BRPI0616093A2 - uso de inibidor de tecido de metaloproteinases (timp) ligado a fixações de glicosilfosfatidilinositol (gpi) para tratamento de lesões na pele - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a construções de fusão de inibidores de tecido fixados por glicosilfosfatidilinositol (GPI) de metaloproteinases (TIMPs) e seu uso para o tratamento de câncer e em medicina regenerativa. Por essa abordagem, as proteínas TIMP fixado por GPI são incorporadas na membrana de superfície de células de tumor e tornam as células de tumor sensíveis a apoptose induzida por FAS. Além disso, as construções de fusão da presente invenção são agentes eficazes úteis em aplicações de curade ferimento. Em uma modalidade, o TIMP é ligado à mucina seguido por GPI para aumentar a apresentação superficial. O uso de GPI para ligar TIMP torna a proteína de fusão resultante particularmente útil como agente anti-câncer para o tratamento de câncer, e, em particular, qualquer câncer residual após uma ressecção cirúrgica incompleta de tumores primários em um individuo.

Description

INIBIDOR DE TECIDO DE METALOPROTEINASES (TIMP) LIGADO AFIXAÇÕES DE GLICOSILFOSFATIDILINOSITOL (GPI) PARATRATAMENTO DE CÂNCER E LESÕES DA PELE

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se ao campo deconstrutos de fusão e seu uso para o tratamento de câncer eem medicina regenerativa. Especificamente, a invençãorefere-se o construtos compreendendo inibidores de tecidofixados em glicosilfosfatidilinositol (GPI) demetaloproteinases (TIMPs). Adicionalmente, os construtos defusão da presente invenção são agentes regenerativoseficazes úteis no campo de aplicações de cura de ferimento.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

TIMPs em pesquisa de câncer

0 tratamento de câncer permanece uma tarefaexigente e emprega diferentes abordagens terapêuticas eestratégias, oferecendo graus variáveis de sucesso. Umaabordagem conhecida é aumentar a sensibilidade de célulasde câncer a lise imuno-mediada. A sensibilidade de tumoresà lise imuno-mediada foi ligada à biologia demetaloproteinases de matriz (MMPs), e especificamente, àexpressão de superfície de célula de MMPs pela célula alvode tumor. Metaloproteinases de matriz (MMPs) degradamcomponentes da matriz extracelular (ECM) e foram envolvidasna remodelagem de tecido, invasão de tumor e metástase(Egeblad & Werb, 2002; Itoh & Nagase, 2002). A atividade deMMP foi associada também à eficiência de apoptose mediadapor perforin/granzima e por FAS (revisado em Egeblad &Werb, 2002). Foi mostrado que a atividade de MMP é reguladaem muitos níveis incluindo quatro inibidores endógênos, oinibidor de tecido de metaloproteinases de matriz (TIMP-1/-2, -3 e -4)- (Bode & Maskos, 2003). 0 equilíbrio in vivoentre MMPs e TIMPs determina se ocorre a ressorção oudeposição de matriz (Nagase & Woessner, 1999).

Os inibidores de tecido endógeno demetaloproteinases (TIMPs) apresentam diversas funçõesfisiológica/biológica incluindo a moderação de crescimentode tumor, metástase e apoptose. Essas diversas atividadesbiológicas de TIMPs foram ligadas em parte à estequiometriade interações de proteina de superficie de célula/MMP/TIMP.O recrutamento de linfócitos citotóxicos representa uma viapotencial na defesa contra tumores. Embora linfócitos Tcitotóxicos (CTL) e células exterminadoras naturais (NK)que infiltram e reconhecem células de tumor sejamidentificadas, uma imunidade anti-tumor eficazfreqüentemente falha em se desenvolver eficientemente. Essaineficácia é um motivo que evita a eliminação total decélulas de tumor residual após resseção cirúrgicaincompleta, devido a um estágio avançado de doença ouinoperabilidade local. A etiologia dessa deficiênciafuncional em linfócitos citotóxicos atualmente não é clara.

Em geral, os efeitos anti-tumor de CTLs e célulasNK são mediados através das vias apoptóticas mediadas porperforin/granzima ou FAS (CD95/CSD95L) (Kagi e outros,1994). A via de perforin é mediada por citotoxinassecretadas durante reconhecimento de NK ou CTL de célulasalvo (Kagi e outros, 1994). 0 CD95, ou receptor de morte deFAS, pertence ao regulador da familia de proteínas de mortecelular e é de importância central em apoptose imunomediada de células de tumor (Nagata, 1999). FAS/CD95/Apo-lhumano é um receptor de glicoproteina de transmembranaúnica (325 aminoácidos, 45-48 kDa). 0 ligante de FAS(ligante de FAS, FASL, CD95L) é uma proteina de membranaintegral e é uma glicoproteina de transmembrana do tipo II.FASL é um membro da familia de TNF, que inclui TNFóc,.cadeias a e (3 de linfotoxina (LT) , ligante CD40 e liganteCD30. A ação de FAS é mediada através de FADD (dominio demorte associado a FAS)/MORTI, uma proteína adaptadora quetem um dominio de morte em sua extremidade-C e se liga aodominio de morte citoplásmico de FAS. Verificou-se quemuitos tumores são resistentes a apoptose mediada atravésda via FAS (Frost e outros, 2003; examinado em Igney &Krammer, 2002) .

Como um sistema de modelo para testar osconstrutos de TIMP-GPI da presente invenção, linhagens decélulas de carcinoma de célula renal foram utilizadas comoexemplo. Carcinoma de célula renal (RCC) é a sétima causaprincipal de câncer. Aproximadamente um terço de pacientescom RCC têm doença metastatica em apresentação e até 50% dereincidência após nefrectomia (Vogelzang & Stadler, 1998).RÇC é - difícil de tratar e terapias imunológicas comointerferon-alfa e interleucina-2 são genericamente maiseficazes do que quimioterapia ou radiação (Vogelzang &Stadler, 1998) . Linfócitos citotóxicos representam umcomponente potencial na defesa contra tumores incluindoRCC.

Um membro da família de TIMP, TIMP-1, é uminibidor de MM? de atuação ampla (Bode & Maskos, 2003). Éuma proteína solúvel que pode ser detectada na superfícieda célula somente através de sua associação com proteínasligadas superficialmente (Brew e outros, 2000; Klier -eoutros, 2001) .: O papel geral de TIMP-1 em biologia decâncer permanece o tema de relatórios conflitantes (Brand/2002) . Até a presente data, é aceito que TIMP-1 desempenhaum papel em angiogênese, migração de células, eproliferação (Brand, 2002). Recentemente, foi mostrado quéuma proteína de TIMP-1 fixada por GPI apresentou umasupressão acentuada de migração de células endoteliais emresposta a bFGF (Djafarzadeh R e outros, 2004).

As estratégias convencionais e abordagens paraterapia de câncer ainda sofrem do problema de que célulasde tumor são difíceis de se eliminar após desenvolvimentodo tumor. Tumores primários são normalmente removidos apartir do paciente por cirurgia. Entretanto, em algunscasos nem todas as regiões estão disponíveis para ocirurgião, e desse modo, as células de tumor permanecem nocorpo onde podem se desenvolver em tumores secundários.

Isso é um resultado da resseção cirúrgica incompleta dotumor primário.

A presente invenção prove, portanto, um agenteanti-câncer eficaz e estratégia para reduzir ou aliviar aproliferação de células de tumor em um indivíduo, emparticular em um paciente que foi submetido a uma resseçãocirúrgica incompleta de um tumor primário. Os agentes ant:j.-câncer da presente invenção são úteis para exterminarcélulas de tumor tanto em linhagens de célula in vitro comoem tecidos in vivo.

O papel de TIMPs em medicina regenerativaA presente invenção é adicionalmente útil nocampo de medicina regenerativa. Uma área significativa nocampo de medicina regenerativa se refere ao processo decura de ferimento. Cura de ferimento se refere a umaresposta de restauração natural em lesão de tecido eenvolve uma cascata complexa de eventos celulares qúefinalmente gera a recobertura, reconstituição, -erecuperação da resistência à tração do tecido lesionadõ.

Esse processo envolve genericamente o recrutamento - eproliferação de diferentes tipos de células, uma elaboraçãoda matriz celular, e um aumento em vigilância imune.Cura de ferimento ocorre em um modo preciso:,seqüencial e pode ser dividido em quatro fases gerais:inflamação, granulação, re-epitelialização e remodelagem detecido. Cada fase do processo de cura de ferimento éregulada por vias de transdução de sinal especiais. Durantecura de ferimento, um aumento na expressão de fatores decrescimento e citocinas ocorre; em particular, aumentos nosniveis de TNF, IL-1 e IL-6, foram descritos. Durante a fasede inflamação inicial, que envolve as proteínas efetorasIL-1, TNF-a e CSF, tanto macrofagos como neutrófilos sãorecrutados para formar um coágulo de fibrina. Durante afase de granulação, os fibroblastos se proliferam, migrampara o ferimento, e secretam ECM. As proteínas efetorasenvolvidas nessa fase mencionada por último incluem MMPs,PDGF, FGF, EGF e VEGF. A terceira face em cura deferimento, re-epitelialização é caracterizada pelaproliferação de ceratinócitos, que migram para dentro doferimento, e também por um aumento em miofibroblastos, quesão responsáveis por contração de ferimento. 0 resultadodessa fase, que envolve as proteínas efetoras MMPs, KGF,TGF, GM-CSF, EGF e uPA e tPA, é a re-epitelialização dasuperfície de ferimento, a dissecação de escara, e aformação de uma barreira. Finalmente, durante - a fase deremodelagem de tecido, fibroblastos produzem uma matrizcolagenosa que leva à formação de tecido de cicatriz,apoptose de fibroblastos, e uma comutação da ativação paradiferenciação : dos ceratinócitos. Proteínas efetorasconhecidas envolvidas nessa fase mencionada por último decura de ferimento incluem TGF-bl, MMPs e TIMPs.

Desse modo, as células efetoras responsáveis pelamaioria dos aspectos de cura de ferimento são osfibroblastos e os ceratinócitos, e MMPs que desempenham umpapel importante tanto na migração de fibroblastos (MMP-i,-2, -3 e -13) e ceratinócitos (MMP-1, -2, -3 e -10) (Singer& Clark, 1999) além da formação de cicatriz. Cada um dosMMPs tem uma especificidade de substrato diferente no ECM,e desempenha um papel importante em degradação de ECM emovimentação. A família de MMP inclui, entre outras coisas,colagenases (MMP-1, MMP-8, MMP-13, MMP-18), estromelisinas(MMP-3, MMP-10, MMP-11), gelatinases (MMP-2, MMP-9),matrilisina (MMP-7), metaloelastase (MMP-12) e uma série demetaloproteinases de matriz ligadas por membrana (MT-MMPs).

Como a função de MMPs é a de romper de forma proteolitica oECM circundante, um equilíbrio entre essa atividade deprotease e deposição de ECM durante cura de ferimento, istoé, reconstrução do tecido lesionado, necessita ser mantidode forma ótima. O controle de atividade de MMP é moduladopelas proteínas de TIMP, que são produzidas pela maioriadas células, e atuam para inibir os MMPs em uma razão de1:1. Onde esse equilíbrio delicado entre a rupturaproteolitica e deposição de ECM é perturbado, distúrbioscomo cura anormal de ferimento podem resultar, por exemplo,em ferimentos crônicos, formação excessiva de cicatriz ouformação de quelóide.

Portanto, existe necessidade de controlar ouinfluenciar o equilíbrio fisiológico entre atividade deprotease e deposição de ECM durante o processo' de cura deferimento.

Em uma modalidade adicional, os construtos defusão da presente invenção fornecem um agente regenerativoeficaz para o tratamento de condições definidas por umequilíbrio perturbado entre atividade de protease de MMP edeposição de ECM como, por exemplo, em formação de quelóideou ferimentos crônicos, que são comumente associados aníveis aumentados de MMP. Adicionalmente, os construtos defusão da presente invenção fornecem um agente regenerativoeficaz que pode reduzir, minimizar ou inibir a formação decicatrizes durante o processo de cura de ferimento.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção prove agentes anti-tumornovos e métodos para o tratamento de câncer.

A presente invenção se baseia na surpreendenteverificação de que TIMP fixado por GPI reduz ou aliviaeficazmente a proliferação de células de câncer, e promoveo extermínio de células de câncer em linhagens de célulastanto in vitro como in vivo. Os determinantes funcionais eestruturais de TIMP foram combinados com uma fixação deglicosilfosfatidilinositol (GPI) e, opcionalmente, commucina, para gerar um agente de quimioterapia altamenteeficaz. Essa abordagem explora proteínas de TIMP fixadaspor glicosilfosfatidilinositol (GPI) a serem incorporadasem membranas superficiais quando purificadas e adicionadasa células de câncer. A fusão de TIMP-GPI com um domínio dèmucina aumenta: ainda mais a apresentação de proteínas deTIMP na membrana de célula superficial e torna o construtòde fusão mais eficaz em tornar as células de câncersensíveis à destruição imuno mediada.

Nos exemplos a seguir, a presente invençãodemonstra que TIMP tem o potencial para a inibição decrescimento de células de tumor e redução dedesenvolvimento de tumor tanto em linhagens de célula invitro como em tecidos in vivo.: A ligação de TIMP a umàfixação de GPI e administração exógena de TIMP fixada porGPI resulta em uma inserção eficiente de proteína de TIMPnas membranas de células de câncer. A expressão dèsuperfície de TIMP-1 fixada por GPI induziu uma variedadede efeitos biológicos em linhagens de célula de câncer comrelevância terapêutica potencial como induzir a viaapoptótica mediada por FAS . em células de câncer. Comomostrado nos exemplos a seguir, a supressão de proliferaçãode células de câncer foi observada como sendo dependente dedose.

A proteína de TIMP-1 fixada por GPI tambémbloqueou a secreção de proMMP-2 e proMMP-9 e alteroudramaticamente a associação de superfície de célula de MMPsdiversos. Mais significativamente, as linhagens de célulade tumor normalmente resistentes a apoptose-FAS foramtornadas sensíveis ao extermínio mediado por FAS/CD95. 0tratamento de GPI-TIMP resulta em uma regulação descendentede proteína BCL2 anti-apoptótica e aumento correspondenteem proteína BAX pró-apoptótica. Esse deslocamento émdireção a uma concentração mais elevada de proteínas pró—apoptóticas pode ser um motivo para a sensibilidadeaumentada de apoptose mediada por FAS de células de câncerconstruídas superficialmente de TIMP.

Utilizando a abordagem acima, as proteínas deTIMP fixadas por GPI ou polipeptideos da presente invençãoprovaram ser particularmente úteis em aplicaçõesterapêuticas no tratamento de câncer residual após resseçãocirúrgica incompleta do tumor primário como em câncer demama avançado, osteosarcoma, carcinoma de célula renal ouem tumores malignos do cérebro, por exemplo, glioblastoma.•

Além disso, uma vez que as células de tumor,incluindo carcinoma de célula renal (RCC), sãointrinsecamente resistentes a extermínio mediado por FAS, apresente invenção prove um meio eficaz para tornar ascélulas de tumor suscetíveis a apoptose mediada por FAS.

Em um primeiro aspecto, a presente invençãorefere-se, portanto, a um construto de fusão (TIMP-GPI óuTIMP-mucina-GPI) compreendendo uma seqüência de aminoácidosde um inibidor de tecido de metaloproteinases (TIMP) ou umfragmento biologicamente ativo do mesmo, onde a TIMP ou ofragmento biologicamente ativo do mesmo está ligado a umaseqüência de aminoácidos de um domínio de mucina seguidopor uma seqüência de aminoácidos de uma fixação deglicosilfosfatidilinositol (GPI).

Em uma modalidade preferida, a extremidade 3' deTIMP é fundida diretamente em uma seqüência de ligação deGPI e não contém um domínio de mucina.

O termo "mucina" se refere a uma família deproteínas grandes, intensamente glicosiladas. Uma classe demucinas é ligada por membrana devido à presença de umdomínio de cobertura de membrana hidrofóbica que favorece aretenção na membrana de plasma, enquanto outra classe demucinas é secretada em superfícies de mucosa. Genes demucina codificam monômeros de mucina que são tipicamentesintetizados como núcleos de apomucina no formato de bastãoque são modificados pós-translação por glicosilaçãoexcepcionalmente abundante. Duas regiões distintamentediferentes são: encontradas em mucinas maduras. Uma regiãoinclui as regiões terminais-carbóxi e -amino, que sãolevemente glicosiladas, porém ricas em resíduos decisteína, que são provavelmente envolvidos noestabelecimento de ligações de dissulfeto dentro e entremonômeros de mucina. A segunda região central é formada demúltiplas repetições de tandem de seqüências de 10 a 80resíduos, onde mais da metade dos resíduos de aminoácidossão serina ou treonina.

Mucinas são genericamente secretadas comoagregados maciços de proteínas tendo massas moleculares deaproximadamente 1 a 10 milhões de Daltons. Nessesagregados, monômeros são ligados entre si principalmentepor interações não covalentes, embora ligações dedissulfeto intermoleculares também possam desempenhar úmpapel nesse processo. Pelo menos 19 genes de mucina humanosforam distinguidos incluindo MUC1, 2, 3A, 3B, 4, 5AC, 5B,6-9, 11-13 e 15-19.

A mucina, como utilizada na presente invenção, épreferivelmente um domínio de mucina ligada por membrana ecompreende preferivelmente uma seqüência de aminoácidosselecionada do grupo que consiste em MUC1, MUC3A, MUC3B,MUC4, MUC11, MUC12, MUC16 e MUC17, ou uma variante ouporção da mesma (as mucinas acima são examinadas em MoniauxN e outros, 2004). Em outra modalidade preferida, umsuporte de mucina é utilizado que é isolado a partir daquimiocina associada à superfície CXCL16 ou fractalcina(CX3CL1).

Fractalcina é um membro da superfamilia de genede quimiocina grande e completa, que consisteprincipalmente em moléculas pró-inflamatórias secretadas. Aestrutura tipica de núcleo de quimiocinas é parcialmentemantida por ligações de dissulfeto entre resíduos dêcisteina conservadas de modo posicionai. Para a maioria dospeptideos de quimiocina, uma característica estruturalfamiliar é a distribuição de quatro cisteinas na molécula,isto é um motivo de marcação de cisteina: CXC, CC e C, ondeC é uma cisteina e X é qualquer resíduo de aminoácidó'.Quatro famílias de quimiocina diferentes foramidentificadas com base na observação de que peptideos dequimiocina podem ser distinguidos pela organização dosresíduos de cisteina localizados próximo à extremidade-N dàmolécula. A próprio fractalcina define uma das famílias dequimiocina, e é distinguida estruturalmente a partir deoutras famílias de quimiocina visto que as cisteinasterminais-N de fractalcina são separadas por três resíduos(isto è, um motivo CX3C) bem como sendo amarrado à membranade célula por uma fixação de transmembrana de extremidade-Cestendida que inclui um domínio semelhante à mucina, ou umsuporte semelhante à mucina. Desse modo, os domínios demucina e fractalcina contidos dentro dos construtos defusão da presente invenção são apropriados para obter umafixação aperfeiçoada da proteína de TIMP na membrana decélula.

