CN1196087A - 新型蛋白质hmw人mp52 - Google Patents

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河合伸治
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Abstract

一种名为HMW人MP52的蛋白质,它在CHO细胞中制备,具有序列表中序列号1所示的氨基酸序列;一种制备HMW人MP52的方法;一种以HMW人MP52作活性成分的药物组合物。因为HMW人MP52具有促进骨形成的作用,它能用于治疗或预防骨疾病等。

Description

新型蛋白质HMW人MP52
技术领域
本发明涉及新型的HMW人MP52以及由它形成的尤其对软骨和骨形成起促进作用的药物组合物。该药物组合物尤其对骨代谢异常所引起的骨疾病有利，如利于骨质疏松的治疗、骨折的治疗、整形外科的重建、骨移植、美容外科及齿科的治疗。另外，该组合物有利于软骨疾病的治疗。
技术背景
临床中实际用于治疗骨疾病的药物组合物包括维生素D3、降钙素、雌激素及双磷酸盐的衍生物。但是，这些药物的治疗效果还不尽人意，人们殷切期望有更好的药物组合物。
已报导属于TGF-β超家族的生长因子，如BMP、TGF及抑制素相关的蛋白质有利于伤口愈合及组织的修复。已知这些蛋白质中有些具有骨形成活性。PCT专利申请WO 93/16099及WO 95/04819中公开了编码人TGF-β样蛋白质的DNA序列及优选的蛋白质人MP52。
E.E.Storm等于自然，1994年，368卷，639-642页报导了，确定了三种小鼠生长/分化因子，即GDF5、GDF6及GDF7为TGF-β超家族的新成员，并且报导因GDF5基因的突变而引起小鼠的短肢症。小鼠GDF5除1个氨基酸外，具有与人MP52相同的预期成熟型氨基酸序列。但该报导中没有表明用这种蛋白质治疗骨疾病。
发明公开
本发明的目的是提供另外一种生长因子，它可作为骨或软骨形成的促进剂。
有人认为成熟型MP52是具有120个氨基酸的蛋白质，其氨基酸序列为序列表序列号1(WO 95/04819)中的355-474位。本发明者们意外地发现，当表达合适的DNA序列时，能形成具有不同氨基酸序列长度的蛋白质，即形成成熟型MP52及HMW(高分子量)人MP52。本发明首次成功地证实HMW人MP52具有骨形成活性，有利于骨疾病的预防及治疗。
本发明涉及符合下列定义任何之一的HMW人MP52：
(1)一种二聚体蛋白质，包括具有序列表中序号1的第1-474位氨基酸序列的肽。
(2)一种二聚体蛋白质，包括具有序列表中序号1的第121-474位氨基酸序列的肽。
(3)一种二聚体蛋白质，包括具有序列表中序号1的第122-474位氨基酸序列的肽。
(4)一种二聚体蛋白质，包括具有序列表中序号1的第121-474位氨基酸序列及序列号1中第122-474位氨基酸序列的肽。
(5)一种二聚体蛋白质，包括具有序列表中序列号1的第1-474位氨基酸序列及序列号1中的第121和(或)第122-474位氨基酸序列的肽。
(6)一种二聚体蛋白质，包括具有序列表中序列号1的第1-474位氨基酸序列及序列号1中第355-474位的氨基酸序列的肽。
(7)一种二聚体蛋白质，包括具有序列表中序列号1的第121及(或)第122-474位氨基酸序列，以及序列号1中第355-474位氨基酸序列的肽
通常蛋白质通过由半胱氨基酸形成的-S-S-键以二聚体形式存在。本说明书中，肽指单体。
HMW人MP52能诱导未分化的间质细胞形成软骨、促进成骨细胞的分化和成熟。因此，HMW人MP52能对因骨代谢异常引起的骨疾病，如骨质疏松的预防及(或)治疗有效。它们也能促进骨折的愈合过程。此外，因为它们具有骨形成活性，所以有利于整形外科的重建、骨移植，以及齿科的治疗。而且，HMW人MP52对因软骨代谢异常而引起的软骨疾病的预防及(或)治疗有效。
本发明的其它目的是提供HMW人MP52的制备方法，其方法为把序列号1中所示的、编码HMW人MP52的DNA序列导入合适的宿主细胞，在表达DNA及形成蛋白质的优选条件下进行培养，然后从由宿主细胞收集到的蛋白质中分离该蛋白质。
本发明的构架中，序列号1所描述的DNA序列用于制备HMW人MP52及它的较短部分。但条件是，它们仍能编码HMW人MP52，并能在合适的载体/宿主细胞系中表达DNA序列。适宜的表达细胞系为本领域的技术人员所熟知，可通过常规实验来确定序列号1中DNA长度的最小要求条件。
蛋白质形成之后，用目前已知的方法从宿主细胞中收集，最后从中分离HMW人MP52。尤其对于HMW人MP52的分离，可用本领域的技术人员已知的、极精确的分化分离方法进行。例如，可考虑用逆相HPLC来达到此目的。
本发明的其它目的是提供含HMW人MP52的药物组合物。根据不同的场合，本组合物可含有通用的载体物质、添加物、稀释剂及(或)赋形剂。因为本发明的药物组合物具有骨形成活性，所以有利于骨、软骨、结缔组织、皮肤、粘膜、上皮或牙齿损伤的治疗或预防，利于牙科植入物、伤口愈合及组织再生过程中使用。
可单独应用HMW人MP52的一种，或以HMW人MP52的混合物形式施用。
