KR20240030783A - 히알루론산이 결합된 나노피브릴의 제조 방법 및 이에 따라 제조된 나노피브릴 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 히알루론산이 결합된 나노피브릴의 제조 방법 및 이에 따라 제조된 나노피브릴에 관한 것이다.
Description
본 발명은 히알루론산이 결합된 나노피브릴의 제조 방법 및 이에 따라 제조된 나노피브릴에 관한 것이며, 보다 구체적으로는 히알루론산의 광가교를 통해 나노피브릴의 표면 특성을 미세조절할 수 있는 방법 및 이에 따라 제조된 나노피브릴에 관한 것이다.
전기방사를 통해 만들어진 나노섬유는 제작이 간편할뿐만 아니라 다공성 구조와, 넓은 표면적, 세포외 기질 구조와 유사한 환경을 제공할 수 있다. 따라서, 현재 조직공학 분야에서는 나노섬유를 지지체로 사용하는 연구가 이루어지고 있다. 나노섬유 제작을 위한 재료로는 천연고분자 또는 합성고분자가 사용되는데 천연고분자는 세포친화도가 높고 생체적합성이 뛰어나지만 특유의 점도와 극성으로 인하여 전기방사가 어려워 트리플루오로아세트산(Trifluoroacetic acid) 같은 유기용매를 사용하거나 폴리바이닐 알코올(polyvinyl alcohol) 등의 고분자를 혼합하여 전기방사를 진행해야 한다는 단점이 있다. 합성고분자는 전기방사가 용이하나 친수성이 낮고 세포가 부착될 수 있는 작용기의 부재로 인해 세포성장에 적합한 환경을 제공하지 못한다는 단점이 존재한다.
히알루론산(Hyaluronic acid: HA)은 세포외 기질을 구성하는 주요 물질 중 하나로 결합조직에서 많이 발견되며 함수성이 매우 높고 세포의 증식 및 분화에 도움을 줄 수 있어 나노섬유에 히알루론산을 결합시키는 시도가 많이 이루어지고 있다. 그러나, 결합하는 히알루론산의 총량이 적을 뿐 아니라 결합 량 조절이 어렵다는 한계가 존재한다.
본 발명자들은 히알루론산이 결합된 나노피브릴을 제조함에 있어서 광가교를 통해 나노피브릴에 결합하는 히알루론산의 양을 정밀하게 조절하고 이를 통해 나노피브릴의 표면 특성을 미세하게 조절하여 다양한 종류의 세포의 성장에 최적화된 환경을 제공할 수 있는 방법을 완성하였다.
일 양상은 히알루론산이 결합된 폴리카프로락톤 나노피브릴의 제조 방법을 제공하는 것이다.
다른 일 양상은 상기 제조 방법에 의해 제조되는 히알루론산이 결합된 폴리카프로락톤 나노피브릴을 제공하는 것이다.
또 다른 일 양상은 제조 방법에 의해 제조되는 히알루론산이 결합된 폴리카프로락톤 나노피브릴 및 세포를 혼합하여 얻어지는 3차원 세포배양용 세포 및 나노피브릴의 복합체를 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 목적 및 이점은 첨부한 청구범위와 함께 하기의 상세한 설명에 의해 보다 명확해질 것이다. 본 명세서에 기재되지 않은 내용은 본 출원의 기술분야 또는 유사한 기술분야 내에서 통상의 지식을 가진 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략한다.
일 양상은 히알루론산이 결합된 폴리카프로락톤 나노피브릴의 제조 방법을 제공한다.
일 구체 예에서, 상기 폴리카프로락톤 나노피브릴 표면에 아민기를 기능화하는 단계는 폴리카프로락톤 나노피브릴의 아미노 분해 반응(aminolysis)을 포함할 수 있다.
일 구체 예에서, 상기 아미노 분해는 폴리카프로락톤 나노피브릴을 메탄올 및 에틸렌다이아민(ethylenediamine) 혼합물에 첨가하는 것일 수 있다.
일 구체 예에서, 상기 아미노화 폴리카프로락톤 나노피브릴 표면에 결합되는 히알루론산은 메타크릴로일(methacryloyl)기가 도입된 메타크릴화 된 히알루론산(Methacryalted Hyaluronic acid)일 수 있다.
일 구체 예에서, 상기 아미노화 PCL 나노피브릴 표면에 히알루론산을 결합하는 단계는 광 개시제의 첨가를 포함할 수 있다.
일 구체 예에서, 상기 광 개시제는 수용성 광개시제 일 수 있다.
일 구체 예에서, 상기 광 개시제는 수용성 광개시제로 2-하이드록시-1-[4-(하이드록시에톡시)페닐]-2-메틸-1-프로파논 (2-Hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)phenyl]-2-methyl-1-propanone), 리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트 (lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate), 1-하이드록시-시클로헥실-페닐-케톤 (1-hydroxy-cyclohexyl-phenyl-ketone), 2,2-디메톡시-1,2-디페닐에탄-1-온 (2,2-dimethoxy-1,2-diphenylethan-1-one), 2-벤질-2-디메틸아미노-1-(4-모르폴리노페닐)-1-부타논 (2-benzyl-2-dimethylamino-1-(4-morpholinophenyl)-1-butanone), 2-메틸-4'-(메틸티오)-2-모르폴리노프로피오페논 (2-methyl-4'-(methylthio)-2-morpholinopropiophenone), 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트 나트륨 (sodium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate), 비스(메시토일)포스피네이트 나트륨 (sodium bis(mesitoyl)phosphinate), 및 리튬 비스(메시토일)포스피네이트 (lithium bis(mesitoyl)phosphinate) 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구체 예에서, 상기 광 개시제는 2-하이드록시-1-[4-(하이드록시에톡시)페닐]-2-메틸-1-프로파논 또는 리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트 일 수 있다.
