JP5837930B2 - 創傷の治癒を加速する医薬送達装置及び増殖因子製剤 - Google Patents

創傷の治癒を加速する医薬送達装置及び増殖因子製剤 Download PDF

Info

Publication number
JP5837930B2
JP5837930B2 JP2013521163A JP2013521163A JP5837930B2 JP 5837930 B2 JP5837930 B2 JP 5837930B2 JP 2013521163 A JP2013521163 A JP 2013521163A JP 2013521163 A JP2013521163 A JP 2013521163A JP 5837930 B2 JP5837930 B2 JP 5837930B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
gdf
rhgdf
tissue
medical device
dextran sulfate
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
JP2013521163A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2013538193A (ja
Inventor
フランク・プローガー
Original Assignee
ビオファーム・ゲゼルシャフト・ツァ・ビオテヒノロジッシェン・エントヴィックルング・フォン・ファルマカ・エムベーハー
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ビオファーム・ゲゼルシャフト・ツァ・ビオテヒノロジッシェン・エントヴィックルング・フォン・ファルマカ・エムベーハー filed Critical ビオファーム・ゲゼルシャフト・ツァ・ビオテヒノロジッシェン・エントヴィックルング・フォン・ファルマカ・エムベーハー
Publication of JP2013538193A publication Critical patent/JP2013538193A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP5837930B2 publication Critical patent/JP5837930B2/ja
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L15/00—Chemical aspects of, or use of materials for, bandages, dressings or absorbent pads
    • A61L15/16—Bandages, dressings or absorbent pads for physiological fluids such as urine or blood, e.g. sanitary towels, tampons
    • A61L15/42—Use of materials characterised by their function or physical properties
    • A61L15/44—Medicaments
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1875—Bone morphogenic factor; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone-inducing factor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/20—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing sulfur, e.g. dimethyl sulfoxide [DMSO], docusate, sodium lauryl sulfate or aminosulfonic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/08—Solutions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L26/00—Chemical aspects of, or use of materials for, wound dressings or bandages in liquid, gel or powder form
    • A61L26/0061—Use of materials characterised by their function or physical properties
    • A61L26/0066—Medicaments; Biocides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/54—Biologically active materials, e.g. therapeutic substances
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L31/00—Materials for other surgical articles, e.g. stents, stent-grafts, shunts, surgical drapes, guide wires, materials for adhesion prevention, occluding devices, surgical gloves, tissue fixation devices
    • A61L31/14—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L31/16—Biologically active materials, e.g. therapeutic substances
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/20—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices containing or releasing organic materials
    • A61L2300/252—Polypeptides, proteins, e.g. glycoproteins, lipoproteins, cytokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/40—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a specific therapeutic activity or mode of action
    • A61L2300/412—Tissue-regenerating or healing or proliferative agents
    • A61L2300/414—Growth factors

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Surgery (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)

