JP2013240326A - 癌および皮膚病変の処置のためのグリコシルホスファチジルイノシトール(gpi)アンカーに連結されたメタロプロテイナーゼの組織インヒビター - Google Patents
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Abstract
【解決手段】メタロプロテイナーゼの組織インヒビター(TIMP)またはその生物活性断片のアミノ酸配列を含む融合構築物であって、該TIMPまたはその生物活性断片が、後にグリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカーが続くムチンドメインに連結されている、融合構築物。前記融合構築物を癌の処理に投与する。
【効果】GPIアンカー型TIMPタンパク質は、腫瘍細胞の表面膜へ組み入れられ、腫瘍細胞をFAS誘導性アポトーシスに対して感受性にする。さらに、本融合構築物は、創傷治癒適用に有用な効果的薬剤である。1つの態様において、TIMPは、細胞提示を増強するために、後にGPIが続くムチンに連結される。TIMPを連結するためのGPIの使用は、結果として生じる融合タンパク質を、癌、特に、個体における原発腫瘍の不完全な外科切除後の任意の残存癌の治療のための抗癌剤として、特に有用にする。
【選択図】なし
【効果】GPIアンカー型TIMPタンパク質は、腫瘍細胞の表面膜へ組み入れられ、腫瘍細胞をFAS誘導性アポトーシスに対して感受性にする。さらに、本融合構築物は、創傷治癒適用に有用な効果的薬剤である。1つの態様において、TIMPは、細胞提示を増強するために、後にGPIが続くムチンに連結される。TIMPを連結するためのGPIの使用は、結果として生じる融合タンパク質を、癌、特に、個体における原発腫瘍の不完全な外科切除後の任意の残存癌の治療のための抗癌剤として、特に有用にする。
【選択図】なし
Description
発明の分野
本発明は、融合構築物、癌の処置のための当該融合構築物の使用、および再生医療における当該融合構築物の使用の分野に関する。具体的には、本発明は、グリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカー型メタロプロテイナーゼの組織インヒビター(TIMP)を含む構築物に関する。加えて、本発明の融合構築物は、創傷治癒適用の分野において有用な効果的再生剤である。
本発明は、融合構築物、癌の処置のための当該融合構築物の使用、および再生医療における当該融合構築物の使用の分野に関する。具体的には、本発明は、グリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカー型メタロプロテイナーゼの組織インヒビター(TIMP)を含む構築物に関する。加えて、本発明の融合構築物は、創傷治癒適用の分野において有用な効果的再生剤である。
発明の背景
癌研究におけるTIMP
癌の治療は困難な課題のままであり、異なる治療的アプローチおよびストラテジーを用いて、様々な成功度合いを示している。1つの公知のアプローチは、癌細胞の免疫媒介性溶解に対する感受性を増加させることである。腫瘍の免疫媒介性溶解に対する感受性は、マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)の生物学、および特に、腫瘍標的細胞によるMMPの細胞表面発現に結びつけられている。マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)は、細胞外マトリックス(ECM)の成分を分解し、組織リモデリング、組織浸潤、および転移に関与している(Egeblad & Werb, 2002; Itoh & Nagase, 2002)。MMP活性はまた、パーフォリン/グランザイム媒介性およびFAS媒介性アポトーシスの両方の効率に関連している(Egeblad & Werb, 2002に概説されている)。MMP活性が、4種の内因性インヒビター、すなわちマトリックスメタロプロテイナーゼの組織インヒビター(TIMP−1、TIMP−2、TIMP−3、およびTIMP−4(Bode & Maskos, 2003))を含む多くのレベルで制御されることが示された。MMPとTIMPの間のインビボのバランスが、マトリックス再吸収とマトリックス沈着のいずれが起こるかを決定する(Nagase & Woessner, 1999)。
癌研究におけるTIMP
癌の治療は困難な課題のままであり、異なる治療的アプローチおよびストラテジーを用いて、様々な成功度合いを示している。1つの公知のアプローチは、癌細胞の免疫媒介性溶解に対する感受性を増加させることである。腫瘍の免疫媒介性溶解に対する感受性は、マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)の生物学、および特に、腫瘍標的細胞によるMMPの細胞表面発現に結びつけられている。マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)は、細胞外マトリックス(ECM)の成分を分解し、組織リモデリング、組織浸潤、および転移に関与している(Egeblad & Werb, 2002; Itoh & Nagase, 2002)。MMP活性はまた、パーフォリン/グランザイム媒介性およびFAS媒介性アポトーシスの両方の効率に関連している(Egeblad & Werb, 2002に概説されている)。MMP活性が、4種の内因性インヒビター、すなわちマトリックスメタロプロテイナーゼの組織インヒビター(TIMP−1、TIMP−2、TIMP−3、およびTIMP−4(Bode & Maskos, 2003))を含む多くのレベルで制御されることが示された。MMPとTIMPの間のインビボのバランスが、マトリックス再吸収とマトリックス沈着のいずれが起こるかを決定する(Nagase & Woessner, 1999)。
内因性メタロプロテイナーゼの組織インヒビター(TIMP)は、腫瘍増殖、転移、およびアポトーシスの緩和を含む多様な生理学的/生物学的機能を示す。TIMPのこれらの多様な生物活性は、TIMP/MMP/細胞表面タンパク質相互作用の化学量論に一部結びつけられている。細胞傷害性リンパ球の補充は、腫瘍に対する防御における1つの潜在的経路を表す。腫瘍細胞に浸潤し、認識する細胞傷害性Tリンパ球(CTL)およびナチュラルキラー(NK)細胞が同定されているが、効果的な抗腫瘍免疫は、しばしば、効率的には発生しない。この無効力が、疾患の進行期あるいは局所的手術不能による不完全な外科切除後の残存腫瘍細胞の完全排除を妨げる1つの理由である。細胞傷害性リンパ球におけるこの機能的欠損の原因は現在、明らかではない。
一般に、CTLおよびNK細胞の抗腫瘍効果は、パーフォリン/グランザイム媒介性またはFAS媒介性(CD95/CSD95L)アポトーシス経路のいずれかを通して媒介される(Kagi et al., 1994)。パーフォリン経路は、標的細胞のCTLまたはNK認識中に分泌される細胞毒により媒介される(Kagi et al., 1994)。CD95、またはFASデスレセプターは、タンパク質の細胞死ファミリーの制御因子に属し、腫瘍細胞の免疫媒介性アポトーシスにおいて中心的な重要性をもつ(Nagata, 1999)。ヒトFAS/CD95/Apo−1は、1回膜貫通糖タンパク質受容体(325アミノ酸、45〜48kDa)である。FASリガンド(FASリガンド、FASL、CD95L)は、複合的な膜タンパク質であり、II型膜貫通糖タンパク質である。FASLは、TNFα、リンフォトキシン(LT)のα鎖およびβ鎖、CD40リガンド、ならびにCD30リガンドを含むTNFファミリーのメンバーである。FASの作用は、FADD(FAS関連デスドメイン)/MORT1(そのC末端にデスドメインを有し、FASの細胞質デスドメインに結合するアダプタータンパク質)を介して媒介される。多くの腫瘍は、FAS経路を通して媒介されるアポトーシスに抵抗性であることが見出されている(Frost et al., 2003;Igney & Krammer, 2002に概説されている)。
本発明のTIMP−GPI構築物を試験するためのモデル系として、腎細胞癌の細胞系が例として用いられている。腎細胞癌(RCC)は、癌の主要原因の第7位である。RCCを有する患者の約3分の1が診察時に転移性疾患に罹っており、最高50%まで腎摘出術後、再発する(Vogelzang & Stadler, 1998)。RCCは治療が難しく、インターフェロン−αおよびインターロイキン−2のような免疫学的治療が、一般的に、化学療法または放射線療法より効果的である(Vogelzang & Stadler, 1998)。細胞傷害性リンパ球は、RCCを含む腫瘍に対する防御における潜在的成分を代表する。
TIMPファミリーの1つのメンバーであるTIMP−1は、幅広く作用するMMPインヒビターである(Bode & Maskos, 2003)。それは、表面結合タンパク質との会合を通してのみ細胞表面上に検出されうる可溶性タンパク質である(Brew et al., 2000; Klier et al., 2001)。癌生物学におけるTIMP−1の全体的役割は、依然として矛盾した報告の主題である(Brand, 2002)。現在までのところ、TIMP−1が、血管新生、細胞遊走、および増殖に役割を果たすことが認められている(Brand, 2002)。最近、GPIアンカー型TIMP−1タンパク質がbFGFに応答して内皮細胞遊走を顕著に抑制することが示された(Djafarzaden R et al., 2004)。
癌治療のための通常のストラテジーおよびアプローチは、いったん腫瘍が発生するとその腫瘍細胞は排除が難しいという問題に未だ悩まされている。原発腫瘍は、通常、手術により患者から除去される。しかしながら、場合によっては、すべての領域に外科医が応じられるとは限らず、従って、腫瘍細胞は身体に残存し、そこでそれらは二次腫瘍へ発展しうる。これは、原発腫瘍の不完全な外科切除の結果である。
そこで、本発明は、個体において、特に、原発腫瘍の不完全な外科切除を受けた患者において、腫瘍細胞の増殖を低下または緩和するための効果的な抗癌剤およびストラテジーを提供する。本発明の抗癌剤は、インビトロでの細胞系およびインビボでの組織の両方において腫瘍細胞を死滅させるのに有用である。
再生医療におけるTIMPの役割
本発明は、さらに、再生医療の分野において有用である。再生医療の分野における1つの重要な領域は、創傷治癒過程に関係している。創傷治癒は、組織傷害に対する自然の回復応答に関し、最終的に傷害組織の再表面形成、再構成、および抗張力の回復を生じる細胞的事象の複雑なカスケードを含む。この過程は、一般的に、異なる細胞型の補充および増殖、細胞マトリックスの同化、ならびに免疫監視の増加に関与する。
本発明は、さらに、再生医療の分野において有用である。再生医療の分野における1つの重要な領域は、創傷治癒過程に関係している。創傷治癒は、組織傷害に対する自然の回復応答に関し、最終的に傷害組織の再表面形成、再構成、および抗張力の回復を生じる細胞的事象の複雑なカスケードを含む。この過程は、一般的に、異なる細胞型の補充および増殖、細胞マトリックスの同化、ならびに免疫監視の増加に関与する。
創傷治癒は、適時かつ連続的な様式で進行し、4つの一般的な段階、すなわち、炎症、肉芽形成、再上皮化、および組織リモデリング、に分けることができる。創傷治癒過程の各段階は、特別のシグナル伝達経路により制御される。創傷治癒の間、増殖因子およびサイトカインの発現が増加し、特に、TNF、IL−1、およびIL−6のレベルが増加することが報告されている。最初の炎症段階はエフェクタータンパク質IL−1、TNF−α、およびCSFが関与するものであり、この段階でマクロファージと好中球の両方が補充され、フィブリン塊が形成される。肉芽形成段階では、線維芽細胞が、増殖し、創傷へ遊走し、そしてECMを分泌する。この後者の段階に関与するエフェクタータンパク質としては、MMP、PDGF、FGF、EGF、およびVEGFが挙げられる。創傷治癒における第三の段階である再上皮化は、創傷へ遊走するケラチノサイトの増殖によって特徴付けられ、また、創傷収縮の原因である筋線維芽細胞の増加によっても特徴付けられる。この段階はエフェクタータンパク質MMP、KGF、TGF、GM−CSF、EGF、uPAおよびtPAが関与するものであり、結果として、創傷表面の再上皮化、乾燥痂皮の解離、およびバリアの形成が生じる。最後の組織リモデリング段階では、線維芽細胞が、瘢痕組織の形成、線維芽細胞のアポトーシス、およびケラチノサイトの活性化から分化への切り換えへ導くコラーゲン性マトリックスを産生する。この最後の段階に関与する既知のエフェクタータンパク質としては、TGF−b1、MMP、およびTIMPが挙げられる。
従って、創傷治癒のほとんどの局面に関与するエフェクター細胞は線維芽細胞とケラチノサイトであり、瘢痕形成に加えて線維芽細胞(MMP−1、−2、−3、および−13)とケラチノサイト(MMP−1、−2、−3、および−10)の両方の遊走に重要な役割を果たすMMP(Singer & Clark, 1999)も関与する。MMPのそれぞれは、ECM内において異なる基質特異性を有し、ECM分解およびターンオーバーに重要な役割を果たす。MMPファミリーには、とりわけ、コラゲナーゼ(MMP−1、MMP−8、MMP−13、MMP−18)、ストロメライシン(MMP−3、MMP−10、MMP−11)、ゼラチナーゼ(MMP−2、MMP−9)、マトリライシン(MMP−7)、メタロエラスターゼ(MMP−12)、および一連の膜結合型マトリックスメタロプロテイナーゼ(MT−MMP)が含まれる。MMPの機能は、周囲のECMをタンパク分解的に破壊することであるため、創傷治癒、すなわち傷害組織の再構築中の当該プロテアーゼ活性とECM沈着との間のバランスは、最適に維持されることが必要である。MMP活性の制御はTIMPタンパク質により調節されるが、それらはたいていの細胞により産生され、1:1の比でMMPを阻害するように作用する。タンパク分解的な破壊とECM沈着との間のこの繊細なバランスが妨害される場合、異常な創傷治癒のような障害、例えば、慢性創傷、過剰瘢痕化、またはケロイド瘢痕化、が結果として生じうる。
それゆえに、創傷治癒過程中、プロテアーゼ活性とECM沈着との間の生理学的バランスを制御する、または生理学的バランスに影響を及ぼす必要性が存在する。
さらなる態様において、本発明の融合構築物は、増加したMMPレベルと一般に関連している、例えばケロイド瘢痕化または慢性創傷における、MMPプロテアーゼ活性とECM沈着との間のバランスの妨害により定義される状態の処置に効果的な再生剤を提供する。加えて、本発明の融合構築物は、創傷治癒過程中の瘢痕の形成を低下、最小化、または阻害するのに効果的な再生剤を提供する。
発明の概要
本発明は、新規な抗腫瘍剤および癌の処置のための方法を提供する。
本発明は、新規な抗腫瘍剤および癌の処置のための方法を提供する。
本発明は、GPIアンカー型TIMPが、効果的に癌細胞増殖を低下または緩和する、ならびに、インビトロとインビボの両方の細胞系における癌細胞の死滅を促進する、という驚くべき知見に基づいている。極めて効果的な化学療法剤を生み出すために、TIMPの構造的および機能的決定基とグリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカーとを(および任意でムチンとを)結合した。このアプローチでは、精製されて癌細胞に加えられた場合に表面膜に組み入れられる、グリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)にアンカーされた(繋ぎとめられた)TIMPタンパク質を利用する。TIMP−GPIとムチンドメインとを融合すると、表面細胞膜上でのTIMPタンパク質の提示がさらに増強され、当該融合構築物は、癌細胞を免疫媒介性破壊に対して感受性とするのにより効果的なものとなる。
以下の実施例では、インビトロの細胞系およびインビボの組織の両方において、TIMPが腫瘍細胞の増殖を阻害し、腫瘍発生を低下させる可能性を有することが実証されている。TIMPをGPIアンカーに連結したGPIアンカー型TIMPを外因的に投与すると、TIMPタンパク質が癌細胞の細胞膜へ効率的に挿入される。GPIアンカー型TIMP−1が癌細胞表面に発現することで、FAS媒介性アポトーシス経路を誘導するような可能性のある治療的関連性を有する種々の生物学的効果が癌細胞に誘導された。以下の実施例で示すように、前記した癌細胞の増殖抑制は用量依存的であることが認められた。
GPIアンカー型TIMP−1タンパク質はまた、プロMMP−2およびプロMMP−9の分泌を遮断し、多様なMMPの細胞表面会合を劇的に変化させた。最も重要なことには、通常はFAS−アポトーシス抵抗性である腫瘍細胞系が、FAS/CD95媒介性の死滅に対して感受性となった。GPI−TIMPによる処置は、抗アポトーシス性BCL2タンパク質の下方制御と、それに対応するアポトーシス促進性BAXタンパク質の増加をもたらす。このようなアポトーシス促進性タンパク質のより高濃度へのシフトは、TIMPでその表面を設計された癌細胞のFAS媒介性アポトーシスに対する感受性を増加させる要因の1つでありうる。
上記アプローチを用いて、原発腫瘍の不完全な外科切除後の残存癌の処置における治療的適用に本発明のGPIアンカー型TIMPタンパク質またはポリペプチドが特に有用であることが証明されている。
さらに、腎細胞癌(RCC)を含む腫瘍細胞は本質的にFAS媒介性死滅に抵抗性であるため、本発明は、腫瘍細胞をFAS媒介性アポトーシスの影響を受けやすいものとするための効果的な手段を提供する。
第一の様相において、本発明は、メタロプロテイナーゼの組織インヒビター(TIMP)のアミノ酸配列またはその生物活性断片を含む融合構築物(TIMP−GPIまたはTIMP−ムチン−GPI)であって、該TIMPまたはその生物活性断片が、後にグリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカーのアミノ酸配列が続くムチンドメインのアミノ酸配列に連結されている、融合構築物、に関する。
好ましい態様において、TIMPの3’末端は、GPI連結配列へ直接的に融合しており、かつムチンドメインを含まない。
「ムチン」という用語は、大きな、高度にグリコシル化されたタンパク質のファミリーに関連する。ムチンの1つのクラスは、原形質膜における保持に有利に働く疎水性膜貫通ドメインの存在による膜結合型であるが、ムチンのもう1つのクラスは、粘膜表面上に分泌される。ムチン遺伝子はムチン単量体をコードしており、ムチン単量体は棒形アポムチンのコアとして代表的に合成され、棒形アポムチンのコアは非常に豊富なグリコシル化によって翻訳後修飾される。2つの明確に異なる領域が成熟ムチンに見出される。1つの領域は、アミノ末端およびカルボキシ末端領域を含み、それらは低度にグリコシル化されているがシステイン残基が豊富であり、当該システイン残基はムチン単量体内およびムチン単量体間のジスルフィド結合に関与すると考えられる。第二の中央領域は、10〜80残基配列の複数のタンデムリピートの形をなし、アミノ酸残基の過半数はセリンまたはトレオニンである。
一般に、ムチンは、おおよそ百万〜1千万ダルトンの分子量を有するタンパク質の巨大な凝集体として分泌される。これらの凝集体内において、単量体は、ほとんど非共有結合性相互作用によって互いに連結しているが、分子間ジスルフィド結合もこの過程で役割を果たしうる。MUC1,2,3A,3B,4,5AC,5B,6〜9,11〜13,15〜19を含む少なくとも19個のヒトムチン遺伝子が識別されている。
本発明に用いられる場合のムチンは、好ましくは膜結合型ムチンドメインであり、好ましくは、MUC1、MUC3A、MUC3B、MUC4、MUC11、MUC12、MUC16、およびMUC17、またはそれらの変種もしくは部分からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む(上記ムチンはMoniaux N et al., 2004に概説されている)。他の好ましい態様において、表面会合型ケモカインCXCL16またはフラクタルカイン(CX3CL1)から単離されるムチンストーク(mucin stalk)が用いられる。
