KR101828925B1 - 저밀도 나노섬유, 그 제조방법 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

전기방사 기술을 이용하여 조직공학에 적용할 수 있는 세포가 3차원으로 성장할 수 있는 친수성 나노섬유의 제조방법 및 이로부터 제조된 친수성 나노섬유를 제공한다.

Description

저밀도 나노섬유, 그 제조방법 및 그의 용도{Low density nanofiber, a process for the preparation thereof, and a use thereof}
조직공학에 응용될 수 이용될 수 있는 저밀도 나노섬유, 그 제조방법 및 그의 용도에 관한 것이다.
조직공학(tissue engineering)은 생명과학과 공학의 기본 개념과 기술을 통합 응용하여 생체조직의 구조와 기능 사이의 상관관계를 이해하고, 나아가서 생체조직의 대용품을 만들어 다시 체내에 이식함으로써 우리 몸의 기능을 유지, 향상 또는 복원하는 것을 목적으로 하는 응용학문이다.
대부분의 인체 내 세포는 부착되어 성장되는 부착세포로써 만일 부착할 곳이 없으면 세포는 성장되지 못하고 사멸하게 된다. 지지체는 다공성 구조 내에 파종 된 세포와 조직 주변으로부터 이동되는 세포의 성장에 중요한 역할을 수행하며, 세포의 부착, 분화, 성장 및 세포 이동에 적합한 환경을 제공해야 한다. 세포외 기질(extracellular matrix)은 주로 동물의 구조적 지지를 담당하는 조직이고, 동물의 결합 조직에 속하며, 세포 사이의 기질과 기저막을 구성된다. 세포 사이의 기질은 여러 세포들 사이의 공간을 채우는 기질이며, 기저막은 얇은 종이처럼 구성되어 있고, 그 위에 상피조직이 위치한다.
조직공학의 핵심 기술 중 하나는 세포가 부착하여 성장할 수 있도록 지지 역할을 하는 지주(support) 또는 지지체(scaffold)를 만들어내는 일이다. 2차원 막이나 캡슐과 달리 지지체는 3차원 형으로, 3차원 구조를 가진 모든 체내 세포가 부착되어 분화 및 증식을 할 수 있는 공간을 일컫는다. 현재, 천연재료, 합성 고분자, 생체 세라믹스 또는 고분자-세라믹 복합소재를 이용한 조직재생용 지지체에 대해 연구가 활발하게 이루어지고 있다. 특히, 수십 또는 수백 나노미터 정도의 직경을 갖을 수 있는 나노섬유는 세포외 기질의 구조적 특성에 적합할 수 있으며, 나노섬유를 얻을 수 있는 초연신법, 주형 합성법, 상분리법, 자기조립법 및 전기방사법 등이 연구되고 있다. 전기방사법(electrospinning method)은 전기방사시 사용되는 고분자 용액에 포함된 고분자의 농도, 사용되는 유기 용매의 종류, 전기장의 세기, 용액의 주입속도 등의 조건을 조절하여 제조되는 나노섬유의 두께를 수십 또는 수백 나노미터에서 크게는 수십 마이크로까지 다양하게 조절할 수 있고, 예를 들어 전기방사에 의해 80 내지 800nm 정도의 직경을 갖고 세포외 기질을 모방할 수 있는 나노섬유를 제공할 수 있다.
그러나 기존의 전기방사법에 적용되는 고분자는 전하를 띠지 않고 고분자 간 꼬임성(entanglement)이 있어야만 하는 등 전기방사에 사용되는 재료를 선택함에 제약이 있었다. 예를 들어, 전하를 띠는 고분자는 바닥면에 증착 시 섬유가 고르게 퍼지지 못하고 위로 솟는 모양이 형성되고, 고분자 간 꼬임성이 없는 물질은 단독 전기방사가 불가능하기 때문에 서포트 고분자를 같이 사용해야만 하는 제약이 있었다. 예를 들어 종래 기술에서는 알지네이트의 경우 고분자 간 꼬임성이 부족하여 단독전기방사가 어려운 물질로 기존에는 항상 섬유 형성이 잘 되는 폴리에틸렌옥사이드, 키토산 등과 섞어서 나노섬유를 준비하였다. 전기방사 후 순수한 알지네이트 나노섬유 시트를 얻기 위해서는 폴리에틸렌옥사이드를 녹이는 방법을 사용하였다. 하지만, 종래 기술로는 폴리에틸렌옥사이드와 알지네이트를 전기방사 전에 이미 섞어서 방사하기 때문에 섬유 제작 후 폴리에틸렌옥사이드를 완벽히 제거하는 점에 어려움이 있다.
또한, 기존의 세포외 기질 구조를 모방하는 나노섬유를 제작하는 재료로 알려진 고분자 중에는 주로 소수성 고분자가 많고, 친수성 고분자를 사용할 경우에는 나노섬유가 물에 용해되지 않도록 하기 위해서 고분자 가교 등의 추후 공정이 필요하므로, 세포 부착 및 증식이 가능한 조직공학용 지지체의 친수성 환경을 조성하는 데 제한이 있다. 특히 상기 가교 공정 중 나노섬유를 구성하는 고분자가 용해되거나, 섬유 구조가 온전히 유지되지 못하는 단점이 있다.