HMW人MP52用于治疗因骨代谢失常引起的骨疾病时，可注射施用，如静脉注射、肌肉内注射，可口服、胃肠外施用，如栓剂，或用其它任何一种传统方法进行全身施用。
该物质用于治疗骨折时，可由注射、口服及胃肠外进行全身施用或局部施用。优选把含有HMW人MP52的基质植入离发生骨折的骨的邻近部位。适宜的基质为天然聚合物，如胶原、纤维蛋白胶(firin glue)、体内可分解的人工聚合物如聚乳酸乙醇酸共聚物。
HMW人MP52用于整形外科的重建、美容外科、骨移植及牙科植入物时，例如可通过胶原·糊、纤维蛋白胶和其它粘附物质将它粘附于待移植骨和齿的表面。该物质也可在骨及齿周围植入的组织、骨或齿槽骨中使用。用于骨移植时，既可使用天然骨又可使用人工骨。人工骨和齿的材料可使用传统的材料，如金属、陶瓷、玻璃和其它天然的或人工的无机物。羟磷灰石是优选的人工物质。人工骨的内部是致密物质，其它部分为多孔材料。例如，人工骨的内部使用高密度金属材料，其外侧使用多孔性的金属材料。多孔性羟磷灰石是人工骨的材料之一。使用这样的多孔性材料，HMW人MP52可渗透到其中。要把人工骨的表面弄粗糙些，这样HMW人MP52可保持在其上。
用于促进骨重建时，可在癌性骨组织去除之后的部分施用HMW人MP52。
根据施用目的及施用方法来确定HMW人MP52的施用量。通常，全身施用时，施用量为1μg～100μg/kg。牙科植入物施用时，适宜的用量为30μg～30mg/部位。
可以任何常规的形式对纯化的HMW人MP52进行制剂化，如制成注射液、丸剂、胶囊及栓剂。局部施用时，要把HMW人MP52包涵在基质，如胶原、纤维蛋白胶、聚乳酸乙醇酸共聚物中。用于齿科植入和骨移植时，把该物质施于骨和齿的表面或多孔部分。
附图简述
图1是HMW人MP52表达载体-pMSS99(5.0kb)的质粒图。pMSS99中HMW人MP52的DNA碱基序列为序列表中序号1所示的第576-2279位核苷酸。
最佳实施方案
通过实施例对本发明进行具体说明。实施例1HMW人MP52的制备(1)HMW人MP52表达载体的构建
用Hind III消化由Biopharm GmbH的Dr.Hoetten提供的含人MP52基因的pSK52s载体后，用0.8％低熔点的琼脂糖凝胶提取.分离含人MP52基因的DNA片段，联结到Behringwerke AG的Dr.Gerd Zettlmeissl提供的pABstop载体的Hind III部位。通过DNA碱基序列测定和限制性酶谱来证实图1所示的HMW人MP52表达载体pMSS99(5.0kb)的结构。pMSS99中HMW人MP52的DNA序列为序列表中序列号1所示的第576-2279位核苷酸。(2)产HMW人MP52的CHO克隆的建立
用磷酸钙介导的DNA转移法将pMSS99和Dr.Zettlmeissl提供的pSVOA dhfr导入Behringwerke AG的Dr.Zettlmeissl提供的CHO-DUKX-B11细胞，即CHO细胞的突变株中。接着用氨甲蝶呤(MTX)通过基因扩增法建立HMW人MP52的高产细胞株。
将10μg pMS99和2μg pSVOA dhfr溶解到1ml的25mM HEPES-140mM NaCl-0.75mM  Na2HPO4(pH 7.05)中，接着与2.5M CaCl250μl混合。将所得沉淀涂在位于10cm平皿中的CHO-DUKX-Bll细胞上，室温放置30分钟。然后将含有10％胎牛血清(FBS)的核苷及脱氧核苷MEMα培养基(MEMα+)8ml加到细胞层上，在CO2培养箱中培养4～6h。室温下将细胞在10％的甘油中处理3分钟，然后在含10％FBS的培养基MEMα+中培养2天。接着将细胞重放于含10％透析FBS、而不含有核苷和脱氧核苷的MEMα培养基中(MEMα-)筛选转化株。分离转化的克隆，接下面描述的Western blot分析法鉴定HMW人MP52的表达。
通过增加氨甲蝶呤的(MTX)的浓度来进一步逐步筛选生产HMW人MP52的克隆，根据pSVOA dhfr基因来扩增MP52基因。在400nM MTX中能得到这样几个克隆，它们的生产能力为1～3μg·HMW人MP52/106细胞/24h。(3)检测培养上清中的HMW人MP52
接下面的Western印迹分析法来鉴定表达HMW人MP52的克隆：还原条件下，用SDS-PAGE(15～25％聚丙烯酰胺梯度凝胶，第一化学)分离培养上清液(1～15μl)，然后将蛋白质转移到PVDF膜(Clear BlotMembrane-P.ATTO)上。把膜在Block Ace(大日本制药)中封闭1小时，用Tris-缓冲盐水冲洗，然后在10倍稀释的Block Ace中用抗HMW人MP52的鸡抗体10μg/ml处理一晚。用含0.1％Tween 20的TBS(TTBS)洗膜，之后在10倍稀释的Block Ace中，用兔-抗鸡的Ig G-ALP偶联物(Sigma A9171处理膜。用TTBS洗膜，然后与碱性磷酸酶偶联基质试剂盒(BIO-RAD)进行反应。可看到与MP52相应的反应带。(4)产HMW人MP52的CHO细胞系的细胞培养