A TIMP, como utilizada na presente invenção, épreferivelmente derivada a partir de um mamífero; maispreferido é um ser humano (as quatro TIMPS são examinadasem Mannello F., e outros, 2001). Os exemplos de proteínasde TIMP que podem ser utilizados de acordo com a presenteinvenção compreendem TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3 ou TIMP-4 esuas variantes correspondentes em outros organismos comocamundongo, coelho, cão, gato, carneiro e vaca.

A fixação de GPI como utilizada na presenteinvenção, é preferivelmente derivada do antigeno- associadoà função de linfócito (LFA-3) ou uma porção do mesmo, einclui uma seqüência de sinal de GPI que media a associaçãode membrana.

A presente invenção também se refere a umamolécula de ácido nucléico, como RNA ou DNA, compreendendouma seqüência de ácido nucléico que codifica para oconstruto de TIMP fixada por GPI da invenção.

Em um aspecto adicional da presente invenção, amolécula de ácido nucléico da invenção está contida em umplasmídeo de expressão, um vetor ou uma célula hospedeirapara expressão da molécula de ácido nucléico da invenção.

A presente invenção também se refere ao uso dosconstrutos de fusão de TIMP-GPI- ou TIMP-mucina-GPI dainvenção para o tratamento de câncer, particularmentecâncer residual após remoção cirúrgica de um tumorprimário.

Em um aspecto adicional da presente invenção, osconstrutos de fusão de TIMP-GPI ou TIMP-mucina-GPI dainvenção estão contidos em uma composição farmacêutica oumedicamento. Em uma modalidade adicional, os construtos defusão de TIMP-GPI ou TIMP-mucina-GPI da invenção sãoapropriadamente utilizados como drogas ou agentes anti-câncer. Em uma modalidade preferida, as drogas anti-câncerda invenção são administradas e aplicadas localmente aolado da resseção de massa de tumor em pacientes com tumorde alto risco com um elevado risco de células de câncerresidual e incidência aumentada de um relapso local, eaqueles pacientes tendo tumor residual óbvio devido àdoença em estágio avançado ou inoperabilidade local.Preferivelmente, o construto de fusão é administrado porpulverização no ferimento e/ou injeção em regiões que nãosão disponíveis para cirurgia.

A presente invenção também se refere a um métodoin vitro para inibição de proliferação de célula de câncercompreendendo as etapas de submeter uma linhagem de célulasde câncer a uma quantidade eficaz de construto de fusão deTIMP-mucina-GPI ou TIMP-GPI. .

Em uma modalidade adicional, a presente invençãoprove novos agentes e métodos para o tratamento d§condições definidas por um equilíbrio perturbado entreatividade de protease de MMP fisiológica normal e deposiçãode ECM, que resultam em cura anormal de ferimento. Em umamodalidade, a presente invenção prove agentes e métodosapropriados para o tratamento de quelóide ou cicatrizaçãohipertrófica e ferimentos crônicos comumente associados âniveis aumentados de MMP. Além disso, a presente invençãotambém prove agentes eficazes e métodos para reduzir,minimizar ou inibir a formação de cicatrizes durante oprocesso de cura de ferimento.DEFINIÇÕES

Com o termo "TIMP", como utilizado aqui, quer sedizer um inibidor de tecido endógeno de metaloproteinases,que é conhecido como sendo envolvido em funçõesfisiológicas/biológicas incluindo a inibição demetaloproteinases de matriz ativas, regulação de ativaçãopró MMP, crescimento de células, e a modulação deangiogênese. A "família de TIMP" humana contém quatromembros, TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3 e TIMP-4. Um membropreferido utilizado na presente invenção, TIMP-1, é umaproteína secretada que pode ser detectada na superfície dacélula através de sua interação com proteínas de superfície(Bode & Maskos, 2003).

O termo "construto de fusão" ou "construto defusão de TIMP", como utilizado aqui, se refere tanto =amolécula de ácido nucléico como a molécula de aminoácidocodificado desse modo.

A invenção se refere: especificamente a ácidosnucléicos contendo uma seqüência de nucleotideo que incluia seqüência definida por SEQ ID NOS:1-5 ou um homólogo damesma, ou fragmentos exclusivos da mesma. Na presenteinvenção, a seqüência de uma molécula de ácido nucléico quecodifica a proteína resultante é considerada homóloga a umasegunda molécula de ácido nucléico se a seqüência denucleotideos da primeira molécula de ácido nucléico forpelo menos aproximadamente 70% homóloga, preferivelmente,pelo menos aproximadamente 80% homóloga, e maispreferivelmente pelo menos aproximadamente 90% homóloga àseqüência da segunda molécula de ácido nucléico. Ahomologia entre duas seqüências de ácido nucléico pode serfacilmente determinada utilizando o algoritmo de BLASTNconhecido (Altshul, e outros, 1990) com ajustespredefinidos. Como exemplo adicional, outro teste conhecidopara determinar a homologia de duas seqüências de ácidonucléico é se elas hibridizam sob condições de hibridizaçãonormal, preferivelmente sob condições de hibridizaçãorigorosas.

Dada a seqüência de ácido nucléico revelada aqui,a pessoa versada pode facilmente projetar estruturas deácido nucléico tendo funções especificas em vários tipos deaplicações. Por exemplo, o técnico pode construiroligonucleotideos ou polinucleotideos para uso comoiniciadores em procedimentos de amplificação de ácidonucléico, como a reação de cadeia de polimerase (PCR),reação de cadeia de ligase (LCR), Reação de Cadeia dereparo (RCR), ensaio de ligação de oligonucleotideo PCR(PCR-OLA) e similares. Oligonucleotideos úteis como sondasem estudos de hibridização, como hibridização no local,podem ser construídas. Inúmeros métodos para rotular taissondas com radioisótopos, etiquetas fluorescentes, enzimas,e frações de ligação (por exemplo, biotina), sãoconhecidos, desse modo as sondas da invenção podem serfacilmente adaptadas para fácil detecção.

Oligonucleotideos também podem ser projetados efabricados para outras finalidades. Por exemplo, a invençãopermite o desenho de oligonucleotideos antisense, eoligonucleotideos de formação tripla para uso no estudo derelações de função/estrutura. A recombinação homóloga podeser implementada por adaptação do ácido nucléico atualmentedescrito para uso como um meio de alvo.

A proteína codificada pelo ácido nucléico dapresente invenção inclui ainda homólogos funcionais. Umaproteína é considerada um homólogo funcional de outraproteína para uma função especifica, como descrito abaixo,se o homólogo tiver a mesma função que a outra proteína. Ohomólogo pode ser, por exemplo, um fragmento da proteína,ou um mutante de substituição, adição ou deleção daproteína.

A determinação se duas seqüências de aminoácidossão substancialmente homólogas é, para fins da presenteinvenção, baseada em buscas FASTA de acordo com Pearson &Lipman (1988) . Por exemplo, a seqüência de aminoácidos deuma primeira proteína é considerada homóloga àquela de umasegunda proteína se a seqüência de aminoácido da primeiraproteína tiver pelo menos aproximadamente 70% de identidadede seqüência de aminoácidos, preferivelmente pelo menosaproximadamente 80% de identidade, e mais preferivelmentepelo menos aproximadamente 95% de identidade, com aseqüência da segunda proteína.

A possibilidade de substituir um aminoácido èmuma seqüência com um aminoácido equivalente é bemconhecida. Grupos de aminoácidos conhecidos como sendoequivalentes incluem:

(a) Ala (A), Ser.(S), Thr(T), Pro(P), Gly.(G) ;

(b) Asn(N), Asp(D), Glu(E), Gln(Q);

(c) His(H), Arg(R), Lys(K);

(d) Met(M), Leu(L), Ile(I), Vai(V); e

(e) Phe(F), Tyr(Y), Trp(W).

Substituições, adições e/ou deleções nasseqüências de aminoácidos podem ser feitas desde que aproteína codificada pelo ácido nucléico da invençãocontinue a satisfazer os critérios funcionais descritosaqui. Uma seqüência de aminoácido que é substancialmenteigual à outra seqüência, porém que difere da outraseqüência por intermédio de uma ou mais substituições,adições e/ou deleções, é considerada como sendo umaseqüência equivalente.

Pref erivelmente, menos de 20%, maispref erivelmente menos de 10%, e ainda mais pref erivelmentemenos de 5%, do número de resíduos de aminoácidos em umaseqüência são substituídos por, adicionados a, ou deletadosda proteína codificada pelo ácido nucleico da invenção.

Com o termo "MMP", como utilizado aqui, quer sedizer uma metaloproteinase de matriz que pertence àsuperfamília de MMP como representado por pelo menos 26metaloendopeptidases de degradação de matriz extracelularque estão atuando durante desenvolvimento e diferenciaçãode tecido, infiltração celular, cura de ferimento, e comomoderadores da resposta imune.

Com o termo "GPI", como utilizado aqui, quer sedizer glicoinositol fosfolipídeos, em particular,glicosilfosfatidilinositol, como descrito em Medof eoutros, 1996. Essas fixações semelhantes a fosfolipideo têmuma estrutura 'comum para fixação de membrana independentede função de proteína. Unidades de fixação de GPI sãocompostas de um glicano linear contendo um fosfoetanolamina, três resíduos de manose, e um glicosamina nãoacetilado ligado a um fosfolipideo de inositol. A seqüênciade GPI contém os sinais que orientam fixação de GPI.

Com o termo "mucina" ou "domínio de mucina", comoutilizado aqui, quer se dizer um componente deglicoproteína não de membrana ou ligado por membrana.Normalmente, mucinas ligadas por membrana apresentamseqüências hidrofóbicas ou domínios de transmembraharesponsáveis por sua fixação na bicamada de lipídeo e,opcionalmente, contêm um ou vários domínios semelhantes afator von Willebrandt, que funcionam na oligomerização demonômeros de mucina e no acondicionamento em vesículassecretoras. O termo "mucina" ou "domínio de mucina", comoutilizado aqui, também abrange suportes de mucina oudomínios semelhantes a mucina, como os suportes de mucinatipicamente encontrados nas quimiocinas CXCL16 ou emfractalcina (CX3CL1).

Um construto de fusão "TIMP-GPI", como utilizadoaqui, se refere a TIMP que é fundido diretamente com umaseqüência de ligação de GPI. 0 construto de fusão de TIMP-GPI é projetado pela substituição de seqüência extrema decDNA ou 3'-mRNA de proteínas naturalmente fixadas por GPI(isto é, uma seqüência que contém os sinais que orientamfixação de GPI), para a seqüência extrema de cDNA ou 3'-mRNA de TIMP endógena.

Um "TIMP-mucina-GPI" ou "TIMP-muc-GPI", comoutilizado aqui, se refere a uma TIMP que é diretamentefundida com um dominio de mucina seguido por uma seqüênciade ligação de GPI. 0 construto de fusão de TIMP-mucina-GPIé projetado, como descrito para TIMP-GPI porém incluindo aseqüência de aminoácido de um dominio de mucina entre asseqüências de aminoácido de TIMP e GPI. Por analogia,"TIMP-fractalcina-GPI" ou "TIMP-frac-GPI" se refere a umTIMP que é diretamente fundido com um dominio . defractalcina seguido por uma seqüência de ligação de GPI.

Com o termo "RCC" quer se dizer carcinoma decâncer, renal que é considerado como um tumor progressivocom opções terapêuticas limitadas devido à resistência dotumor a agentes quimioterapêuticos atuais e radiação. 0 RCCserve como um sistema modelo na presente invenção paramostrar a atividade anti-tumor de TIMP fixado por GPI. Aslinhagens de células de modelo utilizadas na presenteinvenção são as linhagens de células de RCC-26 e RCC-53 queforam estabelecidas a partir de pacientes com carcinomas decélula estágio I e estágio IV.

Com o termo "FAS" quer se; dizer um membro dafamília de receptor de fator de crescimento de nervo/fatorde neerose de tumor que induz apoptose independente de TNF-a. Outras abreviaturas conhecidas na técnica para FAS sãoApol (=proteina de indução de apoptose 1) e CD95.

0 termo "regeneração" se refere genericamente àrecuperação da integridade de tecido traumatizado ou deoutro modo lesionado. Esse termo pode incluir os processosde cura de ferimento, reparo de tecido e outros tipos deatividades de restauração que ocorrem no local onde uminsulto fisiológico e dano resultante ao tecido ocorreu.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A Família TIMP e Engenharia de Proteína deSuperficies Celulares

Inibidores de tecido de metaloproteinases (TIMPs)são conhecidos como os principais inibidores celulares dasubfamilia de metaloproteinase de matriz (MMP),apresentando graus variáveis de eficácia contra membros deMMP diferentes, bem como diferentes padrões de expressão detecido e modos de regulação. As TIMPs tipicamente modulam aatividade de matriz solúvel ligada e MMPs associadas decélulas. Todas as quatro TIMPs de mamíferos têm muitassimilaridades amplas, porém apresenta característicasestruturais distintas, propriedades bioquímicas e padrõesde expressão, que sugere que cada TIMP tem uma função invivo especifica.

A proteína de TIMP-1 é o membro mais amplamenteexpresso e estudado da família TIMP. Outros _ membros dafamilia TIMP incluem TIMP-2, TIMP-3 e TIMP-4. ProteínasTIMP não somente compartilham características estruturaiscomuns, incluindo uma série de resíduos de cisteinaconservada que forma ligações de dissulfeto essenciais paraa. conformação de proteína nativa (Brew e outros, 2000),porém têm também atividades biológicas amplamentesobrepostas. A região terminal-N conservada das proteínasde TIMP é necessária para atividades inibidoras funcionais,'enquanto se pensa que as regiões terminais-C divergentesmodulam a seletividade de inibição e eficiência de ligaçãode agentes aos MMPs (Maskos & Bode, 2003). Entretanto, alémde sua capacidade de atuar como inibidores de MMP, osvários membros da familia de TIMP podem apresentar tambématividades biológicas adicionais, incluindo a regulação deproliferação e apoptose além da modulação de repostasinflamatórias e angiogênicas.

Verificou-se que TIMP-1 inibe grande parte deMMPs (exceto MMP-2 e -14) e, preferencialmente, inibe MMP-8. TIMP-1 é produzido e secretado em forma solúvel por umavariedade de tipos de células e é amplamente distribuídopor todo o corpo. É uma proteina extensamente glicosiladacom uma massa molecular de 28.5 kDa. TIMP-1 apresenta àsformas ativas de MMPs, e complexos com a proforma de MMP9.

Como MMP9, a expressão de TIMP-1 é sensivel a muitosfatores. A sintese aumentada de TIMP-1 é causada por umaampla variedade de reagentes que inclui: TGF beta, EGF~,PDGF, FGFb, PMA, ácido alltransretinóico (RA), IL1 e IL11.

A TIMP-2 é uma glicoproteina de 21 kDa que éexpressa por uma variedade de tipos de células. Forma umcomplexo estequiométrico não covalente com MMPs tantolatente como ativo. A TIMP-2 mostra uma preferência paráinibição de MMP-2.

A TIMP-3 é tipicamente ligada a ECM e inibe âatividade de MMP-1, -2, -3, -9 e 13. A TIMP-3 mostra 30% dehomologia de aminoácido com TIMP-1 e 38% de homologia comTIMP-2. A TIMP-3 foi mostrada como promovendo odesprendimento de células transformadas a partir de ECM eacelerando alterações morfológicas associadas àtransformação de células.

Devido à sua ligação de afinidade elevada comECM, a TIMP-3 é exclusiva entre as TIMPs. A TIMP-3 foimostrada como promovendo o desprendimento de célulastransformadas a partir de ECM e acelerando alteraçõesmorfológicas associadas à transformação de células. A TIMP-3 contém um domínio de ligação de glicosaminoglicano (GAG)que compreende seis aminoácidos (Lys30, Lys26, Lys22,Lys42, Arg20, Lys45) que se considere que são responsáveispara uma associação com a superfície de célula. TIMP-3 é aúnica TIMP que normalmente inibe TACE (enzima de conversãode TNF-a), outra metaloprotease que libera TNF solúvel e éresponsável pelo processamento do receptor IL-6 para dessemodo desempenhar uma parte central no processo de cura deferimento.

A TIMP-4 inibe todas as MMPs conhecidas, epreferencialmente inibe MMP-2 e -7. A TIMP4 mostra 37% deidentidade de aminoácido com TIMPl e 51% de homologia comTIMP2 e TIMP3. A TIMP4 é secretada extracelularmente,predominantemente no tecido do coração e do cérebro eparece funcionar em um modo específico de tecido comrelação a homeostase de matriz extracelular (ECM).

A engenharia de proteína de superfícies de célulaé uma tecnologia potencialmente potente através: da qual acomposição de proteína de superfície de células pode sermanipulada sem transferência de gene. Pela substituição deseqüência de cDNA derivada de mRNA a partir de uma proteínaligada por GPI que contém o domínio de sinal de GPI para aregião de terminal de carboxila de uma proteína deinteresse, é possível gerar um construto de fusão quecodifica uma proteína ligada por GPI.

Essa abordagem oferece múltiplas vantagens emrelação a abordagens de transferência de gene maistradicionais. Por exemplo, o método é aplicável a célulasque .são difíceis ou impossíveis de transieptar (porexemplo, endotélio microvascular primário, células alvoprimárias, etc.). A quantidade de proteína adicionada àsuperfície de célula pode ser controlada e quantificada(por FACS ou imunofluorescência). Além disso, múltiplasproteínas fixadas por GPI podem ser seqüencial ousimultaneamente inseridas nas mesmas células. Através deengenharia molecular é possível expressar um tag de epítopoadicional que auxilia a purificação de proteína bem comomonitoração de reagente durante experimentos. O agente podeser injetado diretamente no tumor ou área peritumorial e oefeito de recrutamento seletivo de leucócitos sobre ocrescimento de tumor ou apoptose induzida por FASdeterminado.

Construtos de Fusão de TIMP para o Tratamento de Câncer

O prognóstico de tumores malignos é na maiorparte dependente de seu estágio clínico e patológico.

Embora a maioria dos carcinomas (por exemplo, tumoresprimário e secundário) possa ser removida totalmentecirurgicamente na maioria dos casos, a resseção de câncerem estágio avançado freqüentemente não é possível eassociado à recorrência prematura da doença e mortalidadeaumentada relacionada à doença.

