JP2023507007A - 疼痛及び軟骨破壊を治療するためのｇｄｆ－５変異体の使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、軟骨欠損及び疼痛を治療するための、アミノ酸交換Ｒ３９９Ｅを有するＧＤＦ－５変異変異体の使用、並びに上記ＧＤＦ－５変異体の薬理学的組成物に関する。

Description

本出願は、疼痛及び炎症を低減するために変形性関節症（ＯＡ）又は他の炎症性関節疾患を罹患している患者に注射するための、ＧＤＦ－５変異体（Ｒ３９９Ｅ）及びその製剤、並びに療法用組成物の使用に関する。

変形性関節症は、関節炎の最も一般的な形態であり、世界中で何百万もの人々に影響を及ぼしている。変形性関節症は、骨の端部のクッションとなる保護軟骨が経時的に摩耗した場合に生じる。変形性関節症は、あらゆる関節に損傷を与える可能性があるが、この障害は最も一般的には、手、膝、股関節、及び脊椎の関節に影響を及ぼす。
軟骨恒常性の破綻は、その原因（加齢、遺伝的素因、外傷、又は代謝障害）が何であれ、軟骨細胞の深刻な表現型修飾を誘導し、引いてはそれが、軟骨損傷を誘導し他の関節組織を標的とする因子のサブセットの合成を促進する。興味深いことには、こうした因子の中には、炎症経路の成分が数多く存在する。軟骨細胞は、サイトカイン、ケモカイン、アラーミン、プロスタノイド、及びアディポカインを産生し、サイトカイン及びケモカインに対する数多くの細胞表面受容体、並びにトール様受容体を発現する。こうした受容体は、ＯＡ関節にある軟骨細胞の炎症及びストレス応答に関与する細胞内シグナル伝達経路を活性化する（Ｈｏｕａｒｄら、Ｃｕｒｒ．Ｒｅｕｍａｔｈｏｌ Ｒｅｐ．、２０１３巻、１１月；１５巻（１１号）：３７５頁）。
ＯＡ症状のみであれば、鎮痛薬で一定期間管理することができるが、関節に対する損傷は元に戻すことができない。活動的であり続け、健康的な体重を維持することにより、この疾患の進行を遅らせ、疼痛及び関節機能の改善を支援することができる。にも関わらず、この疾患を停止させるか又は更に元に戻すために利用可能な効果的な治療は存在せず、ほとんどの場合、患部関節の破壊及び疼痛進行は両方とも、患者の可動性、生活の質、及び運動能力に著しい影響を及ぼす。股関節ＯＡ又は膝関節ＯＡを有する患者の場合、関節全置換術が不可避で唯一の治療選択肢であることが多く、他の関節では疼痛管理が唯一の選択肢であることが多い。
最近の文献によると、Ｘ線写真で確認される膝関節ＯＡが、特にこの疾患を早期発症した人々又は肥満の人々では、心血管疾患、糖尿病、及び腎性死亡のより高いリスクと関連付けられることが示された（Ｍｅｎｄｙら、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ． ２０１８年１２月１日；４７巻（６号）：１８２１年）。