在含有补充有10％FBS、400nM MTX、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的MEMα-的转瓶中培养具有HMW人MP52最高生产能力的CHO细胞系-MC-2[MC-2于1995.6月21日保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所{日本国茨城县筑波市东1丁目1番3号(邮编305)}，保藏号为FERM BP-5142]。当MC-2细胞达到对数期后，用不含血清的MEMα-洗涤，然后在不含血清、添增了10mM HEPES(pH 7.3)、10KIU Aprotinin(抑肽素)、1mM丁酸钠、6μg/ml硒酸钠、5μg/ml转铁蛋白、1μg/ml乙醇胺、9μg/ml胰岛素、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的DME/F12中培养。每天收集条件培养基、收集1周。(5)HMW人MP52的纯化
将CHO培养上清液与0.1体积的0.2M磷酸钠缓冲液，pH 6.0混合，上POROS HS柱(10ml，Perseptive Biosystems)，柱预先用50mMNaCl、20mM磷酸钠缓冲液pH6.0平衡过。用0.05-2M线性梯度的NaCl洗脱蛋白质，将收集20份10ml的级份。认为洗脱的蛋白质为3种类型的单体，还原条件下通过SDS-PAGE分析可确定其表观分子量为52、40和1.4kD。这些单体形成3种类型的同源二聚体(104kD、80kD及28kD)和3种类型的异二聚体(92kD∶40kD～52kD，66kD∶14kD～52kD，54kD∶14kD～40kD)把这些二聚体统称为HMW(highmolecular weight，高分子量)人MP52，但28kD的同源二聚体除外，因为认为它是人MP52的成熟型同源二聚体(WO95/04819)。因此从上面的级份中分离出104kD及80kD的同源二聚体，检测其N末端的氨基酸序列和生物活性。
集中从第5～第9的级份，浓缩10倍。把浓缩物加到预先用含1MNaCl的20mM磷酸钠缓冲液、pH 7.1平衡过的Superdex 200pg(1.6cmI.D.×60cm，Pharmacia)上。以0.5ml/分的流速进行洗脱，分别集中含104kD同源二聚体的级份和含80kD同源二聚体的级份。把各级分加到逆相PHLC柱(RESOURCE RPC，3ml，Pharmacia)上，用35～40％的乙腈洗脱蛋白质。通过SDS-PAGE上蛋白质基带光密度测定来测定分离的HMW人MP52的浓度。
用脉冲液气相测序议(Applied systems，型号476)进行N末端氨基酸序列分析，80kD同源二聚体和104kD同源二聚体分别进行。结果如表1所示。
            表1
HMW MP52              N-末端氨基酸
80kD    Lys Ala Arg Glu Pro Gly Pro Pro Arg Glu Pro
            Ala Arg Glu Pro Gly Pro Pro Arg Glu Pro Lys
104kD   Ala Pro Asp Leu Gly Gln Arg Pro Gln Gly Thr
氨基酸序列80kD由序列表中序号1的Lys121或Ala122-Arg 474组成，氨基酸序列104kD由Alal-Arg 474组成。CHO细胞制备3种类型的同源二聚体，104kD、80kD、28kD，并能制备3种类型的异二聚体，即92kD、66kD及54kD的二聚体，这是一新发现。实施例2生物学活性
将由新生大鼠颅骨细胞克隆而来的骨远祖细胞样ROB-C26细胞(Calcif.Tissue Int.，49卷，221-225页、1991年)以1.5×104细胞/孔的密度铺到48孔多孔培养板中，在含10％FBS的MEMα-中预培养3天。去除培养基之后，把含10％FBS的新MEMα-和在10mM HCl中稀释的80kD或104kD HMW人MP52加到培养物中，在第3天更换培养基和添加物，共培养6天。用磷酸缓冲盐水洗涤细胞层，用含1mMMgCl2的0.2％Nonidet提取。依据Takuwa等的方法(美国生理学杂志，257卷，E797～E803页，1989年)来检测碱性磷酸酶(ALP)的活性。如表2所示，经80kD或104kD HMW人MP52处理的ROB-C26细胞，其每孔ALP的总活性呈浓度依赖性的增加。
                表2
    80kD和104kD HMW人MP52对
    ROB-C26细胞系ALP活性的影响
                                    ALP活性
化合物              浓度(ng/ml)     (nmol/分/孔)
媒介物处理的对照        -             5.47±0.81
80kD HMW               3.6           5.42±1.09
人MP52                 29            7.00±0.89