フラクタルカインは、大きく複雑なケモカイン遺伝子スーパーファミリーのメンバーであり、主に分泌型炎症促進性分子からなる。ケモカインの典型的なコア構造は、位置的に保存されたシステイン残基間のジスルフィド結合により部分的に維持される。ケモカインペプチドの大部分について、よく知られた構造的特徴は、分子内の4つのシステインの分布、すなわち、システインシグネチャーモチーフ:CXC、CC、およびC(Cはシステインであり、Xは任意のアミノ酸残基である)である。4つの異なるケモカインファミリーは、ケモカインペプチドがその分子のN末端近くに位置するシステイン残基の構成により区別されうるという観察に基づいて同定されている。フラクタルカイン自身は、ケモカインファミリーの1つと定義され、フラクタルカインのN末端システインが3つの残基によって隔てられていること(すなわち、CX3Cモチーフ)と、ムチン様ドメインまたはムチン様ストークを含む広範なC末端膜貫通アンカーにより細胞膜へ繋ぎとめられることから、他のケモカインファミリーとは構造的に区別される。従って、本発明の融合構築物内に含まれるムチンおよびフラクタルカインドメインは、細胞膜におけるTIMPタンパク質のアンカリング(繋ぎとめ)の向上を達成するのに適している。
本発明に用いられるTIMPは、哺乳動物由来であることが好ましく、ヒト由来であることがより好ましい(4つのTIMPはMannello F et al., 2001に概説されている)。本発明で使用可能なTIMPタンパク質の例は、TIMP−1、TIMP−2、TIMP−3、またはTIMP−4、ならびにマウス、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、およびウシのような他の生物体におけるそれらの対応する変種を含む。
本発明に用いられるGPIアンカーは、好ましくはリンパ球機能関連抗原(LFA−3)またはその部分由来であり、膜会合を媒介するGPI−シグナル配列を含む。
本発明はまた、本発明のGPIアンカー型TIMP構築物をコードする核酸配列を含む、RNAまたはDNAのような核酸分子に関する。
本発明の他の様相において、本発明の核酸分子は、本発明の核酸分子の発現のための発現プラスミド、ベクター、または宿主細胞内に含まれている。
本発明はまた、癌、特に、原発腫瘍の外科切除後の残存癌の処置のための本発明のTIMP−GPIまたはTIMP−ムチン−GPI融合構築物の使用に関する。
本発明の他の様相において、本発明のTIMP−GPIまたはTIMP−ムチン−GPI融合構築物は、薬学的組成物または医薬に含まれる。他の態様において、本発明のTIMP−GPIまたはTIMP−ムチン−GPI融合構築物は、抗癌剤または抗癌薬として適切に用いられる。好ましい態様において、本発明の抗癌薬は、残存癌細胞および局所的再発の発生率増加の高リスクをもつ高リスク腫瘍患者において、ならびに進行期疾患または局所的手術不能による明らかな残存腫瘍を有する患者において、腫瘤切除側へ局所的に投与および適用される。好ましくは、融合構築物は、創傷への噴霧、および/または手術が有効ではない領域への注入により投与される。
本発明はまた、有効量のTIMP−ムチン−GPI融合構築物またはTIMP−GPI融合構築物に癌細胞系を曝す工程を含む、インビトロでの癌細胞増殖阻害方法に関する。
他の態様において、本発明は、結果として異常な創傷治癒を生じる正常な生理学的MMPプロテアーゼ活性とECM沈着との間のバランスの妨害により定義される状態の処置のための新規の薬剤と方法を提供する。1つの態様において、本発明は、MMPレベルの増加と一般に関連しているケロイドまたは肥厚性瘢痕化および慢性創傷の処置に適した薬剤と方法を提供する。さらに、本発明はまた、創傷治癒過程中における瘢痕の形成を低下、最小化、または阻害するのに効果的な薬剤と方法を提供する。
定義
本明細書に用いられる場合の「TIMP」という用語は、メタロプロテイナーゼの内因性組織インヒビターを意味し、それは、活性マトリックスメタロプロテイナーゼの阻害、プロMMP活性化の制御、細胞増殖、および血管新生の調節を含む生理学的/生物学的機能に関与することが知られている。ヒト「TIMPファミリー」は、4つのメンバー、すなわちTIMP−1、TIMP−2、TIMP−3、およびTIMP−4を含む。本発明で用いられる1つの好ましいメンバーであるTIMP−1は、その表面タンパク質との相互作用を通して細胞表面上に検出されうる分泌性タンパク質である(Bode & Maskos, 2003)。
本明細書に用いられる場合の「TIMP」という用語は、メタロプロテイナーゼの内因性組織インヒビターを意味し、それは、活性マトリックスメタロプロテイナーゼの阻害、プロMMP活性化の制御、細胞増殖、および血管新生の調節を含む生理学的/生物学的機能に関与することが知られている。ヒト「TIMPファミリー」は、4つのメンバー、すなわちTIMP−1、TIMP−2、TIMP−3、およびTIMP−4を含む。本発明で用いられる1つの好ましいメンバーであるTIMP−1は、その表面タンパク質との相互作用を通して細胞表面上に検出されうる分泌性タンパク質である(Bode & Maskos, 2003)。
本明細書に用いられる場合の「融合構築物」または「TIMP融合構築物」という用語は、核酸分子と、その核酸分子にコードされるアミノ酸分子の両方を指す。
本発明は、具体的には、配列番号1〜5により定義される配列を含むヌクレオチド配列を含む核酸、その相同体、またはその固有の断片に関する。本発明において、その結果として生じるタンパク質をコードする核酸分子の配列は、第一核酸分子のヌクレオチド配列が、第二核酸分子の配列と少なくとも約70%相同、好ましくは少なくとも約80%相同、より好ましくは少なくとも約90%相同である場合には、第二核酸分子と相同であるとみなされる。2つの核酸配列間の相同性は、公知のBLASTNアルゴリズム(Altschul, et al., 1990)を初期設定で用いることで容易に決定できる。別の例として、2つの核酸配列の相同性を確かめるための他の公知の試験は、通常のハイブリダイゼーション条件下で、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、それらがハイブリダイズするかどうかである。
本明細書に開示された核酸配列を考慮すれば、当業者は、様々な型の適用において特定の機能を有する核酸構造を容易に設計することができる。例えば、当業者は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、修復連鎖反応(Repair Chain Reaction)(RCR)、PCRオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ(PCR−OLA)などのような核酸増幅手段においてプライマーとして用いるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを構築することができる。in situハイブリダイゼーションのようなハイブリダイゼーション研究においてプローブとして有用なオリゴヌクレオチドが構築されうる。そのようなプローブに放射性同位元素、蛍光タグ、酵素、および結合部分(例えば、ビオチン)で標識するための多数の方法が知られており、従って、本発明のプローブは、簡単な検出性に対して容易に適応できる。
オリゴヌクレオチドはまた、他の目的のために設計および製造されうる。例えば、本発明は、構造/機能相関の研究に用いるアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび三重鎖形成性オリゴヌクレオチドの設計を可能にする。相同組換えは、ターゲティング手段として用いる本記載の核酸の適応により実行されうる。
本発明の核酸にコードされるタンパク質はさらに、機能的相同体を含む。下記のように、あるタンパク質が特定の機能について他のタンパク質と同じ機能を持つ場合には、そのタンパク質は当該他のタンパク質の機能的相同体とみなされる。相同体は、例えば、そのタンパク質の断片、またはそのタンパク質の置換、付加、もしくは欠失変異体でありうる。
2つのアミノ酸配列が実質的に相同であるかどうかの決定は、本発明の目的として、Pearson & Lipman (1988)によるFASTA検索に基づいている。例えば、第一タンパク質のアミノ酸配列が、第二タンパク質の配列と少なくとも約70%、好ましくは少なくとも約80%、より好ましくは少なくとも約95%の同一性を有する場合には、第一タンパク質のアミノ酸配列は第二タンパク質のアミノ酸配列と相同であるとみなされる。
配列における1つのアミノ酸を等価のアミノ酸と置換することの可能性はよく知られている。等価であることが知られたアミノ酸の群としては、以下のものが挙げられる:
(a)Ala(A)、Ser(S)、Thr(T)、Pro(P)、Gly(G);
(b)Asn(N)、Asp(D)、Glu(E)、Gln(Q);
(c)His(H)、Arg(R)、Lys(K);
(d)Met(M)、Leu(L)、Ile(I)、Val(V);および
(e)Phe(F)、Tyr(Y)、Trp(W)
(a)Ala(A)、Ser(S)、Thr(T)、Pro(P)、Gly(G);
(b)Asn(N)、Asp(D)、Glu(E)、Gln(Q);
(c)His(H)、Arg(R)、Lys(K);
(d)Met(M)、Leu(L)、Ile(I)、Val(V);および
(e)Phe(F)、Tyr(Y)、Trp(W)
本発明の核酸にコードされるタンパク質が本明細書に記載された機能の基準を満たしている限り、アミノ酸配列における置換、付加、および/または欠失が生じていてもよい。他の配列と実質的に同じであるが、1もしくは複数の置換、付加、および/または欠失によって他の配列と区別されるアミノ酸配列は、等価の配列であるとみなされる。
本発明の核酸にコードされるタンパク質のアミノ酸配列において、置換、付加、または欠失されるアミノ酸残基の数は、当該配列におけるアミノ酸残基の数の好ましくは20%未満、より好ましくは10%未満、さらに好ましくは5%未満である。
本明細書に用いられる場合の「MMP」という用語は、マトリックスメタロプロテイナーゼを意味し、それは、組織発生および分化、細胞浸潤、創傷治癒の間、ならびに免疫応答の調節剤として作用している少なくとも26個の細胞外マトリックス分解性メタロエンドペプチダーゼに代表されるMMPスーパーファミリーに属する。
本明細書に用いられる場合の「GPI」という用語は、グリコイノシトールリン脂質、特に、Medof et al., 1996に記載されているようなグリコシルホスファチジルイノシトールを意味する。これらのリン脂質様アンカーは、タンパク質の機能に関係のない膜付着のための共通構造を有する。GPIアンカリングユニットは、ホスホエタノールアミン、3つのマンノース残基、およびイノシトールリン脂質に連結された非アセチル化グルコサミンを含む直鎖状グリカンで構成される。GPI配列は、GPIアンカリングを方向づけるシグナルを含む。
本明細書に用いられる場合の「ムチン」または「ムチンドメイン」という用語は、膜結合型または非膜型糖タンパク質成分を意味する。通常、膜結合型ムチンは、脂質二重層におけるそれらのアンカリングに関与する疎水性配列または膜貫通ドメインを示し、任意的に、ムチン単量体のオリゴマー形成および分泌小胞へのパッケージングにおいて機能する1個または数個のフォンビルブラント因子様ドメインを含む。本明細書に用いられる場合の「ムチン」または「ムチンドメイン」という用語はまた、ムチンストークまたはムチン様ドメインを包含し、それらは、例えばCXCL16ケモカインもしくはフラクタルカイン(CX3CL1)に典型的に見出されるムチンストークのようなものである。
本明細書に用いられる場合の「TIMP−GPI」融合構築物は、GPI連結配列に直接的に融合しているTIMPに関する。TIMP−GPI融合構築物は、内因性TIMP 3’−mRNAまたはcDNA末端配列の代わりに、天然のGPIアンカー型タンパク質の3’−mRNAまたはcDNA末端配列(すなわち、GPIアンカリングを方向づけるシグナルを含む配列)を用いることにより設計される。
本明細書に用いられる場合の「TIMP−ムチン−GPI」または「TIMP−muc−GPI」は、後にGPI連結配列が続くムチンドメインに直接的に融合しているTIMPに関する。TIMP−ムチン−GPI融合構築物は、TIMPおよびGPIのアミノ酸配列の間にムチンドメインのアミノ酸配列を含むこと以外、TIMP−GPIについて記載されているように設計される。同様に、「TIMP−フラクタルカイン−GPI」または「TIMP−frac−GPI」は、後にGPI連結配列が続くフラクタルカインドメインに直接的に融合しているTIMPに関する。
「RCC」という用語は腎細胞癌を意味し、それは、現行の化学療法剤および放射線療法に対する腫瘍抵抗性によって治療法の選択肢が制限された進行性腫瘍であると考えられている。RCCは、GPIアンカー型TIMPの抗腫瘍活性を示す本発明のモデル系としての役割を果たす。本発明に用いられるモデル細胞系は、病期I期およびIV期の細胞癌を有する患者から樹立されたRCC−26およびRCC−53細胞系である。
「FAS」という用語は、腫瘍壊死因子/神経成長因子受容体ファミリーのメンバーを意味し、それはTNF−αと無関係にアポトーシスを誘導する。本技術分野で知られているFASについての他の略語は、Apo1(=アポトーシス誘導タンパク質1)およびCD95である。
「再生」という用語は、一般的に、外傷を負わされた或いは別の方法で傷つけられた組織の完全性を回復させることを指す。この用語は、創傷治癒、組織修復、ならびに生理学的傷害および組織損傷の確保が起こった場所で生じる他の型の回復活動を含みうる。
発明の詳細な説明
TIMPファミリーおよび細胞表面のタンパク質工学(Protein Engineering)
メタロプロテイナーゼの組織インヒビター(TIMP)は、マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)サブファミリーの主要な細胞インヒビターとして知られており、異なるMMP膜に対する様々な程度の有効性と、異なる組織発現パターンおよび制御の様式を示す。TIMPは、典型的には、可溶性のマトリックス結合型および細胞会合型MMPの活性を調節する。すべての4つの哺乳動物TIMPは、多くの幅広い類似性を有するが、特有の構造的特徴、生化学的性質、および発現パターンを示し、各TIMPが特定のインビボ機能を有することを示唆している。
TIMPファミリーおよび細胞表面のタンパク質工学(Protein Engineering)
メタロプロテイナーゼの組織インヒビター(TIMP)は、マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)サブファミリーの主要な細胞インヒビターとして知られており、異なるMMP膜に対する様々な程度の有効性と、異なる組織発現パターンおよび制御の様式を示す。TIMPは、典型的には、可溶性のマトリックス結合型および細胞会合型MMPの活性を調節する。すべての4つの哺乳動物TIMPは、多くの幅広い類似性を有するが、特有の構造的特徴、生化学的性質、および発現パターンを示し、各TIMPが特定のインビボ機能を有することを示唆している。
TIMP−1タンパク質は、TIMPファミリーの中で最も広く発現し、かつ研究されたメンバーである。TIMPファミリーの他のメンバーとしては、TIMP−2、TIMP−3、およびTIMP−4が挙げられる。TIMPタンパク質は、天然のタンパク質立体構造に不可欠なジスルフィド結合を形成する一連の保存されたシステイン残基を含む共通の構造的特徴を共有するだけでなく(Brew et al., 2000)、幅広く重複する生物活性も有する。TIMPタンパク質の保存されたN末端領域は、機能的な阻害活性に必要であるが、多岐にわたるC末端領域は、阻害の選択性、および作用物質のMMPへの結合効率を調節すると考えられる(Maskos & Bode, 2003)。しかしながら、MMPインヒビターとして作用するそれらの能力は別として、様々なTIMPファミリーメンバーはまた、血管新生応答および炎症応答の調節に加えて増殖とアポトーシスの制御を含む、さらなる生物活性を示すことができる。
TIMP−1は、ほとんどのMMP(MMP−2およびMMP−14を除く)を阻害することが見出されており、優先的には、MMP−8を阻害する。TIMP−1は、様々な細胞種により産生および可溶形で分泌され、身体中に広く分布している。それは、28.5kDaの分子量をもつ広範にグリコシル化されたタンパク質である。TIMP−1はMMPの活性型を阻害し、MMP9のプロ型と複合体形成する。MMP9と同様に、TIMP−1発現は多くの因子の影響を受ける。TIMP−1の合成の増加は、以下を含む幅広い種類の試薬によって引き起こされる:TGFβ、EGF、PDGF、FGFb、PMA、オールトランス型レチノイン酸(RA)、IL1、およびIL11。
TIMP−2は、様々な細胞種が発現している21kDaの糖タンパク質である。それは、潜在性MMPと活性型MMPのいずれとも、非共有結合性の化学量論的複合体を形成する。TIMP−2は、MMP−2を優先的に阻害する。
TIMP−3は、典型的にはECMに結合しており、MMP−1、−2、−3、−9、および−13の活性を阻害する。TIMP−3は、TIMP−1との30%のアミノ酸相同性、およびTIMP−2との38%の相同性を示す。TIMP−3は、形質転換細胞のECMからの脱離を促進すること、および細胞形質転換に関連した形態学的変化を加速することが示されている。
ECMへの高親和性結合のため、TIMP−3はTIMPの中でも独特である。TIMP−3は、形質転換細胞のECMからの脱離を促進すること、および細胞形質転換に関連した形態学的変化を加速することが示されている。TIMP−3はグルコサミノグリカン(GAG)結合ドメインを含み、それは、細胞表面との会合に関与すると考えられる6個のアミノ酸(Lys30、Lys26、Lys22、Lys42、Arg20、Lys45)を有する。TIMP−3は、TACE(TNF−α変換酵素)を通常、阻害する唯一のTIMPである。TACEは可溶性TNFを放出し、かつIL−6受容体のプロセシングに関与して創傷治癒過程において中心的役割を果たす他のメタロプロテアーゼである。
TIMP−4は、すべての既知のMMPを阻害し、MMP−2とMMP−7を優先的に阻害する。TIMP4は、TIMP1との37%のアミノ酸同一性、ならびにTIMP2およびTIMP3との51%の相同性を示す。TIMP4は、主に心臓および脳組織において細胞外に分泌され、細胞外マトリックス(ECM)恒常性に関して組織特異的様式で機能すると考えられている。
細胞表面のタンパク質工学は、細胞の表面タンパク質組成を遺伝子移入なしに操作できる潜在的に強力な技術である。対象となるタンパク質のカルボキシル末端領域の代わりに、GPIシグナルドメインを含むGPI連結タンパク質からのmRNA由来cDNA配列を用いることにより、GPI連結タンパク質をコードする融合構築物を作り出すことが可能である。
このアプローチは、より伝統的な遺伝子移入アプローチを超える多数の利点を提供する。例えば、この方法は、トランスフェクションすることが困難または不可能である細胞(例えば、一次微小血管内皮細胞、一次標的細胞など)に適用できる。細胞表面に加えられるタンパク質の量については、(FACSまたは免疫蛍光法により)調節および定量化することができる。さらに、複数のGPIアンカー型タンパク質については、同じ細胞へ逐次的にまたは同時に挿入することができる。分子工学(molecular engineering)を通して、タンパク質精製および実験中の試薬のモニタリングの助けとなる付加的なエピトープタグを発現することが可能である。薬剤は腫瘍または腫瘍周囲領域へ直接的に注入することができ、腫瘍増殖における選択的白血球補充またはFAS誘導性アポトーシスへの効果を確認することができる。
癌の処置のためのTIMP融合構築物
悪性腫瘍の予後は、ほとんど、腫瘍の臨床的および病理学的病期に依存する。たいていの癌腫(例えば、一次および二次腫瘍)は、ほとんどの場合、完全に外科的に除去できる。しかし、進行期癌を再切除することはしばしば不可能であり、それが疾患の早期再発および疾患関連死亡率の増加と関連している。
