JPH0931098A - 新規なタンパク質ｈｍｗヒトｍｐ５２ - Google Patents

新規なタンパク質ｈｍｗヒトｍｐ５２

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JPH0931098A
JPH0931098A JP7218022A JP21802295A JPH0931098A JP H0931098 A JPH0931098 A JP H0931098A JP 7218022 A JP7218022 A JP 7218022A JP 21802295 A JP21802295 A JP 21802295A JP H0931098 A JPH0931098 A JP H0931098A
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Michio Kimura
道夫 木村
Tomoaki Matsumoto
智明 松本
Mikiko Takahashi
美樹子 高橋
Shinji Kawai
伸治 河合
Yukio Fujino
幸夫 藤野
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Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 本発明はＣＨＯ細胞で生産された、配列
表配列番号１のアミノ酸配列を有するＨＭＷヒトＭＰ５
２と命名されたタンパク質を提供する。本発明はさらに
ＨＭＷヒトＭＰ５２を生産する方法および有効成分とし
てＨＭＷヒトＭＰ５２を含有する医薬組成物を提供す
る。ＨＭＷヒトＭＰ５２は骨誘導促進作用を有するの
で、骨疾患などの治療または予防に使用され得る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は新規なＨＭＷヒトＭ
Ｐ５２およびＨＭＷヒトＭＰ５２からなる特に軟骨、骨
誘導促進のための医薬組成物に関する。特に、医薬組成
物は、骨代謝異常による骨疾患例えば骨粗鬆症治療のた
め、骨折治療のため、また整形外科的再構築、骨移植、
美容外科および歯科治療の目的のために有用である。更
に、該組成物は軟骨疾患の治療に有用である。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】ビタ
ミンＤ3、カルシトニン、エストロゲンおよびビスホス
ホネート誘導体を含む医薬組成物が実際の臨床で骨疾患
の治療に使用されてきた。しかし、それらの治療結果は
完全に満足すべきものではなく、より良い医薬組成物が
非常に望まれている。
【０００３】ＴＧＦ−βジーンスーパーファミリーに属
する成長因子例えばＢＭＰ、ＴＧＦおよびインヒビン関
連タンパク質が創傷治癒および組織修復に有用なことが
報告されている。これらのタンパク質のうちいくつかは
骨誘導活性を有することも知られている。ＰＣＴ出願Ｗ
Ｏ ９３／１６０９９およびＷＯ ９５／０４８１９に
は、ヒトＴＧＦ−β様タンパク質をコードしているＤＮ
Ａ配列および好適なタンパク質としてヒトＭＰ５２が開
示されている。
【０００４】E. E. Storm等は、Nature, １９９４年、
３６８巻、６３９〜６４２頁に、３種のマウス成長／分
化因子、すなわち、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６およびＧＤＦ７
がＴＧＦ−βジーンスーパーファミリーの新規なメンバ
ーとして同定され、またＧＤＦ５遺伝子での突然変異に
よりマウスで短肢症を惹起することを報告している。マ
ウスＧＤＦ５は、１個のアミノ酸を除いて、ヒトＭＰ５
２と同一の予想成熟型のアミノ酸配列を有している。し
かしこの報告には、骨疾患の治療にこれらのタンパク質
を使用することについては示唆されていない。
【０００５】従って、本発明の目的は、骨または軟骨誘
導促進剤として有用であるさらに進んだ成長因子を提供
するにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】成熟ＭＰ５２は１２０個
のアミノ酸を有するタンパク質とみなされている。その
アミノ酸配列は、配列表配列番号１（ＷＯ ９５／０４
８１９）の３５５番目から４７４番目までである。実際
に、驚くべきことに、適当なＤＮＡ配列を発現させる
と、種々のアミノ酸配列の長さを有するタンパク質、す
なわち成熟ＭＰ５２およびＨＭＷ（高分子量）ヒトＭＰ
５２を製造することを本発明者等は見い出した。本発明
は、骨誘導作用を有し、骨疾患の予防および（または）
治療に有用であるＨＭＷヒトＭＰ５２を確認するのに初
めて成功したものである。
【０００７】本発明は次の定義のいずれかに入るＨＭＷ
