KR20210147735A

KR20210147735A - 히알루론산 기반 나노섬유 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20210147735A
Application number: KR1020200065397A
Authority: KR
Inventors: 유혁상; 응웬 와잉 부 팜; 이미소
Original assignee: 강원대학교산학협력단
Priority date: 2020-05-29
Filing date: 2020-05-29
Publication date: 2021-12-07
Also published as: KR102352244B1

Abstract

전기방사의 방법으로 3차원적인 세포배양이 가능한 히알루론산 기반 나노섬유를 제조하는 방법 및 이에 따라 제조된 히알루론산 기반 나노섬유를 제공한다.

Description

히알루론산 기반 나노섬유 및 이의 제조방법{Nanofiber based on hyaluronic acid and preparation method thereof}

히알루론산 기반 나노섬유 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

히알루론산(hyaluronic acid: HA)은 많은 연조직의 세포 외 기질(ECM)에서 발견되는 글리코사미노글리칸(Glycosaminoglycans)으로서 특히 관절의 활액에서 많이 발견된다. 히알루론산은 우수한 생분해성, 생체적합성, 상처 치유 효과로 인해 많은 분야에서 응용되어 왔다.

그런데, 히알루론산이 나타내는 높은 점도와, 친수성, 및 표면장력으로 인해 전기방사 방법에 의해 히알루론산으로 이루어진 나노섬유를 제조하는 것이 어려운 문제점이 있다. 종래에는 HA를 전기방사 하기 위해 콜라겐, 젤라틴, 제인 등의 다른 고분자와 혼합하거나, 탈이온수, 포름산, DMF를 용매로 활용하여 HA 분자의 수소결합을 방해하여 전기방사성을 높이는 방법들이 시도되었으나, 이 방법들로 만들어진 나노섬유들은 생물학적 환경에 있을 때 HA가 안정적이지 못한 단점이 있었고, 이로 인해 HA의 지속성이 낮아 3차원 세포 배양에 어려움이 있었다.

따라서, 히알루론산을 이용하여 3차원적인 세포배양이 가능한 나노섬유를 제조하는 방법에 관한 연구가 필요하다.

한국 등록특허 제10-1224882호

일 양상은 전기방사에 의한 히알루론산 기반 나노섬유를 제조하는 방법에 관한 것이다.

다른 일 양상은 상기 제조방법에 따라 제조된 히알루론산 기반 나노섬유를 제공하는 것이다.

다른 일 양상은 상기 제조방법에 따라 제조된 히알루론산 기반 나노섬유를 포함하는 3차원 세포배양용 세포지지체를 제공하는 것이다.

일 양상은 폴리카프로락톤 및 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 쉘부 용액과 히알루론산을 포함하는 코어부 용액을 전기방사하여

폴리카프로락톤 및 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 쉘부와 히알루론산을 포함하는 코어부로 이루어진 나노섬유를 제조하는 단계;

코어부의 히알루론산을 가교결합하는 단계; 및

쉘부의 폴리에틸렌글리콜을 제거하는 단계;를 포함하는, 전기방사에 의한 히알루론산 기반 나노섬유의 제조방법을 제공한다.

다른 일 양상은 상기 제조방법에 따라 제조된 히알루론산 기반 나노섬유를 제공한다.

다른 일 양상은 상기 제조방법에 따라 제조된 히알루론산 기반 나노섬유를 포함하는 3차원 세포배양용 세포지지체를 제공한다.

일 양상에 따른 제조방법은 생물학적 환경에서 히알루론산의 안정성이 개선되어 생체 내 더 오래 유지될 수 있는 히알루론산 기반 나노섬유를 제공한다.

이에 따라 제조된 히알루론산 기반 나노섬유는 체내 안정성이 개선되어 생물학적 환경에서 잔류 시간이 더 길어지고, 모양을 더 오래 유지할 수 있을 뿐만 아니라, 나노섬유의 쉘부에 공극(Pore)들이 형성되는 다공성 구조를 가질 수 있으며, 히알루론산이 나노섬유 바깥으로 노출되어 세포 증식 및 세포 접착에 효과적이고, 3차원적 세포배양에 적합한 구조를 나타낸다.