悪性腫瘍の予後は、ほとんど、腫瘍の臨床的および病理学的病期に依存する。たいていの癌腫(例えば、一次および二次腫瘍)は、ほとんどの場合、完全に外科的に除去できる。しかし、進行期癌を再切除することはしばしば不可能であり、それが疾患の早期再発および疾患関連死亡率の増加と関連している。
特に乳癌において、拡大した腫瘍サイズ(>2cm)をもつ進行期疾患が、遠隔転移の発生および限られた生存と関連している。大きな腫瘍容積も残存癌の存在についての臨界パラメーターであると考えられ、残存癌は局所的再発および遠隔転移の伝播の高リスクも示す。同様に、グリア芽細胞腫(星状細胞腫悪性度IV)のような脳腫瘍も、考えられる他の腫瘍監視の標的である。それは、完全な外科切除がほとんどの場合不可能であり、かつ第一次手術の1年以内に局所的再発が全症例の95%に生じているからである。
残存癌に関連する問題を解決するために、特に、不完全な外科切除後の残存癌の処置に有用な新規の癌治療法の選択肢を特定することが必要であった。
解決法として、本発明はGPIアンカー型TIMPを提供する。GPIアンカー型TIMPは、切除端へ局所的に投与することで免疫細胞を引きつけることができ、残存腫瘍の監視を残存癌細胞に集中させることができる。
この目的のために、TIMPタンパク質がGPIでアンカーされ、それを精製して癌細胞に加えると、癌細胞の表面膜へ組み入れられて、完全に機能する。内因性3’−mRNA末端配列の代わりに、天然のGPIアンカー型タンパク質の3’−mRNA末端配列(すなわち、GPIアンカリングを方向づけるシグナルを含む配列)を用いることにより、事実上、いかなるTIMPタンパク質もGPIアンカー型誘導体として発現することができる。
本発明において、精製GPI−TIMPタンパク質の腫瘍細胞系の表面膜への組み入れは、精製TIMP−1−GPI、TIMP−1−ムチン−GPI、または組換えヒト(rh)TIMP−1対照タンパク質と細胞系とのインキュベーションにより実証される。下記に詳述されているように、GPIアンカー型TIMP−1の表面発現により、結果としてTIMP−1についての強い表面シグナルを生じた。
本明細書に用いられる場合、「単離および/または精製された」という用語は、DNAまたはポリペプチド分子のインビトロでの単離であって、天然の細胞環境からの単離、および、核酸またはポリペプチドのような細胞の他の構成成分との会合物からの単離を指し、これにより配列決定、複製、および発現が可能となる。例えば、「単離されたGPI連結配列」は、連結配列の少なくとも一部分をコードする9個より多い、好ましくは36個より多い、より好ましくは45個もしくはそれ以上の連続したヌクレオチド塩基を含むRNAまたはDNA、それらの変種、或いはそれらに相補的なRNAまたはDNAである。この相補的なRNAまたはDNAは、連結配列をコードするRNAまたはDNAに相補的で、本技術分野でよく知られた方法で定義されるストリンジェントな条件下で安定に結合を維持するものである。従って、当該RNAまたはDNAは、RNAまたはDNAの天然源において通常、会合している少なくとも1つの混入核酸を含まない点において、ならびに、好ましくはいかなる他の哺乳動物RNAまたはDNAも実質的に含まない点において、「単離」されている。
本明細書に用いられる場合、「組換え核酸」(例えば、「組換えDNA配列」)という用語は、単離された核酸(例えば、DNA)であって、任意の適切な組織源(tissue source)に由来し、或いは該組織源から単離され、その後にインビトロで化学的に改変されていてもよい核酸を指し、その配列は天然には存在しないか、天然に存在する配列に相当するが、外因性DNAで形質転換されていないゲノム内で位置するであろう場所に位置しない。組織源に「由来する」DNAの例は、所定の生物体内で有用な断片であると同定されているDNA配列で、その後、本質的に純粋な形で化学合成されたものである。組織原から「単離された」DNAの例は、該組織源から化学的手段(例えば、制限エンドヌクレアーゼの使用)によって切り取られ、または取り出された有用なDNA配列であり、それにより、本発明に用いるために、遺伝子工学における公知の方法によってさらなる操作(例えば、増幅)を施こすことができるようになる。
異なる膜貫通配列を有し且つ特定の細胞質拡張部分に結合する従来のポリペプチドアンカーと違って、これらのリン脂質様アンカーは、タンパク質の機能に関係のない膜付着のための一般的な機構として共通構造を用いる。GPIアンカリングユニットは、ホスホエタノールアミン、3つのマンノース残基、およびイノシトールリン脂質に連結された非アセチル化グルコサミンを含む直鎖状グリカンで構成される。それらは、小胞体(ER)において組み立て式に合成され、ER膜を横断する転位の時点で、一次翻訳産物に付加される。該GPI修飾産物は、その後、ERおよびゴルジでグリコシル化され、続いて、細胞表面へ輸送される。
本発明で使用可能な好ましいGPI連結配列はGPIアンカーに由来するものであり、GPIアンカーは、例えば、アルカリホスファターゼ、アセチルコリンエステラーゼ、5’ヌクレオチダーゼ(CO73)のような酵素;リンパ球機能関連抗原(LFA−3;CD58)、神経細胞接着分子(NCAM)のような接着分子;崩壊促進因子(DAFまたはCD55)のような補体調節タンパク質、またはFey受容体III B型(Fc−y−RIIIまたはCD16b)、Thy−1(CD90)、Qa−2、Ly−6A、反応性溶解の膜インヒビター(MIRLまたはCD59)のような他のもの、から単離される。本発明の目的のためには、リンパ球機能関連抗原(LFA−3)が好ましい。当業者は、いかなる他の公知のGPIアンカーもまた本発明の実施に使用できることを認識しているだろう。
TIMP−GPIの構築のために、TIMPの完全長配列、あるいはTIMPの活性を保持するその機能的活性部分のいずれかが、融合構築物に使用できる。同様に、GPI配列の一部もまた、その部分がTIMPタンパク質の癌細胞の表面細胞膜への組み入れを可能にする限り使用できる。
以下において、TIMP融合構築物に関する複数の態様が記載されており、癌の処置のために、および再生医療の分野における薬剤として、該構築物が生産され、提供された。第一の態様において、TIMP分子は、TIMP−1、TIMP−2、TIMP−3、およびTIMP−4からなる群より選択され、好ましくは、GPI配列に融合している。
他の好ましい態様において、GPI配列は36アミノ酸の長さである。
さらに他の態様において、TIMP分子は、TIMP−1、TIMP−2、TIMP−3、およびTIMP−4からなる群より選択され、後にGPI配列が続くムチンドメインまたはフラクタルカインドメインに融合している。
他の態様において、TIMP−1、TIMP−2、TIMP−3、およびTIMP−4からなる群より選択され且つGPI配列に融合しているTIMPタンパク質、または同群より選択され且つ後にGPI配列が続くムチンドメインもしくはフラクタルカインドメインに融合しているTIMPタンパク質は、C末端で切り詰められる。好ましい態様において、該TIMP分子は、最初の50個、50〜100個、または50〜152個のN末端アミノ酸残基へ切り詰められる。より好ましくは、TIMP分子は、最初の152個のN末端アミノ酸残基へ切り詰められ、かつTIMP−1分子である。「切り詰められた(短縮型)」(truncated)という用語は、天然のTIMP核酸配列もしくはタンパク質に見出される核酸塩基もしくはアミノ酸残基の完全数より少なく含むTIMP核酸もしくはアミノ酸配列、或いは、望まない配列が除去されている核酸もしくはアミノ酸配列を指す。
さらに他の態様において、TIMP融合構築物は、配列番号1、2、3、4、および5からなる群より選択される配列により定義される。
その後、機能性TIMPポリペプチドまたはタンパク質を得るために、得られた構築物を任意の適切な細胞系または宿主細胞で発現させることができる。この目的のために、適切な公知のベクターまたはプラスミドのいずれもが、本発明のGPIアンカー型TIMPタンパク質を発現させるのに使用できる。以下により詳細に記載されているように、TIMP−GPIタンパク質で(および対照としてrhTIMP−1タンパク質で)処理された標的癌細胞は、当該タンパク質構築物により認識され、結果として、FAS媒介性アポトーシスによって死滅した。
好ましい態様において、および例として、本発明の融合構築物の発現に用いられる1つのベクターは、ヒト伸長因子1αのプロモーター、それに続くマルチクローニングサイト、および構築物のバイシストロニック発現を可能にする内部リボソーム結合サイト、および選択マーカーとして用いられるジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)を含む(Mack, et al., P.N.A.S. USA 92:7021, 1995)。TIMPタンパク質の3’末端(カルボキシル末端)は、GPI連結配列(例えば、リンパ球機能関連抗原−3(LFA−3))に直接的に融合するか、後にGPIシグナルが続く、CXCL16もしくはフラクタルカイン(CX3CL1)から単離されたムチン様ドメインに融合している。上記で示されているように、これらのムチンドメインは、主として、細胞−細胞間相互作用を促進することが示されたセリン/トレオニン/グリシン/プロリン残基で構成される。結果として生じた融合構築物は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)欠損チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞へトランスフェクションされ、Mack, et al., P.N.A.S. USA 92:7021-7025, 1995に記載のように選抜が行われる。好ましい態様において、トランスフェクションされた細胞は、遺伝子増幅により発現率を増加させるためにメトトレキセートに曝されうる。
他の態様において、TIMP−GPIタンパク質の膜組み入れの効率を増加させるために、TIMP−GPI構築物はさらにムチンドメインに融合されうる。ムチンは、腺上皮の表面の内側を覆う分泌性粘液において初めて同定された、膜結合型または非膜型糖タンパク質成分である。膜結合型ムチンは、脂質二重層におけるそれらのアンカリングに関与する疎水性配列または膜貫通ドメインを示す。現在、合計21個の遺伝子が名称MUCを受けている:MUC1〜2、MUC3A、MUC3B、MUC4、MUC5AC、MUC5B、MUC6〜13、MUC15〜20(Moniaux N, et al., 2004)。ムチンの5つの共通の特徴は以下のとおりである:(1)粘液層への分泌、(2)高分子量O−糖タンパク質、(3)固有でかつ中央に位置した大きなエキソンによりコードされるタンデムリピートアレイの存在、(4)高パーセンテージのセリン残基とトレオニン残基を含む予測ペプチドドメインの存在、ならびに(5)mRNA発現の複雑なパターン。1つの例外として(MUC7)、分泌性ムチン(MUC2、MUC5A、MUC5B、およびMUC6)は、ムチン単量体のオリゴマー形成および分泌小胞へのパッケージングにおいて機能する、1個または数個のフォンビルブラント因子様ドメインとシステインリッチなペプチドとを有する。典型的には、分泌性ムチンは、特定化された上皮細胞により独占的に発現され、粘液に分泌され、ヒト身体内において限定された発現パターンを示す。この4つの分泌性ムチンは、ゲル形成ムチンとも呼ばれるが、プロフォンビルブラント因子との高レベルの類似性をもつ共通構造を有する。それらはまた、フォンビルブラント因子のDドメインとの相同性から、5つのDドメインを有することも知られている。
膜結合型ムチンは、MUC1、MUC3A、MUC3B、MUC4、MUC11、MUC12、MUC16、およびMUC17で構成される。膜アンカー型ムチンは、MUC4を例外として、SEA(ウニ精子タンパク質(Sea urchin sperm protein)、エンテロキナーゼ(Enterokinase)、およびアグリン(Agrin))モジュールを含む。MUC3A〜B、MUC4、MUC11〜12、およびMUC17は、2〜3個の上皮細胞成長因子(EGF)様ドメインを含む。本発明で使用できる膜結合型ムチンの例は、MUC1、MUC3、MUC4、およびMUC12である。本発明の好ましい態様において、表面会合型ケモカインCXCL16またはフラクタルカイン(CX3CL1)のムチンストークが用いられる。CXCL16は、CXCケモカインサブファミリーのメンバーである。このサブグループの他のメンバーと違って、CXCL16は構造的に異なり、4つの別個のドメインを有する:ケモカインドメインはムチン様ストークを介して細胞表面に繋ぎとめられており、ムチン様ストークが、順に、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに付着している。フラクタルカイン(CX3CL1)はCXCL16と類似した構造を有し、CXCL16とフラクタルカインはいずれも、細胞表面上に発現した場合には接着分子として働き、細胞表面から切断されると可溶性ケモカインが化学誘引物質として働く。
好ましくは、ムチンドメインは、公知の通常の遺伝子工学的方法によって、TIMP配列の3’末端とGPIアンカー配列の5’末端との間に融合される。本発明の得られたTIMP−ムチン−GPI融合構築物は、その後、任意の適切な公知の細胞系または宿主細胞においてトランスフェクションされ、発現することができる。当業者は、いかなる他のムチンまたはムチンドメインも本発明の目的に適していることを認識しているだろう。
好ましい態様において、TIMP分子に融合したフラクタルカインは、CX3CL1のアミノ酸100位〜342位を含み、その後にGPI配列が続く。よりいっそう好ましい態様において、TIMP分子は、最初の152個のN末端アミノ酸へ切り詰められたTIMP−1分子である(配列番号5)。
GPIアンカー型TIMPタンパク質の調製のためのTIMP−1(Bode & Maskos, 2003)の使用が本発明において好ましいが、当業者は、他のTIMPもまた本発明の実施に使用できることを認識しているだろう。有用であるヒトTIMPのさらなる例は、TIMP−2、TIMP−3、およびTIMP−4である(Mannello F, et al., 2001)。用いられるTIMPは、ヒトの源(human source)由来であり、ヒト癌細胞を処置するために投与される。当業者は、ヒト以外の生物体におけるTIMP、特にTIMP−1、の相同体もまた腫瘍細胞を殺す同様の効果を有することを認識しているだろう。例えば、いくつかの態様において、イヌ、ネコ、マウス、ウサギ、ウシ、またはヒツジ、およびトリのような動物由来のTIMP−1の配列が、本発明のTIMP−GPI融合構築物の構築に使用できる。その後、TIMP−GPIキメラは、ヒト個体について記載されているのと同様の様式で腫瘍部位に投与される。
GPIアンカー型TIMPで処置されうる腫瘍および癌細胞としては以下の癌が挙げられるが、限定されるわけではない:乳癌、腎癌(renal cancer)、前立腺癌、白血病、精上皮腫、黒色腫、奇形腫、リンパ腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌(kidney cancer)、副腎癌、甲状腺癌、血液癌、皮膚癌、脳の癌、子宮頚癌、腸癌(intestinal cancer)、肝臓癌、結腸癌、胃癌、腸癌(intestine cancer)、消化管癌、リンパ節癌、食道癌、結腸直腸癌、膵臓癌、耳鼻咽喉(ENT)癌、子宮癌、卵巣癌、および肺癌、ならびにそれらの転移癌。
残存癌の処置のために、TIMP−GPIは、残存癌細胞および局所的再発の発生率増加の高リスクをもつ高リスク腫瘍患者において、ならびに進行期疾患または局所的手術不能による明らかな残存腫瘍を有する患者において、腫瘤切除側へ局所的に投与および適用される。融合構築物は、好ましくは、0.5〜5μg/mlタンパク質の濃度で、より好ましくは0.5〜1μg/ml、または1〜2μg/mlの濃度で投与される。約1μg/mlのTIMP−GPI濃度またはTIMP−ムチン−GPI濃度が最も好ましい。当該タンパク質は、任意の適用可能な投与経路により個体へ投与されうる。この処置は、融合構築物が創傷へ噴霧されるように、または手術が有効ではない領域へ注入されるように、手術中に行われることが好ましい。この目的のために、本発明のGPIアンカー型TIMP融合構築物は、1もしくは複数の通常の公知の担体、希釈剤、および賦形剤をさらに含む医薬組成物または医薬の成分でありうる。
下記の実施例から結論づけられるように、GPIアンカー型TIMPは、CTL誘導性アポトーシスとNK細胞誘導性アポトーシス(パーフォリン/グランザイム媒介性溶解経路)によるのではなく、むしろFAS/CD95媒介性アポトーシスを含む第二の経路によって抗腫瘍活性(すなわち腫瘍細胞の死滅)を誘導するとみられる(さらなる詳細について、実施例5および6;図5および6を参照)。さらに、多くの腫瘍細胞はFAS媒介性アポトーシスに対して抵抗性であるところ、TIMP−1−GPIでの処置によって当該細胞系はFAS媒介性アポトーシスに対して感受性となったが、対照のrhTIMP−1での処置では感受性とならなかった。
TIMP−1−GPIタンパク質による処置がBCL2タンパク質の発現を低下させ、BAXタンパク質の発現を増加させることも見出された。BCL2タンパク質は、アポトーシスの制御に関与するタンパク質のファミリーを代表する。このファミリーのいくつかのメンバー(BCL2およびBCL−XLのような)は抗アポトーシス性であるが、別のもの(BadまたはBAXのような)はアポトーシス促進性である。細胞のアポトーシス刺激に対する感受性は、アポトーシス促進性BCL2ファミリーメンバーと抗アポトーシス性BCL2ファミリーメンバーとの間のバランスに依存する。加えて、TIMP−1−GPI処置のBCL2およびBAXの発現への効果が確認され、癌細胞をTIMP−1−GPIで処置するとアポトーシス促進性BAXの発現が増加し、抗アポトーシス性BCL2の発現が減少したことが示されている。
配列番号1、2、3、4、および5にそれぞれコードされたTIMP融合構築物について、同様の結果が得られた。
要約すれば、マイクログラムからミリグラム量の組換えGPIアンカー型TIMPタンパク質を生産する方法の有効性と、これらの分子の癌細胞の表面への組み入れ可能性とが合わさることにより、癌の処置のための効果的なツールが提供される。
再生医療に用いるTIMP融合構築物
さらに、本発明の融合構築物は、再生医療、特に創傷治癒の分野で用いるのに適している。上記のように、GPIに或いはムチン−GPIやフラクタルカイン−GPIに融合しているTIMPタンパク質は細胞表面膜へ効率的に組み入れられるが、それは、タンパク質−タンパク質相互作用と関係なく細胞表面に機能性ドメインを集中させる。本発明のTIMP融合構築物は、典型的には、全く安定であり、増幅された新規の生物活性を示す。
さらに、本発明の融合構築物は、再生医療、特に創傷治癒の分野で用いるのに適している。上記のように、GPIに或いはムチン−GPIやフラクタルカイン−GPIに融合しているTIMPタンパク質は細胞表面膜へ効率的に組み入れられるが、それは、タンパク質−タンパク質相互作用と関係なく細胞表面に機能性ドメインを集中させる。本発明のTIMP融合構築物は、典型的には、全く安定であり、増幅された新規の生物活性を示す。
上記のように、MMPとTACEは、いずれも創傷治癒の過程に重大な役割を果たしている。増加したMMPレベルは、様々な創傷治癒障害、とりわけ、慢性創傷発生に関連している。TIMPはMMPの天然のインヒビターであるため、本発明の融合構築物はまた、例えば、再生医療において、創傷治癒の過程を制御するための効果的な治療剤として用いることができ、MMPレベルにおける増加により特徴付けられる障害を処置するのに適している。
従って、本発明は、再生医療で用いるのに適した、および/またはMMPレベルにおける増加により特徴付けられる障害を処置するための薬剤ならびに方法を提供する。好ましい態様において、本発明の融合構築物は、過剰瘢痕化、ならびにケロイドもしくは肥厚性瘢痕化および/または慢性創傷を含む異常な創傷治癒を処置または予防するために用いられる。さらなる好ましい態様において、本発明の融合構築物は、瘢痕組織の形成を阻害または予防するために用いられる。
