyecciones de CCl4 o aceite de oliva (grupo 2, figura 2).

Análisis por inmunotransferencia de tipo Western

Se colocó el tejido hepático ultracongelado en un mortero de porcelana y se molieron y trituraron hasta obtener un polvo fino mientras todavía estaba a la temperatura del nitrógeno líquido. A continuación, se sometió a lisis el polvo fino con sonicación de forma breve en tampón PBS helado (PMSF 1 mM y 1 |ig/ml de cada uno de aprotinina, leupeptina y pepstatina A). Se aclararon los lisados celulares mediante centrifugación con 14.000 rpm a 4°C. Se midió la concentración de la proteína mediante disolución de Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA). Se redisolvió la misma cantidad de proteína mediante SDS-PAGE y se transfirieron las proteínas en los geles a nitrocelulosa (Bio-Rad, Hercules, CA) usando un secante semiseco (Bio-Rad). Se bloqueó la membrana con BSA al 3% en TBST (Tris-Cl 10 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, Tween-20 al 0,5%) y se incubó durante la noche a 4°C con anticuerpos primarios. Se usaron anticuerpo anti-DR4 (Abcam, Cambridge, MA), anticuerpo anti-DR5 (Abcam), anticuerpo anti-caspasa-8 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA), anticuerpo anti-PARP-1 escindida (Cell Signaling Technology), anticuerpo anti-caspasa-3 escindida (Cell Signaling Technology), anticuerpo anti-caspasa-9 escindida (Cell Signaling Technology), anticuerpo anti-alfa-SMA (Sigma), anticuerpo anti-MMp-2 (Santa Cruz Biotechnology), anticuerpo anti­ colágeno 1 (Cell Signaling Technology), anticuerpo anti-TGF-p (Abcam), anticuerpo anti-TIMP-1 (Millipore, Billerica, Ma), anticuerpo anti-PDGFR-p (Santa Cruz Biotechnology), anticuerpo anti-GAPDH (Santa Cruz Biotechnology) y anticuerpo anti-p-actina (Santa Cruz Biotechnology) en el análisis por inmunotransferencia de tipo Western. Se visualizaron las inmunotransferencias mediante un método de quimioluminiscencia potenciada.

PCR en tiempo real cuantitativa (qPCR)

Se extrajo ARN total de las células cultivadas y tejidos hepáticos de las ratas con el reactivo TRIzol (Life Technologies, Grand Island, NY) siguiendo la instrucción proporcionada por la empresa. Se midió espectrofotométricamente la concentración de ARN usando un dispositivo NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Se sometieron a transcripción inversa 1-2 |ig de ARN total para dar ADNc usando el sistema de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (Life Technologies). Se realizó qPCR por duplicado o triplicado para cada muestra usando mezcla madre SYBR Green rápida (Life Technologies) y el sistema de PCR en tiempo real StepOnePlus (Life Technologies). Se normalizaron los niveles de expresión de genes diana a la expresión de GAPDH y se calcularon basándose en el método comparativo de umbral de ciclo Ct (2'AACt). Se realizó qPCR para las muestras de hígado de rata usando el conjunto de cebadores para qPCR RT2 (Qiagen, Valencia, CA); Colla2 (PPR56530A), Acta2 (PPR59337B), Mmp3 (PPR48487B), Col3a1 (PPR43017A), Mmp9 (PPR44728C), Mmp13 (PPR45162A), Timp1 (PPR48051C), Timp3 (PPR06533A), Gapdh (PPR06557B), Tgfb1 (PPR06430B), Tgfb3 (PPR06467C), Tgfbr2 (PPR06488E) y Bmp7 (p Pr46571A) (ensayo ¡ de cebadores para qPCR RT2, SABiosciences, Quiagen).

Análisis de otros biomarcadores

Se midió el ensayo de hidroxiprolina, un elaborador de la deposición de colágeo en el hígado, usando tejidos hepáticos mediante un kit de ensayo de hidroxiprolina (Sigma, MAK008-1KT) según las instrucciones del fabricante. Se extrajo sangre de las ratas mediante punción cardiaca, se mantuvo a temperatura ambiente durante 2 h y se centrifugó a 3000 rpm durante 20 min. Las pruebas de rutina para determinar la función hepática analizadas en suero incluyeron alanina aminotransferasa (ALT), aspartato aminotransferasa (AST), proteína total, albúmina, fosfatasa alcalina (ALP) bilirrubina total y bilirrubina directa.