                       86            14.30±0.24*
                       290           16.28±0.19*
                       860           18.41±1.95*
104kD HMW              11            6.51±0.90
人MP52                 38            7.54±0.29
                       110           8.32±0.12*
                       380           12.07±0.53*
                       1100          16.98±0.47*
数值表示3或4个培养物的均值±标准差。
*p＜0.01、与媒介物处理的对照组相比(Dunnett检验)。序列表序列数：1序列类型：与蛋白质相对应的核苷酸序列长度：2703链型：双键拓补学：线性分子类型：cDNA-mRNA来源生物名：人(homo sapiens)640～720bp信号肽1783～2142bp成熟肽组织种类：人胎儿序列描述：序列号1：CCATGGCCTC GAAAGGGCAG CGGTGATTTT TTTCACATAA ATATATCGCA CTTAAATGAG      60TTTAGACAGC ATGACATCAG AGAGTAATTA AATTGGTTTG GGTTGGAATT CCGTTTCCAA     120TTCCTGAGTT CAGGTTTGTA AAAGATTTTT CTGAGCACCT GCAGGCCTGT GAGTGTGTGT     180GTGTGTGTGT GTGTGTGTGT GTGTGTGTGA AGTATTTTCA CTGGAAAGGA TTCAAAACTA     240GGGGGAAAAA AAAACTGGAG CACACAGGCA GCATTACGCC ATTCTTCCTT CTTGGAAAAA     300TCCCTCACCC TTATACAAGC CTCCTTCAAG CCCTCAGTCA GTTGTGCAGG AGAAAGGGGG     360CGGTTGGCTT TCTCCTTTCA AGAACGAGTT ATTTTCAGCT GCTGACTGGA GACGGTGCAC     420GTCTGGATAC GAGAGCATTT CCACTATGGG ACTGGATACA AACACACACC CGGCAGACTT     480CAAGAGTCTC AGACTGAGGA GAAAGCCTTT CCTTCTGCTG CTACTGCTGC TGCCGCTGCT     540TTTGAAAGTC CACTCCTTTC ATGGTTTTTC CTGCCAAACC AGAGGCACCT TTGCTGCTGC     600CGCTGTTCTC TTTGGTGTCA TTCAGCGGCT GGCCAGAGG ATG AGA CTG CCC AAA        654
                                       Met Arg Leu Pro Lys
                                               -25CTC CTC ACT TTC TTG CTT TGG TAC CTG GCT TGG CTG GAC CTG GAA TTC       702Leu Leu Thr Phe Leu Leu Trp Tyr Leu Ala Trp Leu Asp Leu Glu Phe
    -20                 -l5                 -10ATC TGC ACT GTG TTG GGT GCC CCT GAC TTG GGC CAG AGA CCC CAG GGG    750Ile Cys Thr Val Leu Gly Ala Pro Asp Leu Gly Gln Arg Pro Gln Gly
-5                   1               5                  10ACC AGG CCA GGA TTG GCC AAA GCA GAG GCC AAG GAG AGG CCC CCC CTG    798Thr Arg Pro Gly Leu Ala Lys Ala Glu Ala Lys Glu Arg Pro Pro Leu
            15                  20                  25GCC CGG AAC GTC TTC AGG CCA GGG GGT CAC AGC TAT GGT GGG GGG GCC    846Ala Arg Asn Val Phe Arg Pro Gly Gly His Ser Tyr Gly Gly Gly Ala