더욱이, 기존의 전기방사법으로 제작된 나노섬유는 상대적으로 고밀도로 얻어지므로 이를 사용한 조직공학용 지지체에서 세포가 촘촘하게 얽혀있는 나노섬유로 이루어진 막을 뚫고 비집고 들어가지 못하므로 섬유의 위쪽 면에 붙어있게 된 결과 세포외기질 구조를 모방한 나노섬유의 구조적 장점을 온전히 살리지 못하고, 조직공학에 적용함에 한계점이 있었다(cell migration on nanofiber mesh, Macromolecular bioscience, 2014 Volume 14, 271-279; two dimensional cell culture on nanofiber mesh, Acta Biomaterialia, 2007, Volume 3, 321-330).
전기방사 기술을 이용하여 조직공학에 적용할 수 있는 세포가 3차원으로 자랄 수 있고 세포의 이동성을 개선시킬 수 있는 저밀도의 친수성 나노섬유의 제조방법 및 이로부터 제조된 친수성 나노섬유를 제공한다. 상기 저밀도 친수성 나노섬유는 세포가 나노섬유 사이로 자유로이 이동이 가능한 3차원 세포성장 환경을 제공할 수 있다.
일 양상은 하기 단계를 포함하는 전기방사를 이용한 친수성 나노섬유의 제조방법에 관한 것이다.
(a) 전기장이 형성된 공간에 쉘(shell)부 소수성 고분자 용액을 방사함과 동시에 코어(core)부 친수성 고분자 용액을 방사하는 단계;
(b) 쉘부 용액의 소수성 고분자가 코어부 용액의 친수성 고분자를 감싸며 형성되는 코어-쉘 나노섬유를 얻는 단계;
(c) 코어-쉘 나노섬유를 형성하는 코어부 친수성 고분자를 가교시키는 단계; 및
(d) 코어-쉘 나노섬유를 형성하는 쉘부 소수성 고분자를 제거하는 단계.
상기 고분자 용액은 합성 고분자 또는 천연 고분자를 사용할 수 있으며, 친수성 고분자 또는 소수성 고분자를 사용할 수 있다.
상기 친수성 고분자는 알지네이트(alginate), 히알루론산(hyaluronic acid), 키토산(chitosan), 플루란(pullulan), 젤라틴(gelatin), 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol: PVA) 및 폴리(γ-글루탐산)(Poly(γ-glutamic Acid): γ-PGA)로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.
상기 소수성 고분자는 폴리(ε-카프로락톤)(poly(ε-caprolactone): PCL), 폴리락트산(poly(lactic acid): PLA), 폴리글리콜산(poly(glycolic acid): PGA) 및 폴리락트산-글리콜산 공중합체(polylactic-co-glycolic acid: PLGA)로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으며, 기타 지방족 폴리에스터(polyester)를 포함할 수 있고, 이에 한정되지 않는다.
상기 고분자 용액은 전기방사 공정(electrospinning process)에 의해 방사될 수 있다. 전기방사 공정은 전기적으로 하전된 고분자 용액 및 용융물의 젯(jet)을 통해 나노섬유를 제조할 수 있는 공정을 의미한다. 상기 전기방사를 이용한 제조방법은 양극과, 상기 양극에 이격되어 구비되는 음극 및 상기 양극과 음극에 결합되는 전원공급장치로 이루어진 전기장 형성부; 상기 전기장 형성부에 의하여 상기 양극과 음극 사이에 형성되는 전기장 형성공간 내에 고분자 용액을 방사시키는 아우터 노즐(outer nozzle); 및 상기 아우터 노즐의 수직 방향에 위치하여 고분자 용액을 방사시키는 이너 노즐(inner nozzle)을 포함하는 제조 장치를 사용할 수 있다.
구체적으로 상기 친수성 나노섬유 제조방법의 (a) 단계는 아우터 노즐(outer nozzle)을 통하여 쉘부 소수성 고분자 용액을 방사하고, 이너 노즐(inner nozzle)을 통하여 코어부 친수성 고분자 용액을 방사하는 것일 수 있다.
또한, 고분자 용액은 구체적으로 동축전기방사 공정(coaxial electrospinning process)으로 제조될 수 있다. 동축전기방사 공정은 두 가지 고분자 용액을 내부에 삽입된 이너 노즐과 아우터 노즐을 통해 독립적으로 토출시키면서 전기 방사를 수행하는 공정으로 두 고분자 용액이 서로 섞이지 않으면서 전기장에 의해 젯(jet)이 형성 및 연신되어 코어-쉘 형태의 나노섬유를 얻을 수 있다.
또한, 상기 동축전기방사 공정에 사용되는 두 개의 고분자 용액은 서로 섞이지 않도록 적절한 용매 및 고분자를 선택할 수 있다. 예를 들어, 아우터 노즐을 통해 소수성 고분자를 유기 용매에 용해한 소수성 고분자 용액을 토출시키고, 이너 노즐을 통해 친수성 고분자를 수성 용매에 용해한 친수성 고분자 용액을 토출시킬 수 있다. 상기 유기용매는 예를 들어, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol), 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane) 및 시클로헥산(cyclohexane)으로 이루어진 군중에서 선택된 어느 하나를 포함할 수 있다.
상기 수성용매는 예를 들어, 물, 인산완충식염수(phosphate buffer saline: PBS), 트리스완충식염수(tris buffered saline: TBS) 및 초산완충용액으로 이루어진 군중에서 선택된 어느 하나를 포함할 수 있다.
상기 쉘부 소수성 고분자 용액은 유기 용매를 기준으로 소수성 고분자 1-99% (w/v)를 포함하는 것일 수 있고, 상기 코어부 친수성 고분자 용액은 수성 용매를 기준으로 친수성 고분자 1-99% (w/v)를 포함하는 것일 수 있다.