Particularmente em câncer de mama, a doença emestágio avançado com tamanho estendido de tumor- (> 2 cm) éassociada à . ocorrência de metástase distante esobrevivência limitada. Um volume grande de tumor também éconsiderado como sendo um parâmetro crítico para a presençade câncer residual, que apresenta também um elevado riscopara relapso local e a propagação de metástase distante. Demodo semelhante, tumores de cérebro como glioblastoma(astrocitoma grau IV) é outro alvo concebível para avigilância de tumor, porque a remoção cirúrgica total equase sempre impossível e relapso local ocorre em 95% detodos os cases em um ano de cirurgia primária.

Para resolver o problema que é ligado a câncerresidual, foi necessário identificar uma nova opção deterapia de câncer que é particularmente útil para otratamento de câncer residual após resseção cirúrgicaincompleta.

Como solução, a presente invenção prove TIMPfixado por GPI, que pode ser aplicada localmente nasmargens de resseção para atrair células imunes e focar avigilância de tumor residual nas células de câncerresidual.

Para essa finalidade, proteínas de TIMP sãofixadas por GPIs e, quando purificadas e adicionadas "acélulas de câncer, incorporam em. suas membranas desuperfície e são totalmente funcionais. Pela substituiçãode seqüências extremas de 3'-mRNA de proteínas naturalmentefixadas por GPI (isto é, uma seqüência que contém os sinaisque orientam fixação por GPI) para a seqüência extrema 3'-mRNA endógena, virtualmente qualquer proteína de TIMP podeser expressa como um derivado fixado por GPI.

Na presente invenção, a incorporação de proteínaTIMP-GPI purificada nas membranas de superfície delinhagens de célula de tumor é demonstrada por incubaçãodas linhagens de célula com TIMP-1-GPI purificada, TIMP-1-mucina-GPI ou proteína de controle (rh)TIMP-1 humaríorecombinante. Como detalhado abaixo, expressão desuperfície com TIMP-1 fixado por GPI resultou em um sinalde superfície forte para TIMP-1.

Como utilizado aqui, os termos "isolado e/oupurificado" se referem a isolamento in vitro de um DNA oumolécula de polipeptídeo a partir de seu ambiente celularnatural, e a partir da associação com componentes dacélula, como ácido nucléico ou polipeptideos, de modo quepossa ser seqüenciado, replicado e/ou expresso. Porexemplo, "seqüência de ligação de GPI isolada" é RNA ou DNAcontendo mais de 9, pref erivelmente 36, e maispreferivelmente 45 ou mais, bases de nucleotideoseqüenciais que codificam pelo menos uma porção de umaseqüência de ligação, ou uma variante do mesmo, ou um RNAou DNA complementar ao mesmo, que é complementar ouhibridiza, respectivamente, ao RNA ou DNA codificando aseqüência de ligação e permanece estavelmente ligado sobcondições rigorosas, como definido pelos métodos bemconhecidos na técnica. Desse modo, o RNA ou DNA é "isolado"em que é livre a partir de pelo menos um ácido nucléicocontaminante com o qual é normalmente associado na fontenatural do RNA ou DNA e é preferivelmente substancialmentelivre de qualquer outro RNA ou DNA de mamífero. .

Como utilizado aqui, o termo "ácido nucléicorecombinante", por exemplo, "seqüência de DNA recombinante"se refere a um ácido nucléico, por exemplo, a DNA, que foiderivado ou isolado de qualquer fonte de tecido apropriado,que pode ser subseqüentemente alterado quimicamente invitro, de modo que sua seqüência não seja de ocorrêncianatural, ou corresponda a seqüências de ocorrência naturalque não são posicionadas como seriam posicionadas em umgenoma que não foi transformado com DNA exógeno. Um exemplode DNA "derivado" de uma fonte, seria uma seqüência de DNAque é identificada como um fragmento útil em um organismodado, e que é então quimicamente sintetizado em formaessencialmente pura. Um exemplo de um tal DNA "isolado" apartir de uma fonte seria uma seqüência de DNA útil que écortada ou removida a partir da fonte por meio químico, porexemplo, pelo uso de endonucleases de restrição, de modoque pode ser adicionalmente manipulado, por exemplo,amplificado, para uso na invenção, pela metodologiaconhecida de engenharia genética.

Ao contrário de fixações de polipeptideoconvencionais, que têm seqüências de transmembranadiferentes e conectam a extensões citoplásmicasespecificas, essas fixações semelhantes a fosfolipideoutilizam uma estrutura comum como um mecanismo geral parafixação de membrana independente de função de proteina.Unidades de fixação de GPI são compostas de um glicanolinear contendo um fosfoetanol amina, três resíduos demanose, e um glicosamina não acetilada ligada a umfosfolipideo de inositol. São pré-fabricados no reticuloendoplásmico (ER) e são adicionados a produtos detranslação primário no momento de sua translocação atravésda membrana ER. Os produtos modificados por GPI são entãoglicosilados no ER e Golgi, e subseqüentemente"transportados para a superfície da célula.

Seqüências de ligação com GPI preferidas quepodem ser utilizadas na presente invenção são derivadas apartir de fixações de GPI que são isoladas, por exemplo, deenzimas como fosfatase alcalina, acetil colinesterase, 5'nucleotidase (C073); moléculas de adesão como antigenoassociado à função de linfócito (LFA-3; CD58); molécula deadesão de célula neural (NCAM); proteínas reguladoras decomplemento como fator de aceleração de diminuição (DAF ouCD55), ou outros como o receptor Fey tipo III B (Fc-y-RIIIou CD16b), Thy-1 (CD90), Qa-2, Ly-6A, inibidor de membranade lise reativo (MIRL ou CD59). Para fins da presenteinvenção, o antigeno associado à função de linfócito (LFA-3) é preferido. A pessoa versada reconhecerá que tambémqualquer outra das fixações de GPI conhecidas podem serutilizadas para a prática da presente invenção.Para o construto de TIMP-GPI, a seqüência decomprimento total de TIMP pode ser utilizada no construtode fusão ou uma porção funcionalmente ativa da mesma, queretém a atividade de TIMP. De modo semelhante também umaporção da seqüência de GPI pode ser utilizada desde que aporção permita a incorporação da proteína de TIMP namembrana de célula de superfície de células de câncer.

A seguir, uma pluralidade de modalidadesreferentes a construtos de fusão de TIMP são descritas,pelo que os construtos foram produzidos e fornecidos paratratamento de câncer e como agentes no campo de medicinaregenerativa. Em uma primeira modalidade, a molécula deTIMP é selecionada do grupo que consiste em TIMP-1, TIMP-2,TIMP-3 e TIMP-4 e é preferivelmente fundida a uma seqüênciade GPI.

Em outra modalidade preferida, a seqüência de GPItem 36 aminoácidos em comprimento.

Ainda em outra modalidade, a molécula de TIMP éselecionada do grupo que consiste em TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3e TIMP-4 e é fundida a um domínio de mucina ou domínio defractalcina seguido pela seqüência de GPI.

Em uma modalidade adicional, a proteína de TIMPque é selecionada do grupo que consiste em TIMP-1, TIMP-2,TIMP-3 e TIMP-4. e fundida à seqüência de GPI, ou fundida-aum domínio e mucina ou domínio de fractalcina seguido pelaseqüência de GPI, é truncada no terminal-C. Em umamodalidade preferida, a molécula de TIMP é truncada nósprimeiros 50, 50-100 ou 50-152 resíduos de aminoácidoterminal-N. Mais preferivelmente, a molécula de TIMP étruncada nos primeiros 152 resíduos de aminoácido determinal-N e é a molécula TIMP-1. 0 termo "truncado" serefere a uma seqüência de aminoácido ou ácido nucléico d®TIMP que contém menos do que o número total de bases deácido nucléico ou residuos de aminoácido encontrados em umaseqüência ou proteína de ácido nucléico de TIMP nativa ou-' auma seqüência de aminoácido ou ácido nucléico foi deletadade seqüências não desejadas.

Ainda em uma modalidade adicional, o construto defusão de TIMP é definido por uma seqüência selecionada apartir do grupo consistindo em SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4 e 5.

0 construto obtida pode ser então expresso emqualquer linhagem de célula apropriada ou célula hospedeirapara obter o polipeptideo de TIMP funcional ou proteína.Para essa finalidade, qualquer um dos vetores conhecidosapropriados ou plasmideos pode ser utilizado para expressaras proteínas de TIMP fixadas por GPI da presente invenção.Como descrito em mais detalhe abaixo, células de cânceralvo tratadas com proteína TIMP-GPI (e como controle comproteína rhTIMP-1) foram reconhecidas pelos constrütos deproteína e, como conseqüência exterminadas devido àapoptose mediada por FAS.

Em uma modalidade preferida, e como exemplo, umvetor utilizado para expressão dos constrütos de fusão dapresente invenção contém o promotor para fator dealongamento humano alfa 1 seguido por um sítio de clonagemmúltiplo e um sítio de ligação ribossômica interno quepermite expressão bicistrônica do construto e reductase dedihidrofolato (DHFR) utilizado como um marcador de seleção(Mack, e outros, P.N.A.S. USA 92: 7021, 1995). Aextremidade 3' (terminal carboxila) da proteína de TIMP éfundida diretamente a uma seqüência de ligação de GPI (porexemplo, derivada a partir de antígeno associado à funçãode linfócito-3 (LFA-3)) ou o domínio semelhante à mucinaisolado a partir de CXCL16 ou fractalcina (CX3CL1) seguidopelo sinal GPI. Como indicado acima, essas regiões demucina são amplamente compostas de resíduos deserina/treonina/glicina/prolina mostrados para facilitarinterações de célula-célula. Os construtos de fusãoresultantes são transfectados em células de ovário dehamster Chinês (CHO) com deficiência de dihidrofolatoreductase (DHFR) e a seleção é executada como descrito(Mack, e outros, P.N.A.S USA 92: 7021-7025, 1995). Em umamodalidade preferida, os meios de transfecção podem serexpostos a metotrexato para aumentar a taxa de expressãopor amplificação de gene.

Em uma modalidade adicional, o construto de TIMP-GPI pode ser adicionalmente fundido em um domínio de mucinapara aumentar a eficiência de incorporação de membrana deproteínas de TIMP-GPI. Mucinas são componentes deglicoproteina não membrana ou ligados à membrana que foramprimeiramente identificados em muco secretado revestindo assuperfícies de epitélios glandulares. Mucinas ligadas pormembrana apresentam seqüências hidrofóbicas ou domínios detransmembrana responsáveis por sua fixação na bicamada delipideo. Atualmente, um total de 21 genes recebeu adenominação MUC: MUC1-2, MUC3A, MUC3B, MUC4, MUC5AC, MUC5B,MUC6-13, MUC15-20 (Moniaux N., e outros, 2004). As cincocaracterísticas comuns de uma mucina são: (1) secreção nacamada de muco, (2) O-glicoproteina com elevado pesomolecular, (3) presença de um conjunto de repetição tandemcodificado por um exon grande posicionado centralmente eexclusivo, (4) presença de um domínio de peptideo previstocontendo uma elevada percentagem de resíduos de serina etreonina, e (5) um padrão complexo de expressão de mRNA.Com.: uma exceção (MUC7), as mucinas secretoras (MUC2,'MUC5AC, MUC5B e MUC6) possuem um ou vários domíniossemelhantes a fator von Willebrandt, peptideos ricos emcisteina, que funcionam na oligomerização de monômeros demucina e no acondicionamento em vesiculas secretoras.Tipicamente, mucinas secretadas são expressasexclusivamente por células epiteliais especializadas, sãosecretadas no muco, e exibem um padrão de expressãorestrito dentro do corpo humano. As quatro mucinassecretoras, também mencionadas como as mucinas de formaçãode gel, têm uma arquitetura comum com um elevado nivel desimilaridade para o fator pro-von Willebrand. São tambémconhecidos como abrigando cinco dominios D devido à suahomologia com os dominios D do fator von Willebrand.

As mucinas ligadas' por membrana são compostas deMUC1, MUC3A, MUC3B, MUC4, MUC11, MUC12, MUC16, e MUC17.

Mucinas fixadas por membrana contêm um módulo SEA (proteiríade esperma de ouriço do mar, enterocinase e agrin) , com 'aexceção de MUC4, MUC3A-B, MUC4, MUC11-12 e MÜC17 contêmdois a três dominios semelhantes a fator de crescimentoepidérmico (EGF). Os exemplos de mucinas ligadas pormembrana que podem ser utilizados na presente invenção sãoMÜC1, MUC3, MUC4, e MUC12. Em uma modalidade preferida dainvenção, o suporte de mucina da quimiocina associada àsuperfície CXCL16 ou fractalcina (CX3CL1) é utilizado. 0CXCL16 é um membro da subfamilia de quimiocina CXC. Áocontrário de outros membros desse subgrupo, CXCL16 éestruturalmente diferente e tem quatro dominios, distintoê:um domínio de quimiocina amarrado à superfície de célulaatravés de um suporte semelhante a mucina, que por sua vèzé fixado aos dominios citoplásmicos e de transmembrana.

Fractalcina (CX3CL1) tem uma estrutura similar àquela deCXCL16, e tanto CXCL16 como fractalcina atuam comomoléculas de adesão quando expressas em superfície decélula, e após clivagem a partir da superfície de célula,as quimiocinas solúveis atuam como meios de quimioatração.

Preferivelmente, o domínio de mucina é fundidoentre a extremidade 3' da seqüência de TIMP e a extremidade5' da seqüência de fixação por GPI por qualquer um dosmétodos de engenharia genética convencionais. 0 construtpde fusão de TIMP-mucina-GPI obtido da invenção pode serentão transfectado e expresso em qualquer linhagem decélula conhecida ou célula hospedeira apropriada. A pessoaversada reconhecerá que quaisquer outras mucinas oudomínios de mucina são apropriados para fins da presenteinvenção.

Em uma modalidade preferida, fractalcina fundidaà molécula de TIMP compreende aminoácidos 100-342 de CX3CL1seguido pela seqüência de GPI. Em uma modalidade ainda maispreferida, a molécula de TIMP é a molécula de TIMP-1truncada nos primeiros 152 aminoácidos de terminal-N (SEQID NO:5).

Embora o uso de TIMP-1 (Bode & Maskos, 2003) paraa preparação de proteína de TIMP fixado por GPI sejapreferido na presente invenção, a pessoa versadareconhecerá que também outras proteínas de TIMP podem serutilizadas para a prática da presente invenção. Exemplosadicionais de TIMPs humanos que são úteis são TIMP-2, TIMP-3 e TIMP-4 (Mannello F., e outros, 2001). As TIMPsutilizadas são derivadas a partir de fontes humanas : eadministradas para tratar células de câncer humano. Apessoa versada reconhecerá, de modo semelhante que tambémhomólogos de TIMP, em particular TIMP-1, em outrosorganismos que não o humano, terá um efeito similar noextermínio de células de tumor. Por exemplo, em algumasmodalidades, a seqüência de TIMP-1 derivada a partir de umanimal como um cão, gato, camundongo, coelho, vaca oucarneiro, e pássaro, pode ser utilizada para a construçãode um construto de fusão de TIMP-GPI da presente invenção.A quimera de TIMP-GPI será subseqüentemente aplicada aositio de tumor de modo similar como descrito para umindivíduo humano.

Tumores e células de câncer que podem sertratados com a TIMP fixado por GPI incluem os cânceres aseguir porém não se limitam aos mesmos: câncer de mama,câncer renal, câncer de próstata, leucemias, seminomas,melanomas, teratomas, linfornas, neuroblastomas, gliomas,câncer retal, câncer endometrial, câncer de rim, cânceradrenal, câncer de tiróide, câncer de sangue, câncer dapele, câncer do cérebro, câncer cervical, câncerintestinal, câncer do figado, câncer de cólon, câncer deestômago, câncer de intestino, câncer gastrointestinal,câncer de linfonodo, câncer de esôfago, câncer colorretal,câncer de pâncreas, câncer de orelha, nariz e garganta(ENT), câncer do útero, câncer de ovário e câncer de pulmãoe as metástases dos mesmos.

Para tratamento de câncer residual, TIMP-GPI podeser administrado e aplicado localmente ao lado da resseçãode massa de tumor em pacientes com tumor de alto risco comum elevado risco de células de câncer residual e incidênciaaumentada de um relapso local e naqueles pacientes com umtumor residual óbvio devido à doença em estágio avançado ouinoperabilidade local. Preferivelmente, o construto defusão é administrado em uma concentração de 0,5 a 5 ug/mlde proteína, mais preferido em 0,5 a 1 \xq, óu la' 2 ug/ml.

Uma concentração de aproximadamente 1 |ng/ml de TIMP-GPI ouTIMP-mucina-GPI é mais preferida. A proteína pode seradministrada ao indivíduo por quaisquer vias deadministração aplicáveis. Prefere-se que o tratamento sejarealizado durante cirurgia de tal modo que o construto defusão seja pulverizado sobre o ferimento ou seja injetadoem regiões que não são disponíveis para cirurgia. Para essafinalidade, o construto de fusão de TIMP fixado por GPI dapresente invenção pode ser um constituinte de umacomposição farmacêutica ou medicamento que compreende aindaum ou mais dos veículos, diluentes e excipienteconvencionalmente conhecidos.

Como concluído a partir dos exemplos abaixo, TIMPfixado por GPI parece induzir sua atividade anti-tumor,isto é o extermínio de células de tumor, não por apoptoseinduzida por célula NK e CTL (via litica mediada porperforin/granzima), porém em vez disso pela segunda via,que envolve apoptose mediada por FAS/CD95 (para detalhesadicionais vide os exemplos 5 e 6; figuras 5 e 6) . Alémdisso, embora muitas células de tumor sejam resistentes aapoptose mediada por FAS, o tratamento com TIMP-1-GPI,porém não rhTIMP-1 de controle, tornou as linhagens decélulas sensíveis a apoptose mediada por FAS.

Verificou-se também que o tratamento com proteiriaTIMP-1-GPI reduz BCL2 e aumenta expressão de proteína BAX.As proteínas BCL2 representam uma familia de proteínasenvolvidas no controle de apoptose. Alguns membros dessafamilia (como BCL2 e BCL-XL) são anti-apoptóticas, enquantooutras (como Bad ou BAX) são pró-apoptóticas. Asensibilidade de células a estímulos apoptóticos depende doequilíbrio entre membros da familia BCL2 pró- e anti-apoptóticos. Além disso, o efeito de tratamento com TIMP-1-GPI sobre a expressão de BCL2 e BAX foi determinado emostra-se que o tratamento de células com câncer com TIMP-1-GPI aumentou a expressão de BAX pró-apoptótico, ediminuiu a expressão de BCL2 anti-apoptótico.