Histología hepática e inmunohistoquímica de fibrosis hepática

Se fijaron los tejidos hepáticos en formalina tamponada al 10%, se incrustaron en parafina, y se cortaron en secciones de 4 |im de grosor. A continuación, se tiñeron las secciones con hematoxilina y eosina (H&E) e inmunohistoquímica. La tinción por inmunohistoquímica realizada incluyó a-SMA (DakoCytomation, Carpinteria, CA) para detectar la activación de HSC y tinción con rojo de sirio para detectar la deposición de colágeno. Se obtuvieron imágenes de los tejidos hepáticos teñidos bajo microscopía óptica (Olympus America) y se cuantificó el área positiva para a -SMA o rojo sirio en 20 campos de cada muestra usando el software ImageJ (NIH). Para la detección de la apoptosis, se usó TUNEL-fluoresceína (R&D systems, Gaithersburg, MD) según la instrucción del fabricante en las secciones de hígado tal como se describió anteriormente.

Resultados

El análisis por inmunotransferencia de tipo Western mostró que TRAIL-R (receptor de TRAIL en ratas) se regulaba por incremento tanto en grupos tratados con CCl4 como tratados con CCl4 combinado con PEG-TRAIL; sin embargo, la expresión de los marcadores fibróticos, PAI-1 y alfa-SMA (a-SMA), se redujeron significativamente en el grupo de PEG-TRAIL en comparación con los grupos de CCl4 y de control (figura 3). Los análisis por inmunohistoquímica de alfa-SMA y rojo sirio demostraron que las ratas tratadas con PEG-TRAIL mostraron una reducción significativa de la fibrosis en comparación con las ratas tratadas con CCl4 sin PEG-TRAIL (p < 0,05). Se cuantificaron las imágenes analizadas como el área positiva (%) por campo (figuras 4A y 4B). Para validar si la reducción de alfa-SMA (a -SMA) y colágeno se debe a la apoptosis inducida por TRAIL en HSC activadas, se analizaron los tejidos hepáticos mediante ensayo TUNEL. Las células positivas para TUNEL se detectaron considerablemente sólo en el grupo de CCl4 y de PEG-TRAIL combinados, pero no se detectaron en otros grupos de control, grupos tratados con aceite de oliva, solución salina y CCl4. La qPCR del ARNm obtenido a partir de tejidos hepáticos tratados con PEG-TRAIL reveló una reducción obvia de múltiples genes relacionados con la fibrosis altamente regulados por incremento asociados con las HSC activadas, incluyendo TRAIL-R, a -SMA, colágeno 1, colágeno 3, TGF-P1, MMP-2, MMP-3, PDGFR, TIMP-1, TIMP-3 y BMP-7 (p<0,05 frente a grupo de CCl4 no tratado con PEG-TRAIL-). Los análisis por inmunotransferencia de tipo Western confirmaron niveles de expresión disminuidos de estos genes a los niveles de proteína en el grupo tratado con PEG-TRAIL.

Además, los niveles de hidroxiprolina fueron más bajos en el grupo tratado con PEG-TRAIL con respecto al grupo no tratado, y estos resultados fueron consistentes con los niveles más bajos de la razón de peso de hígado-peso corporal (LW/BW), fosfatasa alcalina y bilirrubina total (p<0,05 frente a grupo de CCl4 no tratado con PEG-TRAIL). En general, estos resultados in vivo demuestran claramente que la fibrogénesis hepática puede revertirse y/o inhibirse eliminando las HSC activadas y reduciendo simultáneamente las múltiples moléculas asociadas con la fibrosis mediante el tratamiento de los hígados fibróticos con TRAIL y sus agonistas.

Ejemplo 5: El tratamiento con TRAIL pegilado mejora la cirrosis hepática y reduce la incidencia y el volumen de ascitis.