상기 히알루론산 기반 나노섬유는 3차원적인 세포배양이 가능한 세포배양체, 피부 미용 목적의 필러, 및 3차원 세포 퇴행성 관절염 환자의 관절 재생에도 이용될 수 있으며, 약물송달, 피부과학, 조직 지지체 등 많은 분야에서 활용될 수 있다.

도 1은 일 구체예에 따른 히알루론산 기반 나노섬유의 제조방법을 나타낸 모식도이다.
도 2는 PEG 제거 전후의 나노섬유를 UHR-SEM을 통해 관찰한 결과를 나타낸다(상: PEG 제거 전의 PCL/PEG 및 HA로 이루어진 나노섬유, 하: PEG 제거 후의 PCL 및 HA로 이루어진 나노섬유).
도 3(A)는 FTIR 스펙트럼을 통해 나노섬유를 측정한 결과를 나타낸다. 도 3(B)는 TGA를 통해 나노섬유를 측정한 결과를 나타낸다.
도 4는 PEG 제거 전후의 나노섬유를 CLSM을 통해 관찰한 결과를 나타낸다(상: PEG 제거 전의 PCL/PEG 및 HA로 이루어진 나노섬유, 하: PEG 제거 후의 PCL 및 HA로 이루어진 나노섬유).

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한, 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 전체가 참고로 통합된다.

코어부의 히알루론산을 가교결합하는 단계; 및

폴리카프로락톤(Polycaprolactone: PCL) 카프로락톤(CL)으로부터 중합되는 폴리에스터 계열의 생분해성 고분자이며, 생분해성과 생체적합성이 우수한 고분자로 알려져 있다. 상기 생분해성 고분자로서 PCL의 수평균분자량은 특별히 제한되지 않지만, 5,000 내지 150,000 이며, 바람직하게는 8,000 내지 100,000이며, 보다 바람직하게는 10,000 내지 80,000이다.

폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol: PEG)은 화학식 “H-(O-CH₂-CH₂)_m-OH”으로 표시되는 폴리에스테르 화합물을 말하며, m의 값에 따라 수평균 분자량이 달라질 수 있으며, 분자량은 350 내지 40,0000일 수 있으며, 반복 단위(repeating unit)는 100 내지 700 일 수 있다. PEG는 분자량에 따라 폴리에틸렌 옥사이드(poly(ethylene oxide) (PEO)) 또는 폴리 옥시 에틸렌(poly(oxyethylene))으로도 알려져 있다.

일 구체예에서 폴리카프로락톤과 함께 쉘부를 형성한 폴리에틸렌글리콜이 제거되므로 나노섬유 중 빈 공간(공극)을 형성할 수 있다. 분자량 5,000 ~ 10,000 범위를 갖는 폴리에틸렌글리콜은 워시 과정에서 더 쉽게 제거가 가능한 이점이 있다.

상기 제조방법에서 폴리카프로락톤(PCL)과 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 쉘부(껍질)로 하고, 히알루론산(HA)을 코어부(중심부)로 하여 전기방사 함에 따라 연속적인 히알루론산 가닥이 폴리카프로락톤 안에 자리 잡을 수 있다.

또한, 상기 제조방법에서 나노섬유 중 코어부를 이루는 히알루론산의 가교결합 이후 쉘부의 폴리에틸렌글리콜이 제거됨에 따라 히알루론산이 나노섬유 바깥으로 노출되어 세포 증식 및 세포 접착에 효과적일 수 있다.

일 구체예에서, 폴리카프로락톤 및 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 쉘부 용액은 폴리카프로락톤 및 폴리에틸렌글리콜을 0.1 :1 내지 9 :1 의 중량비로 포함할 수 있다.

일 구체예에서, 폴리카프로락톤 및 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 쉘부 용액은 폴리카프로락톤 및 폴리에틸렌글리콜을 1 : 1의 중량비로 포함할 수 있다. 쉘부를 형성하는 PCL 및 PEG의 중량비가 1 : 1인 경우, 폴리카프로락톤과 함께 쉘부를 형성한 폴리에틸렌글리콜이 높은 비율로 잘 제거되므로 나노섬유 중 빈 공간(공극)을 효과적으로 형성할 수 있다.