ヒトＭＰ５２に関する： （１） 配列表配列番号１の１番目から４７４番目まで
のアミノ酸配列を有するペプチドからなる二量体タンパ
ク質。 （２） 配列表配列番号１の１２１番目から４７４番目
までのアミノ酸配列を有するペプチドからなる二量体タ
ンパク質。 （３） 配列表配列番号１の１２２番目から４７４番目
までのアミノ酸配列を有するペプチドからなる二量体タ
ンパク質。 （４） 配列表配列番号１の１２１番目から４７４番目
までのアミノ酸配列を有するペプチドおよび配列番号１
の１２２番目から４７４番目までのアミノ酸配列を有す
るペプチドからなる二量体タンパク質。 （５） 配列表配列番号１の１番目から４７４番目まで
のアミノ酸配列を有するペプチドおよび配列番号１の１
２１番目および（または）１２２番目から４７４番目ま
でのアミノ酸配列を有するペプチドからなる二量体タン
パク質。 （６） 配列表配列番号１の１番目から４７４番目まで
のアミノ酸配列を有するペプチドおよび配列番号１の３
５５番目から４７４番目までのアミノ酸配列を有するペ
プチドからなる二量体タンパク質。 （７） 配列表配列番号１の１２１番目および（また
は）１２２番目から４７４番目までのアミノ酸配列を有
するペプチドおよび配列番号１の３５５番目から４７４
番目までのアミノ酸配列を有するペプチドからなる二量
体タンパク質。
【０００８】タンパク質は通常システインで形成される
−Ｓ−Ｓ−結合を介して二量体として存在する。本明細
書でのペプチドは単量体を意味する。ＨＭＷヒトＭＰ５
２は未分化間葉細胞からの軟骨の形成を誘起し、骨芽細
胞の分化、成熟を促進する。従って、ＨＭＷヒトＭＰ５
２は骨代謝異常に因る骨疾患例えば骨粗鬆症の予防およ
び（または）治療に有効である。これらのものはまた骨
折の治癒過程を促進する。更に、これらのものは整形外
科的再構築、骨移植および歯科治療においてその骨誘導
活性により有用である。更にまた、ＨＭＷヒトＭＰ５２
は軟骨代謝異常に因る軟骨障害の予防および（または）
治療に有効である。
【０００９】本発明のその他の目的は、ＨＭＷヒトＭＰ
５２の生産方法を提供するものであり、本発明方法で
は、配列番号１に示すＨＭＷヒトＭＰ５２をコードして
いるＤＮＡ配列を適当な宿主細胞に導入し、ＤＮＡ発現
およびタンパク質形成に好ましい条件下で培養し、次い
で該宿主細胞から採集された他のタンパク質から該タン
パク質を単離する。
【００１０】本発明の構成のうちで、配列番号１に説明
したＤＮＡ配列は、ＨＭＷヒトＭＰ５２、またそのより
短い部分の生産に使用し得る。但し、それらがＨＭＷヒ
トＭＰ５２をなおコードしていて、かつ適当なベクター
／宿主細胞系でのＤＮＡ配列の発現が可能であることを
条件とする。適当な発現系は当業者に知られていて、配
列番号１のＤＮＡ配列の長さに対する最小要件が何であ
るかを通常の実験により定めることができる。
【００１１】タンパク質形成に続いて、タンパク質をそ
れ自体既知の方法により宿主細胞から採取し、最後にＨ
ＭＷヒトＭＰ５２を単離する。特に、ＨＭＷヒトＭＰ５
２は、当業者に知られている極めて正確に分化する単離
方法を用いて実施することができる。例えば、逆相ＨＰ
ＬＣがこの目的に適合するものと考えられる。
【００１２】本発明のその他の目的は、ＨＭＷヒトＭＰ
５２を含む医薬組成物を提供することにある。随意、本
組成物は通常の担体物質、添加物質、希釈剤および（ま
たは）賦形剤を含有していてもよい。本発明の医薬組成
物は、骨誘導活性を有するため、骨、軟骨、結合組織、
皮膚、粘膜、上皮または歯の損傷の治療または予防、人
工歯根への適用、および創傷治癒および組織再生プロセ
スへの適用に有用である。
【００１３】ＨＭＷヒトＭＰ５２の１種を個別にあるい
は、ＨＭＷヒトＭＰ５２の混合物の形態で投与すること
が可能である。
【００１４】骨代謝異常に因る骨疾患の治療のために
は、ＨＭＷヒトＭＰ５２を注射例えば静脈注射、筋肉内
注射および腹腔内注射、経口投与、非経口投与例えば座
剤、また他のいずれかの常法により全身投与することが
できる。
【００１５】骨折の治療のためには、これらのものは注
射、経口および非経口投与により全身または局所投与す
ることができる。また、ＨＭＷヒトＭＰ５２を含むマト
リックスを骨折した骨に近い領域に移植するのが好まし
い。適当なマトリックスは、天然重合体例えばコラーゲ
ンおよびフィブリン接着剤（fibrin glue）および生体
内で分解可能な人工重合体例えばポリ乳酸グリコール酸
共重合体である。
【００１６】整形外科的再構築、美容外科、骨移植およ
び人工歯根の場合、ＨＭＷヒトＭＰ５２を例えば移植す
べき骨および歯の表面にコラーゲン・ペースト、フィブ
リン接着剤およびその他の接着性物質によって被覆する
ことができる。このものは骨および歯がそのまわりに移