Description

本発明は、新規薬剤送達装置、並びに増殖及び分化因子タンパク質を含有する医薬組成物を対象とする。前記装置及び組成物は、特に、哺乳類の組織の組織再生及び創傷治癒の過程を加速するために設計されている。本発明は、とりわけ、糖尿病性創傷及び潰瘍の支持療法に有用である。
GDF-5(Hoetten et al. 1994, Biochem. Biophys Res. Commun. 204, 646〜652頁)は、幾つかの組織において細胞増殖、分化及び/又は組織形成を促進することが示されているモルフォゲンである。タンパク質も、形態形成タンパク質MP52、骨形態形成タンパク質14(bone morphogenetic protein-14:BMP-14)又は軟骨由来形態形成タンパク質1(cartilage-derived morphogenetic protein-1:CDMP-1)として知られている。GDF-5は、GDF-6及びGDF-7と密接に関連している。これらの三つのタンパク質は、TGF-βスーパーファミリーの特有のサブグループを形成し、したがって、同等の生物学的特性及び著しく高いアミノ酸配列同一性の程度を示す(すなわち、Wolfman et al. 1997, J. Clin. Invest. 100, 321〜330頁を参照すること)。全てのファミリーメンバーは、最初に大型の前駆体タンパク質として合成され、続いてC末端からおよそ110〜140アミノ酸の塩基性残基の集団においてタンパク質分解性切断を受け、それでN末端プロドメインからC末端成熟タンパク質部分を放出する。成熟ポリペプチドは、構造的に関連しており、これらのタンパク質の特徴的な三次元「シスチンノット」モチーフに関与する六つ又は七つのカノニカルシステイン残基を含む保存生体活性ドメインを含有する。天然GDF-5関連タンパク質は、ホモ二量体分子であり、I型及びII型のセリン/トレオニンレセプターキナーゼから構成される特定のレセプター複合体との相互作用を介して、主に作用する。続いてレセプターキナーゼはSmadタンパク質を活性化し、次にシグナルを核に伝播して、標的遺伝子発現を調節する。
GDF-5/-6/-7サブグループのメンバーは、骨及び軟骨の第一の重要なインデューサ及びレギュレーターであることが繰り返し実証されている(Cheng et al. 2003, J. Bone & Joint Surg. 85A, 1544〜1552頁; Settle et al. 2003, Developm. Biol. 254, 116〜130頁)。GDF-5は、神経系の天然増殖因子である(例えば、WO 97/03188; Krieglstein et al., (1995) J. Neurosci Res. 42, 724〜732頁; Sullivan et al., (1997) Neurosci Lett 233, 73〜76頁; Sullivan et al., (1998), Eur. J. Neurosci 10, 3681〜3688頁を参照すること)。更に、例えば、皮膚関連組織増殖の調整(WO 02/076494; Battaglia et al. 2002, Trans. Orthop. Res. Soc. 27, 584頁)及び血管新生過程の誘導(Yamashita et al. 1997, Exp. Cell Res. 235, 218〜26頁)に有用である。
これらの独特の組織誘導活性が発見された後、GDF-5などの増殖因子タンパク質は、治療研究及び再生手術に成功裏に適用されており、これらは単独で又は特定のマトリックス材料と組み合わされて、様々な損傷組織の天然治癒過程を促進及び援助する。生物学的に活性な成熟GDF-5関連タンパク質を含む幾つかの医薬組成物が開発されてきたが(例えば、WO 96/33215を参照すること)、それにもかかわらず製剤及びGDF-5の取扱いは依然として問題があり、それは成熟タンパク質が幾つかの固体物質と相関する傾向があり、生理学的条件下で極めて不十分な可溶性を示すからである。成熟GDF-5/MP52のpH依存性の可溶性プロフィール(すなわち、EP 1 462 126に示されている)は、タンパク質が4.25を越えるpHで水溶液に沈殿し始めること及びpH5〜pH9ではほぼ不溶性になることを明らかにしている。
これらの事実により、安定した液体又はゲル様GDF-5組成物を処方する以前の試みは、重大な問題に直面している。特別の適用において限定された成功しか達成されなかった。骨再生用の材料を記載するEP 1 462 126は、低イオン強度の溶媒を使用してタンパク質の可溶性プロフィールを僅かに改良することに成功した。WO 2008/049588は、in vivoで神経経路を介して相当量のGDF-5関連タンパク質を送達することができる脂質ナノスフィア製剤を記載する。しかし、GDF-5関連タンパク質と特定の材料との組み合わせは、課題を残している。いずれにしても、生理学的条件下で、そのようなタンパク質の効率的な投与のための、新規方法及び医薬組成物を開発する大きな必要性が依然として存在する。
創傷を治癒する目的では、様々な形態、大きさ及び材料のローション様と固体のサージカルドレッシングの両方が開発されており、これらは半滅菌条件下で創傷閉鎖を確実するように主に設計されている。これらのドレッシングのうちの幾つかは、例えばコラーゲンなどの有機材料から作製され、一方、他の装置は、例えば非晶質熱可塑性ポリマーなどの合成成分から構成される。最も進化した世代の一部の創傷ドレッシングは、追加的な薬剤送達機能を特徴とし、これらは抗生物質又はサイトカイン様上皮増殖因子(EGF)又は血小板由来増殖因子(PDGF/ベカプレルミン)などの生体活性物質を投与することができる。例えば、遺伝子操作されたPDGFは、皮下組織又はそれを越えて広がる糖尿病性足部潰瘍の治療に認可された局所用(0.01%)創傷治癒ゲル剤として、商品名Regranex(登録商標)で市販されている。
WO 97/03188 WO 02/076494 WO 96/33215 EP 1 462 126 WO 2008/049588 WO 95/04819 WO 97/06254 WO 97/04095 WO 96/14335 US 5,801,014 WO 01/11041 WO 99/61611 US 5,658,882 WO 96/143335 EP 0 831 884 WO 95/16035 WO 93/16099 WO 99/15191 米国特許第5,658,882号 米国特許第5,658,882号
Hoetten et al. 1994, Biochem. Biophys Res. Commun. 204, 646〜652頁 Wolfman et al. 1997, J. Clin. Invest. 100, 321〜330頁 Cheng et al. 2003, J. Bone & Joint Surg. 85A, 1544〜1552頁 Settle et al. 2003, Developm. Biol. 254, 116〜130頁 Krieglstein et al., (1995) J. Neurosci Res. 42, 724〜732頁 Sullivan et al., (1997) Neurosci Lett 233, 73〜76頁 Sullivan et al., (1998), Eur. J. Neurosci 10, 3681〜3688頁 Battaglia et al. 2002, Trans. Orthop. Res. Soc. 27, 584頁 Yamashita et al. 1997, Exp. Cell Res. 235, 218〜26頁 Schreuder et al. (2005), Biochem Biophys Res Commun. 329, 1076〜86頁 Thompson, J. D., Gibson, T.J., Plewniak.F., Jeanmougin.F. and Higgins.D.G. (1997): The ClustalX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research 24:4876〜4882頁 Thompson, J.D., Higgins, D.G. and Gibson, T.J. (1994): CLUSTALW: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research 22:4673〜4680頁 Takuwa et al. (1989), Am. J. Physiol. 257, E797〜E803頁 Sanyal et al. 2000, Mol Biotechnol. 16, 203〜210頁 Hoetten et al. 1996, Growth Factors 13, 65〜74頁 Storm et al. 1994, Nature 368, 639〜643頁 Chang et al. 1994, J. Biol. Chem. 269, 28227〜28234頁 Storm & Kingsley 1996, Development 122, 3969〜397頁 Aspenberg & Forslund 1999, Acta Orthop Scand 70, 51〜54頁 Walsh et al. 2004, Spine 29, 156〜63頁 Spiro et al. 2000, Biochem Soc Trans. 28, 362〜368頁 Morotome et al. 1998, Biochem Biophys Res Comm 244, 85〜90頁 You et al. (1999), Invest Opthalmol V is Sci 40, 296〜311頁 Yamaguchi et al. 1991, Calcif. Tissue Int. 49, 221〜225頁 Nakamura et al. 2003, J. Periodontal Res. 38,597〜605頁 Farkas et al. 1997, Neurosci. Lett. 236, 120〜122頁 Barrat et al. 2003: Colloidal drug carriers: achievements and perspectives. Cell. mol. life sci. 60, 21〜37頁 Fitzpatrick and Rosen, J. Cosmet. Laser Ther, 5: 25〜34頁(2003) Rokhsar, C.K. et al., Dermatol. Surg. 31: 1166〜1178頁(2005) Remington's Pharmaceutical Sciences (luth ed.; Mack Publishing Company, Eaton, Pennsylvania, 1990) Wang et al. (1980), J. Parent. Drug Assn. 34 (6): 452〜462頁(1980) Wang et al. (1988), J. Parent. Sci. and Tech. 42: 4〜26頁 Lachman et al. (1968), Drug and Cosmetic Industry 102(1): 36〜38, 40 and 146〜148頁 Akers (1988)J. Parent. Sci. and Tech. 36 (5): 222〜228頁
創傷治癒及び他の組織再生の目的に特に望ましいものは、生体活性物質が制御された方法で人体に送達され、このようにして体の高い要求を正確に満たす新たな製剤、サージカルドレッシング及び薬剤送達装置である。したがって、本明細書以降に記載される合成創傷治癒材料及び装置と組み合わせて適用することができる安定した非毒性増殖因子組成物を提供することにより、GDF-5及び関連タンパク質の治療有用性を改善することが本発明の目的である。
定義:
誤解及び不明確さを回避するため、本明細書において頻繁に使用される幾つかの用語を以下のように定義及び例示する。
用語「シスチンノットドメイン」は、本明細書で使用されるとき、TGF-ベータスーパーファミリータンパク質(すなわち、ヒトGDF-5など)の成熟部分に存在し、シスチンノットとして知られている三次元タンパク質構造を形成する、既知の保存された高システインアミノ酸領域を意味する。このドメインにおいて、システイン残基のそれぞれの位置が互いに重要であり、生物学的活性を失わないために、極めて僅かに変動することしか許されない。シスチンノットドメイン単独で、タンパク質の生物学的機能にとって十分であることが実証されている(Schreuder et al. (2005), Biochem Biophys Res Commun. 329, 1076〜86頁)。シスチンノットドメインのコンセンサス配列は、当業界において良く知られている。本明細書において定義された定義によると、タンパク質のシスチンノットドメインは、それぞれのタンパク質のシスチンノットに参加している最初のシステイン残基で始まり、それぞれのタンパク質のシスチンノットに参加している最後のシステインの後の残基で終わる。例えば、ヒトGDF-5前駆体タンパク質(配列番号2)のシスチンノットドメインは、アミノ酸400〜501からなる(図1も参照すること)。
用語「GDF-5関連タンパク質」は、本明細書で使用されるとき、ヒトGDF-5の102アミノ酸のシスチンノットドメイン(配列番号2のアミノ酸400〜501)に少なくとも60%のアミノ酸同一性を有するシスチンノットドメインを含む、天然に生じた又は人工的に作り出された任意のタンパク質を意味する。この用語は、脊椎動物又は哺乳類の種からのGDF-5、GDF-6及びGDF-7タンパク質、並びに、ヒトGDF-5のシスチンノットドメインと上記に記述された率の同一性を示す限りにおいて、これらの組み換えバリアントに由来するタンパク質の群に属するタンパク質を含む。限界値60%は、他のGDF及びBMPなどの更なるタンパク質から、GDF-5/-6/-7群のタンパク質、並びにそのバリアントのメンバーを分けるのに十分に適している。ヒトGDF-5、ヒトGDF-6及びヒトGDF-7の102aaシスチンノットドメインの比較は(図2を参照すること)、これらのタンパク質の間に高度なアミノ酸同一性があることを明らかにしている。ヒトGDF-6は、ヒトGDF-5のシスチンノットドメインと87(85%)の同一残基を共有し、GDF-7は、83(81%)の同一残基を共有する。今まで同定されている他の脊椎動物及び哺乳類の種からのGDF-5/-6/-7分子のそれぞれのドメインも、ヒトGDF-5と比較したとき、少なくとも75%(79%〜99%)の非常に高い率の同一性を示す。対照的に、GDF-5/-6/-7サブグループに属さないGDF及びBMPは、60%未満のかなり低い同一性の値を示す(図3を参照すること)。