Resultados similares foram obtidos para oscons-trutos de fusão de TIMP codificados pela SEQ ID NOS: 1,2,, 3, 4 e 5, respectivamente.Em resumo, a disponibilidade da metodologia paraproduzir quantidades de micrograma para miligrama deproteínas de TIMP fixadas por GPI recombinante emcombinação com a incorporação dessas moléculas emsuperfícies de células com câncer prove uma ferramentaeficaz para o tratamento de câncer.

Os Construtos de Fusão de TIMP para Uso emMedicina Regenerativa

Além disso, os construtos de fusão da presenteinvenção são apropriados para uso em medicina regenerativa,particularmente na área de cura de ferimento. Como descritoacima, as proteínas de TIMP que são fundidas com GPI ou commucina-GPI ou fractalcina-GPI são eficientementeincorporadas na membrana de superfície celular, onde focamdomínios funcionais naquelas superfícies de célulasindependentemente de interações de proteina-proteina. Osconstrutos de fusão de TIMP da presente invenção sãotipicamente bem estáveis e exibem bioatividades novas eamplificadas.

Como descrito acima, tanto MMPs como TACEdesempenha um papel crucial no processo de cura deferimento. Niveis aumentados de MMP são associados a váriosdistúrbios de cura de ferimento, entre outros a ocorrênciade ferimento crônico. Como as TIMPs são inibidores naturaisde MMPs, os construtos de fusão da presente invenção tambémpodem ser empregados como agentes terapêuticos eficazespara controlar o processo de cura de ferimento, porexemplo, em medicina regenerativa e são apropriados paradistúrbios de tratamento caracterizados por um aumento emniveis de MMP.

Desse modo, a presente invenção prove agentes emétodos apropriados para uso em medicina regenerativa e/oupara tratar distúrbios caracterizados por um aumento emníveis de MMP. Em uma modalidade preferida, os construtosde fusão da presente invenção são utilizados para tratar ouevitar cicatrização excessiva, e cura anormal de ferimentoincluindo quelóide ou cicatrização hipertrófica e/ouferimentos crônicos. Em uma modalidade ainda adicional, osconstrutos de fusão da presente invenção são utilizadospara inibir ou evitar a formação de tecido de cicatriz.

Uma resposta típica de cura de ferimento écaracterizada pelo movimento de células especializadas paradentro do sítio de ferimento. Plaquetas e célulasinflamatórias são genericamente as primeiras células achegarem no local de lesão e essas moléculas fornecemfunções importantes e sinais químicos, incluindo citocinãsque são necessárias para o influxo de células de tecidoconectivo e outros fatores de cura. 0 termo "ferimento"significa uma ruptura de função e estrutura fisiológicanormal. Desse modo, o processo de cura de ferimento serefere à seqüência complexa e dinâmica de eventosresultando finalmente na recuperação de função econtinuidade fisiológica.

Quando um ferimento cura, uma cicatriznormalmente se desenvolve em seu lugar. Durante o curso decura normal de ferimento, tecidos simples como gordura,tecido conectivo e epitélio são regenerados. Entretanto,como a pele é um órgão mais complexo que é derivado de duascamadas germinativas, cura através da formação de um tecidopredominantemente fibroso, isto é, uma cicatriz.

Em cura normal de ferimento, a atividadeproteolítica de MMP é controlada por vários mecanismosincluindo transcrição de gene, produção da enzima e porsecreção local de inibidores de TIMP endógeno. Durantereparo de ferimento, um equilíbrio fisiológico existe entreas atividades das MMP's e TIMPs. Entretanto,metaloproteases de matriz são conhecidas por terem niveiselevados em ferimentos crônicos e tais concentraçõeselevadas de MMP são conhecidas por impedirem o processo decura de ferimento. Múltiplos tipos de células, incluindomacrófagos, fibroblastos, neutrófilos, células epiteliais,e células endoteliais, sintetizam MMP's na presença desinais bioquímicos específicos como citocinasinflamatórias. MMP's são capazes de digerir quase todos oscomponentes da matriz extracelular, que desafia oequilíbrio exigido entre as atividades de degradação deproteína de MMPs e outra atividade celular que sintetiza edeposita componentes de proteína de tecido.

A figura 8 prove uma visão geral do processo deremodelagem de tecido, fibrose e aqueles fatores envolvidosjia modulação desse processo. Após uma reação inflamatóriaaguda e crônica a um insulto especifico, uma infecçãoparasitica, ou uma resposta autoimune, fatores fibrogênicóssão expressos e secretados desse modo levando à ativação defibroblastos e ceratinócitos. Esses fatores fibrogênicósincluem, dentre outros, TGF-p, IL-1(3, IL-loc, MOB, TGF-a,IL-4, IL-13, bFGF, TNF-a e PDGF-BB. Talvez as duascitocinas mais importantes dessas sejam: TNF, que émitogênica para fibroblastos e promove angiogênese e ésecretada por macrófagos, mastócitos, e T linfócitos, eTGF-a, que é mitogênica para ceratinócitos e fibroblastos,estimula migração de ceratinócito e é secretada pormacrófagos, T linfócitos, e ceratinócitos. 0 estágioenvolvendo secreção de TGF e TNF marca a transição a partirda fase inflamatória do processo de cura de ferimento parao processo de reconstrução de tecido, isto é, a fasepfoliferativa.Após ativação, fibroblastos secretam IL-6, que émcombinação com TGF-p, leva a uma proliferação dósfibroblastos. TGF-p também promove diferenciação defibroblastos. 0 resultado desses processos de proliferaçãoe diferenciação é um aumento geral em colágeno,fibronectina, TIMPs, MMPs, bem como outras proteínas deECM, que leva a um aumento na produção de ECM e umadiminuição em movimento de ECM.

A presente invenção se baseia na verificaçãoinesperada de que os construtos de fusão revelados, isto é,proteínas de TIMP ou mutantes das mesmas, fundidas em umafixação de GPI, uma fixação de GPI-mucina ou uma fixação deGPI-fractalcina podem ser utilizados como um agente potentepara influenciar o nivel de expressão e/ou atividade dascitocinas e outras enzimas importantes envolvidas noprocesso de cura de ferimento. Desse modo, a presenteinvenção oferece agentes regenerativos eficazes e métodospara controlar o processo de cura de ferimento (porexemplo, para influenciar, inibir ou evitar a formação detecido de cicatriz) e para tratar outras disfunçõesconhecidas associadas ao processo de cura de ferimento.

Cura Anormal de Ferimento

Quelóide e cicatrização hipertrófica sãocaracterizadas por um acúmulo de colágeno em excesso e sãodistinguiveis entre si por sua aparência física. Ascicatrizes tanto de quelóide como hipertrófica sãoferimentos que cura de forma excessiva externos àsuperfície da pele. Uma cicatriz de quelóide continuatipicamente a aumentar além do tamanho e formato doferimento, enquanto uma cicatriz hipertrófica aumentadentro dos limites físicos do ferimento original. Acicatrização hipertrófica é genericamente observável logoapós a lesão de ferimento, ao passo que cicatrizes dequelóide podem se formar tão tarde quanto um ano após omomento da lesão. Entretanto, quase todas as ocorrências decicatrização anormal são associadas a insultos fisiológicosincluindo tatuagens, queimaduras, injeções, mordidas,vacinações, trauma, cirurgia ou infecção.

Cicatrizes hipertróficas e quelóides podem serdescritas como variações do processo tipico de cura deferimento. Em um ferimento tipico, os processos anabólico ecatabólico obtêm equilíbrio aproximadamente 6-8 semanasapós a lesão original. Durante maturação da cicatriz, aresistência à tração da pele melhora à medida que as fibrasde colágeno são progressivamente reticuladas. Nesse ponto,a cicatriz é normalmente hiperêmica e pode ser espessada.

Entretanto, o tecido inicial da cicatriz tende a baixargradualmente durante um periodo de meses fornecendocicatriz mais madura que é tipicamente plana, branca,flexível e possivelmente de aparência estirada. Quando hádesequilíbrio entre as fases anabólica e catabólica doprocesso de cura de ferimento, mais colágeno é produzido doque é degradado, e a cicatriz pode crescer portanto emtodas as direções.

Um método único, ótimo para tratar tecido decicatriz de quelóide e hipertrófica não foi aindadesenvolvido, desse modo a taxa de recorrência dessascicatrizes anormais é significativa.

Em resumo, citocinas e enzimas especificas,incluindo as MMPs e TIMPs, desempenham um papel crucial noprocesso de cura de ferimento e na formação de tecido decicatriz. Além disso, uma expressão anormal nos niveis deMMPs e citocinas é freqüentemente associada à cura deferimento anormal.

Desse modo, a presente invenção oferece agentesregenerativos eficazes e métodos para controlar o processode cura de ferimento e/ou para tratar disfunções comumenteassociadas à cura de ferimento. Especificamente, osconstrutos de fusão da presente invenção podem serutilizados para controlar, alterar, inibir ou mesmo evitar,eficazmente, esses processos indesejáveis. Os construtos defusão da presente invenção podem ser formulados como umproduto farmacêutico e administrodas no sitio de lesão. Emuma modalidade, o sitio de lesão é criado por cirurgia,queimadura, injeção, mordida, vacinação, trauma, cirurgiaou infecção. Em outra modalidade, o construto de fusãoutilizada para a preparação do medicamento a ser aplicadoao sitio de lesão é selecionado a partir do grupo queconsiste em TIMP-1-GPI, TIMP-2-GPI, TIMP-3-GPI, TIMP-4-GPI,TIMP-l-muc-GPI, TIMP-2-muc-GPI, TIMP-3-muc-GPI e TIMP-4-muc-GPI ou mutantes dos mesmos.

Formulações dos Construtos de TIMP e Modos deAdministração

Composições farmacêuticas baseadas nos construtosde TIMP da presente invenção podem ser formuladas em úmmodo convencional utilizando um ou mais veículos ouexcipientes f isiologicamente aceitáveis. Técnicas -"eformulações podem ser genericamente encontradas emRemington's Pharmaceutical Sciences, Meade Publishing Co'}',Easton, Pa. Para fins de injeção, os compostos da invençãopodem ser formulados em uma solução liquida,preferivelmente em um tampão fisiologicamente compatívelcomo uma solução de Hank ou solução de Ringer. Além disso",os compostos podem ser formulados em forma sólida eredissolvidos, ou suspensos imediatamente antes do uso.Formas liofilizadas são também apropriadas.

Além dessas formulações, os compostos tambémpodem ser formulados como uma preparação de depósito. Essasformulações de depósito de longa ação podem seradministradas por implantação (por exemplo, por viasubcutânea ou intramuscular) ou por injeção. Desse modo, oscompostos podem ser formulados com materiais poliméricos ouhidrofóbicos apropriados (por exemplo, como uma emulsão emum óleo aceitável) ou como uma resina de permuta de ions,ou como um derivado pouco solúvel, como um sal poucosolúvel. Outros sistemas de fornecimento apropriadosincluem microesferas, que oferecem a possibilidade de umfornecimento local e não invasivo de drogas durante umperiodo prolongado de tempo. Essa tecnologia especificautiliza microesferas tendo um tamanho pré-capilar que podemser injetadas através de um cateter coronário em qualquerparte selecionada de um tecido, por exemplo, o coração ououtros órgãos, sem causa inflamação resultante ou isquemia.

A terapêutica administrada é lentamente liberada a partirdessas microesferas e prontamente absorvida por célulaspresentes no tecido circundante (por exemplo, célulascancerosas ou lesionadas).

Para administração tópica, os oligômeros dainvenção podem ser formulados em ungüentos, pomadas, géis,ou cremes genericamente conhecidos na técnica. Uma soluçãode lavagem contendo o oligômero pode ser utilizadalocalmente para tratar uma lesão ou inflamação ou paraacelerar genericamente o processo de cura.

Os construtos de TIMP da presente invenção podemser combinados ao preparar um medicamento, de modo que omedicamento resultante compreenda mais de uma,preferivelmente duas, e ainda mais preferivelmente trêsconstrutos de TIMP diferentes. Com essa abordagem, asbioatividades amplificadas e novas dos diferentes membrosda família de TIMP podem ser preferencialmente combinadas edirecionadas à superfície de célula, o que pode levar a umefeito sinergista. Por exemplo, os construtos de fusão deTIMP-1 inibem a maioria das MMPs, exceto MMP-2 e MMP14.Portanto, qualquer uma dos construtos de TIMP-1 pode sercombinado com qualquer uma dos construtos de TIMP-2 ouTIMP-4 os quais ambos inibem preferencialmente MMP-2.

Portanto, por meio dessa combinação, uma inibição maiscompleta da família de MMP pode ser obtida.

Em uma modalidade, as formulações da presenteinvenção compreendem, portanto, um construto de TIMP-1 ouum construto de TIMP-2 e/ou uma de TIMP-4. Em umamodalidade preferida, a formulação compreende um construtode TIMP-1 selecionado do grupo que consiste em uma TIMP-1-GPI truncada como codificado pela SEQ ID NO: 1, uma TIMP-1-frac-GPI truncada como codificado por SEQ ID NO: 5, e umaTIMP-l-muc-GPI truncada como codificado por SEQ ID NO: 2, eum construto TIMP-2 e/ou TIMP-4. Preferivelmente, oconstruto de TIMP-2 é codificado pela SEQ ID NO: 3.

Em uma modalidade adicional, a formulaçãocompreende um construto de TIMP-3 da presente invenção,pref erivelmente aquela codificada por SEQ ID NO: 4, queinibe TACE juntamente com pelo menos uma dos construtos deTIMP selecionados do grupo que consiste em uma TIMP-1-GPItruncada como codificado por SEQ ID NO: 1-., uma TIMP-l-frac-GPI truncada, uma TIMP-l-muc-GPI truncada, um construtoTIMP-2 e. TIMP-4. Preferivelmente, os construtos TIMP-1 eTIMP-2 são codificados por SEQ ID NOS: 1, 2, 3 e 5,respectivamente.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1. Incorporação de TIMP-1-GPI em membranasde célula de RCCs.

A. Para demonstrar reincorporação de proteína deGPI-TIMP-1 em membranas de células, TIMP-1-GPI purificadoou rhTIMP-1 de controle foi adicionado a células RCC-26,RCC-53 e A498 nativas. TIMP-1 foi detectado na superfíciede célula por análise de FACS. Histogramas cinzas são acoloração de controle de isotipo, histogramas de linhacheia representam coloração de anticorpo de TIMP-1.

B. Para demonstrar ligação de GPI após incubaçãocom 200 ng/ml ou 700 ng/ml de TIMP-1-GPI ou rhTIMP-1,células foram tratadas com 60 ng/ml de PLC e entãosubmetidas à análise de FACS. Histogramas cinzasrepresentam o controle de isotipo.

C. ELISA TIMP-1 humano foi utilizado paradeterminar a quantidade de proteína de TIMP-1 liberada apartir de células de RCC tratadas com TIMP-1-GPI (comomostrado em B) após digestão de PLC.

Figura 2. TIMP-1-GPI inibe a liberação de proMMP-2 e proMMP-9 a partir das células RCC-53.

Zimografia foi utilizada para estudar a secreçaode proteínas MMP-2 e MMP-9 a partir de RCC-53. As célulasforam tratadas com quantidades crescentes de TIMP-1-GPI, ourhTIMP-1 de controle, e após 48 h o sobrenadante de culturaisento de soro foi removido e analisado por zimografia degelatinase.

Figura 3. Expressão de superficie de MMPs apóstratamento com TIMP-1-GPI.

Após incubação de células de RCC-53 com 700 ng/mlde proteína TIMP-1-GPI por 24 h FACS foi executadoutilizando anticorpos específicos dirigidos contra: (A)TIMP-1, MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-8 e MMP-9, ou (B)MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-16, HLA-A2 (HB82) , pan HL'Aclasse I (W6/32) e ICAM-1. Como controle adicional, o TIMP-1-GPI foi clivado a partir da superfície após uma.hora portratamento com PLC (vide a figura 1) . Histogramas cinzassão a coloração de controle de isotipo, histogramas delinha cheia representam amostras tratadas com TMP-1-GPI. "JC. A secreção de uma série de MMPs a partir deRCC 5 3 foi testada utilizando Western blot e anticorposmonoclonais dirigidos contra MMP-1, MMP-3, MMP-7, MMP-8,MMP-12 e MMP-13. Meios de cultura (isentos de soro) foramtirados 24 horas após o tratamento de RCC-53 com 700 ng/mlde rhTIMP-1 ou TIMP-1-GPI e comparados com células decontrole não tratadas.

D. O efeito de seqüestro de superficie de célulade MMPs em invasão de RCC-53 através de Matragel

A membrana de embasamento modelo foi avaliada. Amigração ótima das células de RCC-53 para VEGF (4 ng/ml)foi definida como linha de base ou "zero" e o valor deinibição de 100% definido para o valor de migração vistopara células RCC-53 não tratadas sem sinal de VEGF. Ascélulas RCC-53 foram pré-tratadas com 350 ng/ml ou 700ng/ml de rhTIMP-1 ou TIMP-1-GPI. Após uma hora as célulasforam lavadas e aplicadas na câmara de migração. O efeitosobre a migração foi então avaliado. Os dados apresentadosrepresentam uma média de quatro cavidades e doisexperimentos.

Figura 4. Efeito de proteina rhTIMP-1- e TIMP-1-GPI sobre a proliferação das linhagens de RCC.

O efeito de niveis crescentes de proteina decontrole rhTIMP-1 ou TIMP-1-GPI sobre a proliferação deRCC-53 (A), A498 (B) e RCC-26 (C) foi medido utilizando umensaio de MTT. O MTT foi adicionado após 24 h, 48 h ou 72 hcomo indicado.

Figura 5. TIMP-1-GPI não influenciasuscetibilidade de RCC a apoptose mediada por perforinCélulas de RCC foram deixadas sem tratamentotratadas com 700 ng/ml de TIMP-1-GPI (0) ou proteinade rhTJMP-l (o) por 24 h e incubadas com CTL JB4 (A) oulinhagens de NK (B) NKL para RCC-53 e A498, ou NK-92 paraRCC-26). São mostrados exemplos representativos de trêsexperimentos independentes com resultados similares.

Figura 6. TIMP-1-GPI não aumenta a expressão deFAS porém torna as células sensíveis a apoptose induzidapor FAZ.

A. Células RCC-53, RCC-26 ou A498 foram tratadasou não tratadas com 700 ng/ml de TIMP-1-GPI ou rhTIMP-1 por24 h. e foram coloridas com FAS anti-humano (L-958) eanalisadas em relação à expressão de superfície de FAS porcitometria de fluxo. Colorações de controle de isotipo deanticorpo monoclonal são mostradas como histogramas cinzas.