２０１５年には、未入院米国成人の１０．５％（２，５６０万人）がＯＡを有することが報告された。ＯＡを有する成人は、米国未入院成人の総医療費の２２．５％に相当する３，１８４億ドルの医療費を負担し、１０１億ドルの賃金損失を被った。ＯＡ有病率は、年齢（≧６５歳、２５．３％）、性別（女性１３．３％；男性７．５％）、人種／民族（白人１３．３％；アフリカ系アメリカ人７．５％；ラテン系４．２％；その他５．３％；Ｐ＜０．００１）により有意に異なっていた。ＯＡを有する成人のほぼ３分の１（３２．７％）が処方オピオイドを受けたのに対し、ＯＡを有していない成人は１３．８％だった（Ｐ＜０．００１）。回帰分析では、ＯＡを有する成人は、ＯＡを有していない成人よりも、中程度（調整後オッズ比［ＡＯＲ］＝１．９９［９５％ＣＩ：１．６５～２．４０］）又は重度（ＡＯＲ＝２．５９［２．２１～３．０４］）のＰＩＡ、任意の機能制限（ＡＯＲ＝２．５１［２．２１～２．８５］）、及びＳＦ－１２身体的コンポーネントサマリー（ＳＦ－１２ Physical Component Summary）でのより不良なＨＲＱｏＬ（調整後ベータ＝－３．８８［ＳＥ：０．３５７］；Ｐ＜０．００１）を報告する可能性が有意により高いことが示された。ＯＡを有する成人の調整後増分年間総医療費及び賃金損失は、ＯＡを有していない成人と比較して、それぞれ１人当たり１７７８ドル（７５８５ドル対５８０７ドル）及び１８９ドル（７４０ドル対５５１ドル）であり、４５０億ドルの推定全国増分直接費及び１７億ドルの推定全国増分間接費にのぼる（ＤＯＩ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｊｖａｌ．２０１８．０４．０１２）。

現在、組織構造病理（軟骨、骨、滑膜、半月板、靭帯）に対する有益効果及び急性でも慢性でもない疼痛に対する迅速な軽減効果の両方を示す、利用可能な変形性関節症治療は存在しない。
ＧＤＦ－５（Ｈｏｔｔｅｎら、１９９４年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０４巻、６４６～６５２頁、ＮＣＢＩ受入番号ＮＭ＿０００５５７、ＮＰ＿０００５４８）は、幾つかの組織において細胞増殖、分化、及び／又は組織形成を促進することが示されているモルフォゲンである。このタンパク質は、骨形態形成タンパク質－１４（ＢＭＰ－１４）又は軟骨由来形態形成タンパク質－１（ＣＤＭＰ－１）としても知られている。ＧＤＦ－５は、軟骨形成活性を示し、先天性ＧＤＦ－５変異は、マウス及びヒトの指関節、手首関節、及び足首関節に欠損を引き起こす（Ｓｔｏｒｍら、１９９４年；Ｔｈｏｍａｓら、１９９７年）。ＧＤＦ－５の発現は、最も顕著には、関節が発達することになる領域に限定されており、関節形成の最初期マーカーの１つである（Ｓｔｏｒｍ及びＫｉｎｇｓｌｅｙ、１９９９年）。関節軟骨の出生後維持にはＢＭＰ受容体シグナル伝達が必要である（Ｒｏｕｎｔｒｅｅ、２００４年、ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ． ２００４年１１月、２（１））。
野生型ＧＤＦ５治療は、軟骨及び骨の形成を誘導する。従って、アミノ酸残基３９９アルギニンがグルタミン酸に交換されたＧＤＦ５単一点変異体が設計された。以下ではＲ３９９Ｅと称されるが、Ｒ３９９Ｅは、ＧＤＦ５野生型と比較して骨形成能力の低減を示し、軟骨形成能力を維持する。Ｒ３９９Ｅ（ＧＤＦ５変異体）は、初代ブタ及びヒト変形性関節症軟骨細胞にて基質産生を増加させる（Ｔ．Ｍａｎｇ、Ｋ．Ｋｌｅｉｎｓｃｈｍｉｄｔ－Ｄｏｅｒｒ、Ｆ．Ｐｌｏｅｇｅｒ、Ｓ．Ｌｉｎｄｅｍａｎｎ、Ａ．Ｇｉｇｏｕｔ、ＤＯＩ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｊｏｃａ．２０１８．０２．１７６。２０１８年４月 ２６巻、増補１、Ｓ８２頁）。

Ｒ３９９Ｅは、国際公開第２０１３０８３６４９号パンフレットにて特許請求されており、軟骨形成を誘導する能力の向上を示す。この発明の組換えＧＤＦ－５関連タンパク質は、軟骨の形成は望ましいが骨の形成は望ましくない疾患の治療に使用するために特に好適である。従って、この発明の別の態様は、そうした疾患の治療における、指定のタンパク質、核酸、ベクター、又は宿主細胞の使用である。特に、上記タンパク質、核酸、ベクター、又は宿主細胞は、軟骨欠損の治療、又は変形性関節症を含む、軟骨の外傷性断裂又は剥離の治療に使用するためのものである。