구체적으로 상기 친수성 나노섬유 제조방법의 (a) 단계는 아우터 노즐(outer nozzle)을 통하여 쉘부 소수성 고분자 용액을 방사하고, 이너 노즐(inner nozzle)을 통하여 코어부 친수성 고분자 용액을 방사하는 것일 수 있다. 예를 들어 동축전기방사 공정에서 유기 용매에 용해한 소수성 고분자인 폴리카프로락톤을 아우터 노즐로 방사시키고, 수성 용매에 용해한 친수성 고분자인 알지네이트를 이너 노즐로 방사시킬 수 있다. 아우터 노즐에서 방사되는 소수성 고분자는 유기 용매에 용해시키고, 이너 노즐에서 방사되는 친수성 고분자는 수성 용매에 용해시킴에 따라, 계면에서 두 고분자 용액이 서로 섞이지 않으며, 친수성 고분자로부터 형성되는 코어부와, 소수성 고분자로부터 형성되는 쉘부를 포함하는 코어-쉘 구조가 형성될 수 있고, 코어-쉘 구조의 형성 이후 쉘부를 이루는 소수성 고분자 예를 들어 폴리카프로락톤의 제거가 더 용이하다.
상기 친수성 나노섬유 제조방법의 (b) 단계로부터 얻어지는 코어-쉘 나노섬유는 소수성 고분자를 포함하는 쉘부가 친수성 고분자를 포함하는 코어부를 감싸며 형성된 형태일 수 있다. 예를 들어 친수성 고분자를 포함하는 코어부; 및 상기 친수성 고분자 표면에 코팅된 소수성 고분자를 포함하는 쉘부를 포함하는 형태일 수 있다. 예를 들어, 전기 방사를 수행하는 동축전기방사 공정으로, 소수성 고분자인 폴리(ε-카프로락톤)을 쉘부(주형)로 하고, 코어부(내부)에 알지네이트를 담고 있는 형태의 나노섬유를 제작할 수 있다. 상기 폴리(ε-카프로락톤)은 전기방사성이 매우 우수한 물질이므로, 고분자간 꼬임성이 없는 알지네이트의 전기방사를 서포트하여 고른 두께의 나노섬유를 형성하도록 한다.
상기 (b) 단계 및 (c) 단계 사이에 얻어진 코어-쉘 나노섬유로부터 나노섬유 시트를 형성하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 나노섬유로부터 나노섬유 시트를 형성하는 방법은 나노섬유를 회전하는 드럼(회전봉) 위에 증착시켜서 시트를 얻는 방법일 수 있다. 예를 들어 친수성 고분자인 알지네이트가 음이온성 고분자이므로 평평한 바닥에 증착시킬 경우 음이온을 띠는 증착면과의 반발력 때문에 위로 솟는 산모양의 시트가 형성되어서 평평한 시트를 얻을 수 없는 문제점이 있을 수 있다. 따라서 회전하는 드럼을 사용하여 나노섬유를 증착시키게 되면 상대적으로 나노섬유의 표면에 쌓인 음이온이 고르게 퍼지면서 평평한 나노섬유 시트를 제작할 수 있다. 상기 회전하는 드럼은 축 방향으로 회전할 수 있으며, 3차원 세포배양 지지체의 종류에 따라 축의 회전 속도와 방향을 조절하여 나노섬유의 결을 선택할 수 있다. 예를 들어, 축의 회전 속도와 방향을 조절하여 나노섬유의 배열을 랜덤하게 꼬이게 하거나 한쪽 방향으로 배열된 나노섬유(aligned nanofiber) 가 되도록 할 수 있다.
상기 (c) 단계는 나노섬유에 2가 또는 3가 양이온 또는 이들의 염 또는 이들을 포함하는 용액을 처리하여 코어부 친수성 고분자를 가교시키는 것일 수 있다. 상기 2가 또는 3가 양이온 또는 이들의 염 또는 이들을 포함하는 용액은 친수성 고분자 예를 들어, 알지네이트의 가교화 또는 겔화를 유도하는 용액일 수 있으며, 상기 2가 또는 3가 양이온은 칼슘, 마그네슘, 알루미늄 중 선택되는 어느 하나일 수 있다. 상기 코어부 친수성 고분자를 가교시키는 용액은 예를 들어, 염화칼슘(calcium chloride; CaCl2) 또는 칼슘염화물(calcium chloride dihydrate; CaCl2·H2O)형태의 염화칼슘(CaCl2), 염화마그네슘(MgCl2), 인산칼슘(CaP) 및 탄산칼슘(CaCO2)으로 이루어지는 1종 이상의 가교제를 포함하는 용액일 수 있고, 용매로서 물 또는 에탄올을 사용하여 용해한 용액일 수 있다. 상기 용액은 예를 들어, 에탄올에 용해한 0.001 내지 5.0%, 0.002 내지 4.0%, 0.005 내지 3.0%, 0.01 내지 2.5% 및 0.02 내지 2.0%(w/v) 염화칼슘 용액일 수 있다. 이때 쉘부를 이루는 폴리(ε-카프로락톤)과 같은 소수성 고분자는 코어부를 이루는 알지네이트와 같은 친수성 고분자가 가교 과정에서 섬유 구조를 쉽게 잃어버리지 않도록 형태를 잡아줄 수 있다. 또는, 나노섬유로부터 나노섬유 시트를 얻은 후에 상기 나노섬유 시트를 가교시킬 수 있다. 이에 따라 10 내지 85%, 15 내지 80%, 및 20 내지 75%인 가교 수율을 갖는 나노섬유를 얻을 수 있다.