Materiales y métodos

Cirrosis hepática inducida por CCI4 en ratas (grupo 3)

Se dividieron ratas SD de 6-8 semanas de edad (Hanlim Experimental Animal Laboratory) en 3 grupos (8-10 ratas por grupo); i) vehículo (aceite de oliva), ii) CCl4 al 20% en aceite de oliva y iii) CCl4 en aceite de oliva y PEG-TRAIL. En primer lugar se administraron a las ratas CCl4 (2 ml/kg) tres veces por semana mediante inyección intraperitoneal o aceite de oliva como grupos de control durante 8 semanas. En el punto de tiempo de 8 semanas, se trataron las ratas con 4 mg/kg de PEG-TRAIL administrado por vía intravenosa cada dos días durante 2 semanas o se trataron con la misma cantidad de solución salina para los grupos de control, junto con la continuación del tratamiento con CCl4 o aceite de oliva (grupo 3, figura 2).

Análisis por inmunotransferencia de tipo Western y qPCR

Se analizaron los patrones de regulación de TRAIL-R, a -SMA y las moléculas asociadas con la fibrosis enumeradas anteriormente en tejidos hepáticos aislados a niveles de proteína y ARNm mediante inmunotransferencia de tipo Western y qPCR tal como se describió anteriormente.

Histología hepática e inmunohistoquímica de fibrosis hepática

Se fijaron los tejidos hepáticos en formalina tamponada al 10%, se incrustaron en parafina, y se cortaron en secciones de 4 |i m de grosor. A continuación, se tiñeron las secciones con hematoxilina y eosina (H&E) e inmunohistoquímica. La tinción por inmunohistoquímica incluyó a -SMA (DakoCytomation, Carpinteria, CA) para detectar la activación de HSC y tinción con rojo sirio para detectar la deposición de colágeno. Se obtuvieron imágenes de los tejidos hepáticos teñidos bajo microscopía óptica (Olympus America) y se cuantificaron las áreas positivas para a -SMA o rojo sirio en 20 campos de cada muestra usando el software ImageJ (NIH).

Recogida y medición del líquido ascítico

Cuando se produjo ascitis durante el tratamiento, se sacrificaron las ratas y se recogió el líquido ascítico mediante una jeringa esterilizada del peritoneo de las ratas. Se midió el volumen, el recuento de célula, la proteína total y las concentraciones de albúmina del líquido ascítico para determinar el gradiente de albúmina en suero-ascitis (SAAG) que se ha demostrado en estudios prospectivos para clasificar la ascitis.

Resultados

Después de 10 semanas de tratamiento con CCI4 solo, todas las ratas mostraron cirrosis hepática micronodular con signos discretos de inflamación. Se halló ascitis en seis ratas con un volumen que oscilaba entre 4 y 65 ml. Los hígados aislados mostrar daños morfológicos evidentes. Se hallaron signos fuertes de deposición de colágeno de los tejidos hepáticos mediante tinción con rojo sirio en comparación con ratas tratadas con CCl4 durante sólo 6 semanas. En cambio, las ratas tratadas con CCl4 y PEG-TRAIL mostraron hígados morfológicamente normales en comparación con las ratas tratadas con CCl4 solo. Además, los tejidos hepáticos tratados con PEG-TRAIL mostraron claramente una tendencia de marcadores fibróticos más baja, concretamente a -SMA y colágeno, tal como se reveló mediante inmunohistoquímica. Además, el tratamiento con PEG-TRAIL aumentó los niveles de proteína total y albúmina en suero, mientras que redujo significativamente los niveles de bilirrubina e hidroxprolina en los tejidos hepáticos en comparación con las ratas tratadas con CCl4 con PEG-TRAIL (p<0,05 frente a grupo de CCl4 no tratado con PEG-TRAIL). Tal como se demuestra en modelos de fibrosis hepática, el tratamiento con PEG-TRAIL reguló por disminución sustancialmente las moléculas asociadas con la fibrogénesis a niveles de proteína y ARNm. Los cambios en veces relativos del grupo tratado con PEG-TRAIL en múltiples expresiones, incluyendo TRAIL-R, a ­ SMA, colágeno 1, colágeno 3, TGF-P1, MMP-2, MMP-3, PDGFR, TIMP-1 y TIMP-3, fueron significativamente más bajos que en los grupos de CCl4 no tratados con PEG-TRAIL (p<0,05 frente a grupo no tratado con PEG-TRAIL). La ascitis es una de las principales complicaciones en la cirrosis. El 60% (6 de cada 10) de las ratas tratadas con CCl4 durante 8-10 semanas desarrollaron ascitis. En cambio, las ratas tratadas con CCl4 con PEG-TRAIL demostraron una tasa de incidencia reducida de ascitis de tan solo el 30% (3 de cada 10). En particular, el volumen de líquido ascítico se redujo significativamente en el grupo tratado con PEG-TRAIL en comparación con el grupo de CCl4 sin PEG-TRAIL (figura 5). En conjunto, el tratamiento de PEG-TRAIL revierte e inhibe la progresión de la cirrosis a la vez que reduce la incidencia de ascitis en ratas con enfermedades hepáticas cirróticas.