        30                  35                  40ACC AAT GCC AAT GCC AGG GCA AAG GGA GGC ACC GGG CAG ACA GGA GGC    894Thr Asn Ala Asn Ala Arg Ala Lys Gly Gly Thr Gly Gln Thr Gly Gly
    45                  50                  55CTG ACA CAG CCC AAG AAG GAT GAA CCC AAA AAG CTG CCC CCC AGA CCG    942Leu Thr Gln Pro Lys Lys Asp Glu Pro Lys Lys Leu Pro Pro Arg Pro
60                  65                  70GGC GGC CCT GAA CCC AAG CCA GGA CAC CCT CCC CAA ACA AGG CAG GCT    990Gly Gly Pro Glu Pro Lys Pro Gly His Pro Pro Gln Thr Arg Gln Ala75                  80                  85                  90ACA GCC CGG ACT GTG ACC CCA AAA GGA CAG CTT CCC GGA GGC AAG GCA    1038Thr Ala Arg Thr Val Thr Pro Lys Gly Gln Leu Pro Gly Gly Lys Ala
            95                  100                 105CCC CCA AAA GCA GGA TCT GTC CCC AGC TCC TTC CTG CTG AAG AAG GCC    1086Pro Pro Lys Ala Gly Ser Val Pro Ser Ser Phe Leu Leu Lys Lys Ala
        110                 115                 120AGG GAG CCC GGG CCC CCA CGA GAG CCC AAG GAG CCG TTT CGC CCA CCC    1134Arg Glu Pro Gly Pro Pro Arg Glu Pro Lys Glu Pro Phe Arg Pro Pro
    125                 130                 135CCC ATC ACA CCC CAC GAG TAC ATG CTC TCG CTG TAC AGG ACG CTG TCC   1182Pro Ile Thr Pro His Glu Tyr Met Leu Ser Leu Tyr Arg Thr Leu Ser
140                 145                 150GAT GCT GAC AGA AAG GGA GGC AAC AGC AGC GTC AAG TTG GAG GCT GGC   1230Asp Ala Asp Arg Lys Gly Gly ASn Ser Ser Val Lys Leu Glu Ala Gly155                 160                 165                 170CTG GCC AAC ACC ATC ACC AGC TTT ATT GAC AAA GGG CAA GAT GAC CGA   1278Leu Ala Ash Thr Ile Thr Ser Phe Ile Asp Lys Gly Gln Asp Asp Arg
            175                 180                 185GGT CCC GTG GTC AGG AAG CAG AGG TAC GTG TTT GAC ATT AGT GCC CTG   1326Gly Pro Val Val Arg Lys Gln Arg Tyr Val Phe Asp Ile Ser Ala Leu
        190                 195                 200GAG AAG GAT GGG CTG CTG GGG GCC GAG CTG CGG ATC TTG CGG AAG AAG   1374Glu Lys Asp Gly Leu Leu Gly Ala Glu Leu Arg Ile Leu Arg Lys Lys
    205                 210                 215CCC TCG GAC ACG GCC AAG CCA GCG GCC CCC GGA GGC GGG CGG GCT GCC   1422Pro Ser Asp Thr Ala Lys Pro Ala Ala Pro Gly G1y Gly Arg Ala Ala