典型的な創傷治癒応答は、特定化された細胞の創傷部位への移動により特徴付けられる。一般に、血小板と炎症細胞が傷害の場所に到着する最初の細胞であり、これらの分子が重要な機能と、結合組織細胞および他の治癒因子の流入に必要であるサイトカインを含む化学的シグナルとを提供する。「創傷」という用語は、正常な生理学的構造および機能の破壊を意味する。従って、創傷治癒過程は、最終的に生理学的連続性および機能の回復を生じる複雑かつ動的な一連の事象を指す。
創傷が治癒すると、通常、その場所には瘢痕が発生する。正常な創傷治癒の経過中に、脂肪組織、結合組織、および上皮のような単一組織が再生される。しかしながら、皮膚は2つの胚葉に由来するより複雑な器官であるため、それは、大部分線維性の組織、すなわち瘢痕の形成によって治癒する。
正常な創傷治癒において、MMPのタンパク分解活性は、遺伝子の転写や当該酵素の産生といった様々な機構により、および内因性TIMPインヒビターの局所的分泌により制御される。創傷修復中、生理学的バランスは、MMPとTIMPの活性の間に存在する。しかしながら、マトリックスメタロプロテアーゼは、慢性創傷においてそのレベルが上昇し、そのような高いMMP濃度により創傷治癒過程が損なわれることが知られている。マクロファージ、線維芽細胞、好中球、上皮細胞、および内皮細胞を含む複数の細胞型が、炎症性サイトカインのような特定の生化学的シグナルの存在下においてMMPを合成する。MMPは細胞外マトリックスの成分のほとんど全部を消化する能力があり、それが、MMPのタンパク質分解活性と、組織のタンパク質成分を合成し且つ沈着させる他の細胞活性との間の必要なバランスを脅かす。
図8は、組織リモデリング過程、線維症、およびこの過程を調節することに関与する因子の概観を提供する。特定の傷害、寄生虫感染、または自己免疫応答に対する急性および慢性の炎症性反応が起こると、線維形成因子が発現および分泌されて、線維芽細胞およびケラチノサイトの活性化が導かれる。これらの線維形成因子としては、とりわけ、TGF−β、IL−1β、IL−1α、MOB、TGF−α、IL−4、IL−13、bFGF、TNF−α、およびPDGF−BBが挙げられる。おそらく、これらのサイトカインのうちで最も重要なものは以下の2つである:TNF。線維芽細胞に対して分裂促進性であり、血管新生を促進し、マクロファージ、肥満細胞、およびTリンパ球により分泌される。;TGF−α。ケラチノサイトおよび線維芽細胞に対して分裂促進性であり、ケラチノサイト遊走を刺激し、マクロファージ、Tリンパ球、およびケラチノサイトにより分泌される。TNFおよびTGF分泌を含む段階は、創傷治癒過程の炎症期から組織再構築の過程、すなわち増殖期、への遷移を示す。
活性化によって、線維芽細胞は、TGF−βと組み合わせて線維芽細胞の増殖へ導くIL−6を分泌する。TGF−βはまた、線維芽細胞分化を促進する。これらの増殖および分化過程により、コラーゲン、フィブロネクチン、TIMP、MMP、および他のECMタンパク質が全体的に増加し、ECM生成の増加とECMターンオーバーの減少が導かれる。
本発明は、開示される融合構築物、すなわち、GPIアンカー、ムチン−GPIアンカー、もしくはフラクタルカイン−GPIアンカーに融合したTIMPタンパク質またはそれらの変異体が、サイトカインおよび創傷治癒の過程に関与する他の重要な酵素の発現レベルおよび/または活性に影響を及ぼす強力な薬剤として使用できる、という予想外の知見に基づいている。従って、本発明は、創傷治癒の過程を制御する(例えば、瘢痕組織の形成を支配し、阻害し、または予防する)ための、および創傷治癒過程に関連した他の公知の機能障害を処置するための効果的な再生剤ならびに方法を提供する。
異常な創傷治癒
ケロイドおよび肥厚性瘢痕化は、過剰コラーゲンの蓄積を特徴とし、それらの外見により互いに区別できる。ケロイドと肥厚性瘢痕は、いずれも皮膚表面の外部を過度に治癒する創傷である。ケロイド瘢痕は、典型的には、創傷のサイズおよび形を超えて拡大し続けるが、肥厚性瘢痕は元の創傷の物理的境界内で拡大する。肥厚性瘢痕化は、一般的に、組織傷害後すぐに観察できるが、ケロイド瘢痕は、遅くも傷害の時点から1年後に形成しうる。しかしながら、異常な瘢痕化のほとんど全部の事例は、入れ墨、火傷、刺傷、予防接種、外傷、手術、または感染を含む生理学的傷害に関連している。
ケロイドおよび肥厚性瘢痕化は、過剰コラーゲンの蓄積を特徴とし、それらの外見により互いに区別できる。ケロイドと肥厚性瘢痕は、いずれも皮膚表面の外部を過度に治癒する創傷である。ケロイド瘢痕は、典型的には、創傷のサイズおよび形を超えて拡大し続けるが、肥厚性瘢痕は元の創傷の物理的境界内で拡大する。肥厚性瘢痕化は、一般的に、組織傷害後すぐに観察できるが、ケロイド瘢痕は、遅くも傷害の時点から1年後に形成しうる。しかしながら、異常な瘢痕化のほとんど全部の事例は、入れ墨、火傷、刺傷、予防接種、外傷、手術、または感染を含む生理学的傷害に関連している。
肥厚性瘢痕およびケロイドは、どちらも、典型的な創傷治癒過程の変化として説明できる。典型的な創傷において、同化および異化過程は、最初の傷害から約6〜8週間後に平衡に達する。瘢痕の成熟中、皮膚の抗張力は、コラーゲン線維が徐々に架橋結合するにつれて向上する。この時点で、瘢痕は通常、充血性であり、肥厚している場合がある。しかしながら、初期の瘢痕組織は、数ヶ月間かけて次第に鎮静し、典型的には外見は平ら、白色、柔軟、および場合により伸張しているより成熟した瘢痕になる傾向がある。創傷治癒過程の同化段階と異化段階との間のアンバランスがある場合、より多くのコラーゲンが分解されるより産生され、それゆえに、瘢痕は四方八方に成長しうる。
肥厚性およびケロイド瘢痕組織を処置するための単一の最適な方法はまだ開発されておらず、従って、これらの異常な瘢痕の再発率は顕著である。
要約すれば、MMPとTIMPを含むサイトカインおよび特定の酵素は、創傷治癒の過程と瘢痕組織の形成に重大な役割を果たしている。さらに、MMPおよびサイトカインのレベルにおける異常な発現は、しばしば、異常な創傷治癒と関連している。
従って、本発明は、創傷治癒の過程を制御するための、および/または創傷治癒と一般的に関連した機能障害を処置するための効果的な再生剤ならびに方法を提供する。具体的には、本発明の融合構築物は、これらの望ましくない過程を効果的に制御し、変化させ、阻害し、または予防するのに利用できる。本発明の融合構築物は、薬として製剤化し、傷害部位に投与することができる。1つの態様において、傷害部位は、手術、火傷、注射、刺傷、予防接種、外傷、手術、または感染により生じたものである。他の態様において、傷害部位に投与できる医薬の調製に用いられる融合構築物は、TIMP−1−GPI、TIMP−2−GPI、TIMP−3−GPI、TIMP−4−GPI、TIMP−1−muc−GPI、TIMP−2−muc−GPI、TIMP−3−muc−GPI、およびTIMP−4−muc−GPI、またはそれらの変異体からなる群より選択される。
TIMP構築物の製剤化および投与様式
本発明のTIMP構築物に基づいた薬学的組成物は、1もしくは複数の生理学的に許容される担体または賦形剤を用いて通常の様式で製剤化することができる。技術および製剤については、一般的に、Remrnington's Pharmaceutical Sciences, Meade Publishing Co., Easton, Paに見出されうる。注入を目的として、本発明の化合物は、溶液に、好ましくはハンクス液またはリンガー液のような生理学的に適合した緩衝液に、製剤化することができる。さらに、当該化合物を固形状に製剤化し、使用直前に再溶解または懸濁してもよい。凍結乾燥された形状も適している。
本発明のTIMP構築物に基づいた薬学的組成物は、1もしくは複数の生理学的に許容される担体または賦形剤を用いて通常の様式で製剤化することができる。技術および製剤については、一般的に、Remrnington's Pharmaceutical Sciences, Meade Publishing Co., Easton, Paに見出されうる。注入を目的として、本発明の化合物は、溶液に、好ましくはハンクス液またはリンガー液のような生理学的に適合した緩衝液に、製剤化することができる。さらに、当該化合物を固形状に製剤化し、使用直前に再溶解または懸濁してもよい。凍結乾燥された形状も適している。
これらの製剤に加えて、当該化合物はまた、デポー調製物として製剤化してもよい。これらの長時間作用性デポー製剤は、埋め込み(例えば、皮下または筋肉内に)または注入により投与することができる。従って、この化合物は、適切な重合体や疎水性の物質と共に(例えば、許容される油におけるエマルジョンとして)、またはイオン交換樹脂として、または難溶性塩のような難溶性誘導体として、製剤化することができる。他の適切なデリバリーシステムとしては、長期間に渡る薬物の局所的および非侵襲性デリバリーの可能性を提供するミクロスフェアが挙げられる。この特別な技術は前毛細血管のサイズを有するミクロスフェアを利用するもので、炎症または虚血を引き起こすことなく、冠動脈カテーテルを介して組織(例えば、心臓または他の器官)の任意の選択された部分へ注入される。投与された治療用物質はミクロスフェアからゆっくり放出され、周囲組織に存在する細胞(例えば、傷ついた細胞や癌性細胞)によって容易に取り込まれる。
局所的投与のために、本発明のオリゴマーは、当技術分野において一般的に知られた軟膏、膏薬、ゲル、またはクリームに製剤化することができる。オリゴマーを含む洗浄溶液は、傷害や炎症を処置するために、または治癒過程を広く加速するために、局所的に用いることができる。
本発明のTIMP構築物を含む医薬を調製する場合には、1種より多い、好ましくは2種、よりいっそう好ましくは3種の異なるTIMP構築物を組み合わせることができる。このアプローチでは、TIMPファミリーの異なるメンバーの増幅された新規の生物活性を優先的に組み合わせて細胞表面を標的とすることができ、相乗効果を導くことができる。例えば、TIMP−1融合構築物は、MMP−2およびMMP14を除いて、ほとんどのMMPを阻害する。それゆえに、いずれのTIMP−1構築物も、いずれのTIMP−2構築物やTIMP−4構築物(どちらもMMP−2を優先的に阻害する)と組み合わせることができる。従って、この組み合わせによって、MMPファミリーのより完全な阻害を達成することができる。
従って、1つの態様において、本発明の製剤はTIMP−1構築物、またはTIMP−2および/もしくはTIMP構築物を含む。好ましい態様において、当該製剤は、配列番号1にコードされる短縮型(truncated)TIMP−1−GPI、配列番号5にコードされる短縮型TIMP−1−frac−GPI、および配列番号2にコードされる短縮型TIMP−1−muc−GPIからなる群より選択されるTIMP−1構築物、ならびにTIMP−2および/またはTIMP−4構築物を含む。好ましくは、TIMP−2構築物は配列番号3にコードされるものである。
さらなる態様において、当該製剤は本発明のTIMP−3構築物を含み、それは、好ましくは配列番号4にコードされるものであり、配列番号1にコードされる短縮型TIMP−1−GPI、短縮型TIMP−1−frac−GPI、短縮型TIMP−1−muc−GPI、TIMP−2、およびTIMP−4構築物からなる群より選択されるTIMP構築物の少なくとも1つと共にTACEを阻害する。好ましくは、TIMP−1構築物およびTIMP−2構築物は、それぞれ、配列番号1、2、3、および5にコードされるものである。
実施例
以下の実施例において、GPIアンカー型TIMPの癌細胞への抗腫瘍効果がより詳細に説明される。記載された実験はヒトTIMP−1で行われているが、本発明はTIMPのこの型に限定されるべきではない。
以下の実施例において、GPIアンカー型TIMPの癌細胞への抗腫瘍効果がより詳細に説明される。記載された実験はヒトTIMP−1で行われているが、本発明はTIMPのこの型に限定されるべきではない。
以下の実施例において、GPIアンカーをTIMP−1に融合させた。規定濃度のこの阻害性タンパク質を細胞表面タンパク質−タンパク質相互作用と関係なく3つの腎細胞癌(RCC)細胞系(RCC−26、RCC−53、およびA498)の表面に集中させるためである。以下に示されているように、外から加えられたTIMP−1−GPIは、RCC細胞へ効率的に挿入し、MMPの細胞表面との会合を劇的に変化させた。TIMP−1−GPIによる処理は、RCC増殖を阻害し、通常はFAS抵抗性のRCC細胞を、FAS誘導性アポトーシスに対して感受性にしたが、細胞傷害性エフェクター細胞によるパーフォリン媒介性溶解を変化させなかった。FAS媒介性アポトーシスに対する感受性の増加は、アポトーシス促進性BCL−2ファミリータンパク質と抗アポトーシス性BCL−2ファミリータンパク質とのバランスにおける変化と相関した。
RCC−26(Schendel et al., 1993)およびRCC−53細胞系は、それぞれ、病期第I期および第IV期の明細胞癌を有する地元の患者から樹立された。それにより、それらは、RCCの2つの臨床的に両極端をなすものを代表する。腫瘍浸潤CTLが、両方の患者の腫瘍から単離された。これらの天然のエフェクター細胞はインビボで腫瘍成長を制御することができなかったが、RCC−26およびRCC−53の表面マーカー染色により、MHCクラスIの十分な表面発現が明らかにされ、両方の系統は、インビトロでアロ腫瘍特異的および抗腫瘍特異的CTLを誘導することが示された((Schendel et al., 2000)およびDJS、未発表の観察)。A498は、最初に52歳男性の腫瘍から単離され、RCCの良く研究された例である(Giard et al., 1973)。
実施例1
外から加えられたTIMP−1−GPIのRCC−53の表面への組み入れ
GPIアンカー型TIMP−1タンパク質を、以前に記載されているように(Djafarzadeh et al., 2004)、作製および単離した。精製されたGPI−TIMP−1タンパク質の、RCC−53、RCC−26、またはA498 RCC細胞系の表面膜への組み入れを、700ng/mlの精製TIMP−1−GPIまたは組換えヒト(rh)TIMP−1対照タンパク質との細胞系の1時間のインキュベーションにより実証した。表面会合したTIMP−1タンパク質について、その後、FACSを用いて検出した(図1A)。対照rhTIMP−1を添加してもFACSシフトにおける変化は導かれなかったが、GPIアンカー型TIMP−1を添加した場合には、TIMP−1についての強い表面シグナルが生じた。
外から加えられたTIMP−1−GPIのRCC−53の表面への組み入れ
GPIアンカー型TIMP−1タンパク質を、以前に記載されているように(Djafarzadeh et al., 2004)、作製および単離した。精製されたGPI−TIMP−1タンパク質の、RCC−53、RCC−26、またはA498 RCC細胞系の表面膜への組み入れを、700ng/mlの精製TIMP−1−GPIまたは組換えヒト(rh)TIMP−1対照タンパク質との細胞系の1時間のインキュベーションにより実証した。表面会合したTIMP−1タンパク質について、その後、FACSを用いて検出した(図1A)。対照rhTIMP−1を添加してもFACSシフトにおける変化は導かれなかったが、GPIアンカー型TIMP−1を添加した場合には、TIMP−1についての強い表面シグナルが生じた。
外から加えられたタンパク質がGPIアンカーされたことを実証するために、まずRCC−53細胞をTIMP−1−GPIタンパク質(200ng/mlまたは700ng/ml)とインキュベートし、次いで、60ng/ml ホスホリパーゼC(PLC)で処理した。FACS分析により、PLC消化後のTIMP−1細胞表面シグナルの完全な喪失が実証された(図1B)。TIMP−1−GPI組み込み効率を測定するために、膜から解放されたTIMP−1を洗浄緩衝液に収集し、TIMP−1特異的ELISAを用いて定量した(図1C)。その結果、開始時のTIMP−1抗原の66%が200ng/mlの試料から回収され、一方31%が700ng/mlインキュベーションから回収されていた。
実施例2
TIMP−1−GPIタンパク質はプロMMP−2およびプロMMP−9のRCC−53からの放出を遮断する
MMP−2およびMMP−9の発現の増加は、RCCの不良な予後と相関する(Hemmerlein et al., 2004)。病期IV期明細胞癌細胞系RCC−53は恒常的にプロMMP−2とプロMMP−9の両方を分泌する(図2)。増加性表面TIMP−1レベルの、MMP−2およびMMP−9タンパク質の恒常的放出への効果を、ゼラチナーゼ酵素電気泳動アッセイ(Djafarzadeh et al., 2004; Klier et al., 2001)を用いて調べた。600ng/mlや1200ng/mlのrhTIMP−1タンパク質では、プロMMP−2やプロMMP−9の分泌に何ら効果は生じなかった。これに対し、10ng/mlから開始してTIMP−1−GPIで処理すると、プロMMP−2とプロMMP−9のいずれについても増殖培地への放出量が濃度依存的に減少した。
TIMP−1−GPIタンパク質はプロMMP−2およびプロMMP−9のRCC−53からの放出を遮断する
MMP−2およびMMP−9の発現の増加は、RCCの不良な予後と相関する(Hemmerlein et al., 2004)。病期IV期明細胞癌細胞系RCC−53は恒常的にプロMMP−2とプロMMP−9の両方を分泌する(図2)。増加性表面TIMP−1レベルの、MMP−2およびMMP−9タンパク質の恒常的放出への効果を、ゼラチナーゼ酵素電気泳動アッセイ(Djafarzadeh et al., 2004; Klier et al., 2001)を用いて調べた。600ng/mlや1200ng/mlのrhTIMP−1タンパク質では、プロMMP−2やプロMMP−9の分泌に何ら効果は生じなかった。これに対し、10ng/mlから開始してTIMP−1−GPIで処理すると、プロMMP−2とプロMMP−9のいずれについても増殖培地への放出量が濃度依存的に減少した。
実施例3
TIMP−1−GPIでの処理はマトリックスメタロプロテイナーゼの表面発現の増加を導く
ゼラチナーゼ酵素電気泳動法実験の結果に基づくと、TIMP−1−GPIが細胞表面上にMMPを隔離するように作用する可能性がある。TIMP−1は、MMP−14とMMP−16を例外として、ほとんどの活性型のMMPに結合する(Brew et al., 2000; Lang et al., 2004)。RCC−53を700ng/mlのTIMP−1−GPIタンパク質と24時間インキュベートした後、MMP−1、MMP−2、MMP−3、MMP−7、MMP−8、MMP−9、MMP−12、MMP−13、MMP−14、MMP−15、およびMMP−16特異的抗体を用いてFACS分析を行ったところ、MMP−14を例外として、それぞれのMMPについて平均チャネル蛍光強度(MFI)が増加した。rhTIMP−1対照タンパク質では、FACSシグナルに明確な効果は生じなかった(データ非提示)。MHCクラスI(汎クラスIおよびHLA−A2)およびICAM−1を含む他のタンパク質の表面発現は、TIMP−1−GPI処理では生じなかった。TIMP−1−GPI処理されたRCC53をPLCで1時間消化(図1で行われたように)しても、MMPの増加は認められなかった(図3Aおよび3B)。細胞表面上のMMPの蓄積は、図2に示されたプロMMP−2およびプロMMP−9の分泌低下を反映した。このMMP放出の見かけ上の遮断をさらに調べるために、対照RCC53細胞、または700ng/mlのrhTIMP−1もしくはTIMP−1−GPIで24時間処理された細胞由来の培地(無血清)について、MMP−1、MMP−3、MMP−7、MMP−8、MMP−12、およびMMP−13に対するモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロット実験を行った(図3C)。対照RCC−53細胞由来の培地において、各MMPの存在が見出された。rhTIMP−1とインキュベートしても、MMPの分泌は排除されなかった。これに対し、TIMP−1−GPIは、調べられた各MMPの放出を完全に遮断すると考えられた。