상기 히알루론산을 포함하는 코어부 용액은 계면활성제를 더 포함할 수 있다. 코어부에 첨가된 계면활성제는 히알루론산을 감싸 쉘부를 형성하는 폴리카프로락톤과 직접적인 접촉을 방지하고 마찰을 줄일 수 있다. 상기 계면활성제로는 폴리비닐알코올　또는　폴리비닐알코올계 공중합체를 사용할 수 있다.

일 구체예에서, 상기 히알루론산을 포함하는 코어부 용액은 폴리비닐알코올을 더 포함할 수 있다.

히알루론산(hyaluronic acid: HA)은 아세틸글루코사민과 글루쿠론산의 중합체인 다당류로서 여러 조직 예컨대 피부의 세포간물질 중에 중에 존재하는 글리코사미노글리칸을 말한다.

상기 히알루론산을 포함하는 코어부 용액은 히알루론산 이외의 다른 소수성 고분자 또는 친수성 고분자를 추가로 포함하지 않는 것일 수 있다.

이에 따라 제조된 히알루론산 기반 나노섬유는 생물학적 환경에서 히알루론산의 안정성을 개선시킬 수 있다.

전기방사법으로 제조된 나노섬유는 그 구조적 특성이 물조직의 세포외기질 구조를 모방하기 때문에 조직공학용 지지체로 활용도가 높다. 또한, 전기방사를 통해 제조된　나노섬유의 직경은 수십∼수백 ㎚의 범위로 형성되므로 표면적을 극대화할 수 있다. 극대화된 표면적은 높은 반응성과 감응성을 나타내어 고성능을 갖출 수 있으므로, 나노섬유는 같은 두께의 일반 재료에 비해 높은 강도를 나타내고,　섬유직경이 매우 미세하므로 다른 형태에 비하여 유연성이 매우 우수하다.

일 구체예에서, 상기 폴리카프로락톤 및 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 용액과 히알루론산을 포함하는 용액의 전기방사는 동축 전기방사법에 의한 것일 수 있다.

본 명세서에서 동축 전기방사법은 두 가지 고분자 용액(즉, 쉘부 용액 및 코어부 용액)을 내부에 삽입된 이너 노즐과 아우터 노즐을 통해 독립적으로 토출시키면서 전기 방사를 수행하는 공정을 말한다. 이에 따라, 두 고분자 용액이 서로 섞이지 않으면서 전기장에 의해 젯(jet)이 형성 및 연신되어 코어-쉘 형태의 나노섬유를 얻을 수 있다.

상기 동축 전기방사법에 사용되는 두 개의 고분자 용액(즉, 쉘부 용액 및 코어부 용액)은 서로 섞이지 않도록 적절한 용매 및 고분자를 선택할 수 있다. 예를 들어, 아우터 노즐을 통해 적절한 용매에 용해한 쉘부 용액을 토출시키고, 이너 노즐을 통해 적절한 용매에 용해한 코어부 용액을 토출시킬 수 있다.

상기 유기용매는 예를 들어, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol), 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane), 시클로헥산(cyclohexane), 및 이들의 혼합 용액 중에서 선택될 수 있다.

일 구체예에서, 상기 폴리카프로락톤 및 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 쉘부 용액은 클로로포름에 용해된 것일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 히알루론산을 포함하는 코어부 용액은 에탄올에 용해된 것일 수 있다.

코어부의 히알루론산을 가교결합하는 단계에 의해 친수성인 히알루론산을 포함하는 나노섬유가 물에서도 쉽게 녹아나지 않고 그 구조를 유지하게 할 수 있다. 가교제로는 예를 들어, 1,4-부탄디올디글리시딜 에테르(1,4-ButaneDiol Diglycidyl Ether: BDDE), 글루타알데하이드 또는 디바이닐 설폰(DVS)를 첨가할 수 있다.

상기 가교제는 가교 용액 중 0.5 내지 20 (v/v)로 포함될 수 있다. 상기 가교제는 예를 들어 가교 용액 중 0.97% 내지 10.0% (v/v)로 첨가될 수 있다.