ＧＤＦ－５の分野
骨形成を誘導する能力の向上及び骨形成を誘導する能力の低減を示すＧＤＦ－５関連タンパク質。こうした新規タンパク質は、骨組織の形成が望ましくない軟骨欠損の治療に特に有用である。
滑膜関節は、骨格の生体力学的機能に不可欠である。関節炎疾患で観察されるような機能不全は、直接的に、生活の質の深刻な喪失をもたらす。従って、関節生物学は、長年にわたった広範な研究の焦点であり、関節解剖学及び組織学並びに関節機能及び維持における関節軟骨及び他の成分の生体力学的特性及び役割の理解に結び付いている。

ＧＤＦ－５（Ｈｏｅｔｔｅｎら、１９９４年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０４年、６４６～６５２頁）は、幾つかの組織において細胞増殖、分化、及び／又は組織形成を促進することが示されているモルフォゲンである。このタンパク質は、形態形成タンパク質ＭＰ５２、骨形態形成タンパク質－１４（ＢＭＰ－１４）、又は軟骨由来形態形成タンパク質－１（ＣＤＭＰ－１）としても知られている。ＧＤＦ－５は、軟骨形成活性を示し、先天性ＧＤＦ－５変異は、マウス及びヒトの指関節、手首関節、及び足首関節に欠損を引き起こす（Ｓｔｏｒｍら、１９９４年；Ｔｈｏｍａｓら、１９９７年）。ＧＤＦ－５の発現は、最も顕著には、関節が発達することになる領域に限定されており、関節形成の最初期マーカーの１つである（Ｓｔｏｒｍ及びＫｉｎｇｓｌｅｙ、１９９９年）。関節軟骨の出生後維持にはＢＭＰ受容体シグナル伝達が必要である（Ｒｏｕｎｔｒｅｅ、２００４年、ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ． ２００４年１１月、２（１１））。ＧＤＦ－５は、ＧＤＦ－６及びＧＤＦ－７と密接に関連している。こうした３つのタンパク質は、ＴＧＦ－βスーパーファミリーの異なる部分群を形成しており、従って同等の生物学的特性及び極めて高度なアミノ酸配列同一性を示す（つまり、Ｗｏｌｆｍａｎら、１９９７年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００巻、３２１～３３０頁を参照）。ファミリーメンバーは全て、最初はより大きな前駆体タンパク質として合成され、その後、Ｃ末端からおよそ１１０～１４０アミノ酸の塩基性残基のクラスターにてタンパク質分解切断を受け、従ってＮ末端プロドメインからＣ末端成熟タンパク質部分が放出される。成熟ポリペプチドは構造的に関連しており、こうしたタンパク質の特徴的な３次元「システインノット」モチーフを担う６つ又は７つの標準システイン残基を含む保存された生物活性ドメインを含む。天然ＧＤＦ－５関連タンパク質はホモ二量体分子であり、主に、Ｉ型及びＩＩ型セリン／スレオニン受容体キナーゼで構成される特異的受容体複合体との相互作用を介して作用する。その後、受容体キナーゼは、Ｓｍａｄタンパク質を活性化し、次いでＳｍａｄタンパク質は、核内にシグナルを伝播させて標的遺伝子発現を調節する。