TIMP−1−GPIでの処理はマトリックスメタロプロテイナーゼの表面発現の増加を導く
ゼラチナーゼ酵素電気泳動法実験の結果に基づくと、TIMP−1−GPIが細胞表面上にMMPを隔離するように作用する可能性がある。TIMP−1は、MMP−14とMMP−16を例外として、ほとんどの活性型のMMPに結合する(Brew et al., 2000; Lang et al., 2004)。RCC−53を700ng/mlのTIMP−1−GPIタンパク質と24時間インキュベートした後、MMP−1、MMP−2、MMP−3、MMP−7、MMP−8、MMP−9、MMP−12、MMP−13、MMP−14、MMP−15、およびMMP−16特異的抗体を用いてFACS分析を行ったところ、MMP−14を例外として、それぞれのMMPについて平均チャネル蛍光強度(MFI)が増加した。rhTIMP−1対照タンパク質では、FACSシグナルに明確な効果は生じなかった(データ非提示)。MHCクラスI(汎クラスIおよびHLA−A2)およびICAM−1を含む他のタンパク質の表面発現は、TIMP−1−GPI処理では生じなかった。TIMP−1−GPI処理されたRCC53をPLCで1時間消化(図1で行われたように)しても、MMPの増加は認められなかった(図3Aおよび3B)。細胞表面上のMMPの蓄積は、図2に示されたプロMMP−2およびプロMMP−9の分泌低下を反映した。このMMP放出の見かけ上の遮断をさらに調べるために、対照RCC53細胞、または700ng/mlのrhTIMP−1もしくはTIMP−1−GPIで24時間処理された細胞由来の培地(無血清)について、MMP−1、MMP−3、MMP−7、MMP−8、MMP−12、およびMMP−13に対するモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロット実験を行った(図3C)。対照RCC−53細胞由来の培地において、各MMPの存在が見出された。rhTIMP−1とインキュベートしても、MMPの分泌は排除されなかった。これに対し、TIMP−1−GPIは、調べられた各MMPの放出を完全に遮断すると考えられた。
このMMPの表面蓄積の、細胞のECMに浸潤する能力への効果を評価するために、細胞の遊走/浸潤能力を、ECMコーティング化膜での改良型ボイデンチャンバーアッセイを用いて調べた。RCC−53細胞のECMに浸潤する全体的な能力は、それほど顕著ではなかった(データ非提示)。浸潤を増強するために、血管内皮成長因子(VEGF)を下部ウェルへ加え、実験を48時間、実行した。最適な浸潤応答は4ng/mlのVEGFで見られ(データ非提示)、この応答をベースライン浸潤、またはゼロ%阻害として設定した(図3D)。350ng/mlまたは700ng/mlのrhTIMP−1またはTIMP−1−GPIで30分間、前処理されたRCC−53細胞を洗浄し、ボイデンチャンバーの上部ウェルへ加えた。続いて、遊走/浸潤における相対的増加または減少を測定した(「材料および方法」を参照)。rhTIMP−1での処理は細胞の浸潤を部分的に遮断したが、700ng/mlのTIMP−GPIは、RCC−53細胞の浸潤を完全に遮断した(図3D)。
実施例4
GPIアンカー型TIMP−1はRCCの増殖に影響を及ぼす
TIMP−1表面エンジニアリング(TIMP surface engineering)のRCCの増殖への効果を評価するために、MTTアッセイを行った。TIMP−1−GPIタンパク質を外から加えると、24時間目、48時間目、および72時間目において、RCC−53とA498の増殖が用量依存的に減少することが見出された(図4B)。RCC−26細胞は極めてゆっくり増殖し(48+時間の倍加速度)、一般的傾向として増殖の抑制が示唆された(図4C)。TIMP−1−GPI試薬と等モル濃度のホスファチジルイノシトール(Sigma, Germany, Nr. P6636)を用いた追加の対照実験では、細胞の増殖における有意な変化は導かれなかった(データ非提示)。
GPIアンカー型TIMP−1はRCCの増殖に影響を及ぼす
TIMP−1表面エンジニアリング(TIMP surface engineering)のRCCの増殖への効果を評価するために、MTTアッセイを行った。TIMP−1−GPIタンパク質を外から加えると、24時間目、48時間目、および72時間目において、RCC−53とA498の増殖が用量依存的に減少することが見出された(図4B)。RCC−26細胞は極めてゆっくり増殖し(48+時間の倍加速度)、一般的傾向として増殖の抑制が示唆された(図4C)。TIMP−1−GPI試薬と等モル濃度のホスファチジルイノシトール(Sigma, Germany, Nr. P6636)を用いた追加の対照実験では、細胞の増殖における有意な変化は導かれなかった(データ非提示)。
実施例5
細胞媒介性細胞傷害
MMP活性は、細胞傷害性T細胞活性により誘導されるアポトーシス(パーフォリン/グランザイムおよびFAS媒介性アポトーシスの両方)に対する標的細胞の感受性に結びつけられている(Egeblad & Werb, 2002)。TIMP−1−GPIが有するRCCの細胞依存性死滅への効果を、同種異系CTL誘導性アポトーシスおよびNK細胞誘導性アポトーシスを用いて調べた。同種異系CTL媒介性アッセイにおいて、RCC−53、A498、およびRCC−26標的細胞を、700ng/mlのrhTIMP−1またはTIMP−1−GPIで処理し、その後、Cr51で標識し、同種異系CD8+ CTL JB4(図5A)またはNK細胞系(図5B)とインキュベートした。RCC腫瘍細胞系は、CTLおよびNK細胞の両方により認識され、効果的に死滅した。TIMP−1またはTIMP−1−GPIでの処理では、3つのRCC細胞系について、CTL媒介性アポトーシスとNK細胞媒介性アポトーシスのいずれに対する感受性も変化しなかった。
細胞媒介性細胞傷害
MMP活性は、細胞傷害性T細胞活性により誘導されるアポトーシス(パーフォリン/グランザイムおよびFAS媒介性アポトーシスの両方)に対する標的細胞の感受性に結びつけられている(Egeblad & Werb, 2002)。TIMP−1−GPIが有するRCCの細胞依存性死滅への効果を、同種異系CTL誘導性アポトーシスおよびNK細胞誘導性アポトーシスを用いて調べた。同種異系CTL媒介性アッセイにおいて、RCC−53、A498、およびRCC−26標的細胞を、700ng/mlのrhTIMP−1またはTIMP−1−GPIで処理し、その後、Cr51で標識し、同種異系CD8+ CTL JB4(図5A)またはNK細胞系(図5B)とインキュベートした。RCC腫瘍細胞系は、CTLおよびNK細胞の両方により認識され、効果的に死滅した。TIMP−1またはTIMP−1−GPIでの処理では、3つのRCC細胞系について、CTL媒介性アポトーシスとNK細胞媒介性アポトーシスのいずれに対する感受性も変化しなかった。
実施例6
TIMP−GPI処理はRCCをFAS媒介性死滅に対して感受性にする
CTL/NK実験では、TIMP−1−GPI処理が、クロム放出アッセイで測定されるパーフォリン/グランザイム媒介性溶解経路に影響を与えないことが示された。この経路は、貯蔵サイトカインの分泌を用いてアポトーシスを惹起するように迅速に働き、2つの主要な免疫惹起性細胞死機構の1つを表す(Trapani et al., 2000)。第二の経路は、FAS/CD95連結を含む。次に、TIMP−1−GPI処理のFAS媒介性アポトーシスへの効果を調べた。
TIMP−GPI処理はRCCをFAS媒介性死滅に対して感受性にする
CTL/NK実験では、TIMP−1−GPI処理が、クロム放出アッセイで測定されるパーフォリン/グランザイム媒介性溶解経路に影響を与えないことが示された。この経路は、貯蔵サイトカインの分泌を用いてアポトーシスを惹起するように迅速に働き、2つの主要な免疫惹起性細胞死機構の1つを表す(Trapani et al., 2000)。第二の経路は、FAS/CD95連結を含む。次に、TIMP−1−GPI処理のFAS媒介性アポトーシスへの効果を調べた。
RCC系統上のFAS発現を、まず、非活性化抗FAS mAB(L−958)(H. Engelmann、未発表結果)を用いたフローサイトメトリーにより評価した。未処理の細胞、ならびに700ng/mlのTIMP−1−GPIまたはrhTIMP−1対照タンパク質で24時間処理された細胞をL−958で染色し、分析した。FASタンパク質はすべての3つのRCC系統で強く発現していた。TIMP−1−GPIやrhTIMP−1での処理は、FASの細胞表面発現に影響を及ぼさなかった(図6A)。
抗FAS mAB L−957は、FAS発現細胞においてアポトーシスを誘導できる(H. Engelmann、未発表結果)。フローサイトメトリーによりアポトーシスを検出するために、L−957での処理後のアネキシンV−フルオロイソチオシアネート(FITC)の結合およびヨウ化プロピジウム(PI)のRCC細胞への取り込みを用いた。図6Bに実証されているように、RCC−26およびRCC−53は主として、FAS媒介性アポトーシスに抵抗性であった。未処理細胞とL−957処理した細胞の蛍光強度(MFI)は類似していた。MFIのわずかな増加が、L−957処理に応答してRCC−53に見られた。これらの観察結果は、RCCが一般的にFAS媒介性アポトーシスに抵抗性であるという以前の報告(Frost et al., 2003)と一致している。これらの細胞系は、TIMP−1−GPI(L−957+TIMP−1−GPI)で処理するとFAS媒介性アポトーシスに対して感受性になったが、対照rhTIMP−1(L−957+rhTIMP−1)で処理しても感受性にならなかった(図6B)。A498は、活性化抗FAS mABに感受性がより高いことが見出され(L−957処理試料におけるアネキシン−MFIの増加により検出される)、TIMP−1−GPI処理によりA498細胞のアポトーシスは有意に増進されたが、rhTIMP−1処理では増進されなかった。
RCC−26およびA498細胞は、TIMP−1−GPI処理後にFAS誘導性アポトーシスの劇的な増加を示したが、RCC−53細胞系は、感受性においてそれほど顕著ではない増加しか示さなかった(62から93へのMFIにおける変化)。RCC−53のTIMP−1−GPI/FAS誘導性アポトーシスを確認するために、細胞質クロマチンの検出に基づいた第二のELISAアッセイを採用した。このアッセイの利点として、結果の解釈について主観性が入らないこと、およびアネキシンV染色と比較して感度が高いこと挙げられる。クロマチンELISAは、少なくも300個のアポトーシス細胞を検出することができ、細胞表面上のアネキシンVの初期の存在からかなり下流のアポトーシス事象を測定する。アネキシンV FACS分析に見出されたように(図6B)、RCC−53をL−957単独で処理すると、アポトーシスのわずかな増加が引き起こされた(図6C)。しかしながら、RCC−53細胞をTIMP−1−GPIで処理すると、抗FAS誘導性アポトーシスに対する細胞の感受性が用量依存な様式で劇的に増加した。
これらの結果は、癌細胞をGPIアンカー型TIMPで処理すると、FAS誘導性アポトーシスによる癌細胞の死滅がもたらされることを実証している。従って、GPIアンカー型TIMPは抗腫瘍剤として有用である。
実施例7
RCCのTIMP−1−GPI処理はBCL−2タンパク質の発現を低下させ、BAXタンパク質の発現を増加させる
BCL−2タンパク質は、アポトーシスの制御に関与するタンパク質のファミリーを代表する(Igney & Krammer, 2002に概説されている)。このファミリーのいくつかのメンバー(BCL−2およびBCL−XLのような)は抗アポトーシス性であるが、別のもの(BadまたはBAXのような)はアポトーシス促進性である。細胞のアポトーシス刺激に対する感受性は、アポトーシス促進性BCL−2ファミリーメンバーと抗アポトーシス性BCL−2ファミリーメンバーとの間のバランスに依存しうる(Igney & Krammer, 2002)。次に、BCL−2の発現およびBAXの発現に対するTIMP−1−GPI処理の効果を調べた。RCC細胞を700ng/mlのTIMP−1−GPIまたはrhTIMP−1対照と24時間プレインキュベートした後、1μg/ml L−957(または対照mAB)でさらに16時間刺激した。続いて、BCL−2タンパク質とBAXタンパク質のレベルを、細胞内FACSおよびウェスタンブロットを用いて測定した。すべての3つの細胞系において、TIMP−1−GPIでの処理により、アポトーシス促進性BAXの発現が増加し、抗アポトーシス性BCL−2の発現が減少した。ウェスタンブロットアッセイでも同様のパターンが見られた(図7A、B、およびC)。
RCCのTIMP−1−GPI処理はBCL−2タンパク質の発現を低下させ、BAXタンパク質の発現を増加させる
BCL−2タンパク質は、アポトーシスの制御に関与するタンパク質のファミリーを代表する(Igney & Krammer, 2002に概説されている)。このファミリーのいくつかのメンバー(BCL−2およびBCL−XLのような)は抗アポトーシス性であるが、別のもの(BadまたはBAXのような)はアポトーシス促進性である。細胞のアポトーシス刺激に対する感受性は、アポトーシス促進性BCL−2ファミリーメンバーと抗アポトーシス性BCL−2ファミリーメンバーとの間のバランスに依存しうる(Igney & Krammer, 2002)。次に、BCL−2の発現およびBAXの発現に対するTIMP−1−GPI処理の効果を調べた。RCC細胞を700ng/mlのTIMP−1−GPIまたはrhTIMP−1対照と24時間プレインキュベートした後、1μg/ml L−957(または対照mAB)でさらに16時間刺激した。続いて、BCL−2タンパク質とBAXタンパク質のレベルを、細胞内FACSおよびウェスタンブロットを用いて測定した。すべての3つの細胞系において、TIMP−1−GPIでの処理により、アポトーシス促進性BAXの発現が増加し、抗アポトーシス性BCL−2の発現が減少した。ウェスタンブロットアッセイでも同様のパターンが見られた(図7A、B、およびC)。
実施例8
外から加えられたTIMP−1−ムチン−GPIのRCC−53の表面への組み入れ
TIMP−1−ムチン−GPIタンパク質を、実施例1に記載したように作製および単離した。細胞系を700ng/mlの精製TIMP−1−ムチン−GPIまたは組換えヒト(rh)TIMP−1対照タンパク質と1時間インキュベートすることにより、RCC−53、RCC−26、またはA498 RCC細胞系の表面膜に精製GPI−TIMP−1タンパク質が組み入れられることを実証した。表面会合したTIMP−1−ムチン−GPIタンパク質を、FACSを用いて検出した。TIMP−1−ムチン−GPI構築物は、表面膜へ効率的に組み入れられ、抗腫瘍活性を効果的に促進した。
外から加えられたTIMP−1−ムチン−GPIのRCC−53の表面への組み入れ
TIMP−1−ムチン−GPIタンパク質を、実施例1に記載したように作製および単離した。細胞系を700ng/mlの精製TIMP−1−ムチン−GPIまたは組換えヒト(rh)TIMP−1対照タンパク質と1時間インキュベートすることにより、RCC−53、RCC−26、またはA498 RCC細胞系の表面膜に精製GPI−TIMP−1タンパク質が組み入れられることを実証した。表面会合したTIMP−1−ムチン−GPIタンパク質を、FACSを用いて検出した。TIMP−1−ムチン−GPI構築物は、表面膜へ効率的に組み入れられ、抗腫瘍活性を効果的に促進した。
実施例9
個体における残存癌の処置のためのTIMP−GPI
TIMP−1−GPIまたはTIMP−ムチン−GPI試薬を、外科的腫瘍切除後、切除領域へ局所的に1μg/mlで投与する。手術不能の腫瘍、グリア芽細胞腫(星状細胞腫悪性度IV WHO)を外科的に除去し、当該試薬を創縫合前に導入する。
個体における残存癌の処置のためのTIMP−GPI
TIMP−1−GPIまたはTIMP−ムチン−GPI試薬を、外科的腫瘍切除後、切除領域へ局所的に1μg/mlで投与する。手術不能の腫瘍、グリア芽細胞腫(星状細胞腫悪性度IV WHO)を外科的に除去し、当該試薬を創縫合前に導入する。
実施例10
個体における残存癌の処置のためのTIMP−GPI
TIMP−1−GPIまたはTIMP−ムチン−GPI試薬の1μg/mlの量を外科的腫瘍切除後、切除領域へ局所的に投与する。腫瘍、進行期の乳癌、を外科的に除去し、特に局所的再発の臨床的リスクがある場合には、当該試薬を創縫合前に導入する。
個体における残存癌の処置のためのTIMP−GPI
TIMP−1−GPIまたはTIMP−ムチン−GPI試薬の1μg/mlの量を外科的腫瘍切除後、切除領域へ局所的に投与する。腫瘍、進行期の乳癌、を外科的に除去し、特に局所的再発の臨床的リスクがある場合には、当該試薬を創縫合前に導入する。
実施例11
腫瘍転移のモデルにおけるTIMP−GPIの評価
TIMP−1−GPIの腫瘍転移への効果を評価した。マウスのモデルを用い、肝臓へ効率的に転移するT細胞リンパ腫を、TIMP−1−GPIとrhTIMP−1対照タンパク質のいずれかで前処理した。尾静脈を介して生じた腫瘍を投与し、肝臓における腫瘍の分布を3日後と7日後に測定した。その結果、TIMP−1−GPI処理された細胞の方がTIMP処理された対照細胞と比較して、微小転移のレベルが有意に低いことが実証された。
腫瘍転移のモデルにおけるTIMP−GPIの評価
TIMP−1−GPIの腫瘍転移への効果を評価した。マウスのモデルを用い、肝臓へ効率的に転移するT細胞リンパ腫を、TIMP−1−GPIとrhTIMP−1対照タンパク質のいずれかで前処理した。尾静脈を介して生じた腫瘍を投与し、肝臓における腫瘍の分布を3日後と7日後に測定した。その結果、TIMP−1−GPI処理された細胞の方がTIMP処理された対照細胞と比較して、微小転移のレベルが有意に低いことが実証された。
実施例12
マトリゲル浸潤アッセイ
TIMP−1−GPIの、実施例11の腫瘍細胞系への効果を、一連のマトリゲル実験において分析した。その結果、TIMP−1−GPIが、rhTIMP−1と比較して、T細胞腫瘍系細胞のマトリゲル浸潤を起こす能力に著しい効果を生じることが確認された。
マトリゲル浸潤アッセイ
TIMP−1−GPIの、実施例11の腫瘍細胞系への効果を、一連のマトリゲル実験において分析した。その結果、TIMP−1−GPIが、rhTIMP−1と比較して、T細胞腫瘍系細胞のマトリゲル浸潤を起こす能力に著しい効果を生じることが確認された。
実施例13
TIMP融合構築物の線維芽細胞のフィブロネクチン産生への効果
rhTIMP−1とTIMP−1−GPIの存在下または非存在下で、線維芽細胞を集密的(confluent)になるまで培養した。発現および分泌したフィブロネクチンを、抗フィブロネクチン抗体を用いるウェスタンブロット分析により定量した(β−アクチンを対照とした)。図9はこの実験の結果を示しており、rhTIMP−1(700ng/mlにおける)存在下ではフィブロネクチン発現の有意な減少は全く見られなかったが、TIMP−1−GPI存在下(700ng/ml)では線維芽細胞が分泌するフィブロネクチンは強力に低下したことを明らかに実証している。
TIMP融合構築物の線維芽細胞のフィブロネクチン産生への効果
rhTIMP−1とTIMP−1−GPIの存在下または非存在下で、線維芽細胞を集密的(confluent)になるまで培養した。発現および分泌したフィブロネクチンを、抗フィブロネクチン抗体を用いるウェスタンブロット分析により定量した(β−アクチンを対照とした)。図9はこの実験の結果を示しており、rhTIMP−1(700ng/mlにおける)存在下ではフィブロネクチン発現の有意な減少は全く見られなかったが、TIMP−1−GPI存在下(700ng/ml)では線維芽細胞が分泌するフィブロネクチンは強力に低下したことを明らかに実証している。
加えて、線維芽細胞により転写されるフィブロネクチンRNAをノーザンブロット分析により評価した。線維芽細胞を、10ng/mlの線維芽細胞活性化TNF−αの存在下(図10A)または非存在下(図10B)において、350ng/mlのTIMP−1−GPI、700ng/mlのTIMP−1−GPI、700ng/mlの変性TIMP−1−GPI、および700ng/mlのrhTIMP−1−GPI、それぞれと共に培養した。さらに、0%、1%、5%、または10%のFCSを培地中に含めた。