상기 범위 이하에서는 가교가 불충분하여 나노섬유의 강도가 떨어질 수 있고, 상기 농도 이상에서는 지나친 가교로 인해 과도한 섬유화를 나타낼 수 있다. 상기 범위 내의 가교제를 사용하여 제조된 나노섬유는 변형률을 최소화할 수 있는 충분한 강도, 세포 배양에 적합한 친수성 환경을 제공할 수 있는 수화율과 팽윤비를 나타낼 수 있다.

예를 들어, 1,4-부탄디올디글리시딜 에테르(BDDE)을 0.97 % (v/v)로 첨가하여 코어부의 히알루론산을 가교결합할 수 있다.

일 구체예에서, 상기 가교결합 단계는 1,4-부탄디올디글리시딜 에테르(BDDE)를 포함하는 가교 용액을 첨가하는 것일 수 있다.

상기 BDDE는 메탄올 중에 염산(HCL)과 함께 혼합되어 첨가될 수 있다.

상기 가교결합은 30 내지 50℃, 예를 들어 40℃에서 하룻밤 동안 반응시켜 이루어질 수 있다.

상기 제조방법에 따라 제조된 나노섬유에서 히알루론산(HA)은 코어부 에 가교결합되어 존재하고 쉘부를 이루는 폴리카프로락톤(poly(caprolactone): PCL)에 의해 보호될 수 있다.

또한, 상기 제조방법에 따라 제조된 나노섬유에서 쉘부의 폴리에틸렌글리콜이 제거됨에 따라 히알루론산을 감싸는 껍질에 해당하는 쉘부의 일부분이 제거되어 히알루론산이 바깥으로 노출될 수 있다.

이에 따라 제조된 바깥으로 노출된 히알루론산을 포함하는 히알루론산 기반 나노섬유는 세포의 3차원 배양에 적합한 구조를 나타낼 수 있다.

일 구체예에서, 상기 쉘부의 폴리에틸렌글리콜(poly(ethylene glycol): PEG)을 제거하는 단계는 메탄올을 첨가하는 것일 수 있다.

상기 단계에서 쉘부의 PEG가 일부 제거될 수 있다. 이어서 메탄올과 물로 나노섬유를 세척하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이에 따라 나노섬유를 세척하여 남아있는 PEG 및 반응하지 않은 물질들을 제거할 수 있다.

일 구체예에서, 나노섬유를 분쇄하여 나노피브릴을 제조하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 단계에서 나노섬유가 나노피브릴 형태로 곱게 갈아지게 되어 세포 배양 및 생체 내 주입에 더욱 용이하게 될 수 있다.

상기 나노섬유의 분쇄는 나노섬유를 밀링(milling)하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 분쇄는 분석용 분쇄기(A11 basic, IKA)를 사용하여 잘게 조각되어 나노피브릴을 얻는 것일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 나노섬유는 히알루론산이 나노섬유의 바깥으로 노출된 구조를 나타내는 것일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 나노섬유는 히알루론산의 안정성이 개선된 것일 수 있다.

상기 히알루론산 기반 나노섬유는 세포 또는 조직 지지체, 피부미용, 또는 약물송달용으로 이용될 수 있다.

예를 들어, 상기 히알루론산 기반 나노섬유는 3차원적인 세포배양이 가능한 세포배양체, 피부 미용 목적의 필러, 및 3차원 세포 퇴행성 관절염 환자의 관절 재생에도 이용될 수 있다.

상기 히알루론산 기반 나노섬유를 포함하는 필러는 히알루론산의 안정성 개선 및 모양 유지 시간 증가 인해 주입된 부위에 남아 있는 시간을 증가시킬 수 있다.

상기 제조방법에 따라 제조된 히알루론산 기반 나노섬유는 생체 내 지속성을 향상시키고, 나노섬유 바깥으로 히알루론산이 노출된 구조를 나타내므로 3차원적인 세포배양, 세포접착 및 세포증식에 효과적이다.

이에 따라 제조된 히알루론산 기반 나노섬유 구조는 높은 다공성, 넓은 표면적, 서로 연결되어있는 구멍 구조 때문에 세포의 성장을 촉진하고, 세포 기능을 유지하기 위한 생체 모방형 지지체로서 활용될 가능성이 높다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용된다.