関連するアミノ酸配列における対応するアミノ酸の位置の決定、並びにそれらの間の同一性の率の計算は、既知の整列アルゴリズムの助けを借り、任意選択により、これらのアルゴリズムを使用したコンピュータープログラムの助けを借りて容易に実施することができる。例えば、本出願におけるアミノ酸同一性(すなわち、図2)は、規定値パラメーターを用いるフリーウエアプログラムのClustalX(バージョン1.81)により配列を整列し、続いて同一残基を手作業により数えることによって計算される。一対毎の整列(低速だが正確)の初期設定は、ギャップ開始パラメーター:10.00;ギャップ伸張パラメーター:0.10;タンパク質量マトリックス:Gonnet 250である。ClustalXプログラムは、Thompson, J. D., Gibson, T.J., Plewniak.F., Jeanmougin.F. and Higgins.D.G. (1997): The ClustalX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research 24:4876〜4882頁に詳細に記載されている。ClustalXは、ClustalW多重配列整列プログラムのウインドウズインターフェースであり、すなわち様々な供給源から、すなわちftp-igbmc.u-strasbg.fr、ftp.embl-heidelberg.de、ftp.ebi.ac.ukからの匿名のftpによって又は以下のホームページ:http://www-igbmc.u-strasbg.fr/Biolnfo/からのダウンロードを介して入手可能である。ClustalWプログラム及びアルゴリズムも、Thompson, J.D., Higgins, D.G. and Gibson, T.J. (1994): CLUSTALW: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research 22:4673〜4680頁において詳細に記載されている。
用語「バリアント」は、本明細書で使用されるとき、以下のポリペプチドのいずれかを意味する:
a)好ましくは、少なくともシスチンノットドメインを含む、生物学的に活性なタンパク質フラグメント;
b)アミノ酸置換を含有するタンパク質又はコンストラクトの元の配列に対して追加の配列(付加された生物学的機能を有する又は有さない)を過剰に含有する、生物学的に活性なタンパク質コンストラクト;
c)a)とb)の任意の組み合わせ。
用語「医療装置」は、任意の材料(単一又は複合材)、器具若しくは機器又は単独若しくは組み合わせで使用されるかにかかわらず、疾患若しくは傷害の治療又は緩和を目的として使用されることが、製造者によって意図されるものを意味する。これには、薬理学的、免疫学的又は代謝的な手段により人体において又は人体に対して意図される主な作用を達成しないが、そのような手段によりその機能を援助することができる装置が含まれる。
用語「非晶質熱可塑性ポリマー」は、順不同の分子構造を有し、耐荷重形状に形成されうる合成ポリマー材料を意味する。より良好に理解するために、高温材料を分子構造の違いに基づいて2つの主なカテゴリー-半結晶質及び非晶質に分ける。通常の小型分子からなる固体有機化合物は、結晶質になる傾向があり、すなわち、分子は規則的な三次元配列となる。ポリマーは違っており、非晶質になる(分子規模で位置秩序を完全に欠いており、それによって異なる電荷を有する局所領域を作り出す)又は半結晶質になる(同一試料において異なる率の結晶質領域を含有する)ことができる。非晶質熱可塑性ポリマーは特徴的な特質を有し、これらは、明確な融点を有さず、加熱されると粘度を変え、流れが等方性である。その結果、非晶質材料は、典型的には半結晶質材料よりも低い成形収縮及び少ないそりの傾向を示す。用語「非晶質熱可塑性ポリマー」は、ポリスルホン(PSU)、ポリエーテルスルホン(PES)、ポリフェニルスルホン(PPSU)、ポリスチレン、ポリエーテルイミド、ポリアリレート、ポリ塩化ビニル、ポリアミド、(非晶質)、ポリメチルメタクリレート、ポリアミドイミド及びアクリロニトリルブタジエンスチレンなどのポリマー材料を含む。
用語「ポリスルホン系プラスチック」は、定義される特徴がスルホン基であるサブユニットアリール-SO2-アリールを含有する熱可塑性ポリマーの群を表す。これらのポリマーの反復単位を図5に示す。この材料は、再現可能性を有する及び40ナノメートルまで制御可能な孔径を有する膜の容易な製造を可能にする。ポリスルホン系プラスチックを、ガラス繊維で補強することができ、コポリマーとしても使用される。「ポリスルホン系プラスチック」の群は、化学的に関連する物質であるポリスルホン(polysulfone)(またpolysulphoneと綴られ、PSUと略される)、ポリエーテルスルホン(polyethersulfone)(またpolyethersulphoneと綴られ、PESと略される)及びポリフェニルスルホン(polyphenylsulfone)(またpolyphenylsulphoneと綴られ、PPSUと略される)を含有する。
用語「ポリスルホン」(PSU)は、図6に示される反復単位を有する熱可塑性ポリマー(CAS確認番号25154-01-2)を表す。
用語「ポリエーテルスルホン」(PES)は、化学式:ポリ(オキシ-1,4-フェニルスルホニル-1,4-フェニル)を有する熱可塑性ポリマー(CAS確認番号113569-14-5)を表す。この物質は、ポリスルホン及びポリフェニルスルホンと密接に関連する。PESの反復単位は図7に示されている。
用語「ポリフェニルスルホン」(PPSU)は、図8に示される反復単位を有する熱可塑性ポリマー(CAS確認番号25608-64-4)を表す。この物質は、ポリスルホン及びポリエーテルスルホンと密接に関連する。
用語「ポリエーテルイミド」(PEI)は、図9に示される反復単位を有する熱可塑性ポリマー(CAS確認番号61128-46-9)を表す。PEIの反復単位の分子式はC37H24O6N2であり、分子量は592g/molである。
用語「カルボキシメチルデキストラン」(CMD)は、安定したO-エーテル結合により結合している様々な量のカルボキシメチル基を有するデキストランのポリアニオン性誘導体を表す。様々な分子量のCMDは(CMDの一般的な分子量が、例えば10000、40000、1000000である)、市販されている。この定義及び本明細書の以下に開示されている発明によると、CMDを、この分子がGDF-5関連タンパク質と本出願に記載されている固体材料との間、例えば非晶質熱可塑性ポリマー、ポリビニルピロリドン又は例えば織布若しくは不織布コラーゲン、ゼラチン、ポリラクチド(PLA)、ポリグリコリド(PGA)、ポリカプロラクトン(PCL)ポリラクチド、デキストラン、ヒアルロン酸及びキトサン又はこれらの組み合わせなどの生分解性材料との間の分子粘着性を防止することが依然としてできる限り、更に化学的に修飾する(例えば、追加の結合基を担持させる)こともできる。
用語「生物学的活性」は、例えば実施例8又はTakuwa et al. (1989), Am. J. Physiol. 257, E797〜E803頁に記載されている一般的なin vitroアルカリホスファターゼアッセイ(ALP)により測定して、例えばGDF-5関連タンパク質を含む化合物の活性を表す。そのようなASPアッセイに使用することができる適切な細胞株は、例えばATDC-5又はMCHT 1/26細胞である。
簡潔には、本発明は、組織再生が望ましい部位への生体活性GDF-5関連タンパク質の医療装置仲介送達における有意な改善を記載する。より正確には、本発明は、これらの増殖因子タンパク質を、特定の合成及び天然材料から作製した医療装置と組み合わせて使用及び送達することができる。
GDF-5及び密接に関連したタンパク質GDF-6及びGDF-7は、非共通の表面電荷分布パターンを特徴とする。大部分の他の疎水性タンパク質と対照的に、GDF-5の表面は、アラニン、バリン及びロイシンなどの疎水性アミノ酸により優勢的に構成されてはなく、図4に示されている非共通の電荷分布効果を特徴とする。広範囲のpH範囲にわたって、GDF-5の表面は、反対の電荷を有する様々な長さの大きな領域を含む。これらのタンパク質部分は互いに引き寄せ合い、それによって、増殖因子分子の凝集及び沈殿を開始すると思われる。GDF-5関連タンパク質の非共通の電荷分布も、対称的な電荷パターン又は他の非共通の物質特徴を有する幾つかの固体材料への接着を増大させる。
GDF-5関連タンパク質と固体材料との接着は、例えば、ポリビニルピロリドン、並びに例えば織布若しくは不織布コラーゲン、ゼラチン、ポリラクチド(PLA)、ポリグリコリド(PGA)、ポリカプロラクトン(PCL)ポリラクチド、デキストラン、ヒアルロン酸及びキトサン又はこれらの組み合わせなどの特定の生分解性材料の場合において注目される。しかし、前記の不要な接着効果は、特定の非晶質熱可塑性ポリマーがGDF-5との組み合わせで使用される場合、例えばこれらが医薬送達装置の一部である場合、特に強力である。ポリマー糸が規則的に折り畳まれておらず、不規則であるこれらの非晶質の性質に起因して、これらの合成ポリマーは、多数の同一の反復単位からなっているが(例えば図5〜9を参照すること)、疎水性とより極性/親水性の領域の両方を有する順不同の分子構造を示す。とりわけこのことが、更なる組織分布的特徴と組み合わされて、GDF-5関連タンパク質を含む溶液との直接の接触の際に、強力な分子粘着性を引き起こすことが明らかである。
本発明によると、GDF-5関連タンパク質と様々な材料との間、特に、好ましくはポリスルホン系プラスチック及びポリエーテルイミドからなる群より選択され、最も好ましくはポリスルホン(PSU)、ポリエーテルスルホン(PES)、ポリフェニルスルホン(PPSU)からなる群より選択される非晶質熱可塑性ポリマーとの間の前記分子粘着性を、炭水化物の群に属する特定の有機添加剤の助けを借りて効率的に防止することができる。
本発明の第一の実施形態において、前記有機添加剤はトレハロースである。トレハロースは、ミコース又はトレマロースとしても知られており、二つのα-グルコース単位の間のα,α-1,1-グルコシド結合により形成された天然のアルファ結合二糖である。より正確には、一つ又は複数のGDF-5関連タンパク質の溶液への規定量のトレハロースの添加は、GDF-5関連タンパク質と非晶質熱可塑性ポリマーとの接着性相互作用の効率的な遮断を引き起こす。本発明者により実施された実験によると、一つ又は複数のGDF-5関連タンパク質の溶液が0.001〜5%のトレハロースを含有することが、十分な遮断効果のために必要である。特に良好な効果は、0.01〜3%のトレハロースを含有する溶液によって観察することができ、更に良好な効果は、0.1〜2%のトレハロースを含有する溶液によって観察することができた。最良の効果は、前記溶液が0.5〜1%のトレハロースを含有した場合に見られた。
本発明の第二の実施形態において、前記有機添加剤は、硫酸デキストラン又は硫酸カルボキシメチルデキストランであり、ほとんどの場合にこれらをトレハロースの代替物として使用することができる。硫酸デキストランは、17〜20%の硫黄を含有するグルコースの長鎖(様々な長さ)のポリマーである。100〜10000、最も好ましくは500の平均分子量を有する硫酸デキストラン(例えばAmersham 17-0340-01)を使用することが、好ましい。良好な遮断効果は、タンパク質溶液が0.001〜5%の硫酸デキストラン又は硫酸カルボキシメチルデキストラン、好ましくは0.01〜3%の硫酸デキストラン又は硫酸カルボキシメチルデキストラン、より好ましくは0.1〜2%の硫酸デキストラン又は硫酸カルボキシメチルデキストラン、最も好ましくは0.5〜1%の硫酸デキストラン又は硫酸カルボキシメチルデキストランを含有した場合に見られた。
本発明の第三の実施形態において、前記有機添加剤はカルボキシメチルデキストランであり、これは硫酸カルボキシメチルデキストランと化学的に密接に関連している。良好な遮断効果は、タンパク質溶液が、0.001〜5%のカルボキシメチルデキストラン、好ましくは0.01〜3%のカルボキシメチルデキストラン、より好ましくは0.1〜2%のカルボキシメチルデキストラン、最も好ましくは0.5〜1%のカルボキシメチルデキストランを含有した場合に見られた。
例えば実施例4に示されているように、更に極めて低い濃度(0.001%)のトレハロース又は硫酸デキストランは、PES製の中空繊維毛管又は他の非晶質熱可塑性ポリマーへの少なくとも75%のrhGDF-5の結合を防止した。より高い炭水化物濃度では、ほぼ100%の注入rhGDF-5を中空繊維毛管の通過後に検出することができた。したがって、本発明の特定の実施形態において、トレハロース、硫酸デキストラン、硫酸カルボキシメチルデキストラン又はカルボキシメチルデキストランの濃度は、非晶質熱可塑性ポリマーへの少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%又は少なくとも99%の溶解GDF-5関連タンパク質の結合を防止する。
本発明によると、GDF-5関連タンパク質の貯蔵及び/又は送達機能を有し、一つ又は複数の非晶質熱可塑性ポリマーを含む機器又は医療装置は、異なる形態、形状、形式又は設計を有することができる。例えば、実施例9に示されている医薬送達装置は、ポリエーテルスルホン(PES)製の中空繊維毛管装置である。一般に好ましいものは、中空繊維、毛管、チュービング、タンク、容器、メッシュ、スポンジ状要素及び/又は膜からなる群より選択される、GDF-5関連タンパク質の貯蔵又は送達のための一つ又は複数の構造要素を含有する医療装置である。