일 구체 예에서, 상기 광 개시제는 이르가큐어 2959 (Irgacure 2959)일 수 있다.
일 구체 예에서, 상기 히알루론산은 마이클 반응(Michael reaction)으로 아미노화 PCL 나노피브릴 표면에 결합되는 것일 수 있다.
일 구체 예에서, 상기 광가교는 히알루론산이 결합된 PCL 나노피브릴에 자외선을 조사하는 것일 수 있다.
일 구체 예에서, 광가교 시간을 조절하여 폴리카프로락톤 나노피브릴에 결합되는 히알루론산의 양을 조절하는 것일 수 있다.
일 구체 예에서, 상기 폴리카프로락톤 나노피브릴은 폴리카프로락톤 나노섬유를 밀링(milling)하여 얻어지는 것일 수 있다.
일 구체 예에서, 상기 폴리카프로락톤 나노섬유는 폴리카프로락톤을 전기방사하여 얻어지는 것일 수 있다.
다른 일 양상은 상기 제조 방법에 의해 제조되는 히알루론산이 결합된 폴리카프로락톤 나노피브릴을 제공한다.
또 다른 일 양상은 제조 방법에 의해 제조되는 히알루론산이 결합된 폴리카프로락톤 나노피브릴 및 세포를 혼합하여 얻어지는 3차원 세포배양용 세포 및 나노피브릴의 복합체를 제공한다.
본 발명은 친수성 천연고분자인 히알루론산을 PCL 나노피브릴의 표면에 결합시킴에 따라 폴리카프로락톤(PCL) 특유의 소수성 성질을 개선할 뿐만 아니라 세포와의 친화성을 향상시킬 수 있다. 또한, 가교된 히알루론산 층으로 인해 나노피브릴의 함수성이 증가하고, 히알루론산의 결합으로 인해 PCL 나노피브릴의 표면전하가 감소될 수 있다.
본 발명은 히알루론산이 결합된 나노피브릴을 제조함에 있어서 광가교를 통해 나노피브릴에 결합하는 히알루론산의 양을 정밀하게 조절하고 이를 통해 나노피브릴의 표면 특성을 미세하게 조절할 수 있다. 예를 들어 본 발명에서 나노피브릴의 광가교 시간을 증가시킬수록 PCL 나노피브릴에 결합하는 히알루론산의 양을 증가시킬 수 있다. 또한, 나노피브릴의 광가교 시간을 증가시킬수록 PCL 나노피브릴의 표면전하를 감소시킬 수 있다.
뿐만 아니라 본 발명은 광가교를 통해 나노 지지체에 히알루론산이 부착되는 양을 조절할 수 있으므로 특별한 화학물질이나 장치 없이 간단히 수행가능하다는 점에서 매우 경제적이다. 이는 기존의 히알루론산 결합 방법 보다도 더욱 정밀하게 나노 지지체에 결합하는 히알루론산의 양을 조절한다는 점에서 연골세포, 각막세포 등 많은 세포의 다양한 세포의 성장 환경에 최적화된 지지체를 제작할 수 있다.
따라서, 본 발명은 나노피브릴의 광가교 시간을 조절함으로써 나노피브릴 표면에 결합하는 히알루론산의 HA의 양을 조절할 수 있고 이에 따라 나노피브릴의 특성을 사용 목적에 맞게 조절할 수 있으며, 다양한 종류의 세포 성장에 최적화된 환경을 제공할 수 있다.
도 1은 전기방사 및 광가교를 통한 히알루론산이 결합된 나노피브릴 제조의 모식도를 나타낸다.
도 1a는 전기방사 및 아미노 분해 반응을 통해 아미노화 PCL 나노피브릴(aNF)을 제조하는 과정을 나타낸다.
도 1b는 마이클 반응(Michael reaction)과 광가교를 통해 aNF 표면에 히알루론산을 단계별로 결합시키는 과정을 나타낸다.
도 1c는 제조된 나노피브릴과 NIH3T3 세포를 혼합하여 세포/나노피브릴 복합체를 형성시키는 과정을 나타낸다.
도 2는 aNF 와 HA#@NF (#=0, 5) 의 (a) 4000-400cm-1, (b) 3700-3150.cm-1 (c) 1700-1500cm-1, (d) 1220-1120cm-1 범위에서의 FTIR 스펙트럼을 나타낸다.
도 3은 HA@NF의 물리화학적 특성분석 결과를 나타낸다. (a) aNF, HA#@NF (#=0,5)의 SEM 이미지 (스케일바= 20 μm), (b) TGA 열분석도, (c) HA@NF (#=0-5)의 Alcian blue 염색 결과 및 616nm 파장에서의 흡광도를 나타낸다.
도 4는 히알루론산 결합에 따라 발생한 HA@NF에서의 물리화학적 변화를 나타낸다. HA#@NF (#=0-5)의 (a) 팽윤도 및 (b) 제타전위 (ζ-potential) 변화를 나타낸다.
도 5는 NIH3T3 세포/나노피브릴 5일간의 배양 결과를 나타낸다. (a) 세포 생존능력, (b) 세포/나노피브릴 복합체의 DNA 함량, (c) 배양 72시간 이후 세포/나노피브릴의 CLSM 이미지를 나타낸다.
도 1a는 전기방사 및 아미노 분해 반응을 통해 아미노화 PCL 나노피브릴(aNF)을 제조하는 과정을 나타낸다.