植される組織、骨または歯槽骨にも適用できる。骨移植
の場合、このものは天然および人工骨双方に使用するこ
とができる。人工骨および歯の材料としては、通常の材
料例えば金属、セラミック、ガラスおよびその他の天然
または人工無機物質が使用される。ハイドロキシアパタ
イトが好適な人工物質である。人工骨は、内部の濃密な
物質およびその他の部の多孔性の材料により構成するこ
とができる。例えば人工骨の内部材料に密度の高い金
属、そしてその外側の材料に多孔性の金属を使用する。
人工骨の材料の１つに多孔性ハイドロキシアパタイトが
あげられる。このような多孔性材料を用いると、ＨＭＷ
ヒトＭＰ５２はその中に浸透することができる。ざらざ
らな人工骨の表面は、そこにＨＭＷヒトＭＰ５２を保持
することができる。
【００１７】骨再構築を促進するために、ガン性骨組織
を除去した部分にＨＭＷヒトＭＰ５２を投与できる。
【００１８】ＨＭＷヒトＭＰ５２の投与量は、目的およ
び適用方法に基づいて定められる。一般に、全身投与の
ときは、投与量は１μｇ〜１００μｇ／kgである。人工
根に使用するときは、好適な投与量は３０μｇ〜３０mg
／部位である。
【００１９】これらの精製ＨＭＷヒトＭＰ５２はいずれ
の通常の形態例えば注射液、丸剤、カプセル剤および座
剤に処方することができる。局所投与のためには、ＨＭ
ＷヒトＭＰ５２をマトリックス例えばコラーゲン、フィ
ブリン接着剤およびポリ乳酸グリコール酸共重合体に包
含させる。人工歯根および骨移植のためには、このもの
を骨および歯の表面または多孔性部分に投与する。
【００２０】
【発明の実施の形態】実施例を示して本発明を具体的に
説明する。
【００２１】
【実施例】
実施例１ ＨＭＷヒトＭＰ５２の製造 （１） ＨＭＷヒトＭＰ５２の発現ベクターの構築 Biopharm GmbHのDr. Hoettenから提供されたヒトＭＰ５
２遺伝子を含むｐＳＫ５２ｓベクターをHind IIIで消化
後、ヒトＭＰ５２遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを
０.８％低融点アガロースゲルからの抽出により単離
し、Behringwerke AGのDr. Gerd Zettlmeisslから提供
されたｐＡＢｓｔｏｐベクターのHind III部位に結合さ
せた。図１に示すＨＭＷヒトＭＰ５２発現ベクターのｐ
ＭＳＳ９９（５.０kb）の構造をＤＮＡ塩基配列決定お
よび制限酵素消化により確認した。ｐＭＳＳ９９のＨＭ
ＷヒトＭＰ５２ ＤＮＡ塩基配列は、配列表の配列番号
１に示した５７６番目から２２７９番目までのヌクレオ
チドであった。
【００２２】（２） ＨＭＷヒトＭＰ５２を生産するＣ
ＨＯクローンの確立 Behringwerke AGのDr. Zettlmeisslから提供されたＣＨ
Ｏ−ＤＵＫＸ−Ｂ１１細胞、すなわちＣＨＯ細胞の突然
変異株に、ｐＭＳＳ９９およびDr. Zettlmeisslから提
供されたｐＳＶＯＡｄｈｆｒをりん酸カルシウムＤＮＡ
共沈法によって導入した。次に、ＨＭＷヒトＭＰ５２の
高産生細胞株をメトトレキセート（ＭＴＸ）を用いる遺
伝子増幅法により確立した。
【００２３】ｐＭＳＳ９９の１０μｇおよびｐＳＶＯＡ
ｄｈｆｒの２μｇを２５mM ＨＥＰＥＳ−１４０mM Ｎａ
Ｃｌ−０.７５mM Ｎａ2ＨＰＯ4（pH７.０５）１mlに溶
解し、次に２.５Ｍ ＣａＣｌ2５０μｌと混合した。得
られた沈殿を１０cmディシュ中のＣＨＯ−ＤＵＫＸ−Ｂ
１１細胞に重層し、室温で３０分間放置した。次に、１
０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むリボ−およびデオキ
シリボ−ヌクレオチド含有ＭＥＭ ＡＬＰＨＡ培地（Ｍ
ＥＭα+）８mlを細胞層に加え、ＣＯ2インキュベーター
中４〜６時間培養した。細胞を１０％グリセロールで室
温３分間処理した後、１０％ＦＢＳを含むＭＥＭα+培
地で２日間培養した。次に１０％透析ＦＢＳを含むリボ
−およびデオキシリボ−ヌクレオチド不含ＭＥＭ ＡＬ
ＰＨＡ培地（ＭＥＭα-）中に細胞を撒き直して形質転
換株を選択した。形質転換クローンを単離し、次で記述
するウェスターンブロッティング分析によりＨＭＷヒト
ＭＰ５２の発現を検定した。ＨＭＷヒトＭＰ５２産生ク
ローンを更にメトトレキセート（ＭＴＸ）の濃度を上げ
ることにより段階的に選択して、ｐＳＶＯＡｄｈｆｒ遺
伝子に従ってＭＰ５２遺伝子を増幅させた。４００nM
ＭＴＸで１〜３μｇのＨＭＷヒトＭＰ５２／１０6細胞
／２４時間産生する数個のクローンが得られた。
【００２４】（３） 培養上清液中のＨＭＷヒトＭＰ５
２の検出 次のとおりのウェスターンブロッティング分析により、
ＨＭＷヒトＭＰ５２の発現についてクローンを検定し
た：培養上清液（１〜１５μｌ）を還元条件下にＳＤＳ