상기 (d) 단계는 나노섬유에 소수성 용매를 처리하여 쉘부 소수성 고분자를 제거하는 것일 수 있다. 상기 소수성 용매는 클로로포름(chloroform), 톨루엔(toluene), 헥산(hexane), 헵탄(heptane), 테트라데칸(tetradecane), 메틸클로라이드(methyl chloride), 디클로로메탄(dichloromethane), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 디에틸에터(diethyl ether), 부틸카르비톨아세테이트(Butyl carbitol acetate), 에틸카르비톨아세테이트(Ethyl carbitol acetate), 터피네올(α-Terpineol), 에탄올, 아세톤 및 메탄올로 부터 선택되는 어느 하나의 용매 또는 이의 혼합물일 수 있다. 예를 들어, 나노섬유에 클로로포름을 처리하여 쉘부 소수성 고분자를 제거할 수 있으며, 쉘부를 이루는 소수성 고분자 제거됨에 따라 알지네이트와 같은 친수성 고분자가 물에 잘 퍼져서 저밀도 나노섬유로 존재할 수 있다. 알지네이트 시트가 물에 분산됨에 따라 생긴 공간으로 세포가 침투하여 3차원 조직공학용 지지체로 응용할 수 있다.
다른 일 양상은 상기 제조방법으로 제조된 친수성 나노섬유에 관한 것이다.
상기 친수성 나노섬유는 전기방사 시 사용되는 고분자 용액에 포함된 고분자의 농도, 사용되는 유기 용매의 종류, 전기장의 세기, 용액의 주입속도 등의 조건을 조절하여 나노섬유의 두께를 수십 나노미터에서 수백 나노미터의 두께로 조절할 수 있다. 상기 친수성 나노섬유는 1 내지 99% (w/w) 범위의 가교수율을 가질 수 있고, 구체적으로 10 내지 85%, 15 내지 80%, 및 20 내지 75%인 가교 수율을 가질 수 있다.
또한, 상기 친수성 나노섬유는 10 내지 5000% 범위의 팽윤비를 가질 수 있고, 구체적으로 1000 내지 5000%, 1300 내지 4800%, 1500 내지 4500%의 팽윤비를 갖는 친수성 저밀도 나노섬유를 제공할 수 있다.
이와 같이 나노섬유의 가교수율을 조절하고, 높은 팽윤비를 가지는 친수성 저밀도 나노섬유를 이용하여 나노섬유 시트 내에서 세포의 이동성을 증가시킬 수 있으며 이를 세포가 자랄 수 있는 3차원 조직공학용 지지체로 응용할 수 있다. 또한, 상기 제조방법으로 친수성 나노섬유를 이용하여, 세포의 배양을 위한 기체-액체 계면 배양용 지지체, 인공피부 지지체 및 세포외 기질 모방체로 이용할 수 있으며, 상기 친수성 나노섬유를 포함하는 국소용 약물 전달체로 이용할 수 있다.
전기방사 기술을 이용하여 조직공학에 적용할 수 있는 친수성 나노섬유의 제조방법을 제공하며, 전기방사에 제약이 따르는 고분자 재료로부터도 용이하게 나노섬유를 제조할 수 있고, 이로부터 제조된 친수성 나노섬유는 세포가 자랄 수 있는 3차원 환경을 제공하며, 세포외기질을 모방하여 효과적으로 세포가 증식할 수 있다.
도 1은 동축전기방사를 이용하여 저밀도 나노섬유시트를 개발하는 방법 및 3세포의 3차원 성장을 위한 지지체로서의 응용을 나타낸다.
도 2는 저밀도 나노섬유 시트의 나노섬유 밀도 변화에 따른 섬유 모양 가시화(A), 가교 수율(B) 및 물에서의 팽윤비(C)를 나타낸다.
도 3은 시차주사열량계를 이용한 나노섬유에 대한 열적 특성 변화를 나타낸다.
도 4는 나노섬유 시트의 섬유 밀도에 따른 분해속도(A)와 칼슘 방출량(B)을 나타낸다.
도 5는 (A) AL NFhigh 및 (B) AL NF mid 의 나노섬유 시트의 섬유 밀도에 따른 세포의 시트 내 이동 정도의 관찰한 결과를 나타낸다. 1.5mm를 20㎛ 간격으로 스캐닝하였다.
도 6은 섬유아세포를 28일간 각각 (A) 2차원 배양 또는 (B) AL NFhigh 및 (C) AL NF mid 나노섬유 시트를 이용한 3차원 배양하여 공초점레이져현미경으로 관찰한 이미지를 나타낸다. 200㎛를 20㎛ 간격으로 스캐닝하였다.
도 7은 (A) AL NFhigh 및 (B) AL NF mid 의 나노섬유 시트와 섬유아세포를 28일간 배양 후 전자주사현미경으로 관찰한 이미지를 나타낸다.
도 8은 알지네이트를 코어부로 하고, PCL을 쉘부로 하도록 제조한 코어-쉘 구조의 나노섬유(A)에서 칼슘 가교 후(B), 쉘부를 이루는 PCL을 제거한 후의 나노섬유의 모양 변화를 확인한 전자투과현미경(TEM) 이미지(C) 및 (D)를 나타낸다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한, 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다.
실시예 1 내지 3: 나노섬유의 제작
고분자 용액을 제조하여 동축전기방사 방법으로 나노섬유를 제작하였으며, 이를 도 1에 나타내었다. 도 1과 같이, 본 발명의 일 양상에 따르며 폴리카프로락톤 및 알지네이트의 고분자 용액을 제조하고, 이를 동축전기방사 방법으로 토출시켜서 나노섬유 시트를 얻고, 알지네이트를 가교시키고, 폴리카프로락톤을 제거하여서, 저밀도의 알지네이트 나노섬유 시트를 얻을 수 있다. 구체적인 제작 공정은 다음과 같다.