220                 225                 230CAG CTG AAG CTG TCC AGC TGC CCC AGC GGC CGG CAG CCG GCC TCC TTG   1470Gln Leu Lys Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gly Arg Gln Pro Ala Ser Leu235                 240                 245                 250CTG GAT GTG CGC TCC GTG CCA GGC CTG GAC GGA TCT GCC TGG GAG GTG   1518Leu Asp Val Arg Ser Val Pro Gly Leu Asp Gly Ser Gly Trp Glu Val
            255                 260                 265TTC GAC ATC TGG AAG CTC TTC CGA AAC TTT AAG AAC TCG GCC CAG CTG   1566Phe Asp Ile Trp Lys Leu Phe Arg Asn Phe Lys Asn Ser Ala Gln Leu
        270                 275                 280TGC CTG GAG CTG GAG GCC TGG GAA CGG GGC AGG GCC GTG GAC CTC CGT    1614Cys Leu Glu Leu Glu Ala Trp Glu Arg Gly Arg Ala Val Asp Leu Arg
    285                 290                 295GGC CTG GGC TTC GAC CGC GCC GCC CGG CAG GTC CAC GAG AAG GCC CTG    1662Gly Leu Gly Phe Asp Arg Ala Ala Arg Gln Val His Glu Lys Ala Leu
300                 305                 310TTC CTG GTG TTT GGC CGC ACC AAG AAA CGG GAC CTG TTC TTT AAT GAG    1710Phe Leu Va1 Phe Gly Arg Thr Lys Lys Arg Asp Leu Phe Phe Asn Glu315                 320                 325                 330ATT AAG GCC CGC TCT GGC CAG GAC GAT AAG ACC GTG TAT GAG TAC CTG    1758Ile Lys Ala Arg Ser Gly Gln Asp Asp Lys Thr Val Tyr Glu Tyr Leu
            335                 340                 345TTC AGC CAG CGG CGA AAA CGG CGG GCC CCA CTG GCC ACT CGC CAG GGC    1806Phe Ser Gln Arg Arg Lys Arg Arg Ala Pro Leu Ala Thr Arg Gln Gly
        350                 355                 360AAG CGA CCC AGC AAG AAC CTT AAG GCT CGC TGC AGT CGG AAG GCA CTG    1854Lys Arg Pro Ser Lys Asn Leu Lys Ala Arg Cys Ser Arg Lys Ala Leu
    365                 370                 375CAT GTC AAC TTC AAG GAC ATG GGC TGG GAC GAC TGG ATC ATC GCA CCC    1902His Val Asn Phe Lys Asp Met Gly Trp Asp Asp Trp Ile Ile Ala Pro
380                 385                 390CTT GAG TAC GAG GCT TTC CAC TGC GAG GGG CTG TGC GAG TTC CCA TIG    1950Leu Glu Tyr Glu Ala Phe His Cys Glu Gly Leu Cys Glu Phe Pro Leu395                 400                 405                 410CGC TCC CAC CTG GAG CCC ACG AAT CAT GCA GTC ATC CAG ACC CTG ATG    1998Arg Ser His Leu Glu Pro Thr Asn His Ala Val Ile Gln Thr Leu Met