도 1b는 마이클 반응(Michael reaction)과 광가교를 통해 aNF 표면에 히알루론산을 단계별로 결합시키는 과정을 나타낸다.
도 1c는 제조된 나노피브릴과 NIH3T3 세포를 혼합하여 세포/나노피브릴 복합체를 형성시키는 과정을 나타낸다.
도 2는 aNF 와 HA#@NF (#=0, 5) 의 (a) 4000-400cm-1, (b) 3700-3150.cm-1 (c) 1700-1500cm-1, (d) 1220-1120cm-1 범위에서의 FTIR 스펙트럼을 나타낸다.
도 3은 HA@NF의 물리화학적 특성분석 결과를 나타낸다. (a) aNF, HA#@NF (#=0,5)의 SEM 이미지 (스케일바= 20 μm), (b) TGA 열분석도, (c) HA@NF (#=0-5)의 Alcian blue 염색 결과 및 616nm 파장에서의 흡광도를 나타낸다.
도 4는 히알루론산 결합에 따라 발생한 HA@NF에서의 물리화학적 변화를 나타낸다. HA#@NF (#=0-5)의 (a) 팽윤도 및 (b) 제타전위 (ζ-potential) 변화를 나타낸다.
도 5는 NIH3T3 세포/나노피브릴 5일간의 배양 결과를 나타낸다. (a) 세포 생존능력, (b) 세포/나노피브릴 복합체의 DNA 함량, (c) 배양 72시간 이후 세포/나노피브릴의 CLSM 이미지를 나타낸다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한, 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다.
본 발명은 특히 광가교 시간을 조절함으로써 나노 지지체에 결합하는 히알루론산의 양을 조절할 수 있고 그로 인해 지지체의 특성을 용도에 맞게 변화시킬 수 있는 장점이 있다. 이는 지지체의 특성을 히알루론산과 상호작용하는 세포의 특성에 맞게 변화시키고 최적화하여 세포의 체외배양 후 이식에도 사용될 수 있다.
일 양상은 히알루론산이 결합된 폴리카프로락톤 나노피브릴의 제조 방법을 제공한다.
먼저 생체적합성 고분자인 폴리카프로락톤 Poly (ε-caprolactone, PCL)을 이용하여 나노섬유를 제조하였다. 상기 폴리카프로락톤은 분자량 14,000 내지 80, 000의 것을 사용할 수 있으며, 예를 들어 분자량 20,000 내지 70,000, 분자량 30,000 내지 60,000, 또는 분자량 40,000 내지 50,000의 것을 사용할 수 있으며, 예를 들어 분자량 43,000의 것을 사용할 수 있다.
상기 나노섬유는 폴리카프로락톤을 전기방사하여 얻어질 수 있다. 상기 전기방사는 방사 혼합물을 예를 들어 유량 0.1 내지 5 mL/h, 예컨대 1mL/h, 1 내지 27G, 예컨대 25G 니들 조건에서, 1 내지 25Kv 전력, 예컨대 15Kv 전력을 가해 전기방사하는 것일 수 있다.
상기 PCL 나노섬유를 제조한 후 이를 파편화 시켜 폴리카프로락톤 나노피브릴(nanofibril, NF)을 얻었다.
상기 폴리카프로락톤 나노피브릴은 PCL 나노섬유를 밀링(milling)하여 얻어지는 것일 수 있다. 예를 들어, 전기방사를 통해 만들어진 폴리카프로락톤 메쉬를 밀링하여 파편화시켜 PCL 나노피브릴을 제조할 수 있다. 상기 단계는 예를 들어 분석용 밀(analytical mill)을 통해 단편화될 수 있다.
상기 PCL 나노피브릴은 아민기로 기능화될 수 있다.
상기 PCL 나노피브릴 표면에 아민기를 기능화하는 단계는 PCL 나노피브릴의 아미노 분해 반응(aminolysis)을 포함할 수 있다.
상기 아미노 분해는 PCL 나노피브릴을 메탄올 및 에틸렌다이아민(ethylenediamine) 혼합물에 첨가하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 아미노 분해는 37℃에서 1 내지 96시간 예컨대 72시간 동안 반응시키는 것일 수 있다.
상기 아미노 분해 이후 원심분리하여 잔여 에틸렌다이아민을 제거할 수 있다.
이를 통해 아미노화 PCL 나노피브릴(aminolzyed PCL nanofibril, aNF)을 제조할 수 있다.
상기 아미노화 PCL 나노피브릴 표면에 결합되는 히알루론산(HA)은 메타크릴로일(methacryloyl)기가 도입된 메타크릴화 된 히알루론산(Methacryalted Hyaluronic acid)일 수 있다.
상기 메타크릴로일기가 도입된 히알루론산은 증류수에 HA를 용해시키고 테트라 암모늄 부틸 브로마이드(Tetrabutylammonium bromide, TBAB)와 글리시딜 메타크릴레이트(Glycidyl Methacrylate, GMA)를 첨가하여 완전히 용해시키고 상온에서 72시간 동안 반응시키는 단계에 의해 합성되는 것일 수 있다.
예를 들어, 상기 히알루론산 : TBAB, GMA 의 몰 비율은 1 : 3 : 6일 수 있다.
이어서 HA 혼합용액을 냉각시킨 아세톤에서 침전시킴으로써 반응하지 않고 남은 TBAB와 GMA를 제거하여 정제하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이어서 진공오분에서 남아있는 아세톤을 제거할 수 있다.
이를 통해 메타크릴화 된 히알루론산(Methacryalted Hyaluronic acid: MeHA)을 제조할 수 있다.