−ＰＡＧＥ（１５〜２５％ポリアクリルアミド勾配ゲ
ル、第一化学）により分離し、次にタンパク質をＰＶＤ
Ｆ膜（Clear Blot Membrane-P, ATTO）に転写した。膜
をBlock Ace（大日本製薬）で１時間ブロックし、Tris
緩衝食塩水（ＴＢＳ）ですすぎ、次に１０倍希釈された
Block Ace中のＨＭＷヒトＭＰ５２に対するニワトリ抗
体１０μｇ／mlで一晩処理した。膜を０.１％Tween２０
を含むＴＢＳ（ＴＴＢＳ）で洗った後、膜を１０倍希釈
Block Ace中のウサギ抗ニワトリＩｇＧ−ＡＬＰ複合体
(Sigma A9171)で処理した。膜をＴＴＢＳで洗い、アル
カリ性ホスファターゼ複合体基質キット（ＢＩＯ−ＲＡ
Ｄ）と反応させてＭＰ５２に相当するバンドを可視化し
た。
【００２５】（４） ＨＭＷヒトＭＰ５２生産ＣＨＯセ
ル・ラインの細胞培養 ＨＭＷヒトＭＰ５２の最高生産性を有するＣＨＯセル・
ラインのＭＣ−２（寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５１４
２）を１０％ＦＢＳ、４００nM ＭＴＸ、１００Ｕ／ml
ペニシリン、１００μｇ／mlストレプトマイシンを加え
たＭＥＭα-を入れたローラーボトルで増殖させた。Ｍ
Ｃ−２細胞がコンフルエンシーに達した後、細胞を血清
を含まないＭＥＭα-で洗い、次に１０mM ＨＥＰＥＳ
（pH７.３）、１０KIU Aprotinin、１mM酪酸ナトリウ
ム、６μｇ／mlセレン酸ナトリウム、５μｇ／mlトラン
スフェリン、１８μｇ／mlエタノールアミン、９μｇ／
mlインシュリン、１００Ｕ／mlペニシリン、１００μｇ
／mlストレプトマイシンを添加した血清を含まないＤＭ
Ｅ／Ｆ１２中で培養した。馴化培地を１週間毎日採集し
た。
【００２６】（５） ＨＭＷヒトＭＰ５２の精製 ＣＨＯ培養上澄液および０.１容量０.２Ｍりん酸ナトリ
ウム緩衝剤、pH６.０を混合し、５０mM ＮａＣｌ、２０
mMりん酸ナトリウム緩衝剤、pH６.０で予め平衡化して
おいたＰＯＲＯＳ ＨＳカラム（１０ml、PerSeptive Bi
osystems）にかけた。タンパク質を０.０５〜２Ｍ直線
勾配ＮａＣｌで溶出し、１０mlフラクション２０本に採
集した。溶離されたＭＰ５２は３つのタイプの単量体と
して認められ、それらの見掛け分子量を還元条件下でＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥ分析により約５２、４０および１４kDで
あると測定された。これらの単量体は、３つのタイプの
ホモ二量体（１０４kD、８０kDおよび２８kD）および３
つのタイプのヘテロ二量体（９２kD：４０kD〜５２kD、
６６kD：１４kD〜５２kD、および５４kD：１４kD〜４０
kD）を形成し、これらの二量体すべてをＨＭＷ（high m
olecular weight：高分子量）ヒトＭＰ５２と命名し
た。但し、２８kDホモ二量体はヒトＭＰ５２の成熟ホモ
二量体として知られている（ＷＯ ９５／０４８１９）
と思われるので除外する。従って、１０４kDホモ二量体
および８０kDホモ二量体を上記のフラクションから単離
してＮ末端アミノ酸配列および生物活性を検定した。
【００２７】５番目から９番目までのフラクションをプ
ールし、約１０倍に濃縮した。濃縮物を、１Ｍ ＮａＣ
ｌを含む２０mMりん酸ナトリウム緩衝剤、pH７.１で予
め平衡化したSuperdex 200pg（１.６ I.D.×６００cm、
Pharmacia)に充填した。流速０.５ml／分で溶離を行っ
た。１０４kDホモ二量体を含むフラクションと８０kDホ
モ二量体を含むフラクションとを別個にプールした。各
フラクションを逆相ＨＰＬＣカラム（RESOURCE RPC、３
ml、Pharmacia）にかけ、これらのタンパク質を３５〜
４０％アセトニトリルで溶出した。単離したＨＭＷヒト
ＭＰ５２の濃度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでのタンパク
質のバンドのデンシトメトリーにより測定した。Ｎ末端
アミノ酸配列分析は、パルス液ガス相シークエンサー
（Applied Biosystemsモデル４７６）を用いて、８０kD
ホモ二量体および１０４kDホモ二量体について、それぞ
れ行った。結果を表１に示す。
【００２８】
【表１】 アミノ酸配列８０kDは配列表配列番号１のＬｙｓ １２
１またはＡｌａ １２２からＡｒｇ ４７４に由来し、ま
たアミノ酸配列１０４kDはＡｌａ １からＡｒｇ４７４
に由来した。ＣＨＯ細胞は３つのタイプのホモ二量体、
１０４kD、８０kDおよび２８kD、および３つのタイプの
ヘテロ二量体、すなわち９２kD、６６kDおよび５４kDの
二量体を生産することが新たにわかった。