これらの結果は、350ng/ml濃度のTIMP−1−GPIにおいて、転写されたフィブロネクチンRNAが、TNF−αが培地に存在するかどうかに関係なく、かつ培地のFCS含有量に関係なく、有意に低下したことを明確に実証している。700ng/mlのTIMP−1−GPIでは、フィブロネクチンRNAはほとんど検出できなかった。
従って、TIMP−GPI融合構築物は、線維芽細胞における成長因子であるフィブロネクチンの合成および分泌の両方を効率的に阻害する。
実施例14
TIMP融合構築物の線維芽細胞のIL−6産生への効果
実施例13のノーザンブロット分析を、IL−6 RNAに対するプローブを用いて繰り返した。すなわち、線維芽細胞を、10ng/mlの線維芽細胞活性化TNF−αの存在下(図11A)または非存在下(図11B)において、350ng/mlのTIMP−1−GPI、700ng/mlのTIMP−1−GPI、700ng/mlの変性TIMP−1−GPI、および700ng/mlのrhTIMP−1−GPI、それぞれと共に培養した。さらに、0%、1%、5%、または10%のFCSを培地中に含めた(図11)。
TIMP融合構築物の線維芽細胞のIL−6産生への効果
実施例13のノーザンブロット分析を、IL−6 RNAに対するプローブを用いて繰り返した。すなわち、線維芽細胞を、10ng/mlの線維芽細胞活性化TNF−αの存在下(図11A)または非存在下(図11B)において、350ng/mlのTIMP−1−GPI、700ng/mlのTIMP−1−GPI、700ng/mlの変性TIMP−1−GPI、および700ng/mlのrhTIMP−1−GPI、それぞれと共に培養した。さらに、0%、1%、5%、または10%のFCSを培地中に含めた(図11)。
これらの結果は、350ng/ml濃度のTIMP−1−GPIにおいてすでに、転写されたIL−6 RNAが、TNF−αが培地に存在するかどうかに関係なく、かつ培地のFCS含有量に関係なく、際立って低下したことを明確に実証している。
従って、TIMP−GPI融合構築物は、線維芽細胞における創傷治癒に関与するさらに別の重要なサイトカインであるIL−6の合成および分泌を効率的に阻害する。
実施例15
TIMP融合構築物の線維芽細胞によるコラーゲン産生への効果
実施例13および14で行われたノーザンブロット分析を、コラーゲン1A1(図12AおよびB)、コラーゲン4A2(図12CおよびD)、およびコラーゲン16A1(図12EおよびF)に対するプローブを用いてそれぞれ繰り返した。すなわち、線維芽細胞を、10ng/mlの線維芽細胞活性化TNF−αの存在下(図12A、C、E)または非存在下(図12B、D、F)において、350ng/mlのTIMP−1−GPI、700ng/mlのTIMP−1−GPI、700ng/mlの変性TIMP−1−GPI、700ng/mlのrhTIMP−1−GPI、それぞれと共に培養した。さらに、0%、1%、5%、または10%のFCSを培地中に含めた。
TIMP融合構築物の線維芽細胞によるコラーゲン産生への効果
実施例13および14で行われたノーザンブロット分析を、コラーゲン1A1(図12AおよびB)、コラーゲン4A2(図12CおよびD)、およびコラーゲン16A1(図12EおよびF)に対するプローブを用いてそれぞれ繰り返した。すなわち、線維芽細胞を、10ng/mlの線維芽細胞活性化TNF−αの存在下(図12A、C、E)または非存在下(図12B、D、F)において、350ng/mlのTIMP−1−GPI、700ng/mlのTIMP−1−GPI、700ng/mlの変性TIMP−1−GPI、700ng/mlのrhTIMP−1−GPI、それぞれと共に培養した。さらに、0%、1%、5%、または10%のFCSを培地中に含めた。
これらの結果は、350ng/ml濃度のTIMP−1−GPIにおいてすでに、すべての3つの転写されたコラーゲンRNAが、TNF−αが培地に存在するかどうかに関係なく、かつ培地のFCS含有量に関係なく、有意に低下したことを明確に実証している。
従って、TIMP−GPI融合構築物は、ECM生成および組織リモデリングにおける必須タンパク質の1つであるコラーゲンの合成および分泌を阻害する。
実施例16
TIMP融合構築物の線維芽細胞によるTGF−β産生への効果
実施例13〜15のノーザンブロット分析を、TGF−βに対するプローブを用いて繰り返した。すなわち、線維芽細胞を、10ng/mlの線維芽細胞活性化TNF−αの存在下(図13A)または非存在下(図13B)において、350ng/mlのTIMP−1−GPI、700ng/mlのTIMP−1−GPI、700ng/mlの変性TIMP−1−GPI、700ng/mlのrhTIMP−1−GPI、それぞれと共に培養した。さらに、0%、1%、5%、または10%のFCSを培地中に含めた。
TIMP融合構築物の線維芽細胞によるTGF−β産生への効果
実施例13〜15のノーザンブロット分析を、TGF−βに対するプローブを用いて繰り返した。すなわち、線維芽細胞を、10ng/mlの線維芽細胞活性化TNF−αの存在下(図13A)または非存在下(図13B)において、350ng/mlのTIMP−1−GPI、700ng/mlのTIMP−1−GPI、700ng/mlの変性TIMP−1−GPI、700ng/mlのrhTIMP−1−GPI、それぞれと共に培養した。さらに、0%、1%、5%、または10%のFCSを培地中に含めた。
これらの結果は、350ng/ml濃度のTIMP−1−GPIにおいてすでに、TNF−αが培地に存在するかどうかに関係なく、かつ培地のFCS含有量に関係なく、TGF−β RNAをほとんど検出することができなかったことを明確に実証している。
従って、上の実施例により示されているように、TIMP−GPI融合構築物は、線維芽細胞における創傷治癒に関与するさらにもう1つの重要なサイトカイン、すなわちTGF−βの合成および分泌を効率的に阻害する。
実施例17
さらなるTIMP融合構築物の作製
さらなるTIMP融合構築物を、後述の「材料および方法」に従って作製および精製した。具体的には、短縮型(truncated)TIMP−1−GPI融合構築物(配列番号1)、短縮型TIMP−1−muc−GPI融合構築物(配列番号2)、TIMP−2−GPI構築物(配列番号3)、TIMP−3−GPI構築物およびTIMP−3−GPIの変異型(配列番号4)、ならびに、短縮型TIMP−1−フラクタルカイン−GPI融合構築物(配列番号5)を構築、発現、および精製した。
さらなるTIMP融合構築物の作製
さらなるTIMP融合構築物を、後述の「材料および方法」に従って作製および精製した。具体的には、短縮型(truncated)TIMP−1−GPI融合構築物(配列番号1)、短縮型TIMP−1−muc−GPI融合構築物(配列番号2)、TIMP−2−GPI構築物(配列番号3)、TIMP−3−GPI構築物およびTIMP−3−GPIの変異型(配列番号4)、ならびに、短縮型TIMP−1−フラクタルカイン−GPI融合構築物(配列番号5)を構築、発現、および精製した。
短縮型TIMP−1−GPI融合構築物(配列番号1)は、36アミノ酸長のGPIアンカーに融合した、ヒトTIMP−1タンパク質の最初の152個のアミノ酸(すなわち、C末端アミノ酸126〜207位が除去された)を含む。短縮型TIMP−1−muc−GPI融合構築物(配列番号2)は、36アミノ酸長のGPIアンカーに融合したヒトCXCR16(ムチン)のアミノ酸256〜380位に融合した、ヒトTIMP−1タンパク質の最初の152個のアミノ酸を含む。できた融合構築物は、295個のアミノ酸を含み、32,111kDaの分子量を有する。
完全長TIMP−1−GPIから類推して、TIMP−2−GPI(配列番号3)およびTIMP−3−GPIは、それぞれ、GPIアンカー36アミノ酸長に融合した、ヒトTIMP−2およびTIMP−3タンパク質からなる。TIMP−3−GPIの変異型融合構築物(配列番号4)を作製するために、ヒトTIMP−3のGAG結合ドメイン(当該タンパク質の細胞表面との会合に関与すると考えられる)を、以下の6つの交換により変異させた:R43A、K45A、K49A、K53A、K65A、およびK68A。短縮型TIMP−1−フラクタルカイン−GPI融合構築物(配列番号5)は、36アミノ酸長のGPIアンカーに融合したヒトCX3CL1のアミノ酸100〜342位に融合した、ヒトTIMP−1のN末端部分(アミノ酸1〜152位)を含む。
短縮型TIMP−1−GPI(配列番号1)、短縮型TIMP−1−ムチン−GPI(配列番号2)、および短縮型TIMP−1−フラクタルカイン−GPI(配列番号5)構築物の詳細な試験
a)外から加えられる、短縮型TIMP−1−GPI、短縮型TIMP−1−ムチン−GPI、および短縮型TIMP−1−フラクタルカイン−GPIの細胞表面への組み入れ
短縮型TIMP−1−GPI、短縮型TIMP−1−ムチン−GPI、および短縮型TIMP−1−フラクタルカイン−GPIを、Djafarzadeh et al., 2004に従って作製および単離した。精製された融合構築物の、RCC−53、RCC−26、またはA498 RCC細胞系の細胞表面膜への組み入れについて、700ng/mlの精製された、短縮型TIMP−1−GPI、短縮型TIMP−1−ムチン−GPI、および短縮型TIMP−1−フラクタルカイン−GPI、それぞれとの細胞系を1時間インキュベートし、ムチン、フラクタルカイン、およびGPIドメインを欠損しているそれぞれの短縮型TIMP−1の対照TIMP−1タンパク質の場合と比較した。その後、表面会合したタンパク質をFACS分析にて検出した。その結果、対照TIMP−1ではFACSシフトにおける少しの変化へも導かれないだろうと予想されたが、短縮型TIMP−1−GPI、短縮型TIMP−1−ムチン−GPI、および短縮型TIMP−1−フラクタルカイン−GPIでは、いずれもTIMP−1についての強い表面シグナルを生じた。
a)外から加えられる、短縮型TIMP−1−GPI、短縮型TIMP−1−ムチン−GPI、および短縮型TIMP−1−フラクタルカイン−GPIの細胞表面への組み入れ
短縮型TIMP−1−GPI、短縮型TIMP−1−ムチン−GPI、および短縮型TIMP−1−フラクタルカイン−GPIを、Djafarzadeh et al., 2004に従って作製および単離した。精製された融合構築物の、RCC−53、RCC−26、またはA498 RCC細胞系の細胞表面膜への組み入れについて、700ng/mlの精製された、短縮型TIMP−1−GPI、短縮型TIMP−1−ムチン−GPI、および短縮型TIMP−1−フラクタルカイン−GPI、それぞれとの細胞系を1時間インキュベートし、ムチン、フラクタルカイン、およびGPIドメインを欠損しているそれぞれの短縮型TIMP−1の対照TIMP−1タンパク質の場合と比較した。その後、表面会合したタンパク質をFACS分析にて検出した。その結果、対照TIMP−1ではFACSシフトにおける少しの変化へも導かれないだろうと予想されたが、短縮型TIMP−1−GPI、短縮型TIMP−1−ムチン−GPI、および短縮型TIMP−1−フラクタルカイン−GPIでは、いずれもTIMP−1についての強い表面シグナルを生じた。
外から加えられたタンパク質がGPIアンカーされることを実証するために、RCC−53細胞を、まず、短縮型TIMP−1−GPI、短縮型TIMP−1−ムチン−GPI、および短縮型TIMP−1−フラクタルカイン−GPI、それぞれ(200ng/mlまたは700ng/ml)とインキュベートし、その後、60ng/mlホスホリパーゼC(PLC)で処理した。FACS分析の結果、PLC消化後ではTIMP−1細胞表面シグナルが完全に喪失していると予想された。アンカー型TIMP−1構築物の組み込みの効率を測定するために、膜から解放されたTIMP−1構築物を洗浄緩衝液に収集し、TIMP−1特異的ELISAを用いて定量した。開始TIMP−1抗原の大部分が200ng/mlの試料から回収されるだろうと予想された。
b)短縮型TIMP−1−GPI、短縮型TIMP−1−ムチン−GPI、および短縮型TIMP−1−フラクタルカイン−GPIタンパク質は、プロMMP−2およびプロMMP−9のRCC−53からの放出を遮断する
MMP−2およびMMP−9の発現の増加は、典型的には、RCCの不良な予後と相関する(Hemmerlein et al., 2004)。病期IV期明細胞癌細胞系RCC−53は恒常的にプロMMP−2およびプロMMP−9の両方を分泌する(図2)。増加性表面TIMP−1レベルの、MMP−2およびMMP−9タンパク質の恒常的放出への効果を、ゼラチナーゼ酵素電気泳動アッセイ(Djafarzadeh et al., 2004; Klier et al., 2001)を用いて試験した。600ng/mlまたは1200ng/mlのrhTIMP−1タンパク質では、プロMMP−2またはプロMMP−9の分泌に効果は見られなかった。対照的に、10ng/mlから開始して、短縮型TIMP−1−GPI、短縮型TIMP−1−ムチン−GPI、および短縮型TIMP−1−フラクタルカイン−GPI処理では、いずれも、実施例2に記載されたTIMP−1−GPI処理に匹敵する、プロMMP−2およびプロMMP−9の両方の増殖培地への放出の濃度依存性減少を示していると予想された。
MMP−2およびMMP−9の発現の増加は、典型的には、RCCの不良な予後と相関する(Hemmerlein et al., 2004)。病期IV期明細胞癌細胞系RCC−53は恒常的にプロMMP−2およびプロMMP−9の両方を分泌する(図2)。増加性表面TIMP−1レベルの、MMP−2およびMMP−9タンパク質の恒常的放出への効果を、ゼラチナーゼ酵素電気泳動アッセイ(Djafarzadeh et al., 2004; Klier et al., 2001)を用いて試験した。600ng/mlまたは1200ng/mlのrhTIMP−1タンパク質では、プロMMP−2またはプロMMP−9の分泌に効果は見られなかった。対照的に、10ng/mlから開始して、短縮型TIMP−1−GPI、短縮型TIMP−1−ムチン−GPI、および短縮型TIMP−1−フラクタルカイン−GPI処理では、いずれも、実施例2に記載されたTIMP−1−GPI処理に匹敵する、プロMMP−2およびプロMMP−9の両方の増殖培地への放出の濃度依存性減少を示していると予想された。
c)短縮型TIMP−1−GPI、短縮型TIMP−1−ムチン−GPI、および短縮型TIMP−1−フラクタルカイン−GPIタンパク質は、RCCの増殖に影響を与える
TIMP−1表面エンジニアリングのRCCの増殖への効果を評価するために、MTTアッセイを行った。短縮型TIMP−1−GPI、短縮型TIMP−1−ムチン−GPI、および短縮型TIMP−1−フラクタルカイン−GPIをそれぞれ外から加えると、24時間目、48時間目、および72時間目において、実施例4と匹敵して、RCC−53とA498の増殖が用量依存的に減少していると予想された。RCC−26細胞は極めてゆっくり増殖していると予想され(48+時間倍加速度)、一般的傾向として増殖の抑制が示唆された。
TIMP−1表面エンジニアリングのRCCの増殖への効果を評価するために、MTTアッセイを行った。短縮型TIMP−1−GPI、短縮型TIMP−1−ムチン−GPI、および短縮型TIMP−1−フラクタルカイン−GPIをそれぞれ外から加えると、24時間目、48時間目、および72時間目において、実施例4と匹敵して、RCC−53とA498の増殖が用量依存的に減少していると予想された。RCC−26細胞は極めてゆっくり増殖していると予想され(48+時間倍加速度)、一般的傾向として増殖の抑制が示唆された。
実施例18
実施例17の融合構築物のさらなる評価
実施例1〜16の実験を、実施例17の融合構築物を用いて繰り返したところ、同様の結果が予想された。特に、TIMP−2融合構築物は、ほとんどのMMP(MMP−9を除く)を阻害し、優先的にMMP−2を阻害した。TIMP−3融合構築物は、MMP−1、MMP−2、MMP−3、MMP−9、およびMMP−13、加えてTACEを阻害した。TIMP−3の変異型融合構築物(配列番号4)の組み込み特性を調べたところ、追加として、細胞膜へ組み込む能力の向上を示した(これらの実験は実施例8の方法に従って行った)。短縮型TIMP−1融合構築物(配列番号1、2、5)は、完全長TIMP−1融合構築物と比較して、類似した生物学的機能を示し、従って、TIMPのN末端部分がそれらの阻害機能に必須であるという概念を支持した。フラクタルカイン融合構築物(配列番号5)はさらに、ムチン融合構築物(配列番号4)と匹敵する膜組み込み能力を示した。
実施例17の融合構築物のさらなる評価
実施例1〜16の実験を、実施例17の融合構築物を用いて繰り返したところ、同様の結果が予想された。特に、TIMP−2融合構築物は、ほとんどのMMP(MMP−9を除く)を阻害し、優先的にMMP−2を阻害した。TIMP−3融合構築物は、MMP−1、MMP−2、MMP−3、MMP−9、およびMMP−13、加えてTACEを阻害した。TIMP−3の変異型融合構築物(配列番号4)の組み込み特性を調べたところ、追加として、細胞膜へ組み込む能力の向上を示した(これらの実験は実施例8の方法に従って行った)。短縮型TIMP−1融合構築物(配列番号1、2、5)は、完全長TIMP−1融合構築物と比較して、類似した生物学的機能を示し、従って、TIMPのN末端部分がそれらの阻害機能に必須であるという概念を支持した。フラクタルカイン融合構築物(配列番号5)はさらに、ムチン融合構築物(配列番号4)と匹敵する膜組み込み能力を示した。
結果の考察
本発明によるGPIアンカー型タンパク質を用いる細胞表面エンジニアリングは、従来の遺伝子移入アプローチを超えるいくつかの利点を提供する。すなわち、1)トランスフェクションが困難である細胞、例えば、FAS媒介性アポトーシス抵抗性RCC細胞、また、初代培養物、骨髄前駆体、および免疫系細胞にも適用できる。2)ほんの少数の細胞しか利用できない場合や、細胞を容易に増殖できない場合でも用いることができる。3)細胞表面を細胞型に関係なく改変することができる。4)細胞表面上に最終的に提示されるタンパク質の量を正確に制御することができる。5)複数のGPIアンカー型タンパク質を、同じ細胞へ逐次的または同時に組み入れることができる。
本発明によるGPIアンカー型タンパク質を用いる細胞表面エンジニアリングは、従来の遺伝子移入アプローチを超えるいくつかの利点を提供する。すなわち、1)トランスフェクションが困難である細胞、例えば、FAS媒介性アポトーシス抵抗性RCC細胞、また、初代培養物、骨髄前駆体、および免疫系細胞にも適用できる。2)ほんの少数の細胞しか利用できない場合や、細胞を容易に増殖できない場合でも用いることができる。3)細胞表面を細胞型に関係なく改変することができる。4)細胞表面上に最終的に提示されるタンパク質の量を正確に制御することができる。5)複数のGPIアンカー型タンパク質を、同じ細胞へ逐次的または同時に組み入れることができる。
ヒトRCCは、現在の化学療法剤および放射線療法に抵抗性であるため、治療法の選択肢が限られた進行性腫瘍である。免疫療法はいくらかの患者にとって有効であり、RCCが免疫エフェクター機構により標的となりうることを示唆している。CD8+CTLやNK細胞のような腫瘍浸潤リンパ球はしばしば腎臓癌組織に見られ、インビトロで試験された場合には、たびたび自己腫瘍細胞を認識する(Schendel et al., 1997に概説されている)。これらの有望な観察にもかかわらず、腫瘍は、一般的に増殖し続け、RCCが細胞傷害性機構に対する抵抗性を獲得している可能性があることを示す。起こりうる多くの抗腫瘍応答のためには、免疫系が腫瘍を認識しなければならないだけでなく、癌細胞もまた、CTLやNK細胞により利用される殺害機構に感受性が高くなければならない。癌細胞は、アポトーシスに対する感受性の低下を含む免疫防御を回避するために様々な機構を進化させている(Dunn et al., 2004に概説されている)。