(1) 고분자 용액의 제조 공정
폴리(ε-카프로락톤)(poly(ε-caprolactone): PCL) (MW43,000~50,000, 4g) 및 알지네이트(alginate) (15-25 cP, 1 % in H2O) 고분자 용액을 각각 준비하였다.
PCL을 클로로포름/메탄올(chloroform/methanol) 3:1 (v/v) 혼합액에 16% (w/v)의 비율로 녹여주었다. 알지네이트는 물/디메틸술폭시드(dimethylsulfoxide) 0.95:0.5 (v/v) 혼합액에 트리톤 X-100 (Triton X-100)과 알지네이트를 각각 0.5%(w/v)와 2%(w/v)의 비율로 녹였다.
(2) 나노섬유의 제조 공정
실린지 펌프(syringe pump)(제조사 KD scientific, 제조사 New Era Pump Systems Inc.), 전원장치(power supply) 및 동축 전기방사 노즐(제조사 NanoNC)로 구성되는 기구를 사용하여 나노섬유를 제조하였다.
동축 전기방사 노즐(제조사 NanoNC)로 20G의 아우터(outer) 노즐, 28G의 이너(inner) 노즐을 사용하여, PCL과 알지네이트를 각각 포함하는 고분자 용액을 각각 2ml/h와 0.5ml/h의 속도로 토출시켜서 나노섬유를 얻었다. 전압은 25kV를 사용하였다. 전기방사시 습도와 온도는 각각 30~35%, 22~25℃를 유지하였다.
상기 나노섬유는 노즐의 바늘 끝에 맺히는 고분자 용액을 고전압으로 터트리고 그에 따라 고분자가 섬유 모양으로 뿜어져 나오면서 공기 중에서 나선형을 그리며 건조되는 과정을 거쳐서 형성되었다.
노즐 끝에 가해지는 고전압에 의해 생성된 나노섬유는 알지네이트를 코어부로 하고, PCL을 쉘부로 하며, 알지네이트 섬유의 겉을 PCL이 감싸고 있는 형태이다.
(3) 나노섬유 시트의 제조 공정
전기 방사된 나노섬유를 200rpm의 속도로 회전하는 원통형 드럼 (규격: 직경 10cm x 너비 20cm)위에 1시간 동안 증착시켜서 나노섬유 시트를 획득하였다. 상기 나노섬유 시트는 알지네이트를 코어부로 하고, PCL을 쉘부로 하는 나노섬유를 포함한다.
제조한 나노섬유 시트의 무게를 잰 뒤, 고분자 용액의 초기농도, 토출 속도를 고려하여 하기식과 같이 시트 내에 존재하는 알지네이트의 무게를 산출하여서 이를 초기 알지네이트 무게(a))로 하였다.
Figure 112016098880251-pat00001
a: 알지네이트의 무게
b: 최종 나노섬유의 무게
c: 알지네이트 용액의 초기 농도
c':코어 유속
d: 폴리카프로락톤 용액의 초기 농도
d':코어부 유속
(4) 가교 공정
나노섬유의 코어부를 이루고 있는 알지네이트를 가교시키기 위하여 염화칼슘(calcium chloride) 용액에 나노섬유 시트를 3시간 동안 처리(담지)하였다. 폴리카프로락톤으로 이루어진 쉘부(바깥쪽 막)를 통과하여 알지네이트로 이루어진 코어부(안쪽 막)의 가교 효율을 높이기 위해 염화칼슘을 에탄올에 녹여 준비하였다.
구체적으로 30% 에탄올 혼합액에 염화칼슘을 각각 2, 0.02 및 0.002% (w/v)까지 녹여 준비하였다(표 1). 산출한 알지네이트의 무게(a) 대비 100배의 용량의 염화칼슘 용액에 나노섬유 시트를 3시간 동안 처리하여 알지네이트 나노섬유를 가교시켰다. 2, 0.02 및 0.002% (w/v) 염화칼슘 용액으로 가교시킨 알지네이트 나노섬유를 각각 알지네이트 나노섬유 AL NFhigh, AL NF mid 및 AL NFlow로 표시하였다.
[표 1]
Figure 112016098880251-pat00002
상기 표 1과 같이 염화칼슘 용액으로 가교시킨 알지네이트 나노섬유로부터 방출되는 카복실이온(COO-) 대 칼슘이온(Ca2+)의 비를 측정하였다.
또한, 도 2에서와 같이 가교 후 전자주사현미경으로 알지네이트 나노섬유를 관찰하고(A), 가교 수율(B)과 팽윤비(C)를 산출하였다(도 2).
(5) 세척 및 건조 공정
남아있는 염화칼슘을 제거하기 위해 30% 에탄올로 나노섬유 시트를 세척한 후 후 동결 건조하여 수분을 모두 제거하였다. 그 후 클로로포름 을 처리하였는데, 10회에 걸쳐 클로로포름을 계속 교체해주어 PCL을 완벽히 제거하여 순수한 알지네이트 나노섬유 시트 (alginate nanofiber: AL NF)만 획득하였다. 알지네이트 시트는 다시 메탄올로 3번 씻어주어 남 아있는 클로로포름을 모두 제거한 후 물에 분산시켜 동결건조 하였다. 최종 획득한 알지네이트 나노섬유 AL NFhigh, AL NF mid 및 AL NFlow를 각각 실시예 1 내지 3으로 하였다. 최종 획득한 알지네이트 나노섬유의 무게를 측정하였다(b).