本明細書に記載されている本発明の部分及び実施形態は、ヒト増殖/分化因子5(rGDF-5)に非常に緊密に関連する天然に生じる又は人工的に設計されたタンパク質の全てに当てはまる。用語「GDF-5関連タンパク質」には、脊椎動物のGDF-5、GDF-6及びGDF-7タンパク質、並びにそれらの組み換えバリアントの群に属する機能的に同等のタンパク質が含まれる。著しく高い程度のアミノ酸配列同一性によって(図2を参照すること)、この群のタンパク質は同等の生物学的特性を示す。全てのGDF-5関連タンパク質の共通の特徴は、ヒトGDF-5/配列番号2の102aaシスチンノットドメインに少なくとも60%のアミノ酸同一性を有する生体活性シスチンノットドメインを生じていることであり、これはタンパク質の生物学的機能にとって十分である。図3から分かるように、限界値60%は、好ましくは、GDF-5/-6/-7群のメンバーをより遠縁のGDF及びBMPから区別する。特に好ましいタンパク質は、ヒトGDF-5の102aaシスチンノットドメインに少なくとも70%、80%又は90%のアミノ酸同一性を示す。
脊椎動物及び哺乳類のGDF-5関連タンパク質の非限定例は、ヒトGDF-5(WO 95/04819にMP52として及びHoetten et al. 1994, Biochem. Biophys Res. Commun. 204, 646〜652にヒトGDF-5として開示されている)、組み換えヒト(rh) GDF-5/MP52(WO 96/33215)、MP52 Arg(WO 97/06254)、HMWヒトMP52s(WO 97/04095)、CDMP-1(WO 96/14335)、マウス(Mus musculus)GDF-5(US 5,801,014)、ウサギ(Oryctolagus cuniculus)GDF-5 (Sanyal et al. 2000, Mol Biotechnol. 16, 203〜210頁)、トリ(Gallus gallus)GDF-5(NCBI受入番号NP_989669)、アフリカツメガエル(Xenopus laevis)GDF-5(NCBI受入番号AAT99303)、モノマーGDF-5(WO 01/11041及びWO 99/61611)、ヒトGDF-6/BMP-13 (US 5,658,882)、マウスGDF-6(NCBI受入番号NP_038554)、GDF-6/CDMP-2 (WO 96/14335)、ヒトGDF-7/BMP-12(US 5,658,882)、マウスGDF-7(NCBI受入番号AAP97721)、GDF-7/CDMP-3(WO 96/143335)の前駆体又は成熟タンパク質である。本発明に網羅されるものは、また、これら追加の突然変異がタンパク質の生物学的活性を完全になくさない限り、置換、付加及び欠失などの追加の突然変異を有するGDF-5関連タンパク質である。幾つかの好ましいバリアントは、改善された生物学的活性を有するGDF-5関連タンパク質の突然変異体である。例えば、ヒトGDF-5前駆体タンパク質に通常存在する一つ又は複数の残基は(図1を参照すること)、これらの突然変異体において他のアミノ酸に置換されており、ヒトGDF-5前駆体の438位のアルギニンは、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン若しくはアスパラギンに変えられている及び/又はセリン439は、アルパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、ロイシン若しくはイソロイシンに代わってる及び/又はアスパラギン445は、セリン若しくはトレオニンに代わってる。別の高い活性の突然変異体において、メチオニン453及び/又はメチオニン456は、アラニン、バリン又はイソロイシンに代わっている。また特別に興味深いものは、ロイシン441がプロリンに代わっている突然変異体である。
一般に、本発明は、合成ポリマー化合物製の医療装置と組み合わせた、前記組み換え及び野生型GDF-5形態の貯蔵及び/又は送達が有用である全ての状況に、適用することができる。したがって、本発明を使用して、様々な組織及び臓器の再生を促進することができる。例えば、GDF-5は、骨及び軟骨形成、並びに結合組織形成(例えば、WO 95/04819、Hoetten et al. 1996, Growth Factors 13, 65〜74頁; Storm et al. 1994, Nature 368, 639〜643頁; Chang et al. 1994, J. Biol. Chem. 269, 28227〜28234頁を参照すること)及び結合組織接合点形成(EP 0 831 884)の非常に効果的なプロモーターであることが考慮される。この文脈において、GDF-5は、骨格要素間の関節に関する適用において有用である(例えば、Storm & Kingsley 1996, Development 122, 3969〜3979頁を参照すること)。結合組織の一例は、腱及び靱帯である(Wolfman et al. 1997, J. Clin. Invest. 100, 321〜330頁; Aspenberg & Forslund 1999, Acta Orthop Scand 70, 51〜54頁; WO 95/16035)。タンパク質は、半月板及び脊椎/椎間板の修復(Walsh et al. 2004, Spine 29, 156〜63頁)及び脊椎固定適用(Spiro et al. 2000, Biochem Soc Trans. 28, 362〜368頁)において助けになる。GDF-5を、象牙質又は歯周靱帯の再生などの、歯(歯科及び歯周)への適用(例えば、WO 95/04819; WO 93/16099; Morotome et al. 1998, Biochem Biophys Res Comm 244, 85〜90頁を参照すること)において有益に適用することができる。GDF-5は、任意の種類の創傷修復においても有用である。これは、神経系の組織増殖及び例えばドーパミン作動性ニューロンの生存を促進するためにも有益である。この文脈において、GDF-5を、例えばパーキンソン病、場合によっては、アルツハイマー病又はハンチントン舞踏病の組織のような神経変性障害を治療するためにも使用することができる(例えば、WO 97/03188; Krieglstein et al., (1995) J. Neurosci Res. 42, 724-732頁; Sullivan et al., (1997) Neurosci Lett 233, 73〜76頁; Sullivan et al., (1998), Eur. J. Neurosci 10, 3681〜3688頁を参照すること)。GDF-5は、既に損傷を受けた組織において神経機能を維持すること又は神経機能を保持することを可能にする。したがってGDF-5は、一般に適用可能な神経栄養因子であることが考慮される。眼、特に網膜、角膜及び視神経の疾患(例えば、WO 97/03188; You et al. (1999), Invest Opthalmol V is Sci 40, 296〜311頁を参照すること)、発毛、並びに皮膚関連障害の治療及び診断(WO 02/076494; Battaglia et al. 2002, Trans. Orthop. Res. Soc. 27, 584頁)、血管新生の誘導(Yamashita et al. 1997, Exp. Cell Res. 235, 218〜26頁)にも有用である。
このように、本発明を適用することができる好ましい適応症は、創傷治癒である。本発明は、熱傷、皮膚病巣、皮膚傷害又は植皮、糖尿病性創傷及び糖尿病性潰瘍、例えば、糖尿病足部潰瘍の治療を促進するために特に適している。
本発明を適用することができる更なる非限定例は、骨及び/若しくは軟骨損傷に関連する又は骨及び/若しくは軟骨の疾患に影響を与える又は軟骨及び/若しくは骨の形成が望ましい一般的な状態に影響を与える又は脊髄固定に影響を与える疾患の予防又は治療、腱及び/若しくは靱帯を含む結合組織、人工歯根を含む歯周若しくは歯の組織、CNS組織を含む神経組織及び神経病理学的状態、感覚系の組織、肝臓、膵臓、心臓、血管、腎臓、子宮及び甲状腺組織、粘膜、内皮、上皮に関連する損傷又は疾患組織の予防又は治療、神経成長、組織再生、血管新生の促進又は誘導、前駆細胞及び/又は骨髄細胞の誘導又は増殖、臓器又は組織移植のための組織又は細胞の処理又は保存のための増殖又は分化の状態の維持、胃腸内層の完全性、生殖能、避妊又は妊娠における障害の治療である。眼のような感覚器に関する疾患も、本発明の医薬組成物の好ましい適応症に含まれる。神経疾患としては、ここでもパーキンソン病及びアルツハイマー病を例として記述することができる。
GDF-5関連タンパク質の生物学的活性は、確立された試験系の助けを借りて容易に決定することができる。最も有用で好ましいものは、アルカリホスファターゼ(ALP)アッセイ(Takuwa et al. 1989, Am. J. Physiol. 257, E797〜E803頁)として既知の一般的なin vitro試験であり、これは実施例8にも記載されている。GDF-5関連タンパク質は、アルカリホスファターゼ活性を増大させることは、WO 95/04819に記載されているように、すなわちROB-C26細胞において(Yamaguchi et al. 1991, Calcif. Tissue Int. 49, 221〜225頁)、胎児ATDC5細胞において(Riken Gene Bank、ROB 0565)、マウス間質MCHT-1/26細胞において及びNakamura et al. 2003, J. Periodontal Res. 38,597〜605頁に示されているようにHPDL細胞において実証されている。
本発明の組成物におけるGDF-5関連タンパク質の濃度は、適用の様式及び期間に応じて選択されるべきである。基本的に、GDF-5関連タンパク質は、乏しい量であっても効果を発揮することができる極めて強力なサイトカインである。すなわち、本明細書に記載されているアルカリホスファターゼアッセイなどの異なる生物学的アッセイ系の助けを借りて容易に決定することができるように、それぞれの溶液の1mlあたり0.1pgの濃度のGDF-5が生物学的作用を起こすために十分である。したがって、低い濃度、すなわち0.1pg/ml〜1ng/ml以下の範囲は、本発明の組成物が繰り返し投与される場合に好ましい。しかし、最大の効果は、1〜100ng/mlの高い濃度の増殖因子によって達成されうる。広範囲の段階希釈(0.3〜80ng/ml、Farkas et al. 1997, Neurosci. Lett. 236, 120〜122頁)を利用するGDF-5作用の独立した用量反応分析は、1mlあたり20ngの濃度のGDF-5により最適な結果をもたらした。in vivo皮膚モデルは、一般に高い用量の1〜10μg/mlを使用する。したがって、本発明の好ましい実施形態において、本発明の組成物は、0.1pg/ml〜10μg/mlの濃度でGDF-5関連タンパク質を含有する。一回投与の場合のGDF-5関連タンパク質の好ましい総用量は、10ng〜10μgの範囲である。
本発明の更なる態様は、本明細書に開示されている製剤の追加の成分及び構成要素である。
大部分の投与手順は、ほぼ生理学的なpHを有する組成物を必要とする。残念なことに、GDF-5及び密接に関連するタンパク質GDF-6及びGDF-7は、pH4〜pH9のpH値での不十分な可溶性を特徴とする。GDF-5関連タンパク質もおよそ4又は4未満のpHを有する水性液剤により投与されうるが、可溶性の問題を克服する別の方法は、非常に小さな粒径の特定のコロイド薬剤担体に接着することである。増殖因子と選択された微細構造化担体との相互作用は、微酸性/塩基性、更には中性のpHでタンパク質の望ましくない凝集を効率的に防止する。原則として、当業界で既知の様々なコロイド担体を化粧品及び医薬組成物に利用することができる。適切な担体は、文献(すなわち、Barrat et al. 2003: Colloidal drug carriers: achievements and perspectives. Cell. mol. life sci. 60, 21〜37頁)において広範囲に記載されている。幾つかのもののうち、頻繁に使用されるコロイド担体は、すなわち、リポソーム、混合ミセル、マイクロエマルション、脂質微粒子及びポリマーナノ粒子である。脂質微粒子を、脂質ナノスフィア(直径が200nm未満)及びマイクロスフィア(直径が0.2〜100μm)に更に分けることができる。これら及び他のコロイド薬剤担体の作製及び試験は、必要以上の負担なしに実施することができる日常的な事柄である。
加えて、製剤は、天然及び合成の脂質を含むことができる。生体適合性である限りにおいて、全種類の天然及び合成油/脂質を使用することができ、例えば、エチルパルミテート、イソプロピルパルミテートなどの合成油若しくは飽和エステル、イソプロピル、ブチル及びセチルミリステート、ヘキシルステアレート、トリグリセリド(すなわち、オクタン酸又はデカン酸トリグリセリド、Miglyol(登録商標)812などの中鎖トリグリセリド)、セチルリシノレエート、ステアリルオクタノエート(purcelllin oil)及び水素化ポリイソブテンなどのアルキルミリステート又は例えば綿実油、ダイズ油、ゴマ油、ヒマワリ油、ベニバナ油、オリーブ油、アボカド油、ピーナッツ油、クルミ油、アーモンド油及びヘーゼルナッツ油などの天然油である。
製剤は、乳化剤、例えばホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン又はホスファチジルエタノールアミンなどのリン脂質、蒸留モノグリセリド、モノ-及びジグリセリド、モノグリセリドの酢酸エステル、モノグリセリドの有機エステル、脂肪酸のソルビタンエステル、脂肪酸のプロピレングリコールエステル及び脂肪酸のポリグリセロールエステルを含むこともできる。