【００２９】実施例２ 生物学的活性 新生児ラット頭蓋冠細胞からクローニングされた骨原性
細胞様ＲＯＢ−Ｃ２６細胞（Calcif. Tissue Int.、４
９巻、２２１〜２２５頁、１９９１年）を１.５×１０4
細胞／ウエルの密度で４８−ウエル・マルチ・ウエルプ
レート（Coaster）にのせ、１０％ＦＢＳ含有ＭＥＭα-
中で３日間前培養した。培地を除去した後、１０％ＦＢ
Ｓを含有する新たなＭＥＭα-および１０mM ＨＣｌ中連
続希釈した８０kDまたは１０４kD ＨＭＷヒトＭＰ５２
を培養物に加え、培地および添加物を３日目に交換しな
がら６日間培養した。細胞層をりん酸緩衝食塩水で洗
い、１mM ＭｇＣｌ2を含む０.２％Nonidetで抽出した。
アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）活性をTakuwa等の
方法（Am. J. Physiol.、２５７巻、Ｅ７９７〜Ｅ８０
３頁、１９８９年）に従って測定した。表２に示すよう
に、８０kDまたは１０４kDのＨＭＷヒトＭＰ５２でのＲ
ＯＢ−Ｃ２６細胞の処理により、ウエル当りのＡＬＰ総
活性が濃度依存して増大された。
【００３０】
【表２】
【００３１】
【配列表】
配列番号：１ 配列の型：対応するタンパク質のヌクレオチド 配列の長さ：２７０３ 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直線状 分子の型：cDNA − mRNA 起源 生物名：ヒト（homo sapiens） 640〜720 bp シグナルペプチド 1783〜2142 bp 成熟ペプチド 組織の種類：ヒト胎児 配列記載：配列番号１： CCATGGCCTC GAAAGGGCAG CGGTGATTTT TTTCACATAA ATATATCGCA CTTAAATGAG 60 TTTAGACAGC ATGACATCAG AGAGTAATTA AATTGGTTTG GGTTGGAATT CCGTTTCCAA 120 TTCCTGAGTT CAGGTTTGTA AAAGATTTTT CTGAGCACCT GCAGGCCTGT GAGTGTGTGT 180 GTGTGTGTGT GTGTGTGTGT GTGTGTGTGA AGTATTTTCA CTGGAAAGGA TTCAAAACTA 240 GGGGGAAAAA AAAACTGGAG CACACAGGCA GCATTACGCC ATTCTTCCTT CTTGGAAAAA 300 TCCCTCAGCC TTATACAAGC CTCCTTCAAG CCCTCAGTCA GTTGTGCAGG AGAAAGGGGG 360 CGGTTGGCTT TCTCCTTTCA AGAACGAGTT ATTTTCAGCT GCTGACTGGA GACGGTGCAC 420 GTCTGGATAC GAGAGCATTT CCACTATGGG ACTGGATACA AACACACACC CGGCAGACTT 480 CAAGAGTCTC AGACTGAGGA GAAAGCCTTT CCTTCTGCTG CTACTGCTGC TGCCGCTGCT 540 TTTGAAAGTC CACTCCTTTC ATGGTTTTTC CTGCCAAACC AGAGGCACCT TTGCTGCTGC 600 CGCTGTTCTC TTTGGTGTCA TTCAGCGGCT GGCCAGAGG ATG AGA CTC CCC AAA 654 Met Arg Leu Pro Lys -25 CTC CTC ACT TTC TTG CTT TGG TAC CTG GCT TGG CTG GAC CTG GAA TTC 702 Leu Leu Thr Phe Leu Leu Trp Tyr Leu Ala Trp Leu Asp Leu Glu Phe -20 -15 -10 ATC TGC ACT GTG TTG GGT GCC CCT GAC TTG GGC CAG AGA CCC CAG GGG 750 Ile Cys Thr Val Leu Gly Ala Pro Asp Leu Gly Gln Arg Pro Gln Gly -5 1 5 10 ACC AGG CCA GGA TTG GCC AAA GCA GAG GCC AAG GAG AGG CCC CCC CTG 798 Thr Arg Pro Gly Leu Ala Lys Ala Glu Ala Lys Glu Arg Pro Pro Leu 15 20 25 GCC CGG AAC GTC TTC AGG CCA GGG GGT CAC AGC TAT GGT GGG GGG GCC 846 Ala Arg Asn Val Phe Arg Pro Gly Gly His Ser Tyr Gly Gly Gly Ala 30 35 40 ACC AAT GCC AAT GCC AGG GCA AAG GGA GGC ACC GGG CAG ACA GGA GGC 894 Thr Asn Ala Asn Ala Arg Ala Lys Gly Gly Thr Gly Gln Thr Gly Gly 45 50 55 CTG ACA CAG CCC AAG AAG GAT GAA CCC AAA AAG CTG CCC CCC AGA CCG 942 Leu Thr Gln Pro Lys Lys Asp Glu Pro Lys Lys Leu Pro Pro Arg Pro 60 65 70 GGC GGC CCT GAA CCC AAG CCA GGA CAC CCT CCC CAA ACA AGG CAG GCT 990 Gly Gly Pro Glu Pro Lys Pro Gly His Pro Pro Gln Thr Arg Gln Ala 75 80 85 90 ACA GCC CGG ACT GTG ACC CCA AAA GGA CAG CTT CCC GGA GGC AAG GCA 1038 Thr Ala Arg Thr Val Thr Pro Lys Gly Gln Leu Pro Gly Gly Lys Ala 95 100 105 CCC CCA AAA GCA GGA TCT GTC CCC AGC TCC TTC CTG CTG AAG AAG GCC 1086 Pro Pro Lys Ala Gly Ser Val Pro Ser Ser Phe Leu Leu Lys Lys Ala 110 115 120 AGG GAG CCC GGG CCC CCA CGA GAG CCC AAG GAG CCG TTT CGC CCA CCC 1134 Arg Glu Pro Gly Pro Pro Arg Glu Pro Lys Glu Pro Phe Arg Pro Pro 125 130 135 CCC ATC ACA CCC CAC GAG TAC ATG CTC TCG CTG TAC AGG ACG CTG TCC 1182 Pro Ile Thr Pro His Glu Tyr Met Leu Ser Leu Tyr Arg Thr Leu Ser 140 145 150 GAT GCT GAC AGA AAG GGA GGC AAC AGC AGC GTG AAG TTG GAG GCT GGC 1230 Asp Ala Asp Arg Lys Gly Gly Asn Ser Ser Val Lys Leu Glu Ala Gly 155 160 165 170 CTG GCC AAC ACC ATC ACC AGC TTT ATT GAC AAA GGG CAA GAT GAC CGA 1278 Leu Ala Asn Thr Ile Thr Ser Phe Ile Asp Lys Gly Gln Asp Asp Arg 175 180 185 GGT CCC GTG GTC AGG AAG CAG AGG TAC GTG TTT GAC ATT AGT GCC CTG 1326 Gly Pro Val Val Arg Lys Gln Arg Tyr Val Phe Asp Ile Ser Ala Leu 190 195 200 GAG AAG GAT GGG CTG CTG GGG GCC GAG CTG CGG ATC TTG CGG AAG AAG 1374 Glu Lys Asp Gly Leu Leu Gly Ala Glu Leu Arg Ile Leu Arg Lys Lys 205 210 215 CCC TCG GAC ACG GCC AAG CCA GCG GCC CCC GGA GGC GGG CGG GCT GCC 1422 Pro Ser Asp Thr Ala Lys Pro Ala Ala Pro Gly Gly Gly Arg Ala Ala 220 225 230 CAG CTG AAG CTG TCC AGC TGC CCC AGC GGC CGG CAG CCG GCC TCC TTG 1470 Gln Leu Lys Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gly Arg Gln Pro Ala Ser Leu 235 240 245 250 CTG GAT GTG CGC TCC GTG CCA GGC CTG GAC GGA TCT GGC TGG GAG GTG 1518 Leu Asp Val Arg Ser Val Pro Gly Leu Asp Gly Ser Gly Trp Glu Val 255 260 265 TTC GAC ATC TGG AAG