CTLおよびNK細胞は、パーフォリン/グランザイムまたはFAS/FASL依存性アポトーシスにより標的細胞を殺す(Kagi et al., 1994)。インビボでの腫瘍制御のための顆粒エキソサイトーシス対FAS/FASL媒介性溶解活性の相対的な重要性については、論争がある。多くの研究が顆粒エキソサイトーシス機構の優位を指摘しているが、パーフォリンノックアウトマウスを用いた他の研究(Seki et al., 2002)は、FAS依存性アポトーシスがインビボでより顕著な経路を構成しうることを示唆している。RCCを含むほとんどの腫瘍細胞は、FAS媒介性殺傷に本質的に抵抗性である(Frost et al., 2003)。GPIアンカー型TIMPの使用は、腫瘍細胞をFAS媒介性アポトーシスに対して感受性にするための有望な治療アプローチを提示する。
本発明者らは、GPI−TIMP−1を外から添加する細胞エンジニアリングによって、増強されかつ新規なTIMP−1生物活性を誘発できることを示した。外から投与されたTIMP−1−GPIは、RCCの細胞膜へ効率的に挿入され、治療的関連性の可能性と共に、RCC細胞系における様々な生物学的効果を引き出されるようになる。
さらに、GPIアンカー型TIMP−1タンパク質は、多様なRCC発現MMPの細胞表面会合を劇的に変化させた。これは、MMP(プロMMP−2およびプロMMP−9を含む)のRCC細胞からの分泌低下により反映された。TIMP−1はMMP−2の酵素活性を遮断するが、当該酵素のプロ型に結合することは考えられない。けれども、TIMP−1−GPI処理後のプロMMP−2分泌の遮断を実証するデータが、この作用を示唆する。TIMP−1へのGPIアンカーの付加は、TIMP−1タンパク質のMMPに結合する能力を増強した表面化学量論の変化へ導くと思われる。
膜型MMPについても、TIMP−1−GPIの結合の明らかな増加が示された。TIMP−1のMMP−15との会合についてはあまり知られていないが、天然TIMP−1がMMP−16に対してかなり弱い結合しか示さない(Lang et al., 2004)ことに基づくと、TIMP−1−GPIタンパク質のMMP−16への結合が生じることは、予想されないだろう。MMP−16結合に重要なTIMP−1ループの変異分析によれば、TIMP−1における小さな、見かけ上大したことではない変化が、その阻害/結合特性を劇的に変えることが示されている。この場合、TIMP−1の細胞表面上での化学量論の変化は、MMP−16への結合を変えるのに十分であったと思われる。細胞表面上でのMMPの隔離はまた、RCC−53細胞系のECM浸潤を起こす能力の低下と関連していた。
本発明で示したように、TIMP−1−GPI処理により、RCC細胞系の増殖における顕著な用量依存的低下が導かれる。おそらく最も重要なことには、通常はFAS−アポトーシス抵抗性のRCC細胞系が、本発明のTIMP−GPIタンパク質での処理後、FAS/CD95媒介性殺傷に対して感受性になったことである。しかしながら、この薬剤は、パーフォリン経路に対する感受性に影響を及ぼさなかった。これは、GPIアンカー型TIMPが、CTL/NK細胞によるパーフォリン/グランザイム媒介性殺傷によるよりむしろ、FAS誘導性アポトーシス経路による抗腫瘍効果を媒介することを示唆している。
FAS−アポトーシス経路はカスパーゼの活性化により制御されるが、クロム遊離アッセイにより測定されるような、顆粒エキソサイトーシスを利用するCTL/NKによる細胞膜損傷はカスパーゼとは無関係に起こる(Sayers et al., 1998; Seki et al., 2002; Trapani et al., 2000)。カスパーゼの活性化を導く上流の事象は、アポトーシス促進性と抗アポトーシス性のBCL−2ファミリータンパク質間のバランスに関係している。本発明で示したように、GPI−TIMP−1処理によって、抗アポトーシス性BCL−2タンパク質の下方制御と、アポトーシス促進性BAXタンパク質における対応する増加とが生じた。このアポトーシス促進性タンパク質の濃度がより高い方へシフトすることが、TIMP−1表面エンジニアリング化(TIMP surface engineered)RCC細胞のFAS媒介性アポトーシスへの感受性を増加させる1つの理由かもしれない。これらの観察結果は、TIMP−1についての新規な作用を示している。TIMP−3および他のTIMP(TIMP−2およびTIMP−4)についても、同様の作用を示した(データ非提示)。
アデノウイルスベクターを用いて血管平滑筋細胞においてTIMP−1、−2、または−3を過剰発現させると、モデル基底膜を通ってのそれらの遊走が阻害されることが見出された。TIMP−1の過剰発現は細胞増殖に効果を生じなかったが、TIMP−2では細胞増殖の用量依存的な阻害が起こった。TIMP−3の過剰発現もまた増殖の用量依存的な阻害を引き起こし、加えて、ミトコンドリア膜脱分極およびチトクロム−cの漏出を通してのアポトーシスを導いた(Baker et al., 1999; Baker et al., 1998; Smith et al., 1997)。TIMP−3は、他の表面タンパク質との会合とは無関係に、細胞の表面に選択的に結合する唯一のTIMPタンパク質である(Majid et al., 2002; Smith et al., 1997)。GPIアンカーを介してTIMP−1を細胞表面へ集中させることで、TIMP−3について報告されている効果に似た、新規の生物学的作用が導かれる。
TIMP−3は、抗FAS抗体、TNF−α、およびTRAILにより誘導されるアポトーシスに対する黒色腫細胞の感受性を増加させることが示されている。その作用機構は、TIMP−3処理された黒色腫細胞の表面上のFAS、TNF−RI、およびTRAIL−RIの一般的な安定化に関連づけられた(Ahonen et al., 2003)。この受容体表面の発現増加は、カスパーゼ−8およびカスパーゼ−3の活性化に関連づけられた(Ahonen et al., 2003)。
本発明に詳述された実験において、RCC細胞は、TIMP−1−GPI処理後にFAS表面発現における変化を示さなかった(図6A)。加えて、RCC細胞は、TIMP−GPI処理にもかかわらず、TNF−α誘導性アポトーシス(1mlあたり100ユニットから10,000ユニットまで試験された)に対して抵抗性のままであった(データ非提示)。続くRCC細胞のFACS分析では、RCC−53におけるTNF−RI(p55)とTNF−RII(p75)のレベルは辛うじて検出できるものであり、RCC−26またはA498細胞系においては発現が全く見られなかった(データ非提示)。表面発現は、TIMP−1−GPI処理では変化しなかった。従って、TIMP−1−GPI処理後のFAS媒介性アポトーシスに対する感受性の増加は、細胞表面上のデスレセプタータンパク質の一般的な安定化を通して媒介されるのではないとみられる。はっきりしているのは、TIMP−1−GPIでの処理がBcl−2タンパク質のバランスを変化させて、より「アポトーシス促進性」の発現プロファイルを誘発することである。
本発明の結果は、腫瘍生物学、MMP/TIMP機能とアポトーシス経路の間のさらなる関連性を提供する。TIMPタンパク質を直接的またはムチンドメインを介してGPIに連結することで、通常はFAS誘導性アポトーシスに対して抵抗性である腫瘍細胞を、FAS誘導性アポトーシスに対して感受性にする強力な抗腫瘍剤が提示される。この機構により腫瘍細胞は効果的に死滅する。
融合構築物、特にTIMP−1−GPI構築物、TIMP−1−muc−GPI構築物、および配列番号1、2、3、4、5で表わされる構築物の、再生医療、例えば創傷治癒の分野における使用に関して、本発明のTIMP−GPI構築物が、ECM産生の増加へ導く組織リモデリングと線維症の過程に関与する重要な酵素およびサイトカイン(フィブロネクチン、コラーゲン、IL−6、TGF−β)の産生と分泌を効率的に阻害することが本明細書に示されている。従って、GPIアンカー、またはムチンもしくはフラクタルカインおよびGPIを用いて細胞膜においてアンカーされる場合には、TIMPファミリーのメンバー(TIMP−1、TIMP−2、TIMP−3、TIMP−4)は、ECM産生とECMターンオーバーの間の微妙なバランスに影響を及ぼすことにより創傷治癒の過程を効率的に調節するために用いることができる。
材料および方法
細胞系および細胞培養
RCC細胞系であるRCC−53とRCC−26は、患者試料からD.J.S.(Munich, Germany)により作製された。RCC−53、RCC−26、およびA498(American Type Culture Collection)(Giard et al., 1973)は、2mM L−グルタミン(Biochrom KG, Berlin)、1mM ピルビン酸ナトリウム(GIBCO BRL, Life Technologies GmbH, Eggenstein, Germany)、12%加熱不活性化FCS(Biochrom KG, Berlin, No. S01 15)を追加したRPMI1640培地(GIBCO BRL, Life Technologies GmbH, Eggenstein, Germany)中で培養された。新鮮培地を3日ごとに与え、細胞が集密的になった時に培養物を分割した。
細胞系および細胞培養
RCC細胞系であるRCC−53とRCC−26は、患者試料からD.J.S.(Munich, Germany)により作製された。RCC−53、RCC−26、およびA498(American Type Culture Collection)(Giard et al., 1973)は、2mM L−グルタミン(Biochrom KG, Berlin)、1mM ピルビン酸ナトリウム(GIBCO BRL, Life Technologies GmbH, Eggenstein, Germany)、12%加熱不活性化FCS(Biochrom KG, Berlin, No. S01 15)を追加したRPMI1640培地(GIBCO BRL, Life Technologies GmbH, Eggenstein, Germany)中で培養された。新鮮培地を3日ごとに与え、細胞が集密的になった時に培養物を分割した。
細胞傷害性エフェクター細胞:JB4は、本発明者ら自身の施設(E.N.)において作製されたHLA−A2アロ反応性細胞傷害性Tエフェクタークローンであり、Milani et al., 2005に記載のようにして隔週の刺激により増幅した。この細胞は、刺激後7日目または8日目に細胞傷害性アッセイに用いた。ヒトNK白血病性細胞系であるNKL(Robertson et al., 1996)およびNK−92(Gong et al., 1994)は、C.S. Falk(GSF-Institute of Molecular Immunology, Munich, Germany)の好意により供与され、15%加熱不活性化FCSおよび100U/ml 組換えIL−2を含む培地において培養された。細胞傷害性アッセイに用いる前日に、培養物を、新鮮な培地において0.3×106細胞/mlに調整した。
蛍光活性化細胞ソーティング(FACS)分析
細胞を1.5mM EDTA(Biochrom A, Berlin, Germany No. L2113)を含む1×PBS中で剥離し、ヒトの下記タンパク質に特異的な抗体と氷上で60分間、インキュベートした;TIMP−1(IM32L)、MMP−1(IM35L−100)、MMP−3(IM36L−100)、MMP−8(IM38L)(CALBIOCHEM, Merck Darmstadt, Germany);MMP−9(IM 61−100)、MMP−2(IM 51L)(ONCOGENE, Bad Soden, Germany);MMP−7(MAB907)、MMP−12(MAB917)、MMP−14(MAB9181)(R&D Systems, Minneapolis, USA);MMP−13(IM44L)、MMP−15(IM48L)、MMP−16(IM50L)(CALBIOCHEM, Merck Darmstadt, Germany)、およびIgG1κ(SIGMA-AlDRICH, Taufkirchen, Germany No. M9269。ICAM−1およびHLA抗体(W6/32およびHB82)については以前に記載した(Johnson et al., 1988; Barnstable et al., 1978; Parham & Brodsky, 1981)。抗FAS(H. Engelmann、未発表データ)、抗TNF−RI、抗TNF−RII、およびアイソタイプ対照抗体はBigda et al., 1994に記載のように用いた。細胞を1×PBSで3回洗浄し、FTIC標識ロバ抗マウスモノクローナル抗体(DAKO A/S, Glostrup, Denmark No. F0313)と氷上で45分間インキュベートし、その後、1×PBSで3回洗浄し、フローサイトメーター(FACSCalibur, Becton, Dickinson and Company, San Jose, CA, USA)およびCellQuestソフトウェアを用いて分析した。抗BCL−2抗体(ALX-804-225)および抗BAX抗体(ANC-357-040)はALEXIS(Grunberg, Germany)から取得した。
細胞を1.5mM EDTA(Biochrom A, Berlin, Germany No. L2113)を含む1×PBS中で剥離し、ヒトの下記タンパク質に特異的な抗体と氷上で60分間、インキュベートした;TIMP−1(IM32L)、MMP−1(IM35L−100)、MMP−3(IM36L−100)、MMP−8(IM38L)(CALBIOCHEM, Merck Darmstadt, Germany);MMP−9(IM 61−100)、MMP−2(IM 51L)(ONCOGENE, Bad Soden, Germany);MMP−7(MAB907)、MMP−12(MAB917)、MMP−14(MAB9181)(R&D Systems, Minneapolis, USA);MMP−13(IM44L)、MMP−15(IM48L)、MMP−16(IM50L)(CALBIOCHEM, Merck Darmstadt, Germany)、およびIgG1κ(SIGMA-AlDRICH, Taufkirchen, Germany No. M9269。ICAM−1およびHLA抗体(W6/32およびHB82)については以前に記載した(Johnson et al., 1988; Barnstable et al., 1978; Parham & Brodsky, 1981)。抗FAS(H. Engelmann、未発表データ)、抗TNF−RI、抗TNF−RII、およびアイソタイプ対照抗体はBigda et al., 1994に記載のように用いた。細胞を1×PBSで3回洗浄し、FTIC標識ロバ抗マウスモノクローナル抗体(DAKO A/S, Glostrup, Denmark No. F0313)と氷上で45分間インキュベートし、その後、1×PBSで3回洗浄し、フローサイトメーター(FACSCalibur, Becton, Dickinson and Company, San Jose, CA, USA)およびCellQuestソフトウェアを用いて分析した。抗BCL−2抗体(ALX-804-225)および抗BAX抗体(ANC-357-040)はALEXIS(Grunberg, Germany)から取得した。
TIMP−1−GPIタンパク質の精製
TIMP−1−GPIタンパク質は、Djafarzadeh, et al., 2004に記載のように製造および精製した。略説すると、ヒトTIMP−1を、hTIMP−1特異的プライマーを用いてcDNAからクローニングし、LFA−3からクローニングされたGPI−シグナル配列(Kirby et al., 1995; Mdedof et al., 1996)へ翻訳終止コドンなしに融合し、pEF−DHFRへサブクローニングし、DHFR欠損チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞へ安定に導入し、Mack et al., 1995に記載のように選抜した。TIMP−1−GPI融合タンパク質を、界面活性剤Triton X-100による抽出によりCHO細胞から精製し、続いて、DEAE、ヘパリンセファロース、およびサイズ排除を用いたカラム精製を行った(Djafarzadeh et al., 2004)。
TIMP−1−GPIタンパク質は、Djafarzadeh, et al., 2004に記載のように製造および精製した。略説すると、ヒトTIMP−1を、hTIMP−1特異的プライマーを用いてcDNAからクローニングし、LFA−3からクローニングされたGPI−シグナル配列(Kirby et al., 1995; Mdedof et al., 1996)へ翻訳終止コドンなしに融合し、pEF−DHFRへサブクローニングし、DHFR欠損チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞へ安定に導入し、Mack et al., 1995に記載のように選抜した。TIMP−1−GPI融合タンパク質を、界面活性剤Triton X-100による抽出によりCHO細胞から精製し、続いて、DEAE、ヘパリンセファロース、およびサイズ排除を用いたカラム精製を行った(Djafarzadeh et al., 2004)。
TIMP−1 ELISA
製造会社の説明書に従ったプロトコールによるヒトTIMP−1特異的ELISA(MAB970, R&D Systems)で、溶液中のTIMP−1のレベルをモニターした。コーティング化抗ヒトTIMP−1 mAB(MAB970)、ビオチン化抗ヒトTIMP−1検出mAB(BAF970)、およびrhTIMP−1タンパク質(970−TM)は、R&D Systems GmbH(Wiesbaden, Germany)から購入した。
製造会社の説明書に従ったプロトコールによるヒトTIMP−1特異的ELISA(MAB970, R&D Systems)で、溶液中のTIMP−1のレベルをモニターした。コーティング化抗ヒトTIMP−1 mAB(MAB970)、ビオチン化抗ヒトTIMP−1検出mAB(BAF970)、およびrhTIMP−1タンパク質(970−TM)は、R&D Systems GmbH(Wiesbaden, Germany)から購入した。
TIMP−1−GPIの細胞膜への組み入れ
RCC−53細胞(5〜10×106細胞/ml)を、37℃/5%CO2において、200〜700ng/mlの精製されたhTIMP−1−GPIとインキュベートした。その後、細胞を冷PBSで3回洗浄し、ヒトTIMP−1特異的モノクローナル抗体(上記参照)を用いてFACSにより分析した。
RCC−53細胞(5〜10×106細胞/ml)を、37℃/5%CO2において、200〜700ng/mlの精製されたhTIMP−1−GPIとインキュベートした。その後、細胞を冷PBSで3回洗浄し、ヒトTIMP−1特異的モノクローナル抗体(上記参照)を用いてFACSにより分析した。
ホスホリパーゼCによるGPIアンカー切断
細胞(5〜10×106細胞/ml)を、無血清培地内で、200ngまたは700ngのTIMP−1−GPIまたはrhTIMP−1タンパク質と、5%CO2/37℃で1時間インキュベートした。これらの細胞を冷PBSで3回洗浄し、37℃/5%CO2で30分間、無血清培地内で、60ng/ml ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼC(SIGMA-ALDRICH, Taufkirchen, Germany No. 661-9)で処理した。細胞を3回洗浄し、すべての上清を回収した。
細胞(5〜10×106細胞/ml)を、無血清培地内で、200ngまたは700ngのTIMP−1−GPIまたはrhTIMP−1タンパク質と、5%CO2/37℃で1時間インキュベートした。これらの細胞を冷PBSで3回洗浄し、37℃/5%CO2で30分間、無血清培地内で、60ng/ml ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼC(SIGMA-ALDRICH, Taufkirchen, Germany No. 661-9)で処理した。細胞を3回洗浄し、すべての上清を回収した。