Ejemplo 6: El tratamiento con TRAIL pegilado revierte la fibrosis pancreática en modelos de rata de pancreatitis crónica inducida por alcohol.

Materiales y métodos

Pancreatitis crónica (PC) inducida por etanol/ceruleína/dieta líquida LD en ratas

Se dividieron ratas SD de 6-8 semanas de edad (Hanlim Experimental Animal Laboratory) en 3 grupos (8-10 ratas por grupo); i) vehículo (PBS), ii) ratas con PC tratadas con vehículo iii) ratas con PC tratadas con TRAIL. Se indujo un modelo de PC inducida por alcohol experimental en ratas tal como se notificó en otra parte (Deng, X., et at., Am. J. Pathol. 166(1):93-106 (2005)). Se alimentaron los 3 grupos de ratas con una dieta líquida LD con concentraciones de etanol aumentadas gradualmente desde el 0 hasta el 36% durante siete días y después se alimentaron con etanol al 36% durante tres semanas. Se administraron a las ratas por vía intraperitoneal 20 microgramos/kg (|i g/kg) de ceruleína (Sigma) para cuatro inyecciones por hora una vez por semana hasta el día 28. Se trataron las ratas por vía intravenosa con PEG-TRAIL (4 mg/kg) o PBS diariamente durante seis días desde el día 23 hasta el 28. El grupo de control se trató con PBS. Después de los tratamientos, se analizaron muestras de páncreas mediante inmunohistoquímica e inmunotransferencia de tipo Western. Se tiñeron los tejidos pancreáticos con H&E y tinción tricrómica de Masson (colágeno) y se analizaron para determinar la regulación de los biomarcadores, incluyendo a ­ SMA, PDGFRp, caspasa-8 escindida y COX-2.

Resultados

En modelos de PC, se observó claramente fibrogénesis pancreática mediante tinción con H&E y colágeno altamente expresado. Además, se regularon por incremento significativamente a -SMA (marcador de PSC activadas) y los marcadores fibrógenos tales como PDGFRp (6 veces y 4 veces frente a vehículo, respectivamente, p<0,05) (figura 6). El tratamiento con PEG-TRAIL redujo significativamente las deposiciones de colágeno, reguló por disminución a ­ SMA y PDGFp (1 vez y 2 veces frente a vehículo, respectivamente), así como otros marcadores inflamatorios, incluyendo COX-2, tal como se evidencia mediante análisis por inmunotransferencia de tipo Western (p<0,05 frente a grupo con PC no tratado con PEG-TRAIL). La caspasa-8 escindida se reguló por incremento significativamente (13 veces frente a vehículo, p<0,05) sólo en PC tratada con PEG-TRAIL, lo que indica que la erradicación de PSC activadas se debe a la apoptosis mediada por TRAIL.

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Agonista del receptor ligando inductor de la apoptosis relacionado con TNF (TRAIL)-R1/DR4 o TRAIL-R2/DR5 proapoptótico en una cantidad eficaz para su uso en un método para aliviar uno o más síntomas de enfermedad fibrótica en un sujeto, en el que el agonista del receptor TRAIL-R1/DR4 o TRAIL-R2/DR5 se selecciona del grupo que consiste en: TRAIL de longitud completa que comprende los aminoácidos 1 a 281 de SEQ ID NO: 1, TRAIL de longitud completa que comprende los aminoácidos 1 a 281 de SEQ ID NO: 1 pegilado en el extremo N-terminal, fragmentos funcionales de TRAIL que comprenden al menos los aminoácidos 114 a 281 de SEQ ID NO: 1 y fragmentos funcionales de TRAIL que comprenden al menos los aminoácidos 114 a 281 de SEQ ID NO: 1 pegilados en el extremo N-terminal;

e induce la apoptosis en células estrelladas hepáticas, células estrelladas pancreáticas, miofibroblastos activados, células endoteliales activadas o células epiteliales activadas que producen o inducen una cantidad en exceso de matriz extracelular que da como resultado fibrosis de un órgano o tejido, o cirrosis.