PCL 제거 유무를 확인하기 위해서 시차주사열량분석을 수행하였다. 시차주사열량분석기를 이용하여 PCL의 녹는점 피크를 확인하였다(도 3). PCL을 제거한 후 섬유 가닥의 모양 변화를 전자투과현미경(TEM)으로 확인 하였다(도 8(C) 및 (D)).
또한, 도 4와 같이 저밀도 나노섬유 시트의 섬유 밀도에 따른 분해속도(A)와 칼슘 방출량(B)을 측정하였다.
시험예 1: 나노섬유의 전지주사 현미경 관찰, 가교수율 및 팽윤비 평가
실시예 1 내지 3에서 동축전기방사 방법으로 제조하여 최종 획 득한 알지네이트 나노섬유의 특성화를 평가하기 위해 전자주사 현미경으로 나노섬유를 관찰하고, 가교 수율과 팽윤비를 산출하였다.
(1) 전자주사 현미경 관찰
나노섬유의 표면을 전자주사현미경으로 관찰한 결과, 도 2(A)와 같이 쉘부(폴리(ε-카프로락톤), PCL) 및 코어부(알지네이트)로 이루어진 나노섬유(PCL/AL NF), 2% 염화칼슘 용액으로 가교시킨 알지네이트 나노섬유(AL NFhigh)(실시예 1), 0.02% 염화 칼슘 용액으로 가교시킨 알지네이트 나노섬유(AL NF mid)(실시예 2) 및 0.002% 염화칼슘 용액 으로 가교시킨 알지네이트 나노섬유(AL NFlow)(실시예 3) 순으로 나노섬유의 조밀한 정도가 감 소하여, 나노섬유의 밀도가 점차 감소함을 육안을 확인할 수 있었다.
(2) 가교 수율
알지네이트 나 노섬유의 가교 수율을 산출하기 위하여, 초기 알지네이트 무게(a) 및 최종 획득한 알지네이트 나노섬 유의 무게(b)를 측정하여 하기식과 같이 가교 수율을 산출하였고, 이를 도 2(B)에 나타내었다.
가교 수율 = (최종 획득한 알지네이트 나노섬유의 무게(b))/(초기 알지네이트 무게(a)) x 100
각각 2%, 0.02% 및 0.002% 염화칼슘 용액으로 가교시킨 알지네이트 나노섬유(AL NFhigh )(실시예 1), 알지네이트 나노섬유(AL NF mid)(실시예 2) 및 알지네이트 나노섬유(AL NF low)(실시예 3)의 가교 수율을 산출한 결과, 실시예 1(AL NFhigh)의 경우 75.5%, 실시 예 3(AL NFlow)의 경우 22.1%이었으며, 칼슘 용액의 농도가 감소함에 따라 알지네이트 나노섬 유의 가교 수율이 점차 감소함을 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터 칼슘 용액의 농도가 감소할수록 가교 수율이 감소하고, 더 저밀도의 나노섬유를 획득할 수 있음을 알 수 있다.
(3) 팽윤비(swelling ratio)
알지네이트 나노섬유의 팽윤비를 산출하기 위하여, 최종 획득한 알지네이트 나노섬유(동결건조하여 건조한 상태)를 6시간 동안 물에 담근 후 표면의 물기를 제거하고 무게를 측정하여 이를 물에 적신 알지네이트 나노 섬유의 무게(c)로 하였고, 하기식과 같이 팽윤비를 산출하였고, 이를 도 2(C)에 나타내었다.
팽윤비 ( swelling ratio) = (물에 적신 알지네이트 나노섬유의 무게(c))-(최종 획득한 알지네이트 나노섬유의 무게(b) ) /(최종 획득한 알지네이트 나노섬유의 무게(b))x100
상기 방법으로 산출한 팽윤비는 가교 정도가 높은 AL NFhigh에서 약 1322%이고, 가교 정도가 가장 낮은 AL NFlow의 경우 약 4760%이다.
실험예 1: 나노섬유의 PCL제거 확인
실시예 1 및 3에서 동축전기방사 방법으로 제조하여 최종 획득 한 알지네이트 나노섬유에 대해 PCL 제거 유무를 확인하기 위해서 시차주사열량분석을 수행하였다. 시차주사 열량분석기를 이용하여 0 ℃에서 100℃까지 10℃/분으로 온도를 올려주면서 폴리카프로락톤의 녹는점 피크를 확 인하였다(도 3). PCL을 제거한 후 섬유 가닥의 모양 변화를 전자투과현미경(TEM)으로 확인하였다(도 8).
시차주사열량분 석기를 이용하여 분석하였을 때 순수한 폴리카프로락톤은 녹는점 (Tm)의 피크가 약 58℃에서 관찰되었고, 순수한 알지네이트는 특이적인 피크를 관찰할 수 없었다(도 3). 또한, 칼슘이온으로 가교시키지 않은, 쉘부(폴리카프로락톤, PCL) 및 코어부(알지네이트)로 이루어진 나노섬유(PCL/AL NF)의 경우 약 60℃에서 녹는점 (Tm)의 피크를 관찰할 수 있지만, 2% 염화칼슘 용액으로 가교시킨 알지네이트 나노 섬유(AL NFhigh) 및 0.02% 염화칼슘 용액으로 가교시킨 알지네이트 나노섬유(AL NFlow)에서는 이와 같은 특이적인 녹는점 (Tm)의 피크를 관찰할 수 없었다(도 3). 따라서, AL NF high 및 AL NFlow에서는 PCL이 완전히 제거되었음을 정성적으로 확인할 수 있었 다.