増殖
RCC−53、A498、またはRCC−26細胞(30×103/100μl培地)を96ウェルマイクロタイタープレート内で24時間、標準条件下で培養し、堅固に付着し、かつ安定に増殖した細胞を得た。上清を捨てた後、TIMP−1−GPI、緩衝液、またはrhTIMP−1を含む50μlの培地を細胞に加え、24〜72時間、インキュベートした。次に、(3,5−ジメチルチアゾール−2−イル−2,5−ジフェニル−テトラゾリウムブロミド)MTT(SIGMA-ALDRICH, Taufkirchen, Germany No. M2128)の1mg/ml溶液を50μl加えた。37℃での3時間のインキュベーション後、ホルマザン結晶を、100μlのイソプロパノールおよび0.04N HClの添加により溶解した。続いて、GENios plus TEC AN ELISAリーダーを用いて550nmの吸光度を測定した。各実験について少なくとも6ウェルを、実験条件および時点ごとに分析した。
RCC−53、A498、またはRCC−26細胞(30×103/100μl培地)を96ウェルマイクロタイタープレート内で24時間、標準条件下で培養し、堅固に付着し、かつ安定に増殖した細胞を得た。上清を捨てた後、TIMP−1−GPI、緩衝液、またはrhTIMP−1を含む50μlの培地を細胞に加え、24〜72時間、インキュベートした。次に、(3,5−ジメチルチアゾール−2−イル−2,5−ジフェニル−テトラゾリウムブロミド)MTT(SIGMA-ALDRICH, Taufkirchen, Germany No. M2128)の1mg/ml溶液を50μl加えた。37℃での3時間のインキュベーション後、ホルマザン結晶を、100μlのイソプロパノールおよび0.04N HClの添加により溶解した。続いて、GENios plus TEC AN ELISAリーダーを用いて550nmの吸光度を測定した。各実験について少なくとも6ウェルを、実験条件および時点ごとに分析した。
酵素電気泳動法
RCC−53細胞を24ウェルプレート内で培養した(5×104細胞/ウェル)。培地を、rhTIMP−1か増加性量のTIMP−1−GPIのいずれかを含む無血清培地と24時間で交換し、24時間、48時間、および72時間、インキュベートした。Djafarzadeh et al., 2004記載のように、細胞上清を10%SDS−ポリアクリルアミドゲル(Invitrogen, Groningen, Netherlands, No. EC61755BOX)を用いるゼラチン酵素電気泳動法により分析した。組換えMMP−9酵素(Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden, No. RPN2634)を陽性対照として用いた。
RCC−53細胞を24ウェルプレート内で培養した(5×104細胞/ウェル)。培地を、rhTIMP−1か増加性量のTIMP−1−GPIのいずれかを含む無血清培地と24時間で交換し、24時間、48時間、および72時間、インキュベートした。Djafarzadeh et al., 2004記載のように、細胞上清を10%SDS−ポリアクリルアミドゲル(Invitrogen, Groningen, Netherlands, No. EC61755BOX)を用いるゼラチン酵素電気泳動法により分析した。組換えMMP−9酵素(Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden, No. RPN2634)を陽性対照として用いた。
細胞外浸潤アッセイ
細胞のECMに浸潤する能力に対するTIMP−1−GPI処理対rhTIMP−1処理の効果を、市販の細胞浸潤アッセイ(Chemicon International Inc., Temedula, CA, No. ECM 555)を用いて評価した。まず、RCC−53細胞のECMに浸潤する能力について分析した。インサートの底における浸潤された細胞を、添付のプロトコールに記載のように、剥離し、溶解し、CyQuant色素により検出した。2ng/ml〜8ng/mlの増加性レベルの血管内皮増殖因子(VEGF)を、浸潤を増強するために用いた。最適な遊走は、4ng/ml VEGFで見られた(データ非提示)。次に、対照rhTIMP−1またはRIMP−1−GPIの350ng/mlおよび700ng/mlでの処理の遊走への効果を測定した。TIMP薬剤の潜在的効果を定量するために、4ng/ml VEGFに対するRC−53細胞のベースライン遊走を0に設定した。VEGF誘導性遊走に対する100%「阻害」の値を、VEGFの非存在下におけるRCC−53細胞の遊走/浸潤として設定した。rhTIMPまたはTIMP−1−GPIのRCC−53細胞浸潤への結果として生じた効果を、「最大」値に対するパーセント変化(負または正)として計算した。
細胞のECMに浸潤する能力に対するTIMP−1−GPI処理対rhTIMP−1処理の効果を、市販の細胞浸潤アッセイ(Chemicon International Inc., Temedula, CA, No. ECM 555)を用いて評価した。まず、RCC−53細胞のECMに浸潤する能力について分析した。インサートの底における浸潤された細胞を、添付のプロトコールに記載のように、剥離し、溶解し、CyQuant色素により検出した。2ng/ml〜8ng/mlの増加性レベルの血管内皮増殖因子(VEGF)を、浸潤を増強するために用いた。最適な遊走は、4ng/ml VEGFで見られた(データ非提示)。次に、対照rhTIMP−1またはRIMP−1−GPIの350ng/mlおよび700ng/mlでの処理の遊走への効果を測定した。TIMP薬剤の潜在的効果を定量するために、4ng/ml VEGFに対するRC−53細胞のベースライン遊走を0に設定した。VEGF誘導性遊走に対する100%「阻害」の値を、VEGFの非存在下におけるRCC−53細胞の遊走/浸潤として設定した。rhTIMPまたはTIMP−1−GPIのRCC−53細胞浸潤への結果として生じた効果を、「最大」値に対するパーセント変化(負または正)として計算した。
アポトーシスのアネキシンV検出
単細胞レベルでのアポトーシス細胞対壊死細胞の検出および定量は、アネキシンV−FLUOS染色キット(Becton, Dickinson and Company, Heidelberg, Germany, No. 556547)を用いて行った。RCC−53細胞を、24ウェルプレートへ1×106細胞/ウェルで播種し、一晩、付着させた。その後、ウェルを1×PBSで3回すすぎ、1mlの無血清RPMI1640培地を加え、続いて、700ng/mlのTIMP−1−GPIまたはrhTIMP−1を加えた。細胞を37℃/5%CO2で24時間インキュベートした。24時間後、1μg/ml抗FAS活性化mAB L−957(H. Engelmann、未発表データ)またはアイソタイプ対照を加え、37℃/5%CO2で16時間、さらにインキュベートした。細胞をPBSで洗浄し、ペレットにし、室温で15分間、染色溶液(アネキシンV−フルオレセイン標識試薬およびヨウ化プロピジウム(PI)を含むHepes緩衝液)に再懸濁した。その後、細胞をフローサイトメトリーにより分析した。経時変化を調べた結果、RCC細胞におけるアネキシンV結合がPI反応性に先行していた。
単細胞レベルでのアポトーシス細胞対壊死細胞の検出および定量は、アネキシンV−FLUOS染色キット(Becton, Dickinson and Company, Heidelberg, Germany, No. 556547)を用いて行った。RCC−53細胞を、24ウェルプレートへ1×106細胞/ウェルで播種し、一晩、付着させた。その後、ウェルを1×PBSで3回すすぎ、1mlの無血清RPMI1640培地を加え、続いて、700ng/mlのTIMP−1−GPIまたはrhTIMP−1を加えた。細胞を37℃/5%CO2で24時間インキュベートした。24時間後、1μg/ml抗FAS活性化mAB L−957(H. Engelmann、未発表データ)またはアイソタイプ対照を加え、37℃/5%CO2で16時間、さらにインキュベートした。細胞をPBSで洗浄し、ペレットにし、室温で15分間、染色溶液(アネキシンV−フルオレセイン標識試薬およびヨウ化プロピジウム(PI)を含むHepes緩衝液)に再懸濁した。その後、細胞をフローサイトメトリーにより分析した。経時変化を調べた結果、RCC細胞におけるアネキシンV結合がPI反応性に先行していた。
クロマチン特異的ELISAによるアポトーシスの測定
アポトーシスについては、Roche社のCell Death Detection ELISA Plusキット(Pensberg, Germany, No. 1774425)を用いて調べた。RCC−53細胞を、4×104細胞/ウェルの濃度で96ウェルディッシュへ播種し、一晩、付着させた。ウェルを1×PBSで3回すすぎ、200μlの無血清RPMI1640培地を各ウェルへ加え、続いて、700ng/mlのTIMP−1−GPIまたはrhTIMP−1を加えた。その後、細胞を37℃/5%CO2で24時間インキュベートした。TIMP−1−GPIまたはrhTIMP−1との24時間インキュベーション後、1μg/ml 活性化抗FASmAB L−957またはアイソタイプ対照モノクローナル抗体を加え、37℃/5%CO2で16時間インキュベートした。その後、プレートを遠心分離し、上清を注意深く除去した。細胞ペレットを、製造会社により提供された200mlの溶解緩衝液へ30分間置き、遠心分離した。上清のアリコート(20μl)を、細胞質ヌクレオソームの存在を検出するための抗DNA抗体および抗ヒストン抗体を用いたELISAに用いた
アポトーシスについては、Roche社のCell Death Detection ELISA Plusキット(Pensberg, Germany, No. 1774425)を用いて調べた。RCC−53細胞を、4×104細胞/ウェルの濃度で96ウェルディッシュへ播種し、一晩、付着させた。ウェルを1×PBSで3回すすぎ、200μlの無血清RPMI1640培地を各ウェルへ加え、続いて、700ng/mlのTIMP−1−GPIまたはrhTIMP−1を加えた。その後、細胞を37℃/5%CO2で24時間インキュベートした。TIMP−1−GPIまたはrhTIMP−1との24時間インキュベーション後、1μg/ml 活性化抗FASmAB L−957またはアイソタイプ対照モノクローナル抗体を加え、37℃/5%CO2で16時間インキュベートした。その後、プレートを遠心分離し、上清を注意深く除去した。細胞ペレットを、製造会社により提供された200mlの溶解緩衝液へ30分間置き、遠心分離した。上清のアリコート(20μl)を、細胞質ヌクレオソームの存在を検出するための抗DNA抗体および抗ヒストン抗体を用いたELISAに用いた
ウェスタンブロット
ウェスタンブロットは、無血清増殖培地におけるMMPの検出に用いられた。用いた抗MMP抗体については、上記(FACS分析)されている。以下を含む組換えヒトMMPウェスタンブロッティングスタンダードは、R&D Systems(Minneapolis, USA)から購入した;MMP−1(WBC024)、MMP−2(WBC025)、MMP−3(WBC015)、MMP−8(WBC017)、MMP−12(WBC019)、およびMMP−13(WBC020)。ウェスタンブロットはまた、BCL−2、BAX(モノクローナル抗体について上記参照)、およびβ−アクチン(Acris Hiddenhausen, Germany, No. ab8227)の検出にも用いた。全タンパク質は、市販のウェスタンブロット分析キットChemiluminescent Immunodetection System(Invitrogen, Groningen, Netherlands)を用いて検出した。
ウェスタンブロットは、無血清増殖培地におけるMMPの検出に用いられた。用いた抗MMP抗体については、上記(FACS分析)されている。以下を含む組換えヒトMMPウェスタンブロッティングスタンダードは、R&D Systems(Minneapolis, USA)から購入した;MMP−1(WBC024)、MMP−2(WBC025)、MMP−3(WBC015)、MMP−8(WBC017)、MMP−12(WBC019)、およびMMP−13(WBC020)。ウェスタンブロットはまた、BCL−2、BAX(モノクローナル抗体について上記参照)、およびβ−アクチン(Acris Hiddenhausen, Germany, No. ab8227)の検出にも用いた。全タンパク質は、市販のウェスタンブロット分析キットChemiluminescent Immunodetection System(Invitrogen, Groningen, Netherlands)を用いて検出した。
細胞媒介性細胞傷害性
標的細胞をCr51で1〜2時間標識し、96−V底プレートで、ウェルあたり2000細胞の一定細胞数のエフェクター細胞と共インキュベートした。エフェクター細胞の4段階滴定の二連測定を、すべての実験において採用した。自発性遊離および最大遊離を、それぞれ、標的細胞のみをインキュベートすることにより、および標識細胞を直接カウントすることにより、測定した。加湿5%CO2雰囲気における37℃での4時間のインキュベーション後、上清を回収し、Lumaplate固体シンチレーションマイクロプレートへ移し、一晩乾燥させ、TopCountマイクロプレートシンチレーションカウンター(Packard, Meriden, CT)上でカウントした。各E:T比について、溶解のパーセンテージを以下のとおり計算した:%特異的溶解=(実験cpm−自発性cpm/最大cpm−自発性cpm)×100。標的細胞の自発性遊離は、常に総最大遊離の<15%であった。
標的細胞をCr51で1〜2時間標識し、96−V底プレートで、ウェルあたり2000細胞の一定細胞数のエフェクター細胞と共インキュベートした。エフェクター細胞の4段階滴定の二連測定を、すべての実験において採用した。自発性遊離および最大遊離を、それぞれ、標的細胞のみをインキュベートすることにより、および標識細胞を直接カウントすることにより、測定した。加湿5%CO2雰囲気における37℃での4時間のインキュベーション後、上清を回収し、Lumaplate固体シンチレーションマイクロプレートへ移し、一晩乾燥させ、TopCountマイクロプレートシンチレーションカウンター(Packard, Meriden, CT)上でカウントした。各E:T比について、溶解のパーセンテージを以下のとおり計算した:%特異的溶解=(実験cpm−自発性cpm/最大cpm−自発性cpm)×100。標的細胞の自発性遊離は、常に総最大遊離の<15%であった。
参考文献
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Claims (30)
- メタロプロテイナーゼの組織インヒビター(TIMP)またはその生物活性断片のアミノ酸配列を含む融合構築物であって、該TIMPまたはその生物活性断片が、後にグリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカーが続くムチンドメインに連結されている、融合構築物(TIMP−ムチン−GPI)。
- 前記ムチンドメインが膜結合型ムチンドメインである、請求項1記載の融合構築物。
- 前記ムチンドメインが、MUC1、MUC3A、MUC3B、MUC4、MUC11、MUC12、MUC16、およびMUC17、またはそれらの部分からなる群より選択される遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を含む、請求項2記載の融合構築物。
- 前記ムチンドメインが表面会合型ケモカインCXCL16またはフラクタルカイン(CX3CL1)のムチンストークを含む、請求項1記載の融合構築物。
- 前記TIMPが、TIMP−1、TIMP−2、TIMP−3、またはTIMP−4からなる群より選択される、請求項1〜4のいずれか一項記載の融合構築物。
- 前記TIMPがヒトTIMP−1である、請求項1〜5のいずれか一項記載の融合構築物。
- 前記融合構築物が、GPIアンカリングを方向づけるための1つまたは複数のGPIシグナル配列を含む、請求項1〜6のいずれか一項記載の融合構築物。
- 前記GPIアンカーがリンパ球機能関連抗原(LFA−3)またはその部分に由来している、請求項1〜7のいずれか一項記載の融合構築物。
- 前記TIMP−ムチン−GPI構築物が腫瘍細胞の細胞膜へ挿入される、請求項1〜8のいずれか一項記載の融合構築物。
- 請求項1〜9のいずれか一項記載の融合構築物をコードする核酸配列を含む核酸分子。
- 請求項10記載の核酸分子および付加的な発現エレメントを含む発現プラスミド。
- 請求項11記載の発現プラスミドを含む宿主細胞。
- 請求項10記載の核酸分子を含むベクター。
- 請求項1〜9のいずれか一項記載の融合構築物または請求項10記載の核酸分子と、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
- 癌の治療薬の調製のための請求項1〜9のいずれか一項記載の融合構築物の使用。
- 前記癌が、乳癌、腎癌(renal cancer)、前立腺癌、白血病、精上皮腫、黒色腫、奇形腫、リンパ腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌(kidney cancer)、副腎癌、甲状腺癌、血液癌、皮膚癌、脳の癌、子宮頚癌、腸癌(intestinal cancer)、肝臓癌、結腸癌、胃癌、腸癌(intestine cancer)、消化管癌、リンパ節癌、食道癌、結腸直腸癌、膵臓癌、耳鼻咽喉(ENT)癌、子宮癌、卵巣癌、および肺癌、ならびにそれらの転移癌からなる群より選択される、請求項15記載の使用。
- 前記癌が外科切除後の残存癌である、請求項15または16記載の使用。
- 前記融合構築物が、乳癌患者およびグリア芽細胞腫(星状細胞腫VI)を有する患者における残存癌の治療のために抗腫瘍補助剤として局所的に投与される、請求項17記載の使用。
- 前記融合構築物が、0.5〜5μg/ml、好ましくは1μg/mlの濃度で投与される、請求項17または18記載の使用。
- 前記融合構築物が、創傷への噴霧、および/または手術が有効ではない領域への注入により投与される、請求項15〜19のいずれか一項記載の使用。
- 前記融合構築物が、ムチンドメインを含まない融合構築物(TIMP−GPI)である、請求項15〜20のいずれか一項記載の使用。
- 有効量のTIMP−ムチン−GPI融合構築物またはTIMP−GPI融合構築物に癌細胞系を曝す工程を含む、インビトロでの癌細胞増殖阻害方法。
- 前記細胞系が腎細胞癌(RCC)細胞系である、請求項22記載の方法。
- FAS−アポトーシス抵抗性腫瘍細胞系をFAS誘導性アポトーシスに対して感受性にするための、TIMP−ムチン−GPIまたはTIMP−ムチン−GPIの使用。
- 請求項14記載の薬学的組成物、または、請求項1〜9のいずれか一項記載の融合構築物であってムチンドメインを含まない融合構築物(TIMP−GPI)と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を皮膚病原または瘢痕の部位へ投与することを含む、瘢痕の形成を予防または阻害するために皮膚病変を処置する方法。
- 前記瘢痕が肥厚性瘢痕またはケロイド形成である、請求項25記載の方法。
- 前記薬学的組成物が界面活性剤、密閉剤、または担体物質と共に用いられる、請求項25および26記載の方法。
- 請求項1〜9のいずれか一項記載または請求項1〜9記載の融合構築物であってムチンドメインを含まない融合構築物(TIMP−GPI)の、瘢痕の形成を予防または阻害するための被験体の皮膚病変の処置薬の調製のための使用。
- 前記瘢痕が肥厚性瘢痕またはケロイド形成である、請求項28記載の使用。
- 前記薬学的組成物が界面活性剤、密閉剤、または担体物質と共に用いられる、請求項28および29記載の使用。
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