GDF-5関連タンパク質に加えて他の生体活性タンパク質も、本発明の組成物の一部でありうる。TGF-βが再生真皮の大きさを増大させ、真皮表皮接合部を安定化することが示されている(Fitzpatrick and Rosen, J. Cosmet. Laser Ther, 5: 25〜34頁(2003))。新生児包皮線維芽細胞から誘導した七つのサイトカイン(VEGF、IL-6及び-8、HGF、PDGF-a、GCSF、並びにTGF-β1)を含有するカクテル(TNS Recovery Complex, SkinMedica, Inc. Carlsbad, CA, USA)を多施設試験に使用した。評価は、肌のきめの改善及びしわの減少を示した(Rokhsar, C.K. et al., Dermatol. Surg. 31: 1166〜1178頁(2005))。組み換え表皮増殖因子(ReVive Skincare)及びN-フルフリルアデニン(キネチン)植物成長因子も市販されている。これらのタンパク質は、全て、本発明のGDF-5関連タンパク質と一緒に使用することができる。GDF-5関連タンパク質と組み合わされた場合に相乗的に作用する他のタンパク質は、文献/特許において、すなわちWO 99/15191に開示されている。好ましいものは、ニューロトロフィン、ヘッジホッグタンパク質、並びにTGF-アルファ、TGF-ベータ、アクチビン、BMP及びGDFが含まれるが、これらに限定されない形質転換増殖因子ファミリーのタンパク質である。とりわけ好ましいものは、EGF、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、NGF及び/又はGDNFのうちのいずれか一つとの組み合わせである。
組成物において、他の許容される構成成分は、下記である:
-粘膜/上皮表面の完全性を保存するレチノイド(ビタミンA誘導体);
-表皮剥離を向上させるヒドロキシ酸(アルファヒドロキシ酸(AHA)とベータヒドロキシル酸(BHA)に更に分類される有機カルボン酸)、すなわちグルコール酸、乳酸、クエン酸、マンデル酸、リンゴ酸及び酒石酸;
-フリーラジカルの悪影響に反作用する酸化防止剤、すなわちビタミンC、ビタミンE、パンテノール、リポ酸、ユビキノン、ナイアシンアミド、ジメチルアミノエタノール、スピントラップ、メラトニン、カタラーゼ、グルタチオン、スーパーオキシドジムスターゼ、ペルオキシダーゼ、グルコピラノシド、ポリフェノール、システイン、アラントイン、フルフリルアデニン、尿酸及びカルノシン;
-色素沈着過剰を緩和する脱色剤、すなわちN-アセチル-4-S-システアニミルフェノール、コウジ酸、アルブチン、アゼライン酸、カジノキ化合物、ケミカルピーリング剤(レゾルシノール、サリチル酸)、Kligman製剤、Pathak製剤及びWesterhof製剤;
-植物性薬品、すなわちカモミール、チョウセンニンジン、イチョウ、クルクミン、グリシルリジン、カプサイシン及びアロエベラ;
-表皮再生を支持するグリコサミノグリカン、すなわちヒアルロン酸;
-脂質分解を仲介する抗脂肪沈着剤、すなわちテオブロミン、テオフィリン、アミノフィリン、カフェイン、エピネフリンなどのベータアドレナリン作動性刺激物質及びヨヒンビン、ピペロキサン及びフェントラミンなどのアルファ1-アドレナリン作動性刺激物質;
-パパイン及びDNA修復酵素などの酵素;
-ホルモン、すなわちエストロゲン、プロゲステロン、テストステロン及び成長ホルモン;
-抗微生物剤、すなわちトリクロサン、クロルヘキシジン、ポビドンヨード、過酸化水素、ふけ防止調合剤、亜鉛ピリチオン;
-ケミカルUVフィルター、すなわち3-ベンジリデンショウノウ(3-BC)又は4-メチルベンジリデンカンファー(4-MBC);
-更なる緩衝剤、安定剤、防腐剤、還元剤、酸化防止キレート剤、等張性を修飾する作用物質、脱臭剤、麻酔剤、佐剤及び可溶性向上添加剤。
これらは可能な添加剤の非限定例にすぎず、当業者は、安全であると一般に考慮されている、現在使用されている他の賦形剤を容易に加えることができる。医薬組成物を処方する方法及び薬学的に許容される物質を選択する方法についての更なる情報は、すなわち、Remington's Pharmaceutical Sciences (luth ed.; Mack Publishing Company, Eaton, Pennsylvania, 1990); Wang et al. (1980), J. Parent. Drug Assn. 34 (6): 452〜462頁(1980); Wang et al. (1988), J. Parent. Sci. and Tech. 42: 4〜26頁; Lachman et al. (1968), Drug and Cosmetic Industry 102(1): 36〜38, 40 and 146〜148頁;及びAkers (1988)J. Parent. Sci. and Tech. 36 (5): 222〜228頁を参照すること。
本発明は、以下の項目を更に含む:
項目1)
一つ又は複数の溶解GDF-5関連タンパク質を含む少なくとも一つの液体構成成分Aと固体構成成分Bから構成され、
a)前記液体構成成分Aが0.001〜5%の、トレハロース、硫酸デキストラン、カルボキシメチルデキストラン及び硫酸カルボキシメチルデキストランからなる群より選択される有機添加剤を含み、したがって構成成分Bへの含有GDF-5関連タンパク質の少なくとも75%の結合を永久的に防止すること、並びに
b)前記構成成分Bが一つ又は複数の非晶質熱可塑性ポリマーを含むこと
によって特徴付けられる、医療装置。
項目2)
前記非晶質熱可塑性ポリマーがポリスルホン系プラスチック及びポリエーテルイミドからなる群より選択される、前記項目の医療装置。
項目3)
前記固体構成成分Bが液体構成成分Aの貯蔵用及び/又は組織再生部位への液体構成成分Aの送達用に一つ又は複数の合成又は半合成構造要素を含む、前記項目のうちのいずれか一つの医療装置。
項目4)
液体構成成分Aの貯蔵用及び/又は組織再生部位への送達用の前記合成又は半合成構造要素が、中空繊維、毛管、チュービング、タンク、容器、メッシュ、スポンジ状要素及び/又は膜からなる群より選択される、前記項目の医療装置。
項目5)
糖尿病性及び他の潰瘍、熱傷、皮膚傷害及び/又は植皮を含む創傷の治癒を改善するため、神経成長を誘導する又は神経死を防止するため、血管新生を促進するため、前駆細胞及び/又は骨髄細胞の増殖を誘導するため、臓器又は組織移植用の組織又は細胞の処理又は保存のために増殖又は分化の状態を維持するため、骨格要素の関節に関する変性障害の治療のため、並びに/或いは半月板及び/又は脊椎/椎間板の修復のための、項目1〜4のいずれか一つの医療装置の使用。
項目6)
組織再生の促進のための、前記に主張されたもののいずれか一つの医療装置の使用であって、前記組織が、皮膚組織、結合組織、骨、軟骨、結合組織接合点、腱、靱帯、脊椎/椎間板、半月板、歯の組織、象牙質、歯周靱帯、毛髪、感覚系の組織、肝臓、膵臓、心臓、血管、腎臓、子宮及び甲状腺組織、粘膜、内皮、上皮又は神経組織からなる群より選択される使用。
項目7)
溶液中のGDF-5関連タンパク質が非晶質熱可塑性ポリマー、生分解性材料又はポリビニルピロリドンに結合するのを防止する方法であって、トレハロース、硫酸デキストラン、カルボキシメチルデキストラン又は硫酸カルボキシメチルデキストラン(最終濃度: 0.001〜5%)を、GDF-5関連タンパク質の前記溶液に加えることを特徴とする方法。
項目8)
前記生分解性材料が、織布又は不織布コラーゲン、ゼラチン、ポリラクチド(PLA)、ポリグリコリド(PGA)、ポリカプロラクトン(PCL)ポリラクチド、デキストラン、ヒアルロン酸及びキトサン又はこれらの組み合わせからなる群より選択される、前記項目の方法。
以下の非限定例は、図面及び配列プロトコールと一緒に、本発明を更に説明することが意図される。
配列番号1はDNA配列を示し、配列番号2はヒトGDF-5前駆体のタンパク質配列を示す。
配列番号3はDNA配列を示し、配列番号4はヒト成熟モノマーGDF-5のタンパク質配列を示す。
配列番号2のヒトGDF-5前駆体タンパク質の追加的な特徴を示す:aa001-381 プリ-プロドメイン(太字) aa001-027 シグナルペプチド(下線および太字) aa382-501 成熟タンパク質部分 aa400-501 シスチンノットドメイン(下線) ヒトGDF-5の102aaシスチンノットドメイン(配列番号2)、ヒトGDF-6(米国特許第5,658,882号の配列2)及びヒトGDF-7(米国特許第5,658,882号の配列26)の比較を示す。三つの分子全てにおいて同一であるアミノ酸残基は、縁取りにより強調されている。 ヒトGDF-5のシスチンノットドメインに対する幾つかの既知のBMP及びGDFのシスチンノットドメインの配列同一性の表を示す。 中性pHでのGDF-5二量体の静電荷パターンを示す。同様の電荷の領域を同一の色で示す。 ポリスルホン系プラスチックの反復単位を示す。 ポリスルホン(PSU)の反復単位を示す。 ポリエーテルスルホン(PES)の反復単位を示す。 ポリフェニルスルホン(PPSU)の反復単位を示す。 ポリエーテルイミドの反復単位を示す。 実施例1に記載されているrhGDF-5サンドイッチELISAを示す。リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に溶解したrhGDF-5の含有量を、中空繊維毛管の通過前(黒色棒)及び後(白色棒)で比較した。rhGDF-5の含有量をrhGDF-5サンドイッチELISAで分析した。中空繊維毛管の通過の後では、GDF-5を検出することができなかった。rhGDF-5タンパク質が毛管の壁に非特異的に接着した可能性が最も高い。 実施例2に記載されているrhGDF-5サンドイッチELISAを示す。10mMのHCl、pH2.0に溶解したrhGDF-5の含有量を、中空繊維毛管の通過前(黒色棒)及び後(白色棒)で比較した。rhGDF-5の含有量をrhGDF-5サンドイッチELISAで分析した。中空繊維毛管の通過の後では、GDF-5を検出することができなかった。 実施例3に記載されているrhGDF-5サンドイッチELISAを示す。中空繊維毛管をヒト血清と共にプレインキュベートして、rhGDF-5の非特異的結合部位を遮断した。次に5mLのrhGDF-5(PBSに溶解した1μg/mL)を装置に注入した。rhGDF-5の含有量を、中空繊維毛管の通過前(黒色棒)及び後(白色棒)で比較した。rhGDF-5の含有量をrhGDF-5サンドイッチELISAで分析した。中空繊維毛管の通過の後では、GDF-5を検出することができなかった。 実施例4に記載されているrhGDF-5サンドイッチELISAを示す。中空繊維毛管を1%硫酸デキストラン溶液ですすいだ。次に中空繊維に、5mLの1%硫酸デキストラン中rhGDF-5を、10〜1000ng/mLの範囲の増加rhGDF-5濃度で注入した。中空繊維毛管注入前後のrhGDF-5含有量を、rhGDF-5サンドイッチELISAにより決定した。rhGDF-5入力濃度を100%に設定した。rhGDF-5を、中空繊維毛管通過の後で画分において検出することができた。硫酸デキストランによる自由結合部位の遮断は、毛管表面へのrhGDF-5の非特異的接着をまさに防止した。それと対照的に、血清タンパク質による自由結合部位の遮断は、毛管表面へのrhGDF-5の非特異的接着を防止しなかった。 実施例4に記載されているrhGDF-5サンドイッチELISAの結果を示す。中空繊維毛管を0.001%硫酸デキストラン溶液ですすいだ。中空繊維に、5mLの0.001%硫酸デキストラン中1μg/mL rhGDF-5を注入した。中空繊維毛管注入前後のrhGDF-5含有量を、rhGDF-5サンドイッチELISAにより決定した。 実施例5に記載されているrhGDF-5サンドイッチELISAの結果を示す。中空繊維毛管を、1%トレハロース、5mM酢酸ナトリウム、pH5ですすいだ。次に中空繊維に、5mLの1%トレハロース、5mM酢酸ナトリウム、pH5中のrhGDF-5(2μg/mL)を注入した。中空繊維毛管注入前後のrhGDF-5含有量を、rhGDF-5サンドイッチELISAにより決定した。 実施例6に記載されている、rhGDF-5の37℃で1週間の安定性研究の結果を示す。rhGDF-5を、1%トレハロース又は0.1%硫酸デキストランのいずれかで処方した。1日目から7日目(T1〜T7)の時点でのrhGDF-5の含有量を、rhGDF-5サンドイッチELISAにより決定した。未処理rhGDF-5試料を内部対照として機能させ、100%に設定した。 実施例7に記載されているrhGDF-5の凍結/解凍安定性研究を示す。rhGDF-5を、1%トレハロース又は0.1%硫酸デキストランのいずれかに溶解した。rhGDF-5試料を四回、-80℃で凍結し室温で解凍した。凍結/解凍サイクル(C1〜C4)でのrhGDF-5含有量を、rhGDF-5サンドイッチELISAにより決定した。未処理rhGDF-5試料を内部対照として機能させ、100%に設定した。 実施例8に記載されている、MCHT 1/26細胞におけるアルカリホスファターゼ(ALP)活性の用量反応分析を示す。MCHT 1/26細胞を、10mM HCl(黒色三角)及び1%トレハロース、5mM酢酸ナトリウム、pH5.0(白色円)にそれぞれ溶解した4.8〜1200ng/mLのGDF-5で刺激した。ALP活性を、405nMでのp-ニトロフェノールホスフェートからp-ニトロフェノレートへの変換により測定した。データは、三回の独立した測定の平均値である。 実施例9のブタ皮膚におけるin vivo創傷治癒研究を示す。1%トレハロース、5mM酢酸ナトリウム、pH5.0で処方したrhGDF-5(150ng/mL)を、中空繊維適用系により適用した。未処理対照創傷(左側)と対照的に、rhGDF-5処理分層欠損(右側)は、9日以内に再生した。
(実施例)
(実施例1)
中性pHでの緩衝水溶液(PBS)中のGDF-5関連タンパクの送達
最初の実験セットでは、水性緩衝系中のGDF-5又は関連タンパク質が中空繊維毛管装置を通過するかを調査した。例として、rhGDF-5を1×リン酸緩衝生理食塩水に溶解して、6mLの、最終濃度が1μg/mLのGDF-5溶液を生じた。5mLのGDF-5溶液をシリンジにより中空繊維毛管装置に適用した。中空繊維毛管装置の微細孔に残ったGDF-5溶液を、ペトリ皿に収集した。中空繊維毛管装置を通過したGDF-5の含有量を定量化するため、毛管通過前後の試料のアリコートをGDF-5特異的サンドイッチELISAにより分析した。GDF-5のELISAは、rhGDF-5に対する二つのモノクローナル抗体に基づいている。酵素のアビジン-ペルオキシダーゼは、第三試薬の添加により第二抗体に結合する。検出は、基質テトラメチルベンジジンジヒドロクロリドの黄色染料への酵素的変換により実施され、次に測光法により決定される。rhGDF-5の不明試料は、rhGDF-5標準の試験シリーズを使用して定量化される。