본 명세서에서 용어　"내지"를 이용하여 표시된 수치 범위는　용어　"내지" 전과 후에 기재되는 수치를 각각 하한 및 상한으로서 표시되는 범위를 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "이들의 조합"은 마쿠시 형식으로 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 어떤 부분이 다른 부분과 "연결"되어 있다고 할 때, 이는 "직접적으로 연결"되어 있는 경우뿐 아니라, 그 중간에 다른 물리화학적 연결기, 작용기를 두고 물리적으로 또는 화학적으로 연결되어 있는 경우를 포함하며, "간접적으로 연결"되어 있는 경우를 포함한다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 : 폴리카프로락톤 및 히알루론산 나노섬유의 제조

폴리카프로락톤(PCL)(MW :47,000 ~ 49,000)과 폴리에틸렌글리콜(PEG)(MW :8,000)을 1:1의 중량비(w/w)로 클로로포름(46%, w/v)에 녹였다. 히알루론산(HA)(1%, w/v)와 폴리비닐알코올(PVA, 0.5%, w/v)는 2:1의 중량비(w/w)로 50% 에탄올에 녹였다.

클로로포름에 녹인 폴리카프로락톤과 폴리에틸렌글리콜(PCL/PEG)는 외부층(쉘부)으로(유량:1.5ml/h)하고, 50% 에탄올에 녹인 히알루론산과 폴리비닐알코올(HA/PVA)은 내부층(코어부)으로(유량:0.3ml/h)로 하여 동축 전기방사 방법을 통해 폴리카프로락톤 및 폴리에틸렌글리콜을 쉘부로 하고, 히알루론산을 코어부로 하는 나노섬유(PCL/PEG@HA 나노섬유)를 제조하였다. 적용 전압은 15k, 바늘과 수집판 사이의 거리는 10cm으로 하였다.

도 1은 일 구체예에 따른 히알루론산 기반 나노섬유의 제조방법을 나타낸 모식도이다.

이로부터 획득한 그물망 형태의 나노섬유(PCL/PEG@HA nanofibrous mesh)에서 코어부의 히알루론산(HA)을 가교결합하기 위해 나노섬유를 수집판(알루미늄 호일)에서 떼어낸 후 0.05M 1,4-부탄디올디글리시딜 에테르(BDDE)와 0.05M 염산(HCL)이 포함되어있는 메탄올(BDDE : 0.97%(v/v), HCl : 5%(v/v))에 담갔다. 가교결합반응은 밤새 40℃에서 이루어졌다.

반응이 끝난 후 가교결합된 나노섬유 망을 상온에서 메탄올로 30분씩 3번 세척하여 껍질부분(쉘부)에서 HA와 반응하지 않은 BDDE와, 껍질부분의 PEG를 완벽하게 제거하였다. 이어서 나노섬유들을 정제수에서 15분씩 3번 세척하여 코어부 HA와 반응하지 않은 PVA를 제거하였다. 그 후 나노섬유들을 분석용 분쇄기(A11 basic, IKA)를 사용하여 잘게 조각 내어 폴리카프로락톤 및 히알루론산 나노피브릴(PCL@HA NFs)를 얻었다.

이에 따라 도 1에서와 같이 쉘부의 PEG가 제거되어 코어부의 HA가 나노섬유의 바깥으로 노출된 폴리카프로락톤 및 히알루론산 나노섬유(PCL@HA 나노섬유)를 얻을 수 있다.

제조예 : FITC 표지된 히알루론산의 제조

히알루론산(HA)을 에틸렌 다이아민(EDA)와 혼합시켰다.

N-(3-디메틸아미노프로필)-N′-에틸카르보디이미드 염산염 (N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride: EDC.HCl)과 하이드록시벤조트리아졸(Hydroxyl benzotriazole: HOBt)을 DMSO 1ml에 녹였다.

HA 용액에 EDC/HOBt 용액을 첨가한 후 30분간 저어주었다. 몰 비율은 HA:EDC:HOBt=1:10k:10k로 하였다.