As três linhagens de células RCC foram tratadascom TIMP-1-GPI ou rhTIMP-1 seguido por incubação de L-957.

A ligação de anexin V-fluoroisotiocianato (FITC) foiutilizada para detectar apoptose viável e prematura pòrcitometria de fluxo.

O baixo nível de apoptose nas células RCC-53 em(B) foi verificado utilizado um ELISA de nucleossomacitoplasmático mais sensíveis. Os níveis crescentes deapoptose foram detectados após incubação de L-957 comníveis crescentes de TIMP-1-GPI porém não rhTIMP-1.

Figura 7. Expressão de BAX e BCL-2 em RCCs apóstratamento com TIMP-1-GPI ou rhTIMP-1, analisada porcoloração FACS interna e Western blot.

Células RCC-53 (A), RCC-26 (B) e A498 (C) forampré-incubadas com TIMP-1-GPI ou rhTIMP-1 por 24 h., aseguir tratadas com L-957 ativando anticorpo FAS por umperíodo adicional de 16 h. As células foram entãoanalisadas com anticorpos monoclonais anti-BCL-2 e anti-BAXutilizando citometria de fluxo. Em paralelo proteínas foramextraídas e medidas por Western blot. Os sinais derivados apartir de BAX e BCL-2 foram normalizados para níveis de (3-actina após densitometria. Os resultados de FACS sãoapresentados como histogramas com valores em parêntesescorrespondendo a MHI de BCL-2 ou BAX ou anticorpos deisotipo correspondentes.

Figura 8: visão geral de remodelagem de tecido efibrose

Um diagrama esquematico representando a interaçãocomplexa de fatores envolvidos no equilíbrio delicado deprodução de ECM e movimento durante o processo de cura deferimento.

Figura 9: Efeito de construtos de fusão de TIMPsobre produção de fibronectina de fibroblastos na presençade rhTIMP-1

Fibroblastos confluentes foram cultivados napresença ou ausência de rhTIMP-1 e TIMP-1-GPI; fibronectinaexpressa e secretada foi quantificada por análise deWestern blot utilizando anticorpos anti-fibronectina (P~actina serviu como controle). rhTIMP-1 (em 700 ng/ml) nãolevou a nenhuma diminuição significativa em expressão defibronectina, enquanto TIMP-1-GPI (em 700 ng/ml) reduziufortemente a fibronectina que foi secretada pelosfibroblastos.

Figura 10. Efeito de construtos de fusão de TIMPsobre produção de fibronectina de fibroblastos na presençade TNF-a

Fibroblastos foram cultivados na presença (figura10A) ou ausência (figura 10B) de 10 ng/ml de jfibroblastoiativando TNF-a juntamente com 350 ng/ml de TIMP-1-GPI ou700 ng/ml de TIMP-1-GPI, TIMPI-1-GPI desnaturado e rhTIMP-1-GPI, respectivamente. Em uma concentração de 350 ng/ml deTIMP-1-GPI, o RNA de fibronectina transcrito foisignificativamente reduzido, independentemente de se TNF-aestava presente no meio.Figura 11. Efeito de construtos de fusão de TIMPna produção de IL-6 de fibroblastos

RNA de fibronectina como transcrito porfibroblastos foi avaliado por análise Northern blot,utilizando uma sonda para IL-6 RNA. Desse modo,fibroblastos foram cultivados na presença (figura 11A) ouausência (figura 11B) de 10 ng/ml do fibroblasto ativandoTNF-a juntamente com 350 ng/ml de TIMP-1-GPI ou 7 00 ng/mlde TIMP-1-GPI, TIMP-1-GPI desnaturado e rhTIMP-l-GPI,respectivamente. Em uma concentração de 350 ng/ml de TIMP-1-GPI, o IL-6 RNA transcrito foi surpreendentementereduzido, independentemente de se TNF-a estava presente nomeio.

Figura 12. Efeito de construtos de fusão de TIMPsobre a produção de colágeno de fibroblastosRNA de fibronectina, como transcrito porfibroblastos, foi avaliado por análise de Northern blot,utilizando sondas para Colágeno 1A1 (figura 12A e B),Colágeno 4A2 (figura 12C e D) , e Colágeno 16A1 (figura 12Ee F) , respectivamente. Desse modo, fibroblastos foramcultivados na presença (figuras 12A, C, E) ou ausência(figura 12B, D, F) de 10 ng/ml do fibroblasto ativando TNF-a juntamente com 350 ng/ml de TIMP-1-GPI ou 700 ng/ml deTIMP-1-GPI, TIMP-1-GPI desnaturado e rhTIMP-l-GPI,respectivamente. Em uma concentração de 350 ng/ml de TIMP-1-GPI, todos os três RNAs de colágeno transcritos foramsignificativamente reduzidos, independentemente de se TNF-aestava presente no meio.

Figura 13. Efeito de construtos de fusão de TIMPsobre a produção de TGF-p de fibroblastosRNA de fibronectina como transcrito porfibroblastos foi avaliado por análise de Northern blot,utilizando sondas para TGF-(3. Desse modo, fibroblastosforam cultivados na presença (figura 13A) ou ausência(figura 13B) de 10 ng/ml do fibroblasto ativando TNF-ccjuntamente com 350 ng/ml de TIMP-1-GPI ou 700 ng/ml deTIMP-1-GPI, TIMP-1-GPI desnaturado e rhTIMP-l-GPI,respectivamente. Em uma concentração de 350 ng/ml de TIMP-1-GPI, quase nenhum RNA de TGF-p pode ser detectado,independentemente de se TNF-a estava presente no meio, eindependentemente do teor de FCS do meio.

EXEMPLOS

Nos exemplos a seguir, os efeitos anti-tumor daTIMP fixada por GPI em células de câncer são descritos emmais detalhe. Embora os experimentos descritos sejamrealizados com TIMP-1 humana, a invenção não será limitadaa esse tipo de TIMP.

Nos exemplos a seguir, uma fixação por GPI foifundida com TIMP-1 para focar concentrações definidas dessaproteína inibidora na superfície de três linhagens decélulas de carcinoma de células renais (RCC) (RCC-26, RCC-53- e A498) independentemente de interações de proteina--proteina de superfície de célula. Como mostrado a seguir,TIMP-1-GPI adicionado de forma exógena inseriueficientemente na membrana de célula de RCC e alteroudramaticamente a associação de MMPs com a superfície dêcélula. O tratamento com TIMP-.l-GPI inibiu a proliferaçãode RCC e tornou as células RCC normalmente resistentes aFAS sensíveis à apoptose induzida por FAS porém:não alteroua lise mediada por perforin por células efetorascitotóxicas. A sensibilidade aumentada de apoptose mediadapor FAS correlacionou com uma alteração no equilíbrio deproteínas da família BCL-2 pró- e anti-apoptótica.As linhagens de células RCC-26 (Schendel eoutros, 1993) e RCC-53 foram estabelecidas a partir depacientes locais com carcinomas de célula clara estágio I eestágio IV, respectivamente. Desse modo, representam osdois extremos clínicos de RCC. CTL de infiltração de tumorfoi isolado do tumor de dois pacientes. Embora essascélulas efetoras de ocorrência natural fossem incapazes decontrolar o crescimento de tumor in vivo, a coloração demarcador de superfície de RCC-26 e RCC-53 revelou boaexpressão de superfície de MHC classe I, e as duaslinhagens foram mostradas como induzindo CTL específico deanti-tumor e alo in vitro (Schendel e outros, 2000) e DJS,observação não publicada). A498 foi originalmente isolado apartir do tumor de um homem com 52 anos de idade e é umexemplo bem estudado de RCC (Giard e outros, 1973).

Exemplo 1

Incorporação de TIMP-1-GPI adicionado de formaexógena na superfície de RCC-53

A proteína de TIMP-1. fixada por GPI foi gerada éisolada como anteriormente descrito (Djafarzadeh e outros,2004) . A incorporação de proteína de GPI-TIMP-1 purificadanas membranas de superfície de linhagens de células RCCRCC-53, RCC-26 ou A498 foi demonstrada por incubação daslinhagens de células com 700 ng/ml de TIMP-l-GPI ouproteína de controle (rh)TIMP-l humana recombinante por umah. A proteína de TIMP-1 associada à superfície foi entãodetectada utilizando FACS (figura 1). A adição de rhTIMP-1de. controle não levou à alteração no deslocamento de FACS/entretanto, TIMP-1 fixado por GPI resultou em um sinal desuperfície forte para TIMP-1.

Para demonstrar que a proteína adicionada de-forma exógena foi fixada por GPI, células de RCC-53 foram-'-primeiramente incubadas com proteína de TIMP-1-GPI (200 ou:700 ng/ml) e então tratadas cora 60 ng/ml de fosfolipase C(PLC). A análise de FACS demonstrou a perda total de sinalde superfície de célula TIMP-1 após digestão de PLC (Figura1B). Para medir a eficiência de integração de TIMP-1-GPI, aTIMP-1 liberada da membrana foi coletada nos tampões delavagem, e quantificada utilizando ELISA especifico deTIMP-1- (Figura 1C) . Os resultados mostram que 66% doantigeno de TIMP-1 de partida foram recuperados a partir deamostra de 200 ng/ml, enquanto 31% poderiam ser recuperadosa partir da incubação de 700 ng/ml.

Exemplo 2

Proteína de TIMP-1-6PI bloqueia a liberação deproMMP-2 e proMMP-9 a partir de RCC-53

Uma expressão aumentada de MMP-2 e MMP-9correlaciona com um prognóstico ruim de RCC (Hemmerlein eoutros, 2004) . A linhagem de células de carcinoma decélulas claras estágio IV RCC-53 secreta de formaconstitutiva tanto proMMP-2 como proMMP-9 (Figura 2) . Oefeito de aumento de niveis de TIMP-1 em superfície naliberação constitutiva de proteínas de MMP-2 e MMP-9 foitestado utilizando ensaios de zimografia de gelatinase(Djafarzadeh e outros, 2004; Klier e outros, 2001). AprpÇeina rhTIMP-1 em ,600 . ou 1200 ng/ml não teve efeitosobre secreção de proMMP-2 ou proMMP-9. Ao contrário,iniciando em 10 ng/ml, o tratamento com TIMP-1-GPI mostrouuma diminuição dependente de concentração da liberaçãotanto de proMMP-2 como de proMMP-9 no meio de crescimento.

Exemplo 3

Tratamento com TIMP-1-6PI leva a aumento emexpressão superficial de metaloproteinases de matriz

Com base nos resultados dos experimentos dezimografia de gelatinase, é possível que TIMP-1-GPI possaatuar para seqüestrar MMPs na superfície de célula. TIMP-1liga formas mais ativas de MMPs, as exceções sendo MMP-14 eMMP-16 (Brew e outros, 2000; Lang e outros, 2004). Apósincubação de RCC-53 com 700 ng/ml de proteína de TIMP-1-GPIpor 24 h., as análises de FACS utilizando corposespecíficos de MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9,MMP-12, MMP-13,MMP-14 MMP-15 e MMP16 . mostraram, com aexceção de MMP-14, um aumento em intensidade média defluorescência de canal (MFI) para cada uma das MMPs. Aproteína de controle de rhTIMP-1 não teve efeito óbviosobre o sinal de FACS (dados não mostrados). A expressão desuperfície de outras proteínas incluindo MHC classe I (panclasse I e HLA-A2) e ICAM-1 não foi efetuada por tratamentocom TIMP-1-GPI. Digestão do RCC53 tratado com TIMP-1-GPIcom PLC após uma hora (como executado na figura 1) nãomostrou aumento em MMPs (Figura 3A e 3B). O acúmulo de MMPsna superfície da célula espelhou a redução em secreção deproMMP-2 e proMMP-9 mostrados na figura 2. Para testaradicionalmente esse bloqueio aparente de liberação.de MMP,experimentos de Western blot foram executados utilizandoanticorpos monoclonais dirigidos contra MMP-1, (MMP-3, MMP-7> MMP-8, MMP-12 e MMP-13 em meios (isentos, de soro)derivados de células de RCC53 de controle ou célulastratadas 24 horas com 700 ng/ml de rhTIMP-1 ou TIMP-1-GPI(Figura 3C) . A presença de cada uma das MMPs foi- detectadano meio a partir das células dè RCC-53 de controle. Aincubação com rhTIMP-1 não eliminou a secreção das MMPs. Aocontrário, TIMP-1-GPI pareceu bloquear totalmente aliberação de cada MMP estudado.

Para avaliar o efeito desse acúmulo superficialde MMPs sobre a capacidade das células invadirem ECM, acapacidade de migração/invasão das células foi testadautilizando um ensaio de câmara Boyden modificada commembranas revestidas com ECM. A capacidade geral dascélulas de RCC-53 invadirem ECM não foi muito acentuada(dados não mostrados). Para aumentar a invasão, os niveiscrescentes de fator de crescimento endotelial vascular(VEGF) foram aplicados nas cavidades inferiores e osexperimentos foram feitos por 48 h. Uma resposta de 1 invasãoótima foi vista em 4 ng/ml de VEGF (dados não mostrados) eessa resposta foi ajustada como invasão de linha de base,ou zero % de inibição (Figura 3D) . Células de RCC-53 pré-tratadas por 30 minutos com 350 ou 700 ng/ml de rhTIMP-1,ou TIMP-1-GPI foram então lavadas, e aplicadas na cavidadesuperior da câmara Boyden. O aumento ou diminuição relativoem migração/invasão foi então determinado (vide Materiais eMétodos). Embora o tratamento com rhTIMP-1 bloqueasseparcialmente a invasão das células, TIMP-GPI em 700 ng/mlbloqueou totalmente a invasão das células RCC-53 (Figura 3D)

Exemplo 4

TIMP-1 fixada por 6PI efetua proliferação de RCC

Para avaliar o efeito de engenharia de superfíciede TIMP-1 sobre a proliferação de RCC. Ensaios de MTT foramexecutados. Verificou-se que a proteína de TIMP-1-GPÍadicionada de forma exógena elicia uma diminuiçãodependente de dose na proliferação de RCC-53 e A498 em 24,48 e 72 horas (Figura 4b). Células de RCC-26 proliferamextremamente lentamente (taxa de duplicação 48+ h) e átendência geral sugeriu uma supressão de proliferação(Figura 4C) . Controles adicionais utilizandofosfatidilinositol em uma concentração molar igual aoreagente TIMP-1-GPI (Sigma, Alemanha, no. P6636) nãolevaram a alterações significativas em proliferação dascélulas (dados não mostrados).Exemplo 5

Citotoxicidade mediada por células

A atividade de MMP foi ligada à sensibilidade decélulas alvo à apoptose induzida por atividade de célula Tcitotóxica (apoptose mediada tanto por perforin/granzimacomo FAS) (Egeblad & Werb, 2002) . O efeito de TIMP-1-GPIsobre extermínio de RCC dependente de células foi testadoutilizando apoptose induzida por células NK e CTLalogeneicas. Nos ensaios mediados por CTL alogeneicos,células alvo RCC-53, A498 e RCC-26 foram tratadas com 700ng/ml de rhTIMP-1 ou TIMP-1-GPI, a seguir rotuladas comCr51 e incubadas com CD8+ CTL JB4 alogeneicas (Figura 5A)ou linhagens de células NK (Figura 5B) . As linhagens decélulas de tumor RCC foram reconhecidas e efetivamenteexterminadas por células tanto CTL como NK. O tratamentocom TIMP-1 ou TIMP-1-GPI não alterou a suscetibilidade dastrês linhagens de RCC à apoptose mediada por células CTL ouNK.

Exemplo 6

O tratamento com TIMP-GPI torna RCC sensivel aexterminio mediado por FAS

Os experimentos com CTL/NK mostraram que otratamento com TIMP-1-GPI não influenciou a via líticâmediada por perforin/granzima medida no ensaio de liberaçãode cromo. Essa via atua rapidamente utilizando a secreçãode citotoxinas armazenadas para iniciar apoptose erepresenta um dos dois principais mecanismos de morte decélulas imunes-iniciados (Trapani e outros, 2000). Asegunda via envolve ligação de FAS/CD95. O efeito detratamento com TIMP-1-GPI sobre apoptose mediada por FASfoi então determinado.

A expressão de FAS sobre as linhagens de RCC foiprimeiramente determinada por citometria de fluxoutilizando um mAB anti-FAS de não ativação (L-958) (H.Engelmann resultados não publicados). Células não tratadase células tratadas com 700 ng/ml de TIMP-1-GPI ou proteínade controle de rhTIMP-1 por 24 horas foram coloridas com L-958 e analisadas. A proteína de FAS foi fortemente expressapor todas as três linhagens de RCC. O tratamento com TIMP-1-GPI ou rhTIMP-1 não afetou a expressão superficial dacélula de FAS (Figura 6A).

O mAB anti-FAS L-957 pode induzir apoptose emcélulas que expressam FAS (H. Englemann, resultados nãopublicados). A ligação de V-fluoroisotiocianato de anexina(FITC) e incorporação de iodeto de propidio (PI) em célulasde RCC após tratamento com L-957 foi utilizada paradetectar apoptose por citometria de fluxo. Como demonstradona figura 6B, RCC-26 e RCC-53 foram muito resistentes aapoptose mediada por FAS. A intensidade de fluorescência(MFI) de células tratadas com L-957 e não tratadas foisimilar. Um leve aumento em MFI foi visto na RCC-53 emresposta ao tratamento com L-957. Essas observações estãoem linha com relatórios anteriores que RCC é genericamenteresistente a apoptose mediada por FAS (Frost e outros:,2003) . O tratamento com TIMP-1-GPI (L-957+TIMP-1-GPI),porém não rhTIMP-1 de controle (L-957+rhTIMP-l) ,.. tornou aslinhagens de células sensíveis à apoptose mediada- por FAS(figura 6B) . Verificou-se que A498 é mais sensível à mABanti-FAS de ativação (detectado por anexina-MFI aumentadaem amostras tratadas com L-957). O tratamento com TIMP-1-GPI, porém sem rhTIMP-1, aumentou significativamente aapoptose das células A498.

Embora as células RCC-26 e A498 mostrassem umaumento dramático em apoptose induzida por FAS apóstratamento com TIMP-1-GPI, a linhagem de células RCC-53mostrou um aumento menos acentuado em sensibilidade(mudança em MFI de 62 para 93) . Para confirmar a apoptoseinduzida por FAS/TIMP-1-GPI de RCC-53, um segundo ensaioELISA com base na detecção de cromatina citoplásmica foiempregado. As vantagens desse ensaio incluem a falta desubjetividade em interpretar os resultados e suasensibilidade aumenta em relação à coloração de anexina V.ELISA de cromatina é capaz de detectar um número tãopequeno quanto 300 células apoptóticas e mede eventos deapoptose consideravelmente a jusante a partir da presençaprematura de anexina V na superfície da célula. Como foiverificado na análise FACS de anexina V (Figura 6B) , otratamento de RCC-53 com L-957 individualmente induziu umleve aumento em apoptose (Figura 6C). Entretanto, otratamento de células RCC-53 com TIMP-1-GPI aumentoudramaticamente a sensibilidade das células a apoptoseinduzida por anti-FAS em um modo dependente de dose.