簡潔には、第一抗体のaMP-5をTBS(0.01Mのトリス緩衝生理食塩水、0.15MのNaCl、pH7.4)で5μg/mLに調整し、ELISAプレートを50μL/ウェルで被覆し、4℃で一晩インキュベートした。溶液を除去し、プレートを100μLのすすぎ溶液(100mLの貯蔵溶液(0.45MのNa2HPO4、pH6.5)を400mLの水p.a.に希釈し、250μLのツイーン20を加えた)で5回すすいだ。次に、50μL/ウェルの標準及び試料溶液を、それぞれ4回適用し、プレートを密閉し、4℃で20〜24時間インキュベートした。溶液を除去し、プレートを100μLのすすぎ溶液で5回すすいだ。第二ビオチン化抗体aMP-4を希釈緩衝剤(10mMのTRIS、150mMのNaCl、0.5%カゼイン、0.0004%ブロモフェノールブルー、pH7.4)で1μg/mLの濃度に調整し、50μL/ウェルを適用し、密閉プレートを37℃で2時間インキュベートした。溶液を除去し、プレートを100μLのすすぎ溶液で5回すすいだ。ウェル1つあたり50μLのアビジン-ペルオキシダーゼ(0.2U/mLのペルオキシダーゼ活性)を加え、密閉プレートを室温で1時間インキュベートした。溶液を除去し、プレートを100μLのすすぎ溶液で5回すすいだ。次に50μLのTMB(テトラメチルベンジジン)染料溶液をウェル毎に加え、密閉プレートを室温で30分間インキュベートした。最後に反応を、50μLの1N N2SO4をウェル毎に添加することにより停止し、吸収を450nmで測定した。
中空繊維毛管装置通過前後のrhGDF-5の含有量の比較を、図10に示す。驚くべきことに、rhGDF-5を空繊維毛管通過後に画分で検出することができなかった。rhGDF-5タンパク質が毛管の壁に非特異的に接着した可能性が最も高い。
(実施例2)
10mMのHCl、pH2.0中のGDF-5関連タンパク質の送達
10mMのHCl、pH2.0はGDF-5関連タンパク質を溶解する最適な緩衝剤であるので、10mMのHCl、pH2.0中のGDF-5が中空繊維毛管装置を通過するかを調査した。手順は、rhGDF-5(1μg/mL)をPBSの代わりに10mMのHCl、pH2に適用した以外は、実施例1に記載されたものと同じ条件下で実施した。
中空繊維毛管装置を通過した前後の、10mMのHCl、pH2.0に溶解したrhGDF-5の含有量の比較を、図11に示す。
驚くべきことに、rhGDF-5を中空繊維毛管通過後の画分中で検出することができなかった。10mMのHCl、pH2.0は最大タンパク質可溶性を達成するrhGDF-5に最適な緩衝剤であるので、良好なタンパク質可溶性が毛管材料への接着を防止するのに十分ではないことは明白である。したがって、非特異的rhGDF-5相互作用を低減する代替的な戦略を適用した。
(実施例3)
血清タンパク質を用いる遮断による非特異的結合の防止
不要なタンパク質相互作用を低減する一つの戦略は、多量のタンパク質(例えば、ヒト血清アルブミン)により毛管の自由結合部位を遮断することである。遮断手順において、中空繊維毛管装置を5mLのヒト血清とプレインキュベートした。遮断工程の後、PBSに溶解した5mLのrhGDF-5(1μg/mL)を中空繊維毛管装置に注入した。中空繊維毛管装置の通過前後のrhGDF-5の含有量を、実施例1に記載されたように分析した。結果を図12に示す。
rhGDF-5を、中空繊維毛管通過後の画分中で検出することができなかった。血清タンパク質による自由結合部位の遮断は、毛管表面へのrhGDF-5の非特異的接着を防止しなかった。
(実施例4)
硫酸デキストランの添加による非特異的rhGDF-5結合の防止
不要なタンパク質相互作用を低減する別の戦略は、添加剤をrhGDF-5溶液に加えることである(例えば、硫酸デキストラン又はトレハロース)。この目的のために、rhGDF-5を、水中1%(10mg/ml)硫酸デキストラン(Amersham 17-0340-01、ロット99250)を含む緩衝剤に溶解した。この実験において、以下のrhGDF-5濃度を分析した:10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL及び1000ng/mL。
中空繊維毛管装置を、最初にrhGDF-5を有さない5mLの1%硫酸デキストラン溶液ですすいだ。すすぎ工程の後、5mLの1%硫酸デキストラン溶液中rhGDF-5(rhGDF濃度10〜1000ng/mL)を、中空繊維毛管装置に別個に注入した。中空繊維毛管装置の通過前後の5つの試料全てのrhGDF-5含有量を、実施例1に記載されたrhGDF-5のELISAにより分析した。結果を図13に示す。
1%硫酸デキストランをrhGDF-5溶液に加えることは、中空繊維毛管へのrhGDF-5の非特異的結合を成功裏に防止する。1000〜100ng/mLのrhGDF-5の濃度範囲では、注入されたrhGDF-5の100%を、中空繊維毛管の通過後に検出することができた。rhGDF-5の回収は、それぞれ50ng/mLのrhGDF-5では92%であり、10ng/mLでは85%であった。
硫酸デキストランによる実験は、低減された硫酸デキストラン濃度(1%の代わりに0.001%)及び1μg/mLのrhGDF-5で繰り返した。0.001%の硫酸デキストラン濃度でも、中空繊維毛管を通過した後に回収されたrhGDF-5は、75%を越えていた(図14)。
(実施例5)
トレハロースの添加による非特異的rhGDF-5結合の防止
硫酸デキストランの代替的な炭水化物添加剤はトレハロースである。トレハロースによる実験は、トレハロースを硫酸デキストランの代わりに使用した以外は実施例4に記載されたとおりに実施した。
2μg/mLのrhGDF-5を1%又は10%のトレハロース、5mM酢酸ナトリウム、pH5.0に溶解した。中空繊維毛管装置を、最初にrhGDF-5を有さない5mLの1%又は10%のトレハロース、5mM酢酸ナトリウム溶液ですすいだ。すすぎ工程の後、5mLの1%又は10%のトレハロース、5mM酢酸ナトリウム溶液中rhGDF-5(2μg/mL)を、中空繊維毛管装置に注入した。中空繊維毛管装置の通過前後のrhGDF-5の含有量を、実施例1に記載されたrhGDF-5のELISAにより分析した。
結果を図15に示す。驚くべきことに、10%トレハロースのrhGDF-5溶液を使用したとき、rhGDF-5を中空繊維毛管通過後の画分中で検出することができなかった。対照的に、rhGDF-5を1%トレハロース、5mM酢酸ナトリウム、pH5に溶解したとき、中空繊維毛管を通過した後に回収されたrhGDF-5は、100%であった。
(実施例6)
トレハロース及び硫酸デキストランを用いるrhGDF-5の温度安定性研究
創傷治癒用薬剤の製剤の重要な基準は、体温での薬剤安定性である。したがって、1%トレハロース又は0.1%硫酸デキストランの存在下でのrhGDF-5の短期安定性研究を、37℃で一週間実施した。この目的のため、それぞれ1%トレハロース、5mM酢酸ナトリウム、pH5.0及び水中0.1%硫酸デキストランに溶解した200μg/mLのrhGDF-5を含有する、30μlの6つのアリコートを調製した。rhGDF-5溶液を37℃で1週間保存し、一つのアリコートを毎日取り出し、安定性研究が7日目に完了するまで-80℃で保存した。温度ストレス試料のrhGDF-5含有量を、ストレス試験を行わずに-80℃で直接保存したrhGDF-5のアリコートと比較した。試料を、実施例1に記載されたrhGDF-5サンドイッチELISAにより分析した。結果を図16に示す。1%トレハロース、5mM酢酸ナトリウム、pH5.0により又は水性緩衝剤中の0.1%硫酸デキストランにより処方されたとき、rhGDF-5は、37℃で少なくとも一週間安定していることを実証することができた。
(実施例7)
トレハロース及び硫酸デキストランを用いるrhGDF-5の凍結/解凍安定性研究
薬剤安定性にとって別の重要な態様は、薬剤中の添加剤が、生体活性を失うことなく、rhGDF-5の反復凍結/解凍サイクルを支持することである。したがって、1%トレハロース又は0.1%硫酸デキストランの存在下でのrhGDF-5の安定性研究を、37℃で一週間実施した。この目的のため、それぞれ1%トレハロース、5mM酢酸ナトリウム、pH5.0及び1×リン酸緩衝生理食塩水中0.1%硫酸デキストランに溶解した200μg/mLのrhGDF-5を含有する、30μlのアリコートを調製した。rhGDF-5溶液を-80℃で一晩保存し、次に室温で解凍した。凍結/解凍サイクルを四回(C1〜C4)繰り返した。ストレス試料のrhGDF-5含有量を、ストレス試験を受けないで-80℃で直接保存したrhGDF-5のアリコートと比較した。試料を、実施例1に記載されたrhGDF-5サンドイッチELISAにより分析した。結果を図17に示す。1%トレハロース、5mM酢酸ナトリウム、pH5.0により又は水性緩衝剤の0.1%硫酸デキストランにより処方されたとき、rhGDF-5を、活性を失うことなく、少なくとも四回凍結及び解凍できることを実証することができた。
(実施例8)
1%トレハロース中のrhGDF-5の生体活性研究
rhGDF-5製剤の緩衝剤における炭水化物添加剤がGDF-5生体活性に対して影響を有するかという疑問に対処するため、細胞に基づいたアルカリホスファターゼ(ALP)活性アッセイを実施した。1%トレハロース、5mM酢酸ナトリウム、pH5.0に溶解したrhGDF-5 (200μg/mL)の生物学的活性を、マウス間質MCHT 1/26細胞(Hoechst Japan Ltd., Kawagoe, Japan)で測定した。MCHT 1/26細胞を、2mMのL-グルタミン(Invitrogen, Karlsruhe, Germany)及び10%ウシ胎児血清(Invitrogen, Karlsruhe, Germany)を補充した細胞培地(alpha-MEM, (Sigma, Taufkirchen, Germany)において、96マルチウェルプレートのウェル1つあたり4.5×103細胞で平板培養した。24時間後、細胞を、10mMのHCl又は1%トレハロース、5mM酢酸ナトリウム、pH5.0のいずれかに溶解したrhGDF-5で刺激した。細胞をインキュベートする前に、rhGDF-5溶液を細胞培地で更に希釈して、14.8〜1200ng/mLの範囲のrhGDF-5濃度にした。72時間後、細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、1%のNonidet P40、0.1Mのグリシン、pH9.6(Sigma, Taufkirchen, Germany)、1mMのMgCl2及び1mMのZnCl2(Merck, Darmstadt, Germany)を含有するアルカリリン酸緩衝剤1で抽出した。十分な細胞溶解を達成するために、細胞を37℃で15〜18時間インキュベートした。アルカリホスファターゼ酵素活性を、0.1Mのグリシン、pH 9.6、1mMのMgCl2及び1mMのZnCl2中の基質としての10mMのp-ニトロフェニルホスフェート(Pierce, Bonn, Germany)を用いてアッセイした。37℃で30分間インキュベートした後、吸収を、自動マイクロプレート読み取り機(Tecan Spectra Rainbow, TECAN, Crailsheim, Germany)により、空試験値減算を考慮しながら405nMで測定した。結果を図18に示す。
rhGDF-5を、1%トレハロースの存在下で指標細胞株MCTH 1/26にALP酵素活性を誘導する生物学的活性について試験した。rhGDF-5対照試料と比較して、rhGDF-5誘導ALP活性に対するトレハロースの影響がないことを観察することができた。1%トレハロースの存在下でのrhGDF-5によるALP活性の誘導は、用量依存性であり、トレハロースがGDF-5の生物学的活性を低減しないことを示唆している。
(実施例9)
中空繊維毛管装置を介して適用された1%トレハロース中rhGDF-5による創傷治癒in vivo研究
創傷治癒は、糖尿病を罹患している患者及び重篤な熱傷を有する患者において重大な問題であるので、本発明者たちは、それ自体で治癒しない慢性創傷の治癒過程を助長するために、rhGDF-5の皮膚送達装置を開発した。
送達系は、入口及び出口チュービングに連結して、rhGDF-5濃縮媒質による灌流を可能にする中空繊維網状組織からなる。本発明者たちは、中空繊維の壁の表面にGDF-5の接着を予防するGDF-5の薬剤の製剤の開発に成功した。GDF-5は、普通ではない可溶性プロフィールを有する粘着性タンパク質であるので、製剤は、効果的なrhGDF-5送達にとって必須である。
GDF-5は、中性pHで水溶液において低い可溶性を有し(およそ、1μg/mL)、pH2.0〜pH4.5及びpH9.5〜12.0の範囲内で可溶性である。GDF-5の良好な可溶性を達成するため、タンパク質を10mMのHCl、pH2.0又は20mMの酢酸ナトリウム緩衝剤、pH4.0に溶解するべきである。
細胞増殖に対するrhGDF-5の影響を調査するために、単離ヒト細胞に対する細胞培養アッセイを実施した。線維芽細胞及び角化細胞をヒト皮膚生検から直接単離し、rhGDF-5とインキュベートした。興味深いことに、非常に低い濃度のrhGDF-5(75ng/mL)は、細胞増殖に約30%の増加をもたらす。本発明者たちは、この効果が慢性創傷(例えば、糖尿病足部潰瘍)の創傷治癒及び再生過程を加速することを示唆する。
続いて、rhGDF-5による動物の創傷治癒実験を実施した。分層皮膚創傷(5x5cm)をブタの背部に置いた。創傷を、中空繊維毛管適用系を使用して、rhGDF-5(150ng/mLのrhGDF-5、1%トレハロース、5mM酢酸ナトリウム、pH5.0)で処理した。10mLのrhGDF-5溶液を、中空繊維毛管装置により毎日二回、9日間にわたって適用した。rhGDF-5処理創傷は有意に早く再生した(図19)。