이 혼합물에 EDA를 더 넣어준 후(몰비율 HA:EDA=1:10k) 상온에서 24시간 동안 반응시켰다. HA-EDA를 상온의 정제수에서 4시간 동안 투석(MWCO=10kD)한 후 동결건조하여 정제하였다. 그 후 HA-EDA와 FITC (Fluorescein isothiocyanate)를 0.01M PBS(pH=8)에 녹여주고, 3시간 동안 빛을 차단한 환경에서 37℃에서 강하게 저어주어 반응이 일어나게 하였다. 이어서 정제수에서 8시간 동안 투석(MWCO=10kD)한 후 동결 건조하여 FITC 표지된 히알루론산(FITC-HA)을 수집하였다.

실험예: 폴리카프로락톤 및 히알루론산 나노피브릴의 특성 확인

이하 실험예에서 나노섬유의 중심부(코어부)에 HA가 위치하는지 확인하기 위해 FITC 표지된 히알루론산을 사용하여 실시예 1의 제조방법에 따른 나노섬유를 제조하였다.

(1) 초고해상도 주사전자현미경 관찰

폴리에틸렌글리콜(PEG) 제거 전후의 나노섬유 즉, PCL/PEG 및 HA로 이루어진 나노섬유와 PCL 및 HA로 이루어진 나노섬유의 형태를 초고해상도 주사전자현미경(UHR-SEM)을 통해 관찰하였다.

도 2는 PEG 제거 전후의 나노섬유를 초고해상도 주사전자현미경(UHR-SEM)을 통해 관찰한 결과를 나타낸다(상: PEG 제거 전의 PCL/PEG 및 HA로 이루어진 나노섬유(PCL/PEG@HA 나노섬유), 하: PEG 제거 후의 PCL 및 HA로 이루어진 나노섬유(PCL@HA 나노섬유)).

도 2에서와 같이 PCL/PEG@HA 나노섬유(상)와 PCL@HA 나노섬유(하)의 직경은 각각 1597±450nm, 929±220nm이었다. PEG 제거 후 나노섬유의 지름이 확연히 감소하였으며(약 670nm 감소), 세척 단계에 따라 나노섬유의 PEG가 제거되는 것을 볼 수 있었다.

(2) 퓨리에 변환 적외선 분광 스펙트럼 관찰

퓨리에 변환 적외선 분광기(FTIR)을 통해 나노섬유에서 폴리에틸렌글리콜(PEG)의 제거를 확인하였다.

도 3(A)는 퓨리에 변환 적외선 분광기(FTIR) 스펙트럼을 통해 나노섬유를 측정한 결과를 나타낸다.

도 3(A)에서와 같이 나노섬유에서 PEG가 성공적으로 제거되었음을 FTIR 스펙트럼을 통해 확인하였다.

PEG 제거 전의 PCL/PEG 및 HA로 이루어진 나노섬유(PCL/PEG@HA 나노섬유)의 FTIR 스펙트럼과 비교하였을 때, PEG 제거 후의 PCL 및 HA로 이루어진 나노섬유(PCL@HA 나노섬유)의 FTIR 스펙트럼에서는 CH₂-O-CH₂ 피크인 1100 cm -1에서의 높은 피크가 사라져 나노섬유 망에서 PEG가 사라진 것을 확인할 수 있었다.

(3) 열중량 분석

폴리에틸렌글리콜(PEG) 제거 후 히알루론산(HA)이 존재하는지 확인하기 위해 질소 대기 상태에서 25℃에서 700℃까지 분당 10℃ 속도로 온도를 올려주는 열중량 분석(Thermogravimetric analysis)을 실시하였다.

도 3(B)는 열중량 분석기(TGA)를 통해 나노섬유를 측정한 결과를 나타낸다.

도 3(B)에서와 같이 PEG 제거 전의 PCL/PEG 및 HA로 이루어진 나노섬유(PCL/PEG@HA 나노섬유)의 무게 감소는 약 100℃에서 시작되어 100~400℃ 범위에서 피크가 넓게 나타났다.

PEG 제거 후의 PCL 및 HA로 이루어진 나노섬유(PCL@HA 나노섬유)의 무게 감소는 약 350℃에서 시작되어 350~400℃ 범위에서 피크가 좁게 나타났다.