본 명세서에서 히알루론산은 마이클 반응 및 광가교 방법을 통해 아미노화 PCL 나노피브릴 표면에 결합될 수 있다.
PCL 나노피브릴 표면을 아민기로 기능화함에 따라 메타크릴화된 히알루론산을 마이클 반응을 통해 결합시킬 수 있다. 상기 히알루론산은 마이클 반응(Michael reaction)으로 아미노화 PCL 나노피브릴 표면에 결합될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 마이클 반응(Michael reaction)은 공명 안정화된 친핵성 엔올 음이온이 α, β-불포화 카르보닐 화합물과 반응하여 콘쥬게이션 첨가 반응 생성물을 주는 반응을 지칭하며, 마이클 첨가 반응(Michael addition reaction)이라고도 한다.
상기 광가교는 히알루론산이 결합된 PCL 나노피브릴에 자외선을 조사하는 것일 수 있다.
상기 히알루론산이 아미노화 PCL 나노피브릴 표면에 결합하는 단계는 광 개시제(photo initiator)의 첨가를 포함할 수 있다.
상기 광 개시제는 자외선에 의해 히알루론산을 가교시키기 위해 사용되는 것일 수 있다. 상기 광 개시제는 수용성 광 개시제일 수 있다. 예를 들어, 상기 광 개시제는 2-하이드록시-1-[4-(하이드록시에톡시)페닐]-2-메틸-1-프로파논 (이르가큐어 2959 (Irgacure 2959))일 수 있다. 또는 예를 들어, 상기 광 개시제는 리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트, 1-하이드록시-시클로헥실-페닐-케톤, 2,2-디메톡시-1,2-디페닐에탄-1-온, 2-벤질-2-디메틸아미노-1-(4-모르폴리노페닐)-1-부타논, 2-메틸-4'-(메틸티오)-2-모르폴리노프로피오페논, 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트 나트륨, 비스(메시토일)포스피네이트 나트륨, 또는 리튬 비스(메시토일)포스피네이트일 수 있다.
예를 들어, 상기 광 개시제는 0.01 내지 1 % (w/v) 농도의 것일 수 있다. 예를 들어, 0.1% (w/v)의 이르가큐어 2959를 사용할 수 있다.
상기 광 개시제의 가교 방법은 사용하는 광 개시제의 종류에 따라 사용하는 전자파의 영역을 달리할 수 있다.
예를 들어, 2-하이드록시-1-[4-(하이드록시에톡시)페닐]-2-메틸-1-프로파논을 광 개시제로 사용할 경우에는 자외선 영역의 전자파를 이용하여 가교를 진행할 수 있다.
예를 들어, 리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트FMF 광 개시제로 사용할 경우에는 가시광선 영역의 전자파를 이용하여 가교를 진행할 수 있다. 예를 들어, 상기 가시광선은 대략 380 내지 780nm의 파장 영역, 예를 들어 405nm의 파장을 갖는 전자파를 이용하여 가교를 진행할 수 있다.
상기 단계에서 메타크릴화된 히알루론산은 1 내지 30 % (w/v) 농도의 것일 수 있다. 예를 들어, 15% (w/v)의 메타크릴화된 히알루론산을 사용할 수 있다.
마이클 반응으로 아민기로 기능화된 PCL 나노피브릴과 메타크릴화 된 히알루론산을 결합한 후, 자외선을 조사하여 광가교시킴으로써 히알루론산의 결합이 증가하도록 할 수 있다. 예를 들어, 상기 자외선은 365nm, 6w의 것일 수 있다.
상기 제조 방법은 자외선을 조사하여 PCL 나노피브릴 표면에 결합하는 메타크릴화 된 히알루론산을 광가교 시킬 수 있고, 이에 따라 PCL 나노피브릴 표면에 부착되는 히알루론산의 양을 증가시킬 수 있다.
상기 제조 방법은 광가교 시간을 조절하여 PCL 나노피브릴에 결합되는 히알루론산의 양을 조절할 수 있고 이를 통해 NF의 표면특성을 변화시킬 수 있다. 상기 광가교 시간은 수초(s) 또는 수분(min) 일 수 있다. 예를 들어 상기 광가교 시간은 0 내지 60 (초), 0.5 내지 600 (분), 1 내지 100 (분), 1 내지 10 (분), 1 내지 5 (분) 일 수 있다. 예를 들어, 광가교 시간을 증가시킴에 따라 PCL 나노피브릴에 결합하는 히알루론산의 양을 증가시킬 수 있다.
상기 제조 방법은 예를 들어 아미노 분해 반응으로 PCL 나노피브릴 표면에 아민기를 기능화시키고, HA를 결합시키기 위해 이르가큐어 2959가 포함된 메타크릴화 된 히알루론산 용액에 아민기가 기능화된 PCL 나노피브릴을 첨가할 수 있다. 이를 적절한 온도 예컨대 37℃에서 반응시켜 마이클 반응을 통해 나노피브릴 표면에 HA가 결합될 수 있다. 이후 혼합액에 UV를 조사하여 마이클 반응에 참여하지 않은 나머지 메타크릴로일기를 광가교 시킴으로써 나노피브릴에 결합하는 HA의 양을 증가시킬 수 있다.
상기 제조 방법에서 PCL 나노피브릴 표면에 히알루론산을 결합시키고 가교된 히알루론산 층을 이룸에 따라 PCL의 소수성 성질이 개선되고 나노피브릴의 표면전하가 감소되고, 나노피브릴의 함수성이 증가될 수 있다.