Os resultados demonstram que tratamento décélulas de câncer com TIMP fixado por GPI efetua extermíniodas células de câncer por apoptose induzida por FAS.Portanto, TIMP fixado por GPI é útil como agente anti-tumor.

Exemplo 7

Tratamento com TIMP-1-GPI de RCC reduz BCL-2 eaumenta expressão de proteína BAX

As proteínas BCL-2 representam uma família dèproteínas envolvidas no controle de apoptose (examinado emIgney & Krammer, 2002). Alguns membros dessa família (comoBCL-2 e BCL-XL) são anti-apoptóticos, enquanto outros (comoBad ou BAX) são pró-apoptóticos. A sensibilidade de célulasa estímulos apoptoticos pode depender do equilíbrio entremembros de família BCL-2 pró- e anti-apoptóticos (Igney &Krammer, 2002) . O efeito de tratamento com TIMP-1-GPI sobrea expressão de BCL-2 e BAX foi então determinado. Após umapré-incubação de 24 h com 700 ng/ml de TIM-1-GPI oucontrole de rhTIMP-1, células de RCC foram estimuladas comug/ml de L-957 (ou mAB de controle) por um períodoadicional de 16 h. O nivel de BCL-2 e proteina BAX foientão determinado utilizando FACS intracelular e. Westernblot. Em todas as três linhagens de células, o tratamentocom TIMP-1GPI aumentou a expressão de BAX pró-apoptótica, ediminuiu a expressão de BCL-2 anti-apoptótica. Um padrãosimilar foi visto em ensaios de Western blot (Figuras 7A,Be C).

Exemplo 8

Incorporação de TIMP-l-mucina-GPI adicionada deforma exógena na superfície de RCC-53

A proteína TIMP-l-mucina-GPI foi gerada, eisolada como descrito no exemplo 1. A incorporação deproteína GPI-TIMP-1 purificada nas membranas de superfíciede linhagens de células RCC RCC-53, RCC-26 ou A498 foidemonstrada por incubação das linhagens de células com 700ng/ml de TIMP-mucina-GPI purificado ou proteina de controle(rh)TIMP-l humano, recombinante. por uma hora. A proteínaTIMP-l-mucina-GPI associada à superfície foi entãodetectada utilizando FACS. O construto de TIMP-l-mucina-GPÍfoi eficientemente incorporado na membrana de superfície epromoveu efetivamente a atividade anti-tumor.

Exemplo 9

TIMP-GPI para o tratamento de câncer residual emum indivíduo

O reagente TIMP-1-GPI ou TIMP-mucina-GPI éaplicado em 1 |ig/ml localmente na área de resseção apósexcisão cirúrgica de tumor. Um tumor inoperável,.glioblastoma (astrocitoma grau IV WHO) é removidocirurgicamente e os reagentes são instalados antes dofechamento do ferimento.Exemplo 10

TIMP-GPI para o tratamento de câncer residual emum indivíduo

Uma quantidade de 1 ng/ml de reagente de TIMP-1-GPI ou TIMP-mucina-GPI é aplicada localmente na área deresseção após excisão cirúrgica de tumor. Um tumor, câncerde mama em estágio avançado, é removido cirurgicamente e osreagentes são instalados antes do fechamento do ferimento,particularmente se houver um risco clinico de relapsolocal.

Exemplo 11

Avaliação de TIMP-GPI em modelos de metastase detumor

0 efeito de TIMP-1-GPI sobre metástase de tumorfoi avaliado. Utilizando um modelo murino, um linfoma decélula. T: que eficientemente faz metástase no figado foipré-tratado com .TIMP-1-GPI ou proteína de controle derhTIMP-1. 0 tumor resultante foi então administrado atravésda veia da cauda, e a distribuição do tumor no figado foideterminada três e sete dias após. Os resultados demonstramque células tratadas com TIMP-1-GPI mostram um nivelsignificativamente reduzido de micrometástase em relação àscélulas de controle tratadas com TIMP.

Exemplo 12

Ensaios de invasão Matrigel

0 efeito de TIMP-1-GPI sobre as linhagens decélulas de tumor do Exemplo 11 foi ensaiado em uma série deexperimentos Matrigel. Os resultados confirmaram que TIMP-1,-GPI teve um efeito profundo sobre a capacidade dascélulas de linhagem de tumor de células T serem submetidasà invasão de Matrigel em relação a rhTIMP-1.Exemplo 13

Efeito de construtos de fusão de TIMP sobreprodução de fibroblastos, por fibronectina

Fibroblastos confluentes foram cultivados napresença ou ausência de rhTIMP-1 e TIMP-1-GPI. Fibronectinaexpressa e secretada foi quantificada por análise Westernblot utilizando anticorpos anti-fibronectina (p-actinaserviu como controle). A figura 9 representa os resultadosdesse experimento e demonstra claramente que rhTIMP-1 (em700 ng/ml) não levou a nenhuma diminuição significativa emexpressão de fibronectina, enquanto TIMP-1-GPI (em 700ng/ml) reduziu fortemente a fibronectina que foi secretadapelos fibroblastos.

Adicionalmente, RNA de fibronectina transcritopor fibroblastos foi avaliado por análise de Northern blot.

Fibroblastos foram cultivados na presença (Figura 10A) ouausência (Figura 10B) de 10 ng/ml do fibroblasto ativando

TNF-a juntamente com 350 ng/ml de TIMP-1-GPI ou 700 ng/mlde TIMP-1-GPI, TIMP-1-GPI desnaturado e rhTIMP-l-GPI,respectivamente. Além disso, 0%, 1%, 5% ou 10% de FSÇestavam presentes no meio de cultura.

Esses resultados demonstram claramente que em umaconcentração de 350 ng/ml de TIMP-1-GPI, o RNA defibronectina transcrito foi significativamente reduzido,independentemente de se TNF-a estava presente no meio ounão, e independentemente do teor de FCS do meio. Em 700,ng/ml de TIMP-1-GPI, RNA de fibronectina foi raramentedetectável.

Desse modo, o construto de fusão de TIMP-GPi;inibe eficientemente tanto a síntese como a secrèção da'fibronectina de fator de crescimento em fibroblastos.Exemplo 14

Efeito de construtos de fusão de TIMP sobre aprodução de fibroblastos por IL-6

A análise de Northern blot do exemplo 13 foirepetida utilizando uma sonda para RNA IL-6. Desse modo,fibroblastos foram cultivados na presença (Figura 11A) ouausência (Figura 11B) de 10 ng/ml do fibroblasto ativando

TNF-a juntamente com 350 ng/ml TIMP-1-GPI ou 700 ng/ml deTIMP-1-GPI, TIMP-1-GPI desnaturado e rhTIMP-l-GPI,respectivamente. Além disso, 0%, 1%, 5% ou 10% de FSCestavam presentes no meio de cultura (Figura 11).

Os resultados demonstram claramente que já em umaconcentração de 350 ng/ml de TIMP-1-GPI, o RNA de IL-6transcrito foi surpreendentemente reduzido,independentemente de se TNF-a estava presente no meio ounão e independentemente do teor de FCS do meio.

Desse modo, o construto de fusão de TIMP-GPIinibe eficientemente tanto a sintese como a secreção aindade outra citocina importante envolvida na cura deferimento, a saber IL-6, em fibroblastos.

Exemplo 15

Efeito de construtos de fusão de TIMP sobreprodução de colágeno por fibroblastos

A análise de Northern blot executada nos Exemplos13 e 14 foi repetida utilizando sondas para Colágeno 1A1(Figura 12A e B), colágeno 4A2 (Figura 12C e D), e colágeno16A1 (Figura 12E e F), respectivamente. Desse modo, ósfibroblastos foram cultivados na presença (Figuras 12A, C,E) ou ausência (Figura 12B, D, F) de 10 ng/ml dofibroblasto ativando TNF-a juntamente com 350 ng/ml deTIMP-1-GPI ou 700 ng/ml de TIMP-1-GPI, TIMP-1-GPIdesnaturado e rhTIMP-l-GPI, respectivamente. Além disso,0%, 1%, 5% ou 10% de FSC estavam presentes no meio decultura.

Os resultados demonstram claramente que já em umaconcentração de 350 ng/ml de TIMP-1-GPI, todos os três RN Asde colágeno transcrito foram significativamente reduzidos,independentemente de se TNF-a estava presente no meio ounão, e independentemente do teor de FCS do meio.

Desse modo, o construto de fusão de TIMP-GPIinibe eficientemente a sintese e a secreção de colágeno,que é uma proteina essencial na produção de ECM eremodelagem de tecido.

Exemplo 16

Efeito de construtos de fusão de TIMP sobre aprodução de fibroblastos, por TGF-0.

A análise de Northern blot dos Exemplos 13 -15foi repetida utilizando sondas para TGF-0. Desse modo, osfibroblastos foram cultivados na presença (Figura 13A) ouausência (Figura 13B) de 10 ng/ml do fibroblasto ativandoTNF-a juntamente com 350 ng/ml de TIMP-1-GPI ou 7 00 ng/mlde TIMP-1-GPI, TIMP-1-GPI desnaturado e rhTIMP-l-GPI,respectivamente. Além disso, 0%, 1%, 5% ou 10% de FSCestavam presentes no meio de cultura.

Os resultados demonstram claramente que já em umaconcentração de 350 ng/ml de TIMP-1-GPI, quase nenhum RNAde TGF-p pode ser detectado independentemente de se TNF-aestava presente no meio ou não e independentemente do teorde FCS do meio.

Portanto, como ilustrado pelo exemplo acima, oconstruto de fusão de TIMP-GPI inibe eficientemente asintese e a secreção ainda de outra citocina importanteenvolvida na cura de ferimento, a saber TGF-p, emfibroblastos.

Exemplo 17

Geração de construtos de fusão de TIMP adicionais

Construtos de fusão de TIMP adicionais foramgerados e purificados de acordo com a seção "Materiais emétodos", fornecida abaixo. Especificamente, um construtode fusão TIMP-1-GPI truncado (SEQ ID NO: 1), um construtode fusão TIMP-l-muc-GPI truncado (SEQ ID NO: 2), umconstruto TIMP-2-GPI (SEQ ID NO: 3), um construto TIMP-3-GPI e uma forma mudada de TIMP-3-GPI (SEQ ID NO: 4), e umconstruto de fusão TIMP-l-fractalcina-GPI truncado (SEQ IDNO: 5) foram construídos, expressos e purificados.

0 construto de fusão TIMP-1-GPI truncado (SEQ IDNO: 1) compreende os 152 primeiros aminoacidos de proteínaTIMP-1 humana (isto é, os aminoacidos terminais-C 126-207foram deletados) fundidos com uma fixação de GPI de 36aminoacidos de comprimento. O construto de fusão de TIMP-l-muc-GPI truncado (SEQ ID NO: 2) contém os 152 primeirosaminoacidos da proteína TIMP-1 humana fundidos còmaminoacidos 256-280 de CXCR16 humano (mucina)adicionalmente fundido com uma fixação de GPI de 36aminoacidos em comprimento. O construto de fusão resultantecontém 295 aminoacidos e tem um peso molecular de 32.111kDa.

Por analogia ao TIMP-1-GPI de comprimento total,o TIMP-2-GPI (SEQ ID NO: 3) e TIMP-3-GPI consistem emproteína TIMP-2 e TIMP-3 humana, respectivamente, fundidascom uma fixação de GPI de 36 aminoacidos em comprimento'.Para produzir a forma mudada do construto de fusão de TIMP-3-GPI (SEQ ID NO: 4), o dominio de ligação de GAG da TIMP-3humana, que se pensa ser responsável por associação dàproteína com a superfície de célula, foi mudado pelas seistrocas a seguir: R43A, K45A, K49A, K53A, K65A e K68A. 0construto de fusão de TIMP-l-fractalcina-GPI truncada (SEQID NO: 5) contém a porção terminal-N da TIMP-1 humana(aminoácidos 1-152) fundido com aminoácidos 100-342 doCX3CL1 humano, adicionalmente fundido com a fixação de GPIde 36 aminoácidos de comprimento.

Exame detalhado de construtos de TIMP-1-GPItruncada (SEQ ID NO: 1), TIMP-l-mucina-GPI truncada (SEQ IDNO: 2) e TIMP-l-fractalcina-GPI truncada (SEQ ID no. 5)

a) Incorporação de TIMP-1-GPI truncada adicionadade forma exógena, TIMP-l-mucina-GPI truncada e TIMP-1-fractalcina-GPI truncada na superfície celular

TIMP-1-GPI truncada, TIMP-l-mucina-GPI truncada e

TIMP-l-fractalcina-GPI truncada foram geradas e isoladas deacordo com Djafarzadeh e outros, 2004. A incorporação deconstrutos de fusão purificados nas membranas de superfíciede células de linhagens de células de RCC RCC-53, RCC-26 ouA4 98 é demonstrada por incubação das linhagens de célulaspor uma hora com 700 ng/ml de TIMP-1-GPI truncada, TIMP-l-mucina-GPI truncada e TIMP-l-fractalcina-GPI truncada,respectivamente, e comparadas com aquela da proteína deTIMP-1 de controle, TIMP-l-truncada, respectiva que não temdomínios de mucina, fractalcina e GPI. Proteína associada-àsuperfície foi então detectada utilizando análise FACS.

Esperava-se que a adição de TIMP-1 de controle nãoconduzisse a nenhuma alteração no deslocamento de FACS,entretanto, a TIMP-1-GPI truncada, TIMP-l-mucina-GPItruncada e TIMP-l-fractalcina-GPI truncada,respectivamente, resultaram na realidade, em um sinal desuperfície forte para TIMP-1.

Para demonstrar que a proteína adicionada deforma exógena foi fixada por GPI, células de RCC-53 foramprimeiramente incubadas com TIMP-1-GPI truncada, TIMP-1-mucina-GPI truncada e TIMP-l-fractalcina-GPI truncada,respectivamente (200 ou 700 ng/ml) e então tratadas com 60ng/ml de fosfolipase C (PLC) . Esperava-se que a análise deFACS mostrasse uma perda completa de sinal de superfície decélula TIMP-1 após digestão de PLC. Para medir a eficiênciade integração dos construtos de TIMP fixados, os construtosde TIMP-1 liberados da membrana foram coletados nos tampõesde lavagem, e quantificados utilizando ELISA especifico deTIMP-1. Esperava-se que a maior parte do antigeno TIMP-1 departida fosse recuperado a partir da amostra de 200 ng/ml.

b) Proteínas de TIMP-1-GPI truncada, TIMP-1-mucina-GPI truncada e TIMP-l-fractalcina-GPI truncadabloqueiam a liberação de proMMP-2 e proMMP-9 a partir deRCC-53

Uma expressão aumentada de MMP-2 e MMP-9correlaciona-se tipicamente com um prognóstico ruim de RCC(Hemmerlein e outros, 2004). A linhagem de células decarcinoma de célula clara estágio IV RCC-53 secreta deforma constitutiva tanto proMMP-2 como proMMP-9 (Figura 2).O efeito de aumentar os níveis de TIMP-1 em superfície rialiberação constitutiva de proteínas de MMP-2 e MMP-9 foitestado utilizando ensaios de zimografia de gelatinase(Djafarzadeh e outros, 2004; Klier e outros, 2001). Aproteína rhTIMP-1 em 600 ou 1200 ng/ml não teve efeitosobre a secreção de proMMP-2 ou proMMP-9. Ao contrário,iniciando em 10 ng/ml, esperava-se que o tratamento comTIMP-1-GPI truncada, TIMP-l-mucina-GPI truncada e TIMP-1-f ractalcina-GPI truncada, respectivamente, mostrasse urfiadiminuição dependente de concentração da liberação tanto deproMMP-2 como proMMP-9 nos meios de crescimento,comparáveis com o tratamento de TIMP-1-GPI descrito noExemplo 2.c) Proteínas de TIMP-1-GPI truncada, TIMP-1-mucina-GPI truncada e TIMP-l-fractalcina-GPI truncadaimpactam a proliferação de RCC

Para avaliar o efeito de engenharia de superfíciede TIMP-1 sobre a proliferação de RCC, ensaios de MTT foramrealizados. Esperava-se que as proteínas TIMP-1-GPItruncada, TIMP-l-mucina-GPI truncada e TIMP-l-fractalcina-GPI truncada adicionadas de forma exógena, respectivamente,eliciassem uma diminuição dependente de dose emproliferação de RCC-53 e A498 em 24, 48 e 72 horas emcomparação com o exemplo 4. Esperava-se que as células RCC-26 proliferassem extremamente lentamente (48+ h taxa deduplicação); a tendência geral sugeriu realmente umasupressão de proliferação.

Exemplo 18

Avaliação adicional dos construtos de fusãoadicionais do exemplo 17

Os experimentos dos exemplos 1-16 foram repetidosutilizando os construtos de fusão do exemplo 17; resultadossimilares foram esperados. Em particular, os construtos defusão de TIMP-2 inibiram a maioria de MMPs (exceto MMP-9) epreferencialmente inibiram MMP-2. Os construtos de fusão deTIMP-3 inibiram MMP-1, -2, -3, -9 bem como TACE. O mutantedo construto de fusão de TIMP-3 , (SEQ ID NO:. 4) foiexaminado com relação a suas propriedades de integração,que mostrou adicionalmente uma capacidade aperfeiçoada deintegrar-se na membrana de células (esses experimentosforam realizados de acordo com os métodos fornecidos peloexemplo" 8). Os ,construtos de fusão de TIMP-1 truncada (SÉQID NOS: 1, 2, 5) apresentaram funções biológicas similaresem comparação com os construtos de fusão de /TIMP-1 decomprimento total, desse modo suportando a noção de que aporção de terminal-N das TIMPs é essencial para sua funçãoinibidora. 0 construto de fusão de fractalcina (SEQ ID NO:5) mostrou ainda uma capacidade de integração de membranacomparável com aquela do construto de fusão de mucina (SEQID NO: 4).

Discussão dos Resultados

A engenharia de superfície de célula utilizandoproteínas fixadas por GPI, de acordo com a presenteinvenção, oferece várias vantagens em relação a abordagensde transferência de gene tradicionais. 1) 0 método éaplicável em células que são difíceis de transfectar, porexemplo, células RCC resistentes a apoptose mediadas porFAS, porém também culturas primárias, progenitores demedula óssea, e células de sistema imune. 2) O método podeser utilizado quando somente um pequeno número de célulasestá disponível ou quando células não podem ser facilmentepropagadas. 3) A superfície de célula pode ser modificadaindependente do tipo de célula. 4) A quantidade da proteínafinalmente exibida na superfície da célula pode sercontrolada precisamente. 5) Múltiplas proteínas fixadas porGPI podem ser incorporadas seqüencial ou simultaneamentenas mesmas células.