CTC TTC CGA AAC TTT AAG AAC TCG GCC CAG CTG 1566 Phe Asp Ile Trp Lys Leu Phe Arg Asn Phe Lys Asn Ser Ala Gln Leu 270 275 280 TGC CTG GAG CTG GAG GCC TGG GAA CGG GGC AGG GCC GTG GAC CTC CGT 1614 Cys Leu Glu Leu Glu Ala Trp Glu Arg Gly Arg Ala Val Asp Leu Arg 285 290 295 GGC CTG GGC TTC GAC CGC GCC GCC CGG CAG GTC CAC GAG AAG GCC CTG 1662 Gly Leu Gly Phe Asp Arg Ala Ala Arg Gln Val His Glu Lys Ala Leu 300 305 310 TTC CTG GTG TTT GGC CGC ACC AAG AAA CGG GAC CTG TTC TTT AAT GAG 1710 Phe Leu Val Phe Gly Arg Thr Lys Lys Arg Asp Leu Phe Phe Asn Glu 315 320 325 330 ATT AAG GCC CGC TCT GGC CAG GAC GAT AAG ACC GTG TAT GAG TAC CTG 1758 Ile Lys Ala Arg Ser Gly Gln Asp Asp Lys Thr Val Tyr Glu Tyr Leu 335 340 345 TTC AGC CAG CGG CGA AAA CGG CGG GCC CCA CTG GCC ACT CGC CAG GGC 1806 Phe Ser Gln Arg Arg Lys Arg Arg Ala Pro Leu Ala Thr Arg Gln Gly 350 355 360 AAG CGA CCC AGC AAG AAC CTT AAG GCT CGC TGC AGT CGG AAG GCA CTG 1854 Lys Arg Pro Ser Lys Asn Leu Lys Ala Arg Cys Ser Arg Lys Ala Leu 365 370 375 CAT GTC AAC TTC AAG GAC ATG GGC TGG GAC GAC TGG ATC ATC GCA CCC 1902 His Val Asn Phe Lys Asp Met Gly Trp Asp Asp Trp Ile Ile Ala Pro 380 385 390 CTT GAG TAC GAG GCT TTC CAC TGC GAG GGG CTG TGC GAG TTC CCA TTG 1950 Leu Glu Tyr Glu Ala Phe His Cys Glu Gly Leu Cys Glu Phe Pro Leu 395 400 405 410 CGC TCC CAC CTG GAG CCC ACG AAT CAT GCA GTC ATC CAG ACC CTG ATG 1998 Arg Ser His Leu Glu Pro Thr Asn His Ala Val Ile Gln Thr Leu Met 415 420 425 AAC TCC ATG GAC CCC GAG TCC ACA CCA CCC ACC TGC TGT GTG CCC ACG 2046 Asn Ser Met Asp Pro Glu Ser Thr Pro Pro Thr Cys Cys Val Pro Thr 430 435 440 CGG CTG AGT CCC ATC AGC ATC CTC TTC ATT GAC TCT GCC AAC AAC GTG 2094 Arg Leu Ser Pro Ile Ser Ile Leu Phe Ile Asp Ser Ala Asn Asn Val 445 450 455 GTG TAT AAG CAG TAT GAG GAC ATG GTC GTG GAG TCG TGT GGC TGC AGG 2142 Val Tyr Lys Gln Tyr Glu Asp Met Val Val Glu Ser Cys Gly Cys Arg 460 465 470 TAG CAGCACTGGC CCTCTGTCTT CCTGGGTGGC ACATCCCAAG AGCCCCTTCC 2195 *** 475 TGCACTCCTG GAATCACAGA GGGGTCAGGA AGCTGTGGCA GGAGCATCTA CACAGCTTGG 2255 GTGAAAGGGG ATTCCAATAA GCTTGCTCGC TCTCTGAGTG TGACTTGGGC TAAAGGCCCC 2315 CTTTTATCCA