또한, 상기 제조 방법은 광가교 시간을 조절하여 나노피브릴 표면에 부착되는 히알루론산의 양을 조절하고, 나노피브릴의 특성도 조절할 수 있다.
다른 일 양상은 상기 제조 방법에 의해 제조되는 히알루론산이 결합된 폴리카프로락톤 나노피브릴을 제공한다.
또 다른 일 양상은 제조 방법에 의해 제조되는 히알루론산이 결합된 폴리카프로락톤 나노피브릴 및 세포를 혼합하여 얻어지는 3차원 세포배양용 세포 및 나노피브릴의 복합체를 제공한다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해된다.
또한, 본 명세서에서 사용된 성분의 양, 분자량과 같은 특성들, 반응 조건 등을 표현하는 모든 숫자들은 달리 명시되지 않는 한, 모든 경우에 용어 "약(about)"에 의해 수식되는 것으로 이해된다. 따라서, 본 명세서에 기재된 숫자들은 본 발명에 의하여 얻고자 하는 바람직한 특성에 따라 달라질 수 있는 근사치이다. 예를 들어, 본 명세서에서 사용된 용어 "약"은 소정의 값 또는 범위의 5% 이내, 바람직하게는 1% 내지 2% 이내를 의미한다. 예를 들어, "약 10%"는 9.5% 내지 10.5%, 바람직하게는 9.8% 내지 10.2%를 의미한다. 또 다른 예를 들면, "약 100℃는 95℃내지 105℃, 바람직하게는 98℃ 내지 102℃를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "가진다", "가질 수 있다", "포함한다", 또는 "포함할 수 있다" 등의 표현은 해당 특징(예: 수치, 또는 성분 등의 구성요소)의 존재를 가리키며, 추가적인 특징의 존재를 배제하지 않는다.
본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 전체가 참고로 통합된다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 전기방사 및 광가교에 따른 히알루론산이 결합된 나노피브릴 제조
도 1은 전기방사 및 광가교에 따른 히알루론산이 결합된 나노피브릴 제조의 모식도를 나타낸다.
도 1a는 전기방사 및 아미노 분해 반응을 통해 아미노화 폴리카프로락톤 나노피브릴(aNF)을 제조하는 과정을 나타낸다.
도 1b는 마이클 반응(Michael reaction)과 광가교를 통해 aNF 표면에 히알루론산을 단계별로 결합시키는 과정을 나타낸다.
도 1c는 제조된 나노피브릴과 NIH3T3 세포를 혼합하여 세포/나노피브릴 복합체를 형성시키는 과정을 나타낸다.
보다 구체적으로 도 1a는 전기방사를 통해 PCL 나노섬유를 제조하고, 나노섬유를 분쇄하여 파편화된 형태인 나노피브릴(NF)을 제조한 후, 아미노 분해 반응을 통해 NF 표면에 아민기를 기능화(functionalization)하여 아미노화 PCL 나노피브릴(aNF)을 제조하는 과정을 나타낸다.
도 1b는 마이클 반응(Michael reaction)과 광가교를 통해 aNF 표면에 히알루론산을 단계별로 결합시키는 과정을 나타낸다. aNF 표면에 기능화된 아민기와 메타크릴화 된 히알루론산(methacrylated hyaluronic acid, MeHA)의 메타크릴기가 마이클 반응으로 결합하며, 이를 통해 MeHA가 aNF 표면에 결합한다. 이어서 UV 조사를 이용한 광가교로 인해 MeHA가 가교됨에 따라 aNF에 결합하는 히알루론산의 양이 증가하는 과정을 나타낸다.
도 1c는 제조된 나노피브릴과 NIH3T3 세포를 혼합하여 세포/나노피브릴 복합체를 형성시켜 3차원 배양하는 과정을 나타낸다. 히알루론산이 결합된 나노피브릴과 NIH3T3 세포를 혼합하고 원심분리(centrifugation)하여 세포/나노피브릴 현탁액(suspension)을 얻고, 이를 24시간 동안 자가 조립(self-assembly)시켜서 자가 조립된 세포/나노피브릴 복합체를 얻었다.
본원발명에서 전기방사 및 광가교에 따라 히알루론산이 결합된 나노피브릴을 제조하는 보다 구체적인 과정은 다음과 같다.
(1) 전기방사를 통한 PCL 나노섬유 제작 및 아민 기능화
폴리 (ε-카프로락톤) (Poly (ε-caprolactone), PCL) (Mw 43,000)을 클로로포름과 메탄올 (3:1, v/v) 혼합물에 25%로 녹여, 1mL/h의 유량(flow rate)으로 25G 니들을 통해 압출시키며 15kV의 전력을 가해 그라운드(ground)에 증착 될 수 있도록 전기방사 하였다. 이렇게 만들어진 PCL 나노섬유는 분석용 밀(analytical mill)을 통해 단편화(fragmentization) 시켜 PCL 나노피브릴(nanofibril, NF)을 만들었다. 이후 PCL 나노피브릴에 아민 작용기 도입을 위해 메탄올(MeOH)을 용매로 사용한 1M 에틸렌다이아민(ethylenediamine, EDA) 혼합물과 37℃에서 72시간 동안 반응시켜 아미노 분해 반응(aminolysis) 시켰다. 메탄올을 사용해 3회 원심분리 시키고 증류수로 1회 원심분리 시키는 과정을 통해 잔여 에틸렌다이아민을 제거했다. 이렇게 제조된 PCL 나노피브릴을 아미노화 PCL 나노피브릴(aminolzyed PCL nanofibril, aNF)로 명명했다.