Claims (8)

  1. 一つ又は複数の溶解GDF-5関連タンパク質を含む少なくとも一つの液体構成成分Aと固体構成成分Bから構成され、
    a)前記液体構成成分Aが、トレハロース、硫酸デキストラン、カルボキシメチルデキストラン及び硫酸カルボキシメチルデキストランからなる群より選択される有機添加剤を0.001〜5%含み、したがって、含有GDF-5関連タンパク質の少なくとも75%の、構成成分Bへの結合を永久的に防止すること、並びに
    b)前記構成成分Bが一つ又は複数の非晶質熱可塑性ポリマーを含むこと
    を特徴とする医療装置。
  2. 前記非晶質熱可塑性ポリマーが、ポリスルホン系プラスチック及びポリエーテルイミドからなる群より選択される、請求項1に記載の医療装置。
  3. 前記固体構成成分Bが、液体構成成分Aの貯蔵用及び/又は組織再生部位への液体構成成分Aの送達用の一つ又は複数の合成又は半合成構造要素を含む、請求項1または2に記載の医療装置。
  4. 液体構成成分Aの貯蔵用及び/又は組織再生部位への送達用の前記合成又は半合成構造要素が、中空繊維、毛管、チュービング、タンク、容器、メッシュ、スポンジ状要素及び/又は膜からなる群より選択される、請求項3に記載の医療装置。
  5. 糖尿病性及び他の潰瘍、熱傷、皮膚傷害及び/又は植皮を含む創傷の治癒を改善するため、神経成長を誘導する又は神経死を防止するため、血管新生を促進するため、前駆細胞及び/又は骨髄細胞の増殖を誘導するため、臓器又は組織移植用の組織又は細胞の処理又は保存のために増殖又は分化の状態を維持するため、骨格要素の関節に関する変性障害の治療のため、並びに/或いは半月板及び/又は脊椎/椎間板の修復のための、請求項1から4のいずれか一項に記載の医療装置。
  6. 組織再生の促進のための請求項1から5のいずれか一項に記載の医療装置であって、前記組織が、皮膚組織、結合組織、骨、軟骨、結合組織接合点、腱、靱帯、脊椎/椎間板、半月板、歯の組織、象牙質、歯周靱帯、毛髪、感覚系の組織、肝臓、膵臓、心臓、血管、腎臓、子宮及び甲状腺組織、粘膜、内皮、上皮又は神経組織からなる群より選択される、医療装置。
  7. 溶液中のGDF-5関連タンパク質が非晶質熱可塑性ポリマー、生分解性材料又はポリビニルピロリドンに結合するのを防止する方法であって、トレハロース、硫酸デキストラン、カルボキシメチルデキストラン又は硫酸カルボキシメチルデキストラン(最終濃度: 0.001〜5%)を、GDF-5関連タンパク質の前記溶液に加えることを特徴とする方法。
  8. 前記生分解性材料が、織布又は不織布コラーゲン、ゼラチン、ポリラクチド(PLA)、ポリグリコリド(PGA)、ポリカプロラクトン(PCL)ポリラクチド、デキストラン、ヒアルロン酸及びキトサン又はこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項7に記載の方法。
JP2013521163A 2010-07-30 2011-07-29 創傷の治癒を加速する医薬送達装置及び増殖因子製剤 Expired - Fee Related JP5837930B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP10171488.9 2010-07-30
EP10171488 2010-07-30
PCT/EP2011/063128 WO2012013790A1 (en) 2010-07-30 2011-07-29 Drug delivery devices and growth factor formulations for accelerated wound healing