CAAGTTCCCC TGGCTGAGGA TTGCTGCCCG TCTGCTGATG TGACCAGTGG 2375 CAGGCACAGG TCCAGGGAGA CAGACTCTGA ATGGGACTGA GTCCCAGGAA ACAGTGCTTT 2435 CCGATGAGAC TCAGCCCACC ATTTCTCCTC ACCTGGGCCT TCTCAGCCTC TGGACTCTCC 2495 TAAGCACCTC TCAGGAGAGC CACAGGTGCC ACTGCCTCCT CAAATCACAT TTGTGCCTGG 2555 TGACTTCCTG TCCCTGGGAC AGTTGAGAAG CTGACTGGGC AAGAGTGGGA GAGAAGAGGA 2615 GAGGGCTTGG ATAGAGTTGA GGAGTGTGAG GCTGTTAGAC TGTTAGATTT AAATGTATAT 2675 TGATGAGATA AAAAGCAAAA CTGTGCCT 2703
【図面の簡単な説明】
【図１】ＨＭＷヒトＭＰ５２発現ベクターｐＭＳＳ９９
（５.０kb）のプラスミドマップである。ｐＭＳＳ９９
でのＨＭＷヒトＭＰ５２ ＤＮＡ塩基配列は、配列表の
配列番号１に示す５７６番目から２２７９番目のヌクレ
オチドである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ｃ１２Ｎ 5/10 9281−4Ｂ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 河合 伸治 埼玉県川越市南台１丁目３番地２ ヘキス トジャパン株式会社医薬研究開発本部内 (72)発明者 藤野 幸夫 埼玉県川越市南台１丁目３番地２ ヘキス トジャパン株式会社医薬研究開発本部内

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 （１） 配列表配列番号１の１番目から
    ４７４番目までのアミノ酸配列を有するペプチドからな
    る二量体タンパク質、（２） 配列表配列番号１の１２
    １番目から４７４番目までのアミノ酸配列を有するペプ
    チドからなる二量体タンパク質、（３） 配列表配列番
    号１の１２２番目から４７４番目までのアミノ酸配列を
    有するペプチドからなる二量体タンパク質、（４） 配
    列表配列番号１の１２１番目から４７４番目までのアミ
    ノ酸配列を有するペプチドおよび配列番号１の１２２番
    目から４７４番目までのアミノ酸配列を有するペプチド
    からなる二量体タンパク質、（５） 配列表配列番号１
    の１番目から４７４番目までのアミノ酸配列を有するペ
    プチドおよび配列番号１の１２１番目および（または）
    １２２番目から４７４番目までのアミノ酸配列を有する
    ペプチドからなる二量体タンパク質、（６） 配列表配
    列番号１の１番目から４７４番目までのアミノ酸配列を
    有するペプチドおよび配列番号１の３５５番目から４７
    ４番目までのアミノ酸配列を有するペプチドからなる二
    量体タンパク質、（７） 配列表配列番号１の１２１番
    目および（または）１２２番目から４７４番目までのア
    ミノ酸配列を有するペプチドおよび配列番号１の３５５
    番目から４７４番目までのアミノ酸配列を有するペプチ
    ドからなる二量体タンパク質、およびそれら混合物から
    なる群から選択されるＨＭＷヒトＭＰ５２と命名された
    タンパク質。
  2. 【請求項２】 配列表配列番号１に示す少なくとも７２
    １番目から２１４５番目までのＤＮＡ配列を含有するＤ
    ＮＡを適当な宿主細胞に導入し、そして該ＤＮＡ−配列
    の発現およびタンパク質形成を可能とする条件下で宿主
    細胞を培養することからなる請求項１記載のＨＭＷヒト
    ＭＰ５２の生産方法。
  3. 【請求項３】 請求項１記載のＨＭＷヒトＭＰ５２の少
    なくとも１種を活性成分として含有する医薬組成物。
  4. 【請求項４】 整形外科的再構築、骨移植、美容外科ま
    たは人工歯根に使用するための請求項３記載の医薬組成
    物。
  5. 【請求項５】 骨形成、骨、軟骨、結合組織、皮膚、粘
    膜、上皮または歯の損傷の治療または予防を促進するた
    め、人工歯根での適用のため、および創傷治癒および組
    織再生過程での適用のための請求項３記載の医薬組成物
    の使用。
  6. 【請求項６】 骨粗鬆症または骨折の治療のための請求
    項３記載の医薬組成物の使用。
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