(2) 메타크릴화 된 히알루론산 합성
메타크릴로일(methacryloyl)기가 도입된 히알루론산 합성을 위해, 히알루론산 (Mw 0.5 -10.1 kDa)을 증류수에 녹여 20% (w/v) 용액을 만든 후 테트라 암모늄 부틸 브로마이드(Tetrabutylammonium bromide, TBAB)와 글리시딜 메타크릴레이트(Glycidyl Methacrylate, GMA)를 첨가하고 완전히 녹이고 상온에서 72시간 동안 반응시켜서 메타크릴화를 진행시켰다 (히알루론산 : TBAB, GMA 의 몰 비율 = 1 : 3 : 6). 이렇게 제조된 히알루론산 혼합용액은 냉각시킨 아세톤에서 2회 침전시키는 방법으로 히알루론산 혼합용액 중 반응하지 않은 TBAB와 GMA를 제거하여 정제하고, 진공오븐에서 건조시켜 남아있는 아세톤을 제거하는 방법을 통해 메타크릴화 된 히알루론산(Methacryalted Hyaluronic acid: MeHA)을 취득하였다. MeHA의 메타크릴화 정도는 1H-NMR을 통해 분석하였다.
(3) 나노피브릴 표면에 광가교를 통한 히알루론산 결합
마이클 반응 및 광가교 방법으로 히알루론산이 아미노화 PCL 나노피브릴(aNF) 표면에 결합되었다. 간단히 말해 0.1% (w/v) 이르가큐어 2959 (Irgacure 2959)가 첨가된 15% (w/v) 메타크릴화 된 히알루론산(MeHA) 용액에 aNF (0.2 mg/mL)를 분산시켜 37℃ 에서 3시간 동안 교반시키며 반응을 진행하였다. 반응이 끝난 MeHA와 aNF 혼합액에 자외선(365nm, 6w)을 다양한 시간 동안 조사하여 MeHA 사이에서 가교를 진행시켜 aNF 표면에 결합하는 히알루론산의 양이 조절될 수 있도록 하였고 자외선 조사 시간에 따라 각각 HA#@NF (# = 자외선 조사 시간[단위: 분(min)])으로 명명하였다. 예를 들어 히알루론산이 aNF 표면에 결합하고 자외선 조사 시간이 0분인 나노피브릴은 HA0@NF라고 명명한다. 예를 들어 히알루론산이 aNF 표면에 결합하고 자외선 조사 시간이 5분인 나노피브릴은 HA5@NF라고 명명한다.
시험예 1. 특성 분석
(1) 분석 방법
위에서 제조된 나노피브릴 표면의 변화를 관찰하기 위해 SEM을 통해 나노피브릴(aNF, HA0@NF, HA5@NF)의 모양을 관찰하였다.
자외선 조사 시간에 따라 달라지는 나노피브릴 표면에 결합(접목)된 히알루론산의 양을 시각화시켜 나타내기 위해 알시안블루(Alcian blue) 염색을 진행하였다. 616nm 파장에서 염색된 나노피브릴의 흡광도를 측정해 염색 정도의 차이를 수치화시켰다.
또한, 푸리에 변환 적외선(Fourier transform infrared, FTIR) 분석과 열중량 분석기(thermogravimetric analyzer, TGA) 분석을 통해 나노피브릴 표면에 결합되어 있는 히알루론산의 존재를 확인하였다. 또한 결합한 히알루론산 양의 차이로 인해 나타나는 나노피브릴의 제타 전위(zeta potential)를 측정하고, 팽윤비(swelling ratio) 또한 측정하였다. 팽윤비는 각 나노피브릴을 증류수에 담그고 37℃ 에서 3시간 동안 배양한 후, 무게를 측정해 초기 중량(initial weight)과 습윤 중량(wet weight)을 비교하는 방법을 통해 계산되었다.
(2) 분석 결과
(2.1)
FTIR 스펙트럼 분석
도 2는 aNF 와 HA#@NF (#=0, 5) 의 (a) 4000-400cm-1, (b) 3700-3150.cm-1 (c) 1700-1500cm-1, (d) 1220-1120cm-1 범위에서의 FTIR 스펙트럼을 나타낸다.
FTIR 스펙트럼을 통해 NF 표면에 결합한 히알루론산을 확인한 결과, 히알루론산이 결합된 HA0@NF와 HA5@NF에서 수산기에 해당하는 범위인 3600-3200cm-1 에서 aNF에 비해 피크가 더욱 넓어지는 경향을 보였다(도 2b). 1634cm-1 와 1544cm-1 에서는 히알루론산의 N-아세틸기에 해당하는 아마이드 I와 아마이드 II 피크가 나타났다(도 2c). 또한, 피크 글리코사이드 결합 (1185-1172cm-1)에 해당하는 피크가 새로 나타났고 광가교가 진행된 HA5@NF에서 더욱 두드러지게 나타났다(도 2c). 이는 마이클 반응을 통해 히알루론산이 표면에 화학적으로 결합할 수 있으며 광가교를 통해 히알루론산이 결합하는 양을 증가시킬 수 있음을 보여준다.
(2.2)
SEM 이미지 관찰, TGA 열분석, 흡광도 분석 결과
도 3은 HA@NF의 물리화학적 특성분석 결과를 나타낸다. (a) aNF, HA#@NF (#=0,5)의 SEM 이미지 (스케일바= 20 μm), (b) TGA 열분석도, (c) HA@NF (#=0-5)의 알시안블루 염색 결과 및 616nm 파장에서의 흡광도를 나타낸다.