RCC humano é um tumor progressivo com opçõesterapêuticas limitadas devido à resistência do tumor aagentes quimioterapêuticos atuais e radiação. Imunoterapiassão benéficas para alguns pacientes sugerindo que RCC podeser alvejado por mecanismos efetores imunes. Linfócitos deinfiltração em tumor como células NK ou CTL CD8+ sãofreqüentemente vistos em tecidos de câncer renal efreqüentemente reconhecem células de tumor autólogas quandotestadas in vitro (examinado em Schendel e outros, 1997).

Apesar, dessas observações promissoras, os tumores continuamgenericamente a crescer indicando que RCC poderia teradquirido resistência a mecanismos citotóxicos. Para queocorra uma resposta anti-tumor produtiva, o sistema imunenão deve somente reconhecer o tumor, porém as células decâncer devem ser também suscetíveis aos mecanismos deextermínio utilizados por células CTL ou NK. Células decâncer desenvolveram vários mecanismos para evadir dedefesas imunes incluindo sensibilidade reduzida a apoptose(examinado em Dunn e outros, 2004).

Células CTL e NK exterminam suas células alvo porapoptose dependente de FAS/FASL ou perforin/granzima (Kagie outros, 1994). A importância relativa de exocitose degrânulo versus atividades liticas mediadas por FAS/FASLpara controle de tumor in vivo é controversa. Embora muitosestudos apontam para uma dominância do mecanismo deexocitose de grânulo outros estudos utilizando camundongosde nocaute de perforin (Seki e outros, 2002) sugerem queapoptose dependente de FAS pode constituir uma via maisproeminente in vivo. A maioria das células de tumor,incluindo RCC, é resistente de forma intrínseca aextermínio mediado por FAS (Frost e outros, 2003). 0 uso deTIMP fixada por GPI representa uma abordagem terapêuticapromissora para tornar as células de tumor suscetíveis aapoptose mediada por FAS.

Mostrou-se na presente invenção que a engenhariade células por adição exógena de GPI-TIMP-1 pode induziratividades biológicas de TIMP-1 aumentadas bem como novas.TIMP-1-GPI administrado de forma exógena se tornaeficientemente inserido nas membranas de células de RCCs ;einduziu uma variedade de efeitos biológicos nas linhagensde RCC com relevância terapêutica em potencial.

Além disso, a proteína de TIMP-1 fixada por GPIalterou dramaticamente a associação de superfície de célulade diversas MMPs expressas por RCC. Isso foi espalhado poruma secreção reduzida de MMPs, incluindo proMMP-2 e proMMP-9, a partir das células de RCC. Embora TIMP-I bloqueie aatividade enzimática de MMP-2, não se pensa que o mesmo seligue à pró-forma da enzima. Ainda assim os dadosdemonstrando um bloqueio de secreção proMMP-2 apóstratamento com TIMP-1-GPI são sugestivos dessa ação. Pareceque a adição de uma fixação de GPI a TIMP-1 leva a umaestequiometria de superfície alterada, aumentou acapacidade da proteína de TIMP-1 ligar MMPs.

Essa ligação aumentada aparente de TIMP-1-GPI foitambém demonstrada com MMPs do tipo de membrana. Embora nãomuito seja sabido sobre a associação de TIMP-1 com MMP-15,a ligação de proteína de TIMP-1-GPI a MMP-16 não seriaprevista ocorrer com base na avidez bem deficiente de TIMP-1 nativo para essa proteína (Lang e outros, 2004). Aanálise mutacional dos loops de TIMP-1 críticos para aligação de MMP-16 mostra que alterações pequenas,aparentemente insignificantes em TIMP-1 podem deslocardramaticamente suas características inibidoras/de ligação.

Nesse caso, a estequiometria alterada de TIMP-1 nasuperfície da célula parece ter sido suficiente paradeslocar sua ligação para MMP-16. 0 seqüestro de MMPs riasuperfície da célula foi também associado a uma capacidadereduzida da linhagem de células RCC-53 ser submetida àinvasão de ECM.

Como demonstrado na presente invenção, otratamento com TIMP-1-GPI leva a uma redução dependente dedose acentuada na proliferação das linhagens de RCC. Talvezde forma mais significativa, as linhagens de RCCnormalmente resistentes à apoptose-FAS foram tornadassensíveis ao extermínio mediado por FAS/CD9.5 apóstratamento com a proteína TIMP-GPI da invenção. Entretanto,p?agente não afetou sensibilidade à via de perforin. Is'èosugere que TIMP fixada por GPI media seu efeito anti-tumorpela via de apoptose induzida por FAS em1 vez de porextermínio mediado por perforin/granzima por célulasCTL/NK.

A via de apoptose de FAS é regulada por ativaçãode caspase, enquanto o dano de membrana celular por CTL/NKutilizando exocitose de grânulo, como medido pelo ensaio deliberação de cromo, ocorre independente de caspases (Sayerse outros, 1998; Seki e outros, 2002; Trapani, e outros,2000). Eventos a montante levando à ativação de caspaseenvolvem o equilíbrio entre proteínas de família BCL-2 pró-e anti-apoptóticas. Como demonstrado na presente invenção,o tratamento com GPI-TIMP-1 resultou em uma regulagèmdescendente de proteína BCL-2 anti-apoptótica e um aumentocorrespondente em proteína BAX pró-apoptótica. Essedeslocamento em direção a uma concentração mais elevada deproteínas pró-apoptóticas pode ser um motivo para asensibilidade aumentada de apoptose mediada por FAS decélulas RCC construídas superficialmente de TIMP-1. Essasobservações representam uma ação nova para TIMP-1. Açõessimilares foram também mostradas para TIMP-3 e outras TIMPs(TIMP-2 e TIMP-4) (dados não mostrados).

Verificou-se que a superexpressão de TIMP-1, -2ou -3: em células de músculo liso vasculares utilizandovetores adenovirais inibe sua migração através de membranasde embasamento de modelo. A superexpressão de TIMP-1 nãoteve efeito sobre a proliferação de células, enquanto TIMP-2 causou uma inibição dependente de dose de proliferação decélulas. A superexpressão de TIMP-3 também causou umainibição de proliferação, dependente de dose, e além disso,leva à apoptose através da despolarização de membranamitocondrial e vazamento de citocromo-c (Baker e outros,1999; Baker e outros, 1998; Smith e outros, 1997) . TIMP-3 éa única proteína de TIMP que se liga seletivamente àsuperfície de células independente de associação a outrasproteínas de superfície (Majid e outros, 2002; Smith eoutros, 1997). A focalização de TIMP-1 em superfícies decélula através de uma fixação de GPI leva a açõesbiológicas novas que parecem simular efeitos reportadospara TIMP-3.

Mostrou-se que TIMP-3 sensibiliza células demelanoma a apoptose induzida por anticorpo anti-FAS, TNF-alfa e TRAIL. O mecanismo de ação foi ligado a umaestabilização geral de FAS, TNF-RI e TRAIL-RI na superfíciedas células de melanoma tratadas com TIMP-3 (Ahonen eoutros, 2003) . Essa expressão aumentada de superfície dosreceptores foi ligada à ativação de caspase-8 e caspase-3(Ahonen e outros, 2003) .

Nos experimentos detalhados na presente invenção,as células RCC não mostraram uma alteração em expressão desuperfície de FAS após tratamento com TIMP-1-GPI (figura6A) . Além disso, as células RCC permaneceram resistentes aapoptose induzida por TNF-oc (testada a partir de 100 a10.000 unidades por ml) independente de tratamento comTIMP-GPI (dados não mostrados). A análise de FACS dascélulas RCC mostrou subseqüentemente níveis raramentedetectáveis de TNF-RI (p55) e TNF-RII (p75) em RCC-53 e semexpressão nas linhagens RCC-26 ou A498 (dados nãomostrados). A expressão de superfície não alterou comtratamento com TIMP-1-GPI. Desse modo, a sensibilidadeaumentada a apoptose mediada por FAS após tratamento còmTIMP-1-GPI não parece ser mediada através de umaestabilização geral de proteínas de receptor de morte nasuperfície de célula. O que é evidente é que o tratamentocom TIMP-1-GPI altera o equilíbrio de proteínas Bel-2 paraeliciar um perfil de expressão mais "pró-apoptótico".Os resultados da presente invenção fornecem umaligação adicional entre biologia de tumor, função MMP/TIMPe vias de apoptose. A ligação de proteínas de TIMP a GPIdiretamente ou através de dominios de mucina representa umagente -anti-tumor potente para tornar as células de tumor,que são normalmente resistentes contra apoptose induzidapor FAS, sensíveis para apoptose induzida por FAS. Por essemecanismo células de tumor serão efetivamente exterminadas.

Com relação ao uso dos construtos de fusão - èmparticular, o construto de TIMP-1-GPI, o construto de TIMP-1-muc-GPI e aqueles como exposto nas SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4e 5 - no campo de medicina regenerativa, por exemplo, curade ferimento, os construtos de TIMP-GPI da presenteinvenção foram mostrados aqui como inibindo eficientementea produção e secreção de enzimas importantes e citocinas(fibronectina, colágeno, IL-6, TGF-0) envolvidas nosprocessos de remodelagem de tecido e fibrose que levam auma produção aumentada de ECM. Desse modo, os membros dafamília de TIMP (TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3, TIMP-4) se fixadosna membrana de célula por intermédio de uma fixação de GPIou uma mucina ou uma fractalcina e uma GPI, podem serutilizados para modular eficientemente os processos de curade ferimento pela influência do equilíbrio delicado entre' aprodução de ECM e movimento de ECM.

Materiais e métodos

Linhagens de célula e cultura de células

As linhagens de RCC, RCC-53 e RCC-26 foramgeradas por D.J.S. (Munique, Alemanha) a partir de amostrasde paciente. RCC-53, RCC-26 e A4 98 (American Type CultureCollection) (Giard e outros, 1973) foram cultivadas em meioRPMI1640 (GIBCO BRL, Life Technologies GmbH, Eggenstein,Alemanha) suplementadas com 2 mM L-glutamina (Biochrom KG,Berlim), 1 mM de piruvato de sódio (GIBCO. BRL, LifeTechnologies GmbH, Eggnstein, Alemanha), 12% de FCSinativado por calor (Biochrom KG, Berlim, no. SOI 15). Meiofresco foi fornecido a cada terceiro dia e as culturasforam divididas quando as células estavam confluentes.

Células efetoras citotóxicas: JB4 é um cloneefetor T citotóxico HLA-A2-alorreativo gerado em nossaprópria instalação (E.N.) e é expandido por estimulação bi-semanal como descrito (Milani e outros, 2005). É utilizadoem ensaios de citotoxicidade no dia 7 ou 8 apósestimulação. As linhagens leucêmicas NK humanas, NKL(Robertson e outros, 1996) e NK-92 (Gong e outros, 1994)foram gentilmente fornecidas por CS. Falk (GSF-Instituteof Molecular Immunology, Munique, Alemanha) e cultivadas emmeio contendo 15% de FCS inativado a calor e 100 ü/ml deIL-2 recombinante. O dia antes do uso em ensaios decitotoxicidade, a cultura foi ajustada para 0,3 x IO6 decélulas/ml em meio novo.

Análise de separação de células ativada porfluorescência (FACS)

As células . foram desprendidas com 1.5 mM EDTA(Biochrom A, Berlim, Alemanha no. L2113) em 1 x PBS ' eincubadas por 60 min. em gelo com anticorpos específicospara ser humano; TIMP-1 (IM32L), MMP-1 (IM35L-100), MMP-3(IM36L-100), MMP-8 (IM38L) (CALBIOCHEM, Merck Darmstadt,Alemanha); MMP-9 (IM 61-100), MMP-2 (IM 5IL) (ONCOGENE, BadSoden, Alemanha); MMP-7 (MAB907), MMP-12 (MAB917), MMP-14(MAB9181) (R&D Systems, Minneapolis, EUA) ; MMP-13 (IM44L;) ,MMP-15 (IM48L), MMP-16 (IM50L) (CALBIOCHEM, MerçkDarmstadt, Alemanha) e IgGlK (SIGMA-ALDRICH, Taufkirchéh,Alemanha no. M9269). ICAM-1 e anticorpos HLA (W6/32 e HB82)foram descritos anteriormente (Johnson e outros, 1988;Barnstable e outros, 1978; Parham & brodsky, 1981). Anti-FAS (H. Engelmann, dados não publicados), anti-TNF-RI,anti-TNF-RII e anticorpos de controle de isotipo foramutilizados como descrito (Bigda e outros, 1994). As célulasforam lavadas três vezes com 1 x PBS, incubadas com mABanti-camundongo de burro conjugado com FTIC (DAKO A/S,Glostrup, Dinamarca no. F0313) por 45 min. em gelo, aseguir lavadas três vezes com 1 X PBS e analisadasutilizando um citômetro de fluxo (FACSCalibur, Becton,Dickinson and Company, San Jose, CA, EUA) e CellQuestsoftware. Anticorpos anti-BCL-2 (ALX-804-225) e anti-BAX(ANC-357-040) foram obtidos a partir de ALEXIS (Grunberg,Alemanha).

Purificação de proteína TIMP-1-GPI

A proteína TIMP-1-GPI foi produzida e purificadacomo anteriormente descrito (Djafarzadeh, e outros, 2004).

Resumidamente, TIMP-1 humano foi clonado a partir de cDNAutilizando iniciadores específicos de hTIMP-1, fundido semum códon de parada de translação na seqüência de sinal GPIclonada a partir de LFA-3 (Kirby e outros, 1995; Medof eoutços, 1996) e subclonado em pEF-DHFR e estavelmenteintroduzido nas células de ovário de hamster Chinês (CH)deficientes em DHFR e selecionado como descrito (Mack eoutros, 1995) . A proteína de fusão de TIMP-1-GPI foipurificada a partir das células de CHO por extração dedetergente Triton X-100 seguido por purificação de colunautilizando DEAE, heparina sefarose e exclusão de tamanho(Djafarzadeh e outros, 2004) . ,;

ELISA TIMP-1

Um ELISA especifico de TIMP-1 humano utilizando oprotocolo aplicado de acordo com as orientações dofabricante (MAB970, R&D Systems) foi utilizado paramonitorar niveis de TIMP-1 em solução. O mAB TIMP-1 anti-humano de revestimento (MAB970), mAB de detecção TIMP-1anti-humano biotinilado (BAF970) e proteína rhTIMP-1 (970-TM) foram adquiridos a partir de R&D Systems GmbH(Wiesbaden, Alemanha).

Incorporação de TIMP-1-GPI em membranas decélulas

Células RCC-53 (5-10 x IO6 células/ml) foramincubadas com 200 a 700 ng/ml de hTIMP-l-GPI purificado em37°C/5% C02. As células foram então lavadas três vezes comPBS frio e analisadas por FACS utilizando anticorposmonoclonais especificos de TIMP-1 humano (vide acima).

Clivagem de fixação de GPI por fosfolipase C

Células (5-10 x IO6 células/ml) foram incubadascom 200 ou 700 ng de TIMP-1-GPI ou proteína rhTIMP-1 emmeio isento de soro por lha 37°C por 5% C02. As célulasforam lavadas três vezes com PBS frio e tratadas com 60ng/ml de fosfolipase C especifico de fosfatidilinositol(SIGMA-ALDRICH, Taufkirchen, Alemanha no. 661-9) em meioisento de soro por 30 min. a 37°C/5% C02. As células foramlavadas três vezes, todos os sobrenadantes foram colhidos.

Proliferação

Células RCC-53, A498 ou RCC-26 (30 x 103/100 (xlde meio) foram cultivadas em micro placas de titulo de 96cavidades por 24 h sob condições padrão para fornecercélulas fixas de forma firma e de crescimento estável. Apósdescartar os sobrenadantes, 50|il de meio contendo TIPM-f-GPI, tampão, ou rhTIMP-1 foi adicionado a células "eincubado por 24 h a 72 h. A seguir 501 il de uma solução de1 mg/ml de (3,5-dimetil tiazol-2-ila]-2,5-difenil-brometode tetrazólio) MTT (SIGMA-ALDRICH, Taufkirchen, Alemanhano. 2128) foi adicionado. Após. 3 h de incubação a 37°C,cristais de formazan foram dissolvidos por adição de 100 y.1de isopropanol e 0.04 N HC1. A absorvência foi então medidaem 550 nm utilizando leitora de GENios plus TEC AN ELISA'.Para cada experimento pelo menos 6 cavidades foramanalisadas por condição experimental e ponto de tempo.

Zimografia

Células de RCC-53 foram cultivadas em placas de24 cavidades (5 x IO4 células/cavidade). 0 meio foipermutado por 24 h com meio isento de soro contendo rhTIMP-1 ou quantidades crescentes de TIMP-1-GPI e incubado por 24h, 48 h e 72 h. Sobrenadantes de células foram analisadaspor zimografia de gelatina utilizando géis depoliacrilamida-SDS a 10% (Invitrogen, Groningen, Holanda,no. EC61755BOX) como descrito (Djafarzadeh e outros, 2004).

A enzima MMP-9 recombinante (Amersham Biosciences, Uppsala,Suécia, no. RPN2634) foi utilizada como controle positivo.

Ensaio de invasão extracelular

O efeito de tratamento com TIMP-1-GPI vs. rhTIMP-1 sobre a capacidade das células de invadirem ECM foiavaliado utilizando um ensaio de invasão de célulacomercial (Chemicon International Inc., Temecula, CA, no.ECM 555) . Células RCC-53 foram primeiramente analisadas emrelação a sua capacidade de invadir ECM. As célulasinvadidas no fundo da inserção foram desprendidas, Usadase detectadas por corante CyQuant como descrito no protocoloem anexo. Niveis crescentes de fator de crescimentoendotelial vascular (VEGF) 2 ng/ml a 8 ng/ml . foramutilizados para aumentar a invasão. A migração ótima foivista em 4 ng/ml VEGF (dados não mostrados) . O efeito detratamento com 350 ng/ml e 700 ng/ml de controle rhTIMP-1ou TIMP-1-GPI sobre a migração foi então determinado. Paraquantificar os efeitos potenciais dos agentes de TIMP, amigração de linha de base das células RC-53 para 4 ng/mlVEGF foi definida como 0. 0 valor para 100% de "inibiçãd"para migração induzida por VEGF foi definido como amigração/invasão de células RCC-53 na ausência de VEGF. Osefeitos resultantes de tratamento com rhTIMP ou TIMP-1-GPIsobre a invasão de RCC-53 foram calculados como percentagemde alteração (negativa ou positiva) em relação ao valor"máximo".