ＧＤＦ－５／－６／－７部分群のメンバーは、主に骨及び軟骨の重要な誘導因子及び調節因子であることが繰り返し実証されている（Ｃｈｅｎｇら、２００３年、Ｊ．Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ．８５Ａ巻、１５４４～１５５２頁；Ｓｅｔｔｌｅら、２００３年、Ｄｅｖｅｌｏｐｍ． Ｂｉｏｌ． ２５４巻、１１６～１３０頁）。ＧＤＦ－５及び関連タンパク質は、Ｉ型及びＩＩ型と称される２種類の膜結合型セリン－スレオニンキナーゼ受容体に結合してオリゴマー化する。リガンドが結合すると、こうした複合体は、転写因子のＳＭＡＤファミリーのメンバーをリン酸化することによりシグナルを伝達し、転写因子のＳＭＡＤファミリーのメンバーは、活性化されると核に進入し、応答性遺伝子の転写を調節する（Ｍａｓｓａｇｕｅ、１９９６年）。最近の実験では、骨格パターン形成に、２つの異なるＩ型受容体ＢＭＰＲ－ＩＡ及びＢＭＰＲ－ＩＢの関与が示唆されている。両受容体は、正常発生中に動的パターンで発現される。幾つかの四肢構造では、例えば、関節区域間及び軟骨膜では、ＢＭＰＲ－ＩＡ及びＢＭＰＲ－ＩＢの重複発現が観察される（Ｍｉｓｈｉｎａら、１９９５年；Ｚｏｕら、１９９７年；Ｂａｕｒら、２０００年）。ＢＭＰＲ－ＩＡ及びＢＭＰＲ－ＩＢの発現パターンに関して、ＧＤＦ－５シグナル伝達は、ＢＭＰＲ－ＩＡ及びＢＭＰＲ－ＩＢの両方との相互作用により達成されるはずである（Ｃｈａｎｇら、１９９４年；Ｚｏｕら、１９９７年）。ｂｍｐｒ－１ｂ遺伝子のヌル変異は、ＧＤＦ－５を欠くマウスに見られるものとよく似た欠損を骨及び関節形成に欠損を有する生存可能なマウスを生み出すが（Ｓｔｏｒｍ及びＫｉｎｇｓｌｅｙ、１９９６年；Ｙｉら、２０００年）、ｂｍｐｒ－Ｉａ／マウスは、胚形成の初期に死亡することが知られている（Ｍｉｓｈｉｎａら、１９９５年）。しかしながら、ＧＤＦ－５－Ｃｒｅ駆動因子の制御下にあるＢＭＰＲ－ＩＡの条件付きノックアウトは、胚致死性を迂回し、正常に形成された関節を有する生存可能なマウスを生み出す。しかし、出生後、関節内の関節軟骨は、変形性関節症を彷彿とさせるプロセスで摩耗する。これは、軟骨恒常性及び修復におけるこの受容体の重要性を指し示している（Ｒｏｕｎｔｒｅｅら、２００４年）。

ＧＤＦ－５関連タンパク質ファミリーの野生型タンパク質の活性は、一般に、軟骨及び骨の形成をもたらす。しかしながら、軟骨の形成は好ましいが、骨組織の形成は望ましくない様々な医学的状態が存在する。例えば、関節欠損の場合、軟骨の形成は望ましいが、骨化は回避されるべきであることは明らかである。
驚くべきことに、軟骨形成を誘導する能力の向上及び骨形成を誘導する能力の低減を示すＧＤＦ－５関連タンパク質のバリアントを提供することが可能であることが見出された。これは、ＢＭＰＲ－ＩＢに対する親和性の増加及び／又はＢＭＰＲ－ＩＡに対する親和性の低減を示すように、ＧＤＦ－５関連タンパク質（Ｒ３９９Ｅ）を改変することにより達成することができ、最も近い先行技術である国際公開第２０１３０８３６４９号パンフレットの主題である。
野生型ＧＤＦ－５は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、ＢＭＰＲ－ＩＡ（ＫＤ約１～１．１ｎＭ）と比較して約４０～１２０倍より高い親和性（ＫＤ約８～２７ｐＭ）でＢＭＰＲ－ＩＢに結合する。ＢＭＰＲ－ＩＢに対する親和性は増加するが、ＢＭＰＲ－ＩＡに対する親和性は低減されるように、ＧＤＦ－５関連タンパク質の結合親和性を改変することにより、軟骨形成は促進されるが骨の形成は低減されることが見出された。これは、ＧＤＦ－５関連タンパク質のアミノ酸配列におけるＢＭＰＲ－ＩＢ及び／又はＢＭＰＲ－ＩＡ結合部位に関連する１つ又は複数のアミノ酸残基の特定の置換により達成することができる。