도 3a에서 보는 바와 같이 SEM을 통해 나노피브릴의 구조를 관찰한 결과, aNF의 표면은 아미노 분해 반응으로 인해 거칠어졌으며 기공이 많이 생긴 것이 관찰되었다. HA0@NF는 aNF와 차이가 발견되지 않았으나 HA5@NF에서 얇은 층이 형성된 것이 발견되었으며 표면 또한 aNF와 비교해 더욱 매끄러워졌다.
도 3b에서 보는 바와 같이, TGA 분석결과 aNF는 405.5 ℃에서 열분해가 진행되었으며 NF의 열분해가 시작된 온도인 413.5 ℃ 보다 낮았다. 이는 아미노 분해로 인해 분자량이 작아졌기 때문에 발생한 것으로 예상된다. NF와 aNF는 700℃에 도달했을 때 모두 완전히 분해되었다. 그러나 동일한 온도에 도달했을 때, 히알루론산을 결합시킨 HA0@NF와 HA5@NF의 잔존질량은 각각 5.89%와 6.92%로 완전히 분해되지 않았다. 또한, 광가교 과정을 거친 HA5@NF의 잔존질량이 HA0@NF보다 높은 결과가 도출되었다. 이는 광가교를 통해 aNF에 결합하는 히알루론산의 양이 증가할 수 있음을 보여준다.
도 3c에서 보는 바와 같이, 광가교 시간과 히알루론산 결합양의 관계를 알아보기 위해 알시안블루 염색을 진행했을 때, 광가교 시간이 증가할수록 염색의 강도가 높아지는 현상이 나타났으며, HA1@NF, HA3@NF, HA5@NF의 흡광도는 HA0@NF에 비해 각각 1.45, 1.5, 1.83배 높은 흡광도 수치를 보였다. 이를 통해 aNF에 결합하는 히알루론산은 광가교 시간에 비례해 증가하는 것을 알 수 있다.
(2.3)
팽윤도 및 제타전위 변화 측정 결과
도 4는 히알루론산 결합에 따라 발생한 HA@NF에서의 물리화학적 변화를 나타낸다. HA#@NF (#=0-5)의 (a) 팽윤도 및 (b) 제타전위 (ζ-potential) 변화를 나타낸다.
도 4a에서와 같이, HA@NF의 팽윤도를 측정한 결과 aNF의 팽윤도는 177.9%로 광가교 과정을 거치지 않은 HA0@NF의 220.4% 와 유의미한 차이를 보였다. 또한, 광가교가 진행된 HA1@NF, HA3@NF, HA5@NF의 팽윤도는 각각 230.3%, 250.6%, 313.4%로 광가교 시간이 증가함에 따라 팽윤도 또한 비례해서 증가함이 확인되었다.
도 4a에서와 같이, aNF와 HA@NF의 제타전위를 측정했을 때, 표면에 아민기가 수식되어 있는 aNF의 경우 42.2mV로 양전하를 띄고 있는 반면에, 히알루론산이 결합된 HA@NF의 경우 HA0@NF는 -20.9mV, HA1@NF은 -36.1mV, HA3@NF은 -35.6mV, HA5@NF -41.6mV로 나타났다. 광가교 시간이 증가할수록 카복실기로 인해 음전하를 띄는 히알루론산의 결합이 증가함으로 인해 제타전위가 음전하를 띄는 것이 관찰되었다. 따라서 광가교 시간을 조절하는 방법을 통해 히알루론산이 결합하는 양을 조절할 수 있으며 나노피브릴 표면특성이 조절될 수 있음을 확인하였다.
시험예 2. 생체외(In vitro) 실험
히알루론산이 결합된 나노피브릴이 세포생존에 끼치는 영향을 평가하기 위해 생체외 실험을 진행하였다.
NIH3T3 세포 (1×105)와 나노피브릴(aNF, HA0@NF, HA5@NF; 0.2mg)을 혼합해 5일 동안 배양한 뒤, WST-1 분석을 통해 세포의 생존능력을 평가하였다. 또한, 세포/나노피브릴 복합체 (cell/NF complex)에서의 DNA 함량을 알아보기 위해 피코그린 분석(PicoGreen assay)을 진행하였다. 또한, 세포/나노피브릴 복합체에서 세포와 NF간 상호작용을 알아보기 위해 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)와 팔로이딘(phalloidin) 염색을 진행한 후, 공초점주사현미경(confocal laser scanning microscope, CLSM)을 통해 관찰하였다.
보다 구체적으로 도 5는 NIH3T3 세포/나노피브릴 5일간의 배양 결과를 나타낸다. (a) 세포 생존능력, (b) 세포/나노피브릴 복합체의 DNA 함량, (c) 배양 72시간 이후 세포/나노피브릴의 CLSM 이미지를 나타낸다.
도 5a에서 보는 바와 같이, NIH3T3 세포와 각 나노피브릴을 혼합하여 5일 동안 배양 후, 세포/나노피브릴 복합체의 생존력을 평가한 결과, 배양이 진행된 후 3일간은 aNF에서 가장 높은 생존능력이 나타났으며, 히알루론산이 결합되어있는 나노피브릴에서는 상대적으로 낮은 생존능력을 나타내는 것이 관찰되었다. 하지만 5일이 지났을 때 HA5@NH에서 가장 높은 생존능력을 보여주었으며 aNF와 HA0@NF 보다 각각 1.28배, 1.34 배 높은 생존능력을 보였다.