            415                 420                 425AAC TCC ATG GAG CCC GAG TCC ACA CCA CCC ACC TGC TGT GTG CCC ACG   2046Asn Ser Met Asp Pro Glu Ser Thr Pro Pro Thr Cys Cys Val Pro Thr
        430                 435                 440CGG CTG AGT CCC ATC AGC ATC GTC TTC ATT GAC TCT GCC AAC AAC GTG   2094Arg Leu Ser Pro Ile Ser Ile Leu Phe Ile Asp Ser Ala Asn Asn Val
    445                 450                 455GTG TAT AAG CAG TAT GAG GAG ATG GTC GTG GAG TCG TGT GGC TGC AGG   2142Val Tyr Lys Gln Tyr Glu Asp Met Val Val Glu Ser Cys Gly Cys Arg
460                 465                 470TAG CAGCACTGGC CCTCTGTCTT CCTGGGTGGC ACATCCCAAG AGCCCCTTCC        2195***475TCCACTCCTG GAATCACAGA GGGGTCAGGA AGCTGTGGCA GGAGCATCTA CACAGCTTGG 2255GTGAAAGGGG ATTCCAATAA GCTTGCTCGC TCTCTGAGTG TGACTTGGGC TAAAGGCCCC 2315CTTTTATCCA CAAGTTCCCC TGGCTGAGGA TTGCTGCCCG TCTGCTGATG TGACCAGTGG 2375CAGGCACAGG TCCAGGGAGA CAGACTCTGA ATGGGACTGA GTCCCAGGAA ACAOTGCTTT 2435CCGATGAGAC TCAGCCCACC ATTTCTCCTC ACCTGGGCCT TCTCAGCCTC TGGACTCTCC 2495TAAGCACCTC TCAGGAGAGC CACAGGTGCC ACTGCCTCCT CAAATCACAT TTGTGCCTGG 2555TGACTTCCTG TCCCTGGGAC AGTTGAGAAG CTGACTGGGC AAGAGTGGGA GAGAAGAGGA 2615GAGGGCTTGG ATAGAGTTGA GGAGTGTGAG GCTGTTAGAC TGTTAGATTT AAATGTATAT 2675TGATGAGATA AAAAGCAAAA CTGTGCCT                                    2703

Claims (6)

1.一种选自如下的命名为HMW人MP52的蛋白质及其混合物：
(1)一种二聚体蛋白质，它包括具有序列表中序列号1的第1-474位氨基酸序列的肽，
(2)一种二聚体蛋白质，它包括具有序列表中序列号1的第121-474位氨基酸序列的肽，
(3)一种二聚体蛋白质，它包括具有序列表中序列号1的第122-474位氨基酸序列的肽，
(4)一种二聚体蛋白质，它包括具有序列表中序列号1的第121-474位氨基酸序列的肽以及具有序列号1中第1 22-474位氨基酸序列的肽，
(5)一种二聚体蛋白质，它包括具有序列表中序列号1的第1-474位氨基酸序列的肽以及具有序列号1中第121位和/或第122-474位氨基酸序列的肽，
(6)一种二聚体蛋白质，它包括具有序列表中序列号1的第1-474位氨基酸序列的肽以及具有序列号1中第355-474位氨基酸序列的肽，
(7)一种二聚体蛋白质，它包括具有序列表中序列号1的第121和/或第122-474位氨基酸序列的肽以及具有序列号1中第355-474位氨基酸序列的肽。
2.权利要求1中HMW人MP52的制备方法，它包括将至少含有序列表中序列号1的第721-2145位DNA序列的DNA导入合适的宿主细胞，并在表达该DNA序列和形成蛋白质的条件下培养宿主细胞。
3.一种药物组合物，它至少含有权利要求1中HMW人MP52的一种作活性成分。
4.权利要求3的药物组合物，它用于整形外科的重建、骨移植、美容外科或牙齿植入。
5.权利要求3中药物组合物的应用，它能促进骨形成，预防或治疗骨、软骨、结缔组织、皮肤、粘膜或牙齿的损伤能用于牙齿植入和伤口的愈合及组织再生过程。
6.权利要求3中药物组合物在治疗骨质疏松或骨折中的应用。
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