이와 같은 열 특성(무게 감소 시작 온도가 다른것)으로부터 가교결합 및 PEG 제거, 세척 단계 후 나노섬유 망의 일부 HA core가 손실되었다는 것을 알 수 있다.

(4) 공초점 레이저 주사 현미경 관찰

폴리에틸렌글리콜(PEG) 제거 전후의 나노섬유 망을 공초점 레이저 주사 현미경(CLSM)을 통해 관찰하였다.

도 4는 PEG 제거 전후의 나노섬유를 CLSM을 통해 관찰한 결과를 나타낸다(상: PEG 제거 전의 PCL/PEG 및 HA로 이루어진 나노섬유, 하: PEG 제거 후의 PCL 및 HA로 이루어진 나노섬유).

코어부에 존재하는 히알루론산(HA)을 확인하기 위하여 CLSM을 통해 PCL/PEG@FITC-HA 나노섬유와 PCL@FITC-HA 나노섬유를 시각화시켰다.

도 4에서와 같이 나노섬유에서 폴리에틸렌글리콜(PEG)의 제거한 후 FITC-HA의 형광 강도가 급격히 증가하였으며, 이를 통해 코어부의 히알루론산이 바깥으로 성공적으로 노출되었음을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로, 상기 게시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

폴리카프로락톤 및 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 쉘부 용액과 히알루론산을 포함하는 코어부 용액을 전기방사하여
폴리카프로락톤 및 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 쉘부와 히알루론산을 포함하는 코어부로 이루어진 나노섬유를 제조하는 단계;
코어부의 히알루론산을 가교결합하는 단계; 및
쉘부의 폴리에틸렌글리콜을 제거하는 단계;를 포함하는, 전기방사에 의한 히알루론산 기반 나노섬유의 제조방법.
청구항 1에 있어서, 상기 쉘부 용액은 폴리카프로락톤 및 폴리에틸렌글리콜을 0.1 :1 내지 9: 1 의 중량비로 포함하는 것인 나노섬유의 제조방법.
청구항 1에 있어서, 상기 쉘부 용액은 폴리카프로락톤 및 폴리에틸렌글리콜을 1 : 1 중량비로 포함하는 것인 나노섬유의 제조방법.
청구항 1에 있어서, 상기 코어부 용액은 폴리비닐알코올을 더 포함하는 것인 나노섬유의 제조방법.
청구항 1에 있어서, 상기 전기방사는 동축 전기방사법에 의한 것인 나노섬유의 제조방법.
청구항 1에 있어서, 상기 폴리카프로락톤 및 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 쉘부 용액은 클로로포름에 용해된 것인 나노섬유의 제조방법.
청구항 1에 있어서, 상기 히알루론산을 포함하는 코어부 용액은 에탄올에 용해된 것인 나노섬유의 제조방법.
청구항 1에 있어서, 상기 가교결합 단계는 1,4-부탄디올디글리시딜 에테르(BDDE), 글루타알데하이드 또는 디바이닐 설폰(DVS)을 포함하는 가교 용액을 첨가하는 것인 나노섬유의 제조방법.
청구항 1에 있어서, 상기 가교결합 단계는 1,4-부탄디올디글리시딜 에테르(BDDE)를 포함하는 가교 용액을 첨가하는 것인 나노섬유의 제조방법.
청구항 1에 있어서, 상기 쉘부의 폴리에틸렌글리콜을 제거하는 단계는 메탄올을 첨가하는 것인 나노섬유의 제조방법.
청구항 1에 있어서, 나노섬유를 분쇄하여 나노피브릴을 제조하는 단계를 더 포함하는 것인 나노섬유의 제조방법.
청구항 1의 제조방법에 따라 제조된 히알루론산 기반 나노섬유.
청구항 12에 있어서, 히알루론산이 나노섬유의 바깥으로 노출된 구조를 나타내는 것인 나노섬유.
청구항 12에 있어서, 히알루론산의 안정성이 개선된 것인 나노섬유.
청구항 12에 따른 히알루론산 기반 나노섬유를 포함하는 3차원 세포배양용 세포지지체.