또한, 전자투과현미경(TEM)(Carl Zeiss,LEO 912 AB)으로 확인한 결과, PCL이 존재하는 PCL/AL NF의 경우에는 코어-쉘 구조를 확인할 수 있었으나, PCL을 제거한 AL NFhigh 및 AL NFlow 나노섬유의 경우에는 코어-쉘 구조가 보이지 않았고, 알지네이트 나노섬유의 다공성 구조를 확인할 수 있었다(도 8).
실험예 2: 나노섬유의 섬유 밀도에 따른 분해속도 및 칼슘 방출량 평가
실시예 1 및 2에서 제조한 알지네이트 나노섬유 시트 AL NFhigh 및 AL NFmid을 준비하여 각각 5mg를 각각 세포 배양용 배지(DMEM) 500㎕와 인산완충식염수(phosphate buffered sa line) 5mL에 담근 후, 37℃, 200rpm 조건에서 진탕(shaking) 여부를 달리하여 14일 동안 시트의 무게변화를 측정하였다. 또한, 시트의 분해에 따라 방출되는 칼슘의 양을 칼슘 분석 키트(calcium assay kit)(10% FBS supplemented DMEM)를 이용하여 정량하였다. 이로부터 시트의 분해 속도 및 방출되는 칼슘의 양을 산출하였다.
그 결과, 정적인 환경에서는 섬유의 분해가 거의 일어나지 않았고, 그에 따라 방출되는 칼슘의 초기 대비 3% 미만으로 양도 미미하였다.
한편, 37℃에서 200rpm으로 진탕시킨 알지네이트 나노섬유(AL NFhigh 및 AL NFmid)의 14일 동안 무게 변화를 도 4(A)에 나타내고, 측정한 칼슘 방출량을 도 4(B)에 나타내었다. AL NFhigh와 AL NFmid 모두 14일 동안 큰 무게 변화를 보이지 않고, 칼슘 방출량도 소량이므로 세포 성장에 적합함을 알 수 있다.
실험예 3: 세포의 이동 정도 평가
실시예 1 및 3에서 제조한 알지네이트 나노섬유 시트 내 세포의 이동 정도를 평가하기 위하여 나노섬유 시트에 세포를 처리한 후 섬유아세포를 형광염색 후 공초점레이져 현미경으로 관찰하였다. 먼저 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane: PDMS)을 이용하여 슬라 이드 글라스(slide glass) 위에 직경 8mm 깊이 2mm의 틀을 만들고 그 내부를 3mg의 멸균시킨 알지네이트 나 노섬유 시트로 채워주었다. 나노섬유 시트에 세포의 부착을 돕기 위하여 시트에 피브로넥틴(fibronectin)을 50ug/ml의 농도로 3시간 동안 처리해 주었다. 알지네이트 나노섬유 시트 위에 2x105 개의 섬유아세포(NIH3T3, 1x106cells/ml, 10% FBS supplmented DMEM)를 처리 하였고, 24시간 후 세포의 F-액틴(F-actin)과 핵을 알렉사568-팔로이딘(Alexa568-phalloidin)과 4', 6-디아 미노-2-페닐인돌(4′,6-diamidino-2-phenylindol: DAPI)로 염색하였다.
처리한 염화칼슘 용액의 농도(AL NFhigh경우 2% 염화칼슘 용액 및 AL NFlow경우 0.02% 염화칼슘 용액)에 따라 알지네이트 나노섬유 시트의 섬유 구성 밀도를 달리하는 것이 세포의 시트 내 이동성 에 영향을 미치는지 알아보기 위하여 세포를 섬유의 윗부분에 처리한 후, 알지네이트 나노섬유 시트의 1.5mm의 깊이를 20㎛씩 스캐닝하여 나노섬유 시트내에서의 세포의 위치를 공초점레이져 현미경(Carl Zeiss, LSM700)으로 확인하였고, 세포의 스트레칭(stretching) 모양을 확인하였다.
알지네이트 나노섬유 시트의 1.5 mm의 두께를 아래에서 위로 스캐닝한 결과 AL NFhigh은 위에서부터 340에서 400㎛ 부근에 세포 가 위치하여 있는 것을 확인하였고(도 5(A)), AL NFmid는 560에서 800㎛부근까지 세포가 이동한 것을 확인하였다(도 5(B)).
그 결과 알지네이트 나노섬유의 밀도가 상대적으로 낮은 AL NFmid가 세포의 이동도가 더 우수함을 확인할 수 있었다. 또한, 기존의 기술로 제조된 나노섬유 시트보다 본 발명의 제조방법에 따라 제조한 나노섬유는 더 저밀도 나노섬유 시트를 제공할 수 있으므로, 세포의 3차원적 배양에 더 적합하다고 할 수 있다.
실험예 4: 세포의 증식 정도 평가
실시예 1 내지 3에서 제조한 알지네이트 나노섬유 시트 내 세포의 3차원 배양으로 인한 증식 정도를 평가하기 위하여 나노섬유 시트에 섬유아세포(NIH3T3)를 10% FBS supplmented DMEM 배지상에서 1x106cells/ml 농도로 하여 37℃, 5% CO2조건으로 유지한 항온기(incubator)에서 28일간 배양하였다.