2. Agonista del receptor TRAIL-R1/DR4 o TRAIL-R2/DR5 para su uso según la reivindicación 1, en el que la enfermedad fibrótica es cirrosis del hígado, o fibrosis del páncreas, de los pulmones o de la piel.

3. Agonista del receptor TRAIL-R1/DR4 o TRAIL-R2/DR5 para su uso según una cualquiera de la reivindicación 1 ó 2, en el que el agonista del receptor TRAIL-R1/DR4 o TRAIL-R2/DR5 se incorpora en o encapsula por nanopartículas, micropartículas, micelas, liposomas, partículas de lipoproteínas sintéticas o nanotubos de carbono, un gel o una suspensión, o recubrimientos que tienen el agonista del receptor TRAIL-R1/DR4 o TRAIL-R2/DR5 unido a los mismos o incorporado en los mismos, o dispositivos en los que el agonista del receptor TRAIL-R1/DR4 o TRAIL-R2/DR5 está unido covalentemente a o asociado con la superficie del dispositivo, mezclado con o aplicado debajo de un recubrimiento polimérico en la superficie, o aplicado físicamente al dispositivo en el momento de la implantación.

4. Agonista del receptor TRAIL-R1/DR4 o TRAIL-R2/DR5 para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el agonista del receptor TRAIL-R1/DR4 o TRAIL-R2/DR5 se formula para liberación retardada, sostenida o modificada.

5. Agonista del receptor TRAIL-R1/DR4 o TRAIL-R2/DR5 para su uso según la reivindicación 1-3, en el que el agonista del receptor TRAIL-R1/DR4 o TRAIL-R2/d R5 es TRAIL pegilado que comprende un TRAIL trimérico que comprende motivos de cremallera de aminoácidos que favorecen la formación del trímero en los extremos N-terminales del mismo; y un polietilenglicol (PEG) o un derivado del mismo, en el que el PEG está unido al extremo N-terminal de un monómero del TRAIL trimérico.

6. Agonista del receptor TRAIL-R1/DR4 o TRAIL-R2/DR5 para su uso según la reivindicación 5, en el que el

PEG o el derivado del mismo tiene forma trimérica lineal o ramificada.

7. Agonista del receptor TRAIL-R1/DR4 o TRAIL-R2/DR5 para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6, en el que el PEG o el derivado del mismo se selecciona del grupo que consiste en succinimidilpropionato de metoxipolietilenglicol, N-hidroxisuccinimida de metoxipolietilenglicol, aldehído de metoxipolietilenglicol, maleimida de metoxipolietilenglicol y polietilenglicol de ramificación múltiple.

8. Agonista del receptor TRAIL-R1/DR4 o TRAIL-R2/DR5 para su uso según la reivindicación 7, en el que el

PEG o el derivado del mismo es aldehído de metoxipolietilenglicol.

9. Agonista del receptor TRAIL-R1/DR4 o TRAIL-R2/DR5 para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 5-8, en el que el PEG o el derivado del mismo tiene un peso molecular de entre 1.000 y 100.000 o un peso molecular de entre 5.000 y 50.000.

10. Agonista del receptor TRAIL-R1/DR4 o TRAIL-R2/DR5 para su uso según la reivindicación 1, en el que la cantidad eficaz se administra antes de la cirugía, o en el momento de o inmediatamente después de la cirugía.

11. Agonista del receptor TRAIL-R1/DR4 o TRAIL-R2/DR5 para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que la cantidad eficaz del agonista de TRAIL-R1/DR4 o TRAIL-R2/DR5 se administra en una o más dosificaciones.

12. Agonista del receptor TRAIL-R1/DR4 o TRAIL-R2/DR5 para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, que comprende además administrar agentes activos además del agonista del receptor TRAIL-R1/DR4 o TRAIL-R2/DR5.

13. Unidad de dosificación que comprende un agonista del receptor TRAIL-R1/DR4 o TRAIL-R2/DR5 según la reivindicación 1, para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-12.

14. Unidad de dosificación para su uso según la reivindicación 13, formulada en una cantidad eficaz para el tratamiento de enfermedad hepática o pancreática, fibrosis pulmonar o fibrosis de la piel.