Detecção de anexina-V, de apoptose

A detecção e quantificação de células apoptóticasvs. Necróticas no nivel de célula única foram executadasutilizando Kit de coloração anexina-V-FLUOS (Becton,Dickinson and Company, Heidelberg, Alemanha, no. 55647).

Células RCC-53 foram semeadas em 1 x IO6 células/cavidadeem placas de 24 cavidades e deixadas fixar durante a noite.

As cavidades foram então enxaguadas 3 vezes com lxPBS e 1ml de meio RPMI 1640 isento de soro foi adicionado, seguidopor, 700 ng/ml de TIMP-1-GPI ou rhTIMP-1. As células foramincubadas por 24 h a 37°C/5% C02. Após 24 h., 1 | ig/ml demAB de ativação anti-FAS L-957 (H. Engelmann, dados nãopublicados) ou controle de isotipo foram adicionados e ascélulas foram adicionalmente incubadas por 16 h a 37°C/5%CO2. As células foram lavadas com PBS, formadas em pelotase suspensas novamente em solução de coloração (reagente derotulação de anexina-V-fluoresceina e iodeto de propidio(PI) em tampão Hepes) por 15 min. em temperatura ambiente.

As células foram então analisadas por citometria de fluxo.

Um estudo de curso de tempo mostrou que a ligação deanexina-V em células RCC precede a reatividade de PI.

Medição de apoptose por ELISA especifico decrornatina

A apoptose foi medida utilizando o Kit ELISA Plusde Detecção de Morte de células a partir da Roche(Pensberg, Alemanha, no. 1774425) . Células RCC-53 foramsemeadas em um prato com 96 cavidades em uma concentraçãode 4 x IO5 células/cavidade e deixadas fixar durante anoite. As cavidades foram enxaguadas 3 vezes com 1 x PBS' e1001 ±1 de meio RPMI 1640 isento de soro foi adicionado emcada cavidade, seguido por 700 ng/ml de TIMP-1-GPI ourhTIMP-1. As células foram então incubadas por 24 h em37°C/5% C02. Após incubação de 24 h. com TIMP-1-GPI ourhTIMP-1, 1 lig/ml de mAB anti-FAS de ativação L-957 ou mABde controle de isotipo foram adicionados e incubados por 16h a 37°C/5% C02. A seguir a placa foi centrifugada e osobrenadante foi cuidadosamente removido. A pelota decélulas foi colocada em 200 ml de tampão de lise fornecidopelo fabricante por 30 min. e centrifugada. Alíquotas dosobrenadante (20 (0.1) foram utilizadas em um ELISA comanticorpos anti-DNA e anti-histona para detectar a presençade nucloessomas citoplásmicos.

Western blot

Western blot foi utilizado para a detecção deMMPs em meios de crescimento isentos de soro. Os anticorposanti-MMP utilizados são descritos acima (análise de FACS)".

Padrões de Western blotting MMP humano recombinante foramadquiridos de R&D Systems (Minneapolis, EUA) e incluíram;

MMP-1 (WBC024)., MMP-2 (WBC025) , MMP-3 (WBC015) , MMP-8(WBC017), MMP-12 (WBC019) e MMP-13 (WBC020) . Western blotfoi também utilizado para a detecção de BCL-2, BAX (vicieacima para mAbs) e p-actina (Acris Hiddenhausen, Alemanha,no. ab8227). Todas as proteínas foram detectadas utilizandoum kit de análise de Western blot comercial, Sistema deImunodetecção Qumiluminescente (Invitrogen, Groningen,Holanda).

Citotoxicidade mediada por células

Células alvo foram rotuladas com Cr51 por 1 - 2h, lavadas e co-incubadas com células efetoras em um númerode célula constante de 2000 células por cavidade em 96placas de fundo V. Medições em duplicata de titulações dequatro etapas de células efetoras foram utilizadas em todosos experimentos. Liberações espontâneas e máximas foramdeterminadas por incubação das células alvo individualmentee por contagem diretamente de células rotuladas,respectivamente. Após 4 h de incubação a 37 °C em umaatmosfera de 5% de C02 umidifiçada, sobrenadantes foramcolhidos, transferidos para microplacas de cintilaçãosólida Lumaplate, secos durante a noite e contados em umcontador de cintilação de microplaca TopCount (Packard,Meriden, CT) . Para cada razão E:T, a percentagem de lisefoi calculada como a seguir: % de lise especifica = (cpmexperimental - cpm espontâneo/cpm máximo - cpm espontâneo)x 100. A liberação espontânea de células alvo foi sempre' <15% da liberação máxima total.

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<110> Huss, Ralf

Nelson, Peter

<120> Inibidor de tecido de Metaloproteinases (TIMP) ligado a fixações deglicosilfosfatidilinositol (GPI) para tratamento de câncer

<130> 109-002P

<150> EP 05 020 462.7

<151> 2005-09-20

<160> 5

<170> Patentln versão 3.1

<210> 1

<211> 582

<212> DNA

<213> Seqüência artificialgaattcatgg ccccctttga gcccctggct tctggcatcc tgttgttgct gtggctgata 60

gcccccagca gggcctgcac ctgtgtccca ccccacccac agacggcctt ctgcaattcc 120

gacctcgtca tcagggccaa gttcgtgggg acaccagaag tcaaccagac caccttatac 180

cagcgttatg agatcaagat gaccaagatg tataaagggt tccaagcctt aggggatgcc 240

gctgacatcc ggttcgtcta cacccccgcc atggagagtg tctgcggata cttccacagg 300

tcccacaacc gcagcgagga gtttctcatt gctggaaaac tgcaggatgg actcttgcac 360

atcactacct gcagttttgt ggctccctgg aacagcctga gcttagctca gcgccggggc 420

ttcaccaaga cctacactgt tggctgtgag gaatgcacag tgtctagaac aacctgtatc 480

ccaagcagcg gtcattcaag acacagatat gcacttatac ccataccatt agcagtaatt 540

acaacatgta ttgtgctgta tatgaatgta ttatgagtcg ac 582

<210> 2<211> 900<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> TIMP-1 humano truncado fundido com dominio de mucina e seqüência de GPI<400> 2

gaattcatgg ccccctttga gcccctggct tctggcatcc tgttgttgct gtggctgata 60

gcccccagca gggcctgcac ctgtgtccca ccccacccac agacggcctt ctgcaattcc 120

gacctcgtca tcagggccaa gttcgtgggg acaccagaag tcããccágac caccttatac 180

cagcgttatg agatcaagat gaccaagatg tataaagggt tccaagcctt aggggatgcc 240gctgacatcc ggttcgtcta cacccccgcc atggagagtg tctgcggata cttccacagg

tcccacaacc gcagcgagga gtttctcatt gctggaaaac tgcaggatgg actcttgcac

atcactacct gcagttttgt ggctccctgg aacagcctga gcttagctca gcgccggggc

ttcaccaaga cctacactgt tggctgtgag gaatgcacag tgtctagact tgatctcaaa

gaatgtggac atgcttactc ggggattgtg gcccaccaga agcatttact tcctaccagc

cccccaactt ctcaggcctc agagggggca tcttcagata tccacacccc tgcccagatg

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gttgggcctg aggctgggga gaaccagaag cagccggaaa aaaatgctgg tcccacagcc

tctagcacaa cctgtatccc aagcagcggt cattcaagac acagatatgc acttataccc

ataccattag cagtaattac aacatgtatt gtgctgtata tgaatgtatt atgagtcgac

<210> 3<211> 599<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> TIMP-2 humano fundido com seqüência de GPI<400> 3

gaattcatgg caaccctaga gaggatccag tatgagatca agcagataaa gatgttcaaa

gggcctgaga aggatataga gtttatctac acggccccct cctcggcagt gtgtggggtctcgctggacg ttggaggaaa gaaggaatat ctcattgcag gaaaggccga gggggacggcaagatgcaca tcaccctctg tgacttcatc gtgccctggg acaccctgag caccacccag

aagaagagcc tgaaccacag gtaccagatg ggctgcgagt gcaagatcac gcgctgcccc

atgatcccgt gctacatctc ctccccggac gagtgcctct ggatggactg ggtcacagag

aagaacatcá acgggcacca ggccaagttc ttcgcctgca tcaagagaag tgacggctcc

tgtgcgtggt accgcggcgc ggcgcccccc aagcaggagt ttctcgacat cgaggaccca

tctagaacaa cctgtatccc aagcagcggt cattcaagac acagatatgc acttataccc

ataccattag cagtaattac aacatgtatt gtgctgtata tgaatgtatt atagtcgac

<210> 4<211> 758<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> TIMP-3 humano mudado fundido com seqüência de GPI<400> 4

gaattcatga ccccttggct cgggctcatc gtgctcctgg gcagctggag cctgggggac

tggggcgccg aggcgtgcac atgctcgccc agccaccccc aggacgcctt ctgcaactcc

gacatcgtga tcgcggccgc ggtggtgggg gcgaagctgg tagcggaggg gcccttcggc

acgctggtct acaccatcgc gcagatggcg atgtaccgag gcttcaccaa gatgccccat

gtgcagtaca tccatacgga agcttccgag agtctctgtg gccttaagct ggaggtcaac

aagtaccagt acctgctgac aggtcgcgtc tatgatggca agatgtacac ggggctgtgc

aacttcgtgg agaggtggga ccagctcacc ctctcccagc gcaaggggct gaactatcgg

tatcacctgg gttgtaactg caagatcaag tcctgctact acctgccttg ctttgtgacttccaagaacg agtgtctctg gaccgacatg ctctccaatt tcggttaccc tggctaccagtccaaacact acgcctgcat ccggcagaag ggcggctact gcagctggta ccgaggatgggcccccccgg ataaaagcat catcaatgcc acagacccct ctagaacaac ctgtatcccaagcagcggtc attcaagaca cagatatgca cttataccca taccattagc agtaattacaacatgtattg tgctgtatat gaatgtatta tagtcgac

<210> 5

<211> 1314

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> TIMP-1 humano truncado fundido com domínio de fractalcinade GPI

<400> 5

gaattcatgg ccccctttga gcccctggct tctggcatcc tgttgttgct gtggctgata

gcccccagca gggcctgcac ctgtgtccca ccccacccac agacggcctt ctgcaattcc

gacctcgtca tcagggccaa gttcgtgggg acaccagaag tcaaccagac caccttatac

cagcgttatg agatcaagat gaccaagatg tataaagggt tccaagcctt aggggatgcc

gctgacatcc ggttcgtcta cacccccgcc atggagagtg tctgcggata cttccacagg

tcccacaacc gcagcgagga gtttctcatt gctggaaaac tgcaggatgg actcttgcac

atcactacct gcagttttgt ggctccctgg aacagcctga gcttagctca gcgccggggc

ttcaccaaga cctacactgt tggctgtgag gaatccacag tgtctagagg cggcaccttcgagaagcaga tcggcgaggt gaagcccagg accacccctg ccgccggggg aatggacgagtctgtggtcc tggagcccga agccacaggc gaaagcagta gcctggagcc gactccttct 600

tcccaggaag cacagagggc cctggggacc tccccagagc tgccgacggg cgtgactggt 660

tcctcaggga ccaggctccc cccgacgcca aaggctcagg atggagggcc tgtgggcacg 720

gagcttttcc gagtgcctcc cgtctccact gccgccacgt ggcagagttc tgctccccac 780

caacctgggc ccagcctctg ggctgaggca aagacctctg aggccccgtc cacccaggac 840

ccctccaccc aggcctccac tgcgtcctcc ccagccccag aggagaatgc tccgtctgaa 900

ggccagcgtg tgtggggtca gggacagagc cccaggccag agaactctct ggagcgggag 960

gagatgggtc ccgtgccagc gcacacggat gccttccagg actgggggcc tggcagcatg 1020

gcccacgtct ctgtggtccc tgtctcctca gaagggaccc ccagcaggga gccagtggct 1080

tcaggcagct ggacccctaa ggctgaggaa cccatccatg ccaccatgga cccccagagg 1140

ctgggcgtcc ttatcactcc tgtccctgac gcccaggctg ccacccggag gcaggctaga 1200

acaacctgta tcccaagcág cggtcattca agacacagat atgcacttat acccatacca 1260

ttagcagtaa ttacaacatg tattgtgctg tatatgaatg tattatgagt cgac 1314

Claims (30)

1. Construto de fusão (TIMP-mucina-GPI)compreendendo uma seqüência de aminoácidos de um inibidorde tecido de metaloproteinases (TIMP) ou um fragmentobiologicamente ativo do mesmo, em que o TIMP ou fragmentobiologicamente ativo do mesmo é ligado a um dominio demucina seguido por uma fixação deglicosilfosfatidilinositol (GPI).

2. Construto de fusão, de acordo com areivindicação 1, em que o dominio de mucina é um dominio demucina ligado por membrana.

3. Construto de fusão, de acordo com areivindicação 2, em que o dominio de mucina compreende umaseqüência de aminoácidos codificada por um gene selecionadodo grupo que consiste em MUC1, MUC3A, MUC3B, MUC4, MUC11,MUC12, MUC16 e MUC17, ou uma porção do mesmo.

4. Construto de fusão, de acordo com areivindicação 1, em que o dominio de mucina compreende osuporte de mucina- da quimiocina associada à superficieCXCL16 ou fractalcina (CX3CL1).

5. Construto de fusão, de acordo com qualquer umadas reivindicações 1-4, em que o TIMP é selecionado dogrupo que consiste em TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3 ou TIMP-4.

6. Ccnstruto de fusão, de acordo com qualquer umadas reivindicações 1-5, em que o TIMP é TIMP-1 humano.

7. Ccnstruto de fusão, de acordo com qualquer umadas reivindicações 1-6, em que o construto de fusão contémuma ou mais seqüências de sinais de GPI para orientarfixação de GPI.

8. Ccnstruto de fusão, de acordo com qualquer umadas reivindicações 1-7, em que a fixação de GPI é derivadado antigeno associado à função de linfócito (LFA-3) ou umaporção do mesmc.

9. Construto de fusão, de acordo com qualquer umadas reivindicações 1-8, em que o construto de TIMP-mucina-GPI é inserido nas membranas de célula de células de tumor.

10. Molécula de ácido nucléico compreendendo umaseqüência de ácidos nucléicos que codifica para o construtode fusão conforme qualquer uma das reivindicações 1-9.

11. Plasmideo de expressão compreendendo amolécula de ácido nucléico, conforme a reivindicação 10, eelementos de expressão adicionais.

12. Célula hospedeira compreendendo o plasmideode expressão conforme a reivindicação 11.

13. Vetor compreendendo a molécula de ácidonucléico conforme a reivindicação 10.

14. LComposição farmacêutica compreendendo oconstruto de fusão conforme qualquer uma das reivindicações 1-9 ou a molécula de ácido nucléico conforme areivindicação 10, e um veiculo farmaceuticamente aceitável.

15. Uso de um construto de fusão, conformequalquer uma das reivindicações 1-9, para a preparação deum medicamento para o tratamento de câncer.

16. Uso, de acordo com a reivindicação 15, em queo câncer é selecionado do grupo que consiste em câncer demama, câncer renal, câncer de próstata, leucemias,seminomas, melanomas, teratomas, linfornas, neuroblastomas,gliomas, câncer retal, câncer endometrial, câncer de rim,câncer adrenal, câncer de tiróide, câncer de sangue, câncerda pele, câncer do cérebro, câncer cervical, câncerintestinal, câncer do figado, câncer de cólon, câncer deestômago, câncer de intestino, câncer gastrointestinal,câncer de linfonodo, câncer de esôfago, câncer colorretal,câncer de pâncreas, câncer de orelha, nariz e garganta(ENT), câncer do útero, câncer de ovário e câncer de pulmãoe as metástases, dos mesmos.

17. Uso, de acordo com a reivindicação 15 ou 16,em que o câncer é câncer residual após remoção cirúrgica.

18. Uso, de acordo com a reivindicação 17, em queo construto de fusão é administrado localmente comoadjuvante anti-tumor para o tratamento de câncer residualem pacientes com câncer de mama e pacientes comglioblastoma (astrocitoma VI).

19. Uso, de acordo com a reivindicação 17 ou 18,em que o construto de fusão é administrado em umaconcentração de 0,5 a 5 ug/ml, preferivelmente 1 ug/ml.

20. Uso, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 15-19, em que o construto de fusão éadministrada por pulverização no ferimento e/ou injeção emregiões que não são disponíveis para cirurgia.

21. Uso, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 15-20, em que o construto de fusão é umconstruto de fusão (TIMP-GPI) que não inclui o domínio demucina.

22. Método in vitro para inibição de proliferaçãode células de câncer compreendendo a etapa de submeter umalinhagem de células de câncer a uma quantidade eficaz deconstruto de fusão de TIMP-mucina-GPI ou TIMP-GPI.

23. Método, de acordo com a reivindicação 22, emque a linhagem de células é uma linhagem de células dècarcinoma de célula renal (RCC).

24. Uso de TIMP-mucina-GPI ou TIMP-mucina-GPIpara tornar linhagens de célula de tumor sensíveis àapoptose induzida por FAS resistentes a apoptose-FAS.

25. Método de tratar uma lesão da pele paraevitar ou inibir a formação de uma cicatriz, o métodocompreendendo administrar a composição farmacêuticaconforme a reivindicação 14 ou uma composição farmacêutica,compreendendo o construto de fusão conforme qualquer umadas reivindicações 1-9, em que o construto de fusão é umconstruto de fusão (TIMP-GPI) que não inclui o dominio demucina, e um veiculo farmaceuticamente aceitável para ositio da lesão da pele, ou cicatriz.

26. Método, de acordo com a reivindicação 25, emque a cicatriz é uma cicatriz hipertrófica ou uma formaçãode quelóide.

27. Método, de acordo com as reivindicações 25 e 26, em que a composição farmacêutica é utilizada juntamentecom um detergente, vedante ou substância de veiculo.

28. Uso de um construto de fusão, conformequalquer uma das reivindicações 1-9 ou conforme asreivindicações 1-9, em que o construto de fusão é umconstruto de fusão (TIMP-GPI) que não inclui o dominio demucina para a preparação de um medicamento para ' otratamento de uma lesão na pele de um sujeito a fim deevitar ou inibir a formação de uma cicatriz.

29. Uso, de acordo com a reivindicação 28, em quea cicatriz é uma cicatriz hipertrófica ou uma formação dequelóide.

30. Uso, de acordo com as reivindicações 28 e 29,em que a composição farmacêutica é utilizada juntamente comum detergente, vedante ou substância de veiculo.