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2013538193A JP2013538193A (ja) 2013-10-10
JP5837930B2 true JP5837930B2 (ja) 2015-12-24

Family

ID=44629156

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2013521163A Expired - Fee Related JP5837930B2 (ja) 2010-07-30 2011-07-29 創傷の治癒を加速する医薬送達装置及び増殖因子製剤

Country Status (6)

Country Link
US (2) US20130122066A1 (ja)
EP (1) EP2598177B1 (ja)
JP (1) JP5837930B2 (ja)
AU (1) AU2011284657B2 (ja)
CA (1) CA2806143A1 (ja)
WO (1) WO2012013790A1 (ja)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2537538A1 (en) * 2011-06-22 2012-12-26 Biopharm Gesellschaft Zur Biotechnologischen Entwicklung Von Pharmaka mbH Bioresorbable Wound Dressing
EP2740485B1 (en) * 2012-12-07 2018-10-31 Brightpulse Holding LTD. Protein slurp-1 for use in the treatment of ocular diseases
TW202102273A (zh) * 2019-07-10 2021-01-16 美麗康生技股份有限公司 防水透氣濕式敷料

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0625989B1 (en) 1992-02-12 2000-01-19 BIOPHARM GESELLSCHAFT ZUR BIOTECHNOLOGISCHEN ENTWICKLUNG VON PHARMAKA mbH Dna sequences encoding novel growth/differentiation factors
DE19525416A1 (de) 1995-07-12 1997-01-16 Bioph Biotech Entw Pharm Gmbh Verwendung von MP52 zur Behandlung und Prävention von Erkrankungen des Nervensystems
EP1439190A1 (en) 1993-01-12 2004-07-21 The Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor-5
IL110589A0 (en) 1993-08-10 1994-11-11 Bioph Biotech Entw Pharm Gmbh Growth/differentiation factor of the TGF- beta family
ES2255059T3 (es) 1993-12-07 2006-06-16 Genetics Institute, Llc Bmp-12, bmp-13 y composiciones suyas inductoras de tendon.
AU1120295A (en) 1994-11-07 1996-05-31 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Cartilage-derived morphogenetic proteins
ATE325131T1 (de) 1995-04-19 2006-06-15 Bioph Biotech Entw Pharm Gmbh Neues protein und verfahren zu dessen herstellung
PT831884E (pt) 1995-06-05 2003-11-28 New York Society Uso de proteinas morfogeneticas do caso para cicatrizacao e reparacao da ligacao do tecido conjuntivo
JPH0931098A (ja) 1995-07-24 1997-02-04 Hoechst Japan Ltd 新規なタンパク質ｈｍｗヒトｍｐ５２
ZA966489B (en) 1995-08-03 1997-02-26 Bioph Biotech Entw Pharm Gmbh New protein human MP52 Arg.
JPH11335398A (ja) 1998-05-22 1999-12-07 Hoechst Marion Roussel Kk 新規な骨誘導活性を有する単量体蛋白質およびそれらからなる軟骨・骨疾患の予防および治療薬
EP1074620A1 (en) 1999-08-06 2001-02-07 HyGene AG Monomeric protein of the TGF-beta family
AU1024899A (en) 1997-09-19 1999-04-12 Biopharm Gesellschaft Zur Biotechnologischen Entwicklung Von Pharmaka Mbh Cytokines having neurotrophic activity
US6446794B1 (en) * 2000-02-25 2002-09-10 Technicor Inc. Absorbent/adsorbent containers
US6357626B1 (en) * 2001-03-05 2002-03-19 Jack Yongfeng Zhang Pre-filled oral liquid disposable plastic container
WO2002076494A2 (en) 2001-03-23 2002-10-03 Biopharm Gesellschaft Zur Biotechnologischen Entwicklung Von Pharmaka Mbh USE OF CYTOKINES OF THE TGF-β SUPERFAMILY FOR THE TREATMENT AND DIAGNOSIS OF SKIN RELATED DISORDERS
US6669980B2 (en) * 2001-09-18 2003-12-30 Scimed Life Systems, Inc. Method for spray-coating medical devices
BR0214275A (pt) * 2001-11-19 2004-09-21 Scil Technology Gmbh Dispositivo tendo propriedades osteocondutora e osteoindutora
EP1462126A1 (en) 2003-03-28 2004-09-29 BIOPHARM GESELLSCHAFT ZUR BIOTECHNOLOGISCHEN ENTWICKLUNG VON PHARMAKA mbH Improved Osteoinductive Materials
EP1698691A1 (en) * 2005-03-04 2006-09-06 Biopharm Gesellschaft zur biotechnologischen Entwicklung von Pharmaka mbH Growth factor mutants with improved biological activity
US20060286171A1 (en) * 2005-06-17 2006-12-21 Tianhong Zhou Bone morphogenetic protein formulations
EP1915986A1 (en) 2006-10-23 2008-04-30 BIOPHARM GESELLSCHAFT ZUR BIOTECHNOLOGISCHEN ENTWICKLUNG VON PHARMAKA mbH Lipid growth factor formulations
AU2007234612B2 (en) * 2006-12-14 2013-06-27 Johnson & Johnson Regenerative Therapeutics, Llc Protein stabilization formulations
US20080234727A1 (en) * 2007-03-22 2008-09-25 Venkat Garigapati Novel Carriers For Coating Growth Factors Onto Sutures
US8198237B2 (en) * 2007-05-15 2012-06-12 Stryker Corporation Concentrated protein preparations of bone morphogenetic proteins and methods of use thereof
WO2009006097A1 (en) * 2007-06-29 2009-01-08 Johnson & Johnson Regenerative Therapeutics, Llc Liquid protein formulations comprising gdf-5 for use at elevated temperatures
FR2919188B1 (fr) * 2007-07-27 2010-02-26 Proteins & Peptides Man Complexes entre un polymere amphiphile et une proteine osteogenique appartenant a la famille des bmps
BRPI0911048A2 (pt) * 2008-04-14 2015-12-29 Atrm Llc formulações líquidas tamponadas de gdf-5

Also Published As

Publication number Publication date
AU2011284657A1 (en) 2013-02-28
WO2012013790A1 (en) 2012-02-02
US20160317666A1 (en) 2016-11-03
EP2598177B1 (en) 2015-06-17
CA2806143A1 (en) 2012-02-02
JP2013538193A (ja) 2013-10-10
US20130122066A1 (en) 2013-05-16
AU2011284657B2 (en) 2013-11-14
EP2598177A1 (en) 2013-06-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9782511B2 (en) Bioresorbable wound dressing
RU2705211C2 (ru) Композиция и способ лечения кожных рубцов
Staiano-Coico et al. Human keratinocyte growth factor effects in a porcine model of epidermal wound healing.
Xie et al. Hyaluronic acid: evaluation as a potential delivery vehicle for vitronectin: growth factor complexes in wound healing applications
US5616562A (en) Methods and compositions using substance P to promote wound healing
Brodkey et al. The complex nature of interactive neuroregeneration-related molecules
Amado et al. Effects of collagen membranes enriched with in vitro-differentiated N1E-115 cells on rat sciatic nerve regeneration after end-to-end repair
WO1999006060A1 (en) Methods for treating neurological deficits
KR20080031405A (ko) 상피 재생의 촉진
JP2021106935A (ja) 創傷を処置するための組成物
JP5837930B2 (ja) 創傷の治癒を加速する医薬送達装置及び増殖因子製剤
Wan et al. Growth factors: Bioactive macromolecular drugs for peripheral nerve injury treatment–Molecular mechanisms and delivery platforms
EP0981353B1 (en) Facilitation of repair of neural injury with cm101/gbs toxin
Hilliard et al. Growth Factors in Plastic Surgery
MXPA00001197A (en) Methods for treating neurological deficits

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20140618

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20150601

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20150831

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20150916

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20151009

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20151106

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 5837930

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees