CN115006542A - 透明质酸/玉米醇溶蛋白基纳米药物载体及制法和应用 - Google Patents

透明质酸/玉米醇溶蛋白基纳米药物载体及制法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了透明质酸/玉米醇溶蛋白基纳米药物载体及制法和应用。本发明以聚乙二醇修饰的透明质酸为亲水基，与疏水性玉米醇溶蛋白通过静电作用自组装形成纳米颗粒，该双亲性纳米载体可用于亲水性和疏水性药物的高效负载。本发明方法制备的纳米复合载体具有肿瘤组织特异性酶响应的电荷反转的特性，该透明质酸/玉米醇溶蛋白基纳米颗粒在正常生理环境呈电负电，有助于其长效循环；通过肿瘤细胞中过表达的CD44受体介导的内吞作用，被肿瘤细胞靶向摄取；在肿瘤组织及溶酶体透明质酸酶环境下，纳米载体表面透明质酸被降解，实现表面由负到正的电荷反转，有利于纳米药物通过转胞吞作用，实现在肿瘤组织的深度渗透。

Description

透明质酸/玉米醇溶蛋白基纳米药物载体及制法和应用
技术领域
本发明属于生物医药及纳米材料技术领域，具体涉及一种具有电荷反转特性的透明质酸/玉米醇溶蛋白基纳米药物载体的制备方法和应用。
背景技术
玉米醇溶蛋白是自然界最为广泛存在的植物蛋白之一，具有价格低廉、易获得、无毒、生物相容性好等优点，被广泛应用于食品、化工、医药等行业。在纳米医学领域，玉米醇溶蛋白纳米颗粒由于良好的自组装特性、生物相容性、可降解性及可修饰性等特点，已被广泛用于构筑纳米药物输送载体。然而，基于玉米醇溶蛋白的纳米载体由于表面带电正性，在体内循环时易被网状内皮系统清除，无法实现药物的长效循环；同时由于其缺乏靶向性，难以将药物有效输送至靶点病灶部位。因此，如何对玉米蛋白载体进行功能化修饰，改善其亲水性、表面电荷分布及靶向性，使其满足对目标药物的高效递送、靶向摄取和定点释放具有重要研究意义。
此外，当纳米药物用于肿瘤治疗时，由于肿瘤独特的生理病理学特征，如致密的基质组织、高细胞密度、高肿瘤间质内压以及高度乏氧等，使得纳米药物在肿瘤组织中的渗透和扩散非常困难。电荷反转策略是解决这一问题的重要方法，利用肿瘤组织微环境与正常组织的环境差异(如微酸性、酶异常或氧化还原环境等)，刺激药物载体结构发生变化，使纳米颗粒到肿瘤组织表面电荷转变为正电性，以利于纳米载药体系在肿瘤组织的渗透、内化与溶酶体逃逸、入核。
近年来，国内外诸多研究团队设计开发了利用肿瘤微酸环境触发电荷反转的纳米载体，如修饰不同系列酸敏感的酸酐基团(丁二酸酐、2，3-二甲基马来酸酐等)嵌段聚合物和水凝胶等，以促进纳米药物的细胞内吞和肿瘤渗透。然而，由于肿瘤微环境的酸度有限，导致酸刺激的纳米载体电荷反转效率低。此外，该类纳米载体易在生理环境中发生水解，从而被快速清除，限制了其在肿瘤组织的渗透深度。考虑到玉米醇溶蛋白纳米载体在生理环境下具有电正性，若通过载体的复合修饰，构建具有肿瘤微环境响应电荷反转的玉米蛋白基复合载体，巧妙设计表面电荷动态快速可调控，是解决纳米药物肿瘤渗透瓶颈问题的重要策略。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种透明质酸/玉米醇溶蛋白基纳米药物载体的制备方法。
本发明方法具体如下：
步骤(1)将透明质酸溶于超纯水中形成透明质酸水溶液，每升超纯水溶解0.5～10g透明质酸；所述的透明质酸的分子量为40～1000kDa；
然后加入浓度为20～40mM的NHS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺)甲醇溶液，搅拌均匀后再加入溶有EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺)和NHS的水溶液，水溶液中EDC和NHS的摩尔比为1：1，EDC的浓度和NHS的浓度均为5～15mM；
加入的NHS甲醇溶液与透明质酸水溶液的体积比为0.1～0.5：1，EDC和NHS的水溶液与透明质酸水溶液的体积比为0.25～1：1；
搅拌1～6小时后，加入mPEG-NH2(甲氧基聚乙二醇胺)固体粉末，加入的mPEG-NH2与透明质酸的质量比为0.2～0.5：1，所述的mPEG-NH2的分子量为2000～5000Da；
在常温反应18～36小时，反应结束后，透析纯化，冻干即得到聚乙二醇(PEG)修饰的改性透明质酸。
步骤(2)将制得的改性透明质酸与玉米醇溶蛋白溶解醇溶液中，改性透明质酸与玉米醇溶蛋白的质量比为1：0.5～20；所述的醇溶液为50％～70％的甲醇溶液、乙醇溶液或丙醇溶液；所述的玉米醇溶蛋白为分子量20～40KDa的α-玉米醇溶蛋白和/或β-玉米醇溶蛋白；
超声混合后置于透析袋中，放入装有超纯水的溶出仪中搅拌透析；混合溶液在搅拌透析下反应至混合溶液变为乳白色，取出混合溶液经离心、洗涤得到目标产物透明质酸/玉米醇溶蛋白基纳米药物载体。
本发明的第二个发明目的是提供一种透明质酸/玉米醇溶蛋白基纳米药物载体，采用以上方法制备得到。
该透明质酸/玉米醇溶蛋白基纳米药物载体以聚乙二醇(PEG)修饰的透明质酸为亲水基，与疏水性玉米醇溶蛋白通过静电作用自组装形成纳米颗粒，并可装载亲疏水药物；该电荷反转透明质酸/玉米醇溶蛋白基纳米颗粒经肿瘤细胞中过表达的CD44受体作用内吞入细胞内部，被溶酶体中的透明质酸酶降解表面的透明质酸由负电荷转变为正电荷，以利于纳米药物通过转胞吞作用实现对肿瘤组织的深度渗透。
该透明质酸/玉米醇溶蛋白基纳米药物载体的粒径为160～500nm，电位为-38～-20mV，其在透明质酸酶的作用下，电位可由-38～-20mV快速转变为3～10mV。
本发明的第三个发明目的是提供采用以上方法制备得到的透明质酸/玉米醇溶蛋白基纳米药物载体在包载药物上的应用。透明质酸/玉米醇溶蛋白基纳米药物载体的载药量为9～20％、包封效率为90～95％。
具体应用方法是：将透明质酸/玉米醇溶蛋白基纳米药物载体和亲水性药物或疏水性药物加入溶剂中，搅拌1～24小时，充分溶解；
所述的溶剂为水、二甲基甲砜、丙酮、乙醇或甲醇溶液；然后通过溶剂蒸发法去除水，或通过离心洗涤法去除有机溶剂，冻干后即得到载药改性透明质酸基玉米醇溶蛋白纳米颗粒。
所述的亲水性药物为盐酸阿霉素、5-氟尿嘧啶或吉西他滨；加入的透明质酸/玉米醇溶蛋白基纳米药物载体与亲水性药物的质量比为2～25：1；
所述的疏水性药物为姜黄素、槲皮素、羟基喜树碱、紫杉醇或窃衣素；加入的透明质酸/玉米醇溶蛋白基纳米药物载体与疏水性药物的质量比为5～20：1。
本发明制备的透明质酸/玉米醇溶蛋白基纳米药物载体具有肿瘤组织特异性酶响应的电荷反转的特性，该透明质酸/玉米醇溶蛋白基纳米颗粒在正常生理环境呈电负电，有助于其长效循环；通过肿瘤细胞中过表达的CD44受体介导的内吞作用，被肿瘤细胞靶向摄取；在肿瘤组织及溶酶体透明质酸酶环境下，纳米载体表面透明质酸被降解，实现表面“由负到正的电荷反转”，有利于纳米药物通过转胞吞作用，实现在肿瘤组织的深度渗透。
本发明的有益效果包括：
(1)本发明以PEG修饰的透明质酸为亲水基，与疏水性玉米醇溶蛋白通过静电作用自组装形成纳米颗粒，制备一种双亲性纳米颗粒，可作为多种药物的载体，包括亲水性药物和疏水性药物。
(2)本发明的电荷反转型透明质酸/玉米醇溶蛋白纳米载体具有良好的生物相容性，可在体内降解，降解产物对人体无毒性，从而解决了传统合成材料导致的载体生物相容性差、体内毒性等问题。
(3)本发明的纳米载体以具有CD44特异性靶向的透明质酸为外层，特别适用于CD44受体高表达的肿瘤细胞，增强其肿瘤靶向性和胞内摄取。
(4)该纳米药物载体具有肿瘤组织特异性酶响应的电荷反转的特性，酶催化反应高效、电荷反转速度快，有利于纳米药物通过转胞吞作用，实现在肿瘤组织的深度渗透。
(5)本发明制备方法简单，操作方便，条件温和。制备所得的纳米颗粒分散性好，形貌粒径均一，其纳米制剂具有良好的生物稳定性，有利于长效保存。
附图说明
图1为本发明一实施例改性前后透明质酸的核磁共振氢谱图；
图2为本发明一实施例制备的透明质酸/玉米醇溶蛋白基纳米药物载体的SEM图；
图3为本发明一实施例制备的透明质酸/玉米醇溶蛋白基纳米药物载体的DLS图；
图4为本发明一实施例中载药前后透明质酸/玉米醇溶蛋白纳米颗粒的红外光谱图；
图5为本发明一实施例中载药前后透明质酸/玉米醇溶蛋白纳米颗粒的UV光谱图；
图6为本发明一实施例中载药后透明质酸/玉米醇溶蛋白纳米颗粒的电荷反转图；
图7为本发明一实施例中载药后透明质酸/玉米醇溶蛋白纳米颗粒的粒径和电位随时间变化图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本领域技术人员在理解本发明的技术方案基础上进行修改或等同替换，而未脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围内。以下具体实施方式中，所采用的原料均购于市场，未经处理直接使用。
实施例1.
步骤(1)将0.5g分子量为40～100kDa的透明质酸溶于1升超纯水中形成透明质酸水溶液；加入0.5升浓度为20mM的NHS甲醇溶液，搅拌均匀后再加入1升溶有EDC和NHS的水溶液，水溶液中EDC的浓度和NHS的浓度均为5mM；搅拌1小时后，加入0.1克分子量为2000～3000Da的mPEG-NH2固体粉末；在常温反应18小时，反应结束后，透析纯化，冻干即得到聚乙二醇(PEG)修饰的改性透明质酸。
步骤(2)将制得的改性透明质酸与分子量为20～40KDa的α-玉米醇溶蛋白溶解在70％的甲醇溶液中，改性透明质酸与玉米醇溶蛋白的质量比为2：1；
超声混合后置于透析袋中，放入装有超纯水的溶出仪中搅拌透析；混合溶液在搅拌透析下反应至混合溶液变为乳白色，取出混合溶液经离心、洗涤得到目标产物透明质酸/玉米醇溶蛋白基纳米药物载体。
实施例2.
步骤(1)将10.0g分子量为300～500kDa的透明质酸溶于1升超纯水中形成透明质酸水溶液；加入0.1升浓度为40mM的NHS甲醇溶液，搅拌均匀后再加入1升溶有EDC和NHS的水溶液，水溶液中EDC的浓度和NHS的浓度均为8mM；搅拌6小时后，加入3.0克分子量为3000～4000Da的mPEG-NH2固体粉末；在常温反应36小时，反应结束后，透析纯化，冻干即得到聚乙二醇(PEG)修饰的改性透明质酸。
步骤(2)将制得的改性透明质酸与分子量为20～40KDa的β-玉米醇溶蛋白溶解在50％的甲醇溶液中，改性透明质酸与玉米醇溶蛋白的质量比为1：1；
超声混合后置于透析袋中，放入装有超纯水的溶出仪中搅拌透析；混合溶液在搅拌透析下反应至混合溶液变为乳白色，取出混合溶液经离心、洗涤得到目标产物透明质酸/玉米醇溶蛋白基纳米药物载体。
实施例3.
步骤(1)将1.0g分子量为800～1000kDa的透明质酸溶于1升超纯水中形成透明质酸水溶液；加入0.3升浓度为25mM的NHS甲醇溶液，搅拌均匀后再加入0.5升溶有EDC和NHS的水溶液，水溶液中EDC的浓度和NHS的浓度均为10mM；搅拌2小时后，加入0.5克分子量为4000～5000Da的mPEG-NH2固体粉末；在常温反应24小时，反应结束后，透析纯化，冻干即得到聚乙二醇(PEG)修饰的改性透明质酸。
步骤(2)将制得的改性透明质酸与分子量为20～40KDa的α-玉米醇溶蛋白溶解在60％的乙醇溶液中，改性透明质酸与玉米醇溶蛋白的质量比为1：20；
超声混合后置于透析袋中，放入装有超纯水的溶出仪中搅拌透析；混合溶液在搅拌透析下反应至混合溶液变为乳白色，取出混合溶液经离心、洗涤得到目标产物透明质酸/玉米醇溶蛋白基纳米药物载体。
实施例4.
步骤(1)将3.0g分子量为700～900kDa的透明质酸溶于1升超纯水中形成透明质酸水溶液；加入0.2升浓度为30mM的NHS甲醇溶液，搅拌均匀后再加入0.25升溶有EDC和NHS的水溶液，水溶液中EDC的浓度和NHS的浓度均为15mM；搅拌3小时后，加入1.2克分子量为2500～3000Da的mPEG-NH2固体粉末；在常温反应20小时，反应结束后，透析纯化，冻干即得到聚乙二醇(PEG)修饰的改性透明质酸。
步骤(2)将制得的改性透明质酸与分子量为20～40KDa的β-玉米醇溶蛋白溶解在55％的乙醇溶液中，改性透明质酸与玉米醇溶蛋白的质量比为1：5；
超声混合后置于透析袋中，放入装有超纯水的溶出仪中搅拌透析；混合溶液在搅拌透析下反应至混合溶液变为乳白色，取出混合溶液经离心、洗涤得到目标产物透明质酸/玉米醇溶蛋白基纳米药物载体。
实施例5.
步骤(1)将5.0g分子量为120～250kDa的透明质酸溶于1升超纯水中形成透明质酸水溶液a；加入0.4升浓度为25mM的NHS甲醇溶液，搅拌均匀后再加入0.8升溶有EDC和NHS的水溶液，水溶液中EDC的浓度和NHS的浓度均为6mM；搅拌4小时后，加入4.0克分子量为3000～4500Da的mPEG-NH2固体粉末；在常温反应30小时，反应结束后，透析纯化，冻干即得到聚乙二醇(PEG)修饰的改性透明质酸。
步骤(2)将制得的改性透明质酸与分子量为20～40KDa的玉米醇溶蛋白溶解在50％的丙醇溶液中，改性透明质酸与玉米醇溶蛋白的质量比为1：10；玉米醇溶蛋白为α-玉米醇溶蛋白和β-玉米醇溶蛋白按照1:1的混合玉米醇溶蛋白；
超声混合后置于透析袋中，放入装有超纯水的溶出仪中搅拌透析；混合溶液在搅拌透析下反应至混合溶液变为乳白色，取出混合溶液经离心、洗涤得到目标产物透明质酸/玉米醇溶蛋白基纳米药物载体。
实施例6.
步骤(1)将8.0g分子量为120～250kDa的透明质酸溶于1升超纯水中形成透明质酸水溶液；加入0.3升浓度为30mM的NHS甲醇溶液，搅拌均匀后再加入0.4升溶有EDC和NHS的水溶液，水溶液中EDC的浓度和NHS的浓度均为12mM；搅拌5小时后，加入2.5克分子量为2000～3000Da的mPEG-NH2固体粉末；在常温反应24小时，反应结束后，透析纯化，冻干即得到聚乙二醇(PEG)修饰的改性透明质酸。
步骤(2)将制得的改性透明质酸与分子量为20～40KDa的为α-玉米醇溶蛋白溶解在65％的丙醇溶液中，改性透明质酸与玉米醇溶蛋白的质量比为1：15；
超声混合后置于透析袋中，放入装有超纯水的溶出仪中搅拌透析；混合溶液在搅拌透析下反应至混合溶液变为乳白色，取出混合溶液经离心、洗涤得到目标产物透明质酸/玉米醇溶蛋白基纳米药物载体。
实施例7.
制备改性透明质酸：将376mg透明质酸(HA)溶于75mL超纯水(DDW)中，加入7.5mL的经甲醇溶解的43.38mg的N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)，在此溶液中加入溶有38.3mg的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和43.38mg的N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)的15mL超纯水(DDW)，搅拌1小时后，将100mg甲氧基聚乙二醇胺(mPEG-NH2)缓慢加入搅拌后的溶液中，在常温下搅拌24小时。反应结束后，在甲醇和DDW混合物(1:1,v/v)透析48小时，冷冻干燥后即得到PEG修饰的白色改性透明质酸粉末。
对附图1中的改性前后透明质酸的核磁共振氢谱图的结果进行比较，发现改性后的透明质酸在3.6ppm处出现新的化学位移，为mPEG-NH2中-O-CH2-中氢的特征峰。
利用实施例7制备的改性透明质酸制备透明质酸/玉米醇溶蛋白基纳米药物载体，见实施例实施例8～11。
实施例8.
将5mg改性透明质酸与25mg玉米醇溶蛋白溶解在70％乙醇溶液中，超声混合5min；将上述混合溶液置于透析袋中，放入装有300mL的DDW的溶出仪中搅拌透析1小时，混合溶液在搅拌透析下反应至混合溶液变为乳白色，取出混合溶液在3000rpm离心10min一次、取上清液8000rpm离心20min一次，去除上清液加入超纯水超声分散继续8000rpm离心20min三次以得到所述的电荷反转透明质酸/玉米醇溶蛋白纳米颗粒。
附图2为该PEG修饰的透明质酸/玉米醇溶蛋白纳米药物载体颗粒的SEM图，从图中发现纳米颗粒呈均匀的球形形态，且分散性较好。
附图3为PEG修饰的透明质酸/玉米醇溶蛋白纳米药物载体颗粒的DLS图，结果可知制备的纳米载体粒径为222.3nm，PDI为0.129，另测得其电位为-27.9mV。
对比例1.
根据专利CN 112675133 A公开的一种玉米醇溶蛋白-透明质酸复合纳米颗粒的制备方法。将1g玉米醇溶蛋白溶分散到50mL浓度70％的乙醇水溶液中，制备得玉米醇溶蛋白乙醇水溶液；将0.1g透明质酸溶解至125mL去离子水中，并用1mol/L的盐酸溶液调节pH至4，得到透明质酸溶液。然后，在800rpm磁子搅拌下，将玉米醇溶蛋白乙醇水溶液缓慢细流式注入透明质酸水溶液中，反应1h。随后，使用旋转蒸发仪在45℃，65rpm，压力为-0.1MPa条件下对反应物混合溶液进行减压蒸馏，得到玉米醇溶蛋白-透明质酸复合纳米颗粒分散液，冷冻干燥后得到玉米醇溶蛋白和透明质酸复合纳米颗粒。制备得到玉米醇溶蛋白-透明质酸的复合纳米颗粒的粒径分布范围为250-400nm。根据其SEM和粒径分布结果可知该纳米颗粒存在粒径分布较宽、粘连度高等问题。
本发明在制备透明质酸/玉米醇溶蛋白基纳米药物载体过程中，通过对透明质酸PEG修饰改性，可有效阻止复合纳米载体的粘连，改善其在水溶液中的分散性。可经搅拌透析装置制备得到表面光滑、球形度高、粒径均一、分散性好的透明质酸/玉米醇溶蛋白基纳米药物载体。
实施例9.
将10mg改性透明质酸与50mg玉米醇溶蛋白溶解在70％乙醇溶液中，超声混合5min；将上述混合溶液置于透析袋中，放入装有300mL的DDW的溶出仪中搅拌透析1h，混合溶液在搅拌透析下反应至混合溶液变为乳白色，取出混合溶液在3000rpm离心10min一次、取上清液8000rpm离心20min一次，去除上清液加入超纯水超声分散继续8000rpm离心20min三次以得到所述的电荷反转透明质酸酶靶向玉米醇溶蛋白纳米颗粒。制备得到的透明质酸/玉米醇溶蛋白纳米药物载体颗粒的粒径为261.4nm，PDI为0.213，电位为-28.8mV。
实施例10.
将15mg改性透明质酸与75mg玉米醇溶蛋白溶解在70％乙醇溶液中，超声混合5min；将上述混合溶液置于透析袋中，放入装有300mL的DDW的溶出仪中搅拌透析1h，混合溶液在搅拌透析下反应至混合溶液变为乳白色，取出混合溶液在3000rpm离心10min一次、取上清液8000rpm离心20min一次，去除上清液加入超纯水超声分散继续8000rpm离心20min三次以得到所述的电荷反转透明质酸酶靶向玉米醇溶蛋白纳米颗粒。制备得到的透明质酸/玉米醇溶蛋白纳米药物载体颗粒的粒径为398.3nm，PDI为0.205，电位为-30.6mV。
实施例11.
将20mg改性透明质酸与100mg玉米醇溶蛋白溶解在70％乙醇溶液中，超声混合5min；将上述混合溶液置于透析袋中，放入装有300mL的DDW的溶出仪中搅拌透析1h，混合溶液在搅拌透析下反应至混合溶液变为乳白色，取出混合溶液在3000rpm离心10min一次、取上清液8000rpm离心20min一次，去除上清液加入超纯水超声分散继续8000rpm离心20min三次以得到所述的电荷反转透明质酸酶靶向玉米醇溶蛋白纳米颗粒。制备得到的透明质酸/玉米醇溶蛋白纳米药物载体颗粒的粒径为400.8nm，PDI为0.223，电位为-34.9mV。
实施例12.
将透明质酸/玉米醇溶蛋白基纳米药物载体和亲水性药物(盐酸阿霉素、5-氟尿嘧啶或吉西他滨)按照质量比为2：1加入溶剂水中，搅拌1小时，充分溶解；然后通过溶剂蒸发法去除水，冻干后即得到载药改性透明质酸基玉米醇溶蛋白纳米颗粒。
实施例13.
将透明质酸/玉米醇溶蛋白基纳米药物载体和亲水性药物(盐酸阿霉素、5-氟尿嘧啶或吉西他滨)按照质量比为15：1加入二甲基甲砜溶液中，搅拌10小时，充分溶解；然后通过离心洗涤法去除有机溶剂，冻干后即得到载药改性透明质酸基玉米醇溶蛋白纳米颗粒。
实施例14.
将透明质酸/玉米醇溶蛋白基纳米药物载体和亲水性药物(盐酸阿霉素、5-氟尿嘧啶或吉西他滨)按照质量比为25：1加入乙醇溶液中，搅拌24小时，充分溶解；然后通过离心洗涤法去除有机溶剂，冻干后即得到载药改性透明质酸基玉米醇溶蛋白纳米颗粒。
实施例15.
将透明质酸/玉米醇溶蛋白基纳米药物载体和疏水性药物(姜黄素、槲皮素、羟基喜树碱、紫杉醇或窃衣素)按照质量比为5：1加入溶剂水中，搅拌12小时，充分溶解；然后通过溶剂蒸发法去除水，冻干后即得到载药改性透明质酸基玉米醇溶蛋白纳米颗粒。
实施例16.
将透明质酸/玉米醇溶蛋白基纳米药物载体和疏水性药物(姜黄素、槲皮素、羟基喜树碱、紫杉醇或窃衣素)按照质量比为10：1加入甲醇溶液中，搅拌18小时，充分溶解；然后通过离心洗涤法去除有机溶剂，冻干后即得到载药改性透明质酸基玉米醇溶蛋白纳米颗粒。
实施例17.
将透明质酸/玉米醇溶蛋白基纳米药物载体和疏水性药物(姜黄素、槲皮素、羟基喜树碱、紫杉醇或窃衣素)按照质量比为20：1加入甲醇溶液中，搅拌20小时，充分溶解；然后通过离心洗涤法去除有机溶剂，冻干后即得到载药改性透明质酸基玉米醇溶蛋白纳米颗粒。
实施例18.一种包载阿霉素的透明质酸/玉米醇溶蛋白基纳米药物：
将20mL透明质酸/玉米醇溶蛋白纳米药物载体(1mg/mL)的水溶液与1mL盐酸阿霉素(5mg/mL)的丙酮溶液混合均匀，搅拌24h；取出混合溶液在3000rpm离心10min一次、取上清液8000rpm离心20min一次，去除上清液加入超纯水超声分散继续8000rpm离心20min三次以得到所述的包载阿霉素的改性透明质酸/玉米醇溶蛋白纳米药物。制备得到的包载阿霉素的改性透明质酸/玉米醇溶蛋白纳米药物的粒径为250.3nm，PDI为0.196，电位为-16.9mV，包封率为92.97％，载药量为18.17％，且具有较高的均一度、球形度和分散性。
如图附图4载药前后改性透明质酸/玉米醇溶蛋白的红外谱图和附图5载药前后改性透明质酸/玉米醇溶蛋白的UV光谱图可知，亲水性盐酸阿霉素被成功包载到改性透明质酸/玉米醇溶蛋白纳米颗粒中。
附图6为包载阿霉素的改性透明质酸/玉米醇溶蛋白纳米药物在不同pH下的表面电位结果，在pH＝5.0且存在透明质酸酶环境中，包载阿霉素的改性透明质酸/玉米醇溶蛋白纳米药物在45min就发生表面电荷“由负转正”反转现象，而在未加透明质酸酶的条件下，包载阿霉素的改性透明质酸/玉米醇溶蛋白纳米药物并未发生电荷反转，表明该纳米药物具有快速的透明质酸酶响应的电荷反转能力。
附图7为包载阿霉素的改性透明质酸/玉米醇溶蛋白纳米药物混悬液的在室温下保存两周的稳定性实验测试数据，其在两周内，粒径和电位均没有发生明显改变，说明其具有较好的稳定性。
药物在人神经胶质瘤细胞(U251，CD44受体过表达)的胞内摄取及靶向分子竞争实验结果表明，游离的盐酸阿霉素和包载阿霉素的改性透明质酸/玉米醇溶蛋白纳米药物均在4h后表现出明显的胞内摄取，根据细胞内的荧光强度可知，同等浓度、同等时间条件下，纳米药物被肿瘤细胞摄取更高。对U251细胞进行透明质酸预处理后，发现具有CD44靶向能力的包载阿霉素的改性透明质酸/玉米醇溶蛋白纳米药物摄取能力明显下降，而游离的盐酸阿霉素的摄取能力没有发生明显变化，这进一步说明了包载阿霉素的改性透明质酸/玉米醇溶蛋白纳米药物具有被CD44受体介导的肿瘤细胞靶向摄取能力。
利用激光共聚焦示踪游离的盐酸阿霉素和包载阿霉素的改性透明质酸/玉米醇溶蛋白纳米药物在U251 3D肿瘤球中的渗透深度，发现游离的盐酸阿霉素在瘤体达到40μm时，出现无法渗透至肿瘤球中心，而包载阿霉素的电荷反转型透明质酸/玉米醇溶蛋白纳米药物在70μm的瘤体深度时，仍表现出较强的渗透能力。表明本发明设计的电荷反转型纳米药物有利于通过转胞吞作用，实现在肿瘤组织的深度渗透。
实施例19.一种包载羟基喜树碱的透明质酸/玉米醇溶蛋白基纳米药物：
将3mg羟基喜树碱溶于含有5mg改性透明质酸和25mg玉米醇溶蛋白的70％乙醇溶液中，超声混合5min；将上述混合溶液置于透析袋中，放入装有300mL的DDW的溶出仪中搅拌透析1h，混合溶液在搅拌透析下反应至混合溶液变为乳白色，取出混合溶液在3000rpm离心10min一次、取上清液8000rpm离心20min一次，去除上清液加入超纯水超声分散继续8000rpm离心20min三次以得到所述的包载羟基喜树碱的改性透明质酸/玉米醇溶蛋白纳米药物。制备得到的包载羟基喜树碱的改性透明质酸/玉米醇溶蛋白纳米药物的粒径为224.7nm，PDI为0.121，电位为-17.2mV，包封率为90.78％，载药量为17.66％，在pH＝5.0存在透明质酸酶环境下，该纳米药物在45min可发生电荷反转。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.透明质酸/玉米醇溶蛋白基纳米药物载体的制备方法，其特征在于，具体是：
步骤(1)制备改性透明质酸；
将透明质酸溶于超纯水中形成透明质酸水溶液，每升超纯水溶解0.5～10g透明质酸；
然后加入浓度为20～40mM的NHS甲醇溶液，搅拌均匀后再加入溶有EDC和NHS的水溶液，水溶液中EDC和NHS的摩尔比为1：1，EDC的浓度和NHS的浓度均为5～15mM；加入的NHS甲醇溶液与透明质酸水溶液的体积比为0.1～0.5：1，加入的EDC和NHS的水溶液与透明质酸水溶液的体积比为0.25～1：1；
搅拌1～6小时后，加入mPEG-NH2固体粉末，mPEG-NH2与透明质酸的质量比为0.2～0.5：1；在常温反应18～36小时，反应结束后，透析纯化，冻干即得到聚乙二醇修饰的改性透明质酸；
所述的EDC为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺，所述的NHS为N-羟基硫代琥珀酰亚胺，所述的mPEG-NH2为甲氧基聚乙二醇胺；
步骤(2)将制得的改性透明质酸与玉米醇溶蛋白溶解醇溶液中，改性透明质酸与玉米醇溶蛋白的质量比为1：0.5～20；
超声混合后置于透析袋中，放入装有超纯水的溶出仪中搅拌透析；混合溶液在搅拌透析下反应至混合溶液变为乳白色，取出混合溶液经离心、洗涤得到目标产物透明质酸/玉米醇溶蛋白基纳米药物载体。
2.如权利要求1所述透明质酸/玉米醇溶蛋白基纳米药物载体的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的透明质酸的分子量为40～1000kDa；所述的mPEG-NH2的分子量为2000～5000Da。
3.如权利要求1所述透明质酸/玉米醇溶蛋白基纳米药物载体的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述的醇溶液为50％～70％的甲醇溶液、乙醇溶液或丙醇溶液；所述的玉米醇溶蛋白为分子量20～40KDa的α-玉米醇溶蛋白和/或β-玉米醇溶蛋白。
4.一种透明质酸/玉米醇溶蛋白基纳米药物载体，采用权利要求1-4任一所述方法制备得到。
5.采用权利要求1-4任一所述方法制备的透明质酸/玉米醇溶蛋白基纳米药物载体在包载药物上的应用。
6.如权利要求5所述的透明质酸/玉米醇溶蛋白基纳米药物载体在包载药物上的应用，其特征在于：所述的透明质酸/玉米醇溶蛋白基纳米药物载体的载药量为9～20％、包封效率为90～95％。
7.如权利要求5所述的透明质酸/玉米醇溶蛋白基纳米药物载体在包载药物上的应用，其特征在于：将透明质酸/玉米醇溶蛋白基纳米药物载体和亲水性药物或疏水性药物加入溶剂中，搅拌1～24小时，充分溶解；
所述的溶剂为水、二甲基甲砜、丙酮、乙醇或甲醇溶液；然后通过溶剂蒸发法去除水，或通过离心洗涤法去除有机溶剂，冻干后即得到载药改性透明质酸基玉米醇溶蛋白纳米颗粒。
8.如权利要求7所述的透明质酸/玉米醇溶蛋白基纳米药物载体在包载药物上的应用，其特征在于：所述的亲水性药物为盐酸阿霉素、5-氟尿嘧啶或吉西他滨；加入的透明质酸/玉米醇溶蛋白基纳米药物载体与亲水性药物的质量比为2～25：1。
9.如权利要求7所述的透明质酸/玉米醇溶蛋白基纳米药物载体在包载药物上的应用，其特征在于：所述的疏水性药物为姜黄素、槲皮素、羟基喜树碱、紫杉醇或窃衣素；加入的透明质酸/玉米醇溶蛋白基纳米药物载体与疏水性药物的质量比为5～20：1。
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