特定の置換を有するＧＤＦ－５関連タンパク質の結合親和性は、ヒト野生型ＧＤＦ－５関連タンパク質、特にヒト野生型ＧＤＦ－５の結合親和性と比較される。
誤解及び曖昧さを回避するために、本明細書で頻繁に使用される一部の用語を、以下の通り定義及び例示する。
「システインノットドメイン」という用語は、本明細書で使用される場合、つまりヒトＧＤＦ－５などのＴＧＦ－ベータスーパーファミリータンパク質の成熟部分に存在し、システインノットとして知られている３次元タンパク質構造を形成する、周知で保存されたシステインリッチアミノ酸領域を意味する。このドメインでは、互いに対するシステイン残基の対応する位置が重要であり、生物学的活性を喪失しないためにはわずかな変化しか許容されない。このタンパク質の生物学的機能にはシステインノットドメイン単独で十分であることが実証されている（Ｓｃｈｒｅｕｄｅｒら（２００５年）、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．３２９巻、１０７６～８６頁）。システインノットドメインのコンセンサス配列は、当技術水準にて周知である。本明細書で規定される定義によると、タンパク質のシステインノットドメインは、対応するタンパク質のシステインノットに寄与する最初のシステイン残基から始まり、対応するタンパク質のシステインノットに寄与する最後のシステインに続く残基で終わる。

「ＧＤＦ－５関連タンパク質」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒト成長／分化因子５（ｈＧＤＦ－５）と非常に密接に関連する、あらゆる天然に存在するか又は人工的に作出されたタンパク質を意味する。全てのＧＦＤ－５関連タンパク質に共通する特徴は、ヒトＧＤＦ－５の１０２個アミノ酸システインノットドメイン（アミノ酸４００～５０１）に対して少なくとも６０パーセントのアミノ酸同一性を有するシステインノットドメインの出現である。このタンパク質の生物学的機能にはこれで十分である。「ＧＤＦ－５関連タンパク質」という用語は、脊椎動物種又は哺乳動物種に由来するＧＤＦ－５、ＧＤＦ－６、及びＧＤＦ－７タンパク質の群に属するタンパク質、並びにそうしたタンパク質がヒトＧＤＦ－５のシステインノットドメインと上記で言及されている同一性パーセンテージを示す限り、それらの組換えバリアントを含む。６０パーセントの限界値は、ＧＤＦ－５／－６／－７群のタンパク質のメンバー並びにそれらのバリアントを、より遠縁のＧＤＦ及びＢＭＰなどの更なるタンパク質と区別するために十分に好適である。ヒトＧＤＦ－５、ヒトＧＤＦ－６、及びヒトＧＤＦ－７の１０２個アミノ酸システインノットドメインを比較すると、こうしたタンパク質間に高度なアミノ酸同一性があることが明らかになる。ヒトＧＤＦ－６は、ヒトＧＤＦ－５のシステインノットドメインと８７個（８５パーセント）の同一残基、ヒトＧＤＦ－７は８３個（８１パーセント）の同一残基を共有する。これまでに識別されている、他の脊椎動物種及び哺乳動物種由来のＧＤＦ－５／－６／－７分子のそれぞれのドメインも、ヒトＧＤＦ－５と比較した場合、少なくとも７５パーセント（７９パーセント～９９パーセント）の非常に高い同一性パーセンテージを示す。対照的に、ＧＤＦ－５／－６／－７部分群に属していないＧＤＦ及びＢＭＰは、６０パーセント未満のはるかにより低い同一性値を示す。

脊椎動物及び哺乳動物ＧＤＦ－５関連タンパク質