도 5b에서 보는 바와 같이, NIH3T3 세포와 각 나노피브릴 복합체에서 배양 1일, 3일, 5일 후 DNA를 추출하여 정량적으로 분석하였다. 그 결과, 배양 후 1일차에 히알루론산이 결합된 HA@NF를 사용한 복합체의 DNA가 aNF를 사용했을 때 보다 높게 나타났다. 또한, HA5@NF를 사용했을 때의 DNA 함량이 HA0@NF를 사용했을 때 보다 높았다. 배양기간이 증가하면서 세포/나노피브릴 복합체에 존재하는 DNA 함량은 감소하였는데, 배양 5일 동안 HA@NF 혼합물이 aNF 보다 높은 DNA 함량을 보여주었다. 또한 HA5@NF 복합체의 DNA 함량이 가장 높았으며 HA0@NF 복합체가 뒤를 이었다.
도 5c에서 보는 바와 같이, DAPI와 팔로이딘 염색을 통해 NIH3T3 세포와 각 나노피브릴 사이의 상호작용을 알아보았을 때, HA5@NF 나노피브릴과 혼합되어 배양된 세포는 aNF나 HA0@NF와 혼합된 세포에 비해 더욱 넓게 퍼져 있는 모양이었다. 초록색으로 염색된 엑틴 필라멘트의 경우 HA5@NF를 사용한 복합체에서 더욱 강하게 염색되었으며 길게 늘어나 있는 모습을 보였다.
이를 통해 본 발명이 제시하는 방법과 같이 히알루론산을 PCL 나노피브릴에 결합시켜 친수성을 확보함과 동시에 표면전하 등의 고분자 표면특성을 특정 세포의 배양환경에 맞게 변화시킴으로써 세포의 생존에 적합한 환경을 조성할 수 있고 이것은 3차원 환경에서 세포 배양 시 매우 유용함을 확인할 수 있었다.
본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로, 상기 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (15)
- 폴리카프로락톤(poly caprolactone, PCL) 나노피브릴의 표면에 아민기를 기능화하여 아미노화 PCL 나노피브릴을 제조하는 단계;
상기 아미노화 PCL 나노피브릴 표면에 히알루론산을 결합하는 단계; 및
상기 히알루론산을 광가교(photo-crosslinking)하는 단계;를 포함하는 히알루론산이 결합된 폴리카프로락톤 나노피브릴의 제조 방법. - 청구항 1에 있어서, 상기 폴리카프로락톤 나노피브릴 표면에 아민기를 기능화하는 단계는 폴리카프로락톤 나노피브릴의 아미노 분해 반응(aminolysis)을 포함하는 것인 제조 방법.
- 청구항 2에 있어서, 상기 아미노 분해는 폴리카프로락톤 나노피브릴을 메탄올 및 에틸렌다이아민(ethylenediamine) 혼합물에 첨가하는 것인 제조 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 아미노화 폴리카프로락톤 나노피브릴 표면에 결합되는 히알루론산은 메타크릴로일(methacryloyl)기가 도입된 메타크릴화 된 히알루론산(Methacryalted Hyaluronic acid)인 것인 제조 방법.
- 청구항 1에 있어서, 아미노화 PCL 나노피브릴 표면에 히알루론산을 결합하는 단계는 광 개시제의 첨가를 포함하는 것인 제조 방법.
- 청구항 5에 있어서, 상기 광 개시제는 수용성 광개시제인 것인 제조 방법.
- 청구항 5에 있어서, 상기 광 개시제는 수용성 광개시제로 2-하이드록시-1-[4-(하이드록시에톡시)페닐]-2-메틸-1-프로파논 (2-Hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)phenyl]-2-methyl-1-propanone), 리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트 (lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate), 1-하이드록시-시클로헥실-페닐-케톤 (1-hydroxy-cyclohexyl-phenyl-ketone), 2,2-디메톡시-1,2-디페닐에탄-1-온 (2,2-dimethoxy-1,2-diphenylethan-1-one), 2-벤질-2-디메틸아미노-1-(4-모르폴리노페닐)-1-부타논 (2-benzyl-2-dimethylamino-1-(4-morpholinophenyl)-1-butanone), 2-메틸-4'-(메틸티오)-2-모르폴리노프로피오페논 (2-methyl-4'-(methylthio)-2-morpholinopropiophenone), 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트 나트륨 (sodium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate), 비스(메시토일)포스피네이트 나트륨 (sodium bis(mesitoyl)phosphinate), 및 리튬 비스(메시토일)포스피네이트 (lithium bis(mesitoyl)phosphinate) 중에서 선택되는 어느 하나인 것인 제조 방법.
- 청구항 5에 있어서, 상기 광 개시제는 이르가큐어 2959 (Irgacure 2959)인 것인 제조 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 히알루론산은 마이클 반응(Michael reaction)으로 아미노화 PCL 나노피브릴 표면에 결합되는 것인 제조 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 광가교는 히알루론산이 결합된 PCL 나노피브릴에 자외선을 조사하는 것인 제조 방법.
- 청구항 1에 있어서, 광가교 시간을 조절하여 폴리카프로락톤 나노피브릴에 결합되는 히알루론산의 양을 조절하는 것인 제조 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 폴리카프로락톤 나노피브릴은 폴리카프로락톤 나노섬유를 밀링(milling)하여 얻어지는 것인 제조 방법.
- 청구항 12에 있어서, 상기 폴리카프로락톤 나노섬유는 폴리카프로락톤을 전기방사하여 얻어지는 것인 제조 방법.
- 청구항 1의 제조 방법에 의해 제조되는 히알루론산이 결합된 폴리카프로락톤 나노피브릴.
- 청구항 1의 제조 방법에 의해 제조되는 히알루론산이 결합된 폴리카프로락톤 나노피브릴 및 세포를 혼합하여 얻어지는 3차원 세포배양용 세포 및 나노피브릴의 복합체.
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