또한, 비교를 위해 나노섬유 시트 대신에 커버 글라스(cover glass)를 사용하였고, 이를 피브로넥틴 용액(fibronectin solution) (5μg/ml)의 500㎕에 담지 하여 3시간동안 코팅시킨 후 섬유아세포(NIH3T3)를 상기 실시예 1내지 3의 나노섬유에서와 동일한 조건으로 처리하여 28일간 배양하였다.
나노섬유 시트와 섬유아세포를 28일간 배양한 후 실험예 3에서와 동일하게 세포를 형광염색 후 공초점레이져 현미경(FV1000 SPD, Olympus)으로 관찰하였다. 그 결과, 기존의 방법으로 제조한 비교예 1에서 세포가 2차원적으로 배양한 것과 달리(도 6(A)), 실시예 1 및 3에서 제조한 나노섬유시트에서는 섬유아세포가 3차원적으로 성장하였음을 확인할 수 있었다(도 6(B) 및 (C)).
또한, 상기 실시예 1 및 2의 나노섬유 시트와 섬유아세포를 28일간 배양한 후 전자주사현미경(Hitachi, S-4300)으로 배양후 남아 있는 섬유의 형상을 관찰하였다. 그 결과, 실시예 1 및 2에서도 모두 세포 표면에 섬유 가닥들이 보였으며, 전반적으로 섬유는 분해가 많이 일어나서 드물게 세포 위에 남아 있는 것이 관찰되었고, 일부는 세포가 알지네이트 섬유를 뚫고 이동하는 것과 같은 모습이 관찰되기도 하였다(도 7(A)(B)).
약어 설명
PCL/AL NF: 쉘부(폴리(ε-카프로락톤), PCL) 및 코어부(알지네이트)로 이루어진 나노섬유
AL NFhigh: 2% 염화칼슘 용액으로 가교시킨 알지네이트 나노섬유
AL NF mid : 0.02% 염화칼슘 용액으로 가교시킨 알지네이트 나노섬유
AL NFlow: 0.002% 염화칼 슘 용액으로 가교시킨 알지네이트 나노섬유
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 상기 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (11)

  1. 하기 단계를 포함하는 전기방사를 이용한 친수성 나노섬유의 제조방법:
    (a) 전기장이 형성된 공간에 쉘(shell)부 소수성 고분자 용액을 방사함과 동시에 코어(core)부 친수성 고분자 용액을 방사하는 단계;
    (b) 쉘부 용액의 소수성 고분자가 코어부 용액의 친수성 고분자를 감싸며 형성되는 코어-쉘 나노섬유를 얻는 단계;
    (c) 코어-쉘 나노섬유를 형성하는 코어부 친수성 고분자를 가교시키는 단계; 및
    (d) 코어-쉘 나노섬유를 형성하는 쉘부 소수성 고분자를 제거하는 단계.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 (a) 단계는 아우터 노즐(outer nozzle)을 통하여 쉘부 소수성 고분자 용액을 방사하고, 이너 노즐(inner nozzle)을 통하여 코어부 친수성 고분자 용액을 방사하는 것인, 친수성 나노섬유의 제조방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 유기 용매를 기준으로 소수성 고분자 1 내지 99% (w/v)를 포함하는 것을 쉘부 소수성 고분자 용액으로 하고, 수성 용매를 기준으로 친수성 고분자 1 내지 99% (w/v)를 포함하는 것을 코어부 친수성 고분자 용액으로 하는, 친수성 나노섬유의 제조방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 (b) 단계 및 (c) 단계 사이에 얻어진 코어-쉘 나노섬유로부터 나노섬유 시트를 형성하는 단계를 더 포함하는, 친수성 나노섬유의 제조방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 (c) 단계는 2가 또는 3가 양이온 또는 이들의 염 또는 이들을 포함하는 용액을 처리하여 코어부 친수성 고분자를 가교시키는 것인, 친수성 나노섬유의 제조방법.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 용액은 에탄올에 용해한 0.002 내지 2.0%(w/v) 염화칼슘 용액인, 친수성 나노섬유의 제조방법.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 (d) 단계는 소수성 용매를 처리하여 쉘부 소수성 고분자를 제거하는 것인, 친수성 나노섬유의 제조방법.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 친수성 고분자는 알지네이트(alginate), 히알루론산(hyaluronic acid), 키토산(c hitosan), 플루란(pullulan), 젤라틴(gelatin), 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol: PVA) 및 폴리(γ-글루탐 산)(Poly(γ-glutamic Acid): γ-PGA)로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인, 친수성 나노섬유의 제조방법.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 소수성 고분 자는 폴리(ε-카프로락톤)(poly(ε-caprolactone): PCL), 폴리락트산(poly(lactic acid): PLA), 폴리글리콜 산(poly(glycolic acid): PGA) 및 폴리락트산-글리콜산 공중합체(polylactic-co-glycolic acid: PLGA)로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인, 친수성 나노섬유의 제조방법.
  10. 하기 식(1)에 따른 10 내지 5000% (w/w) 범위의 팽윤비를 나타내고, 하기 식(2)에 따른 1 내지 99% (w/w) 범위의 가교수율을 나타내는, 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항의 방법으로 제조된, 친수성 나노섬유.
    식(1): 팽윤비 (swell ing ratio) = (물에 적신 알지네이트 나노섬유의 무게(c))-(최종 획득한 알지네이트 나노섬유의 무게(b) ) /(최종 획득한 알지네이트 나노섬유의 무게(b))x100
    식(2): 가교 수율 = (최종 획득한 알지네이트 나노섬유의 무게(b))/(초기 알지네이트 무게(a)) x 100
  11. 청구항 10의 친수성 나노섬유를 포함하는 세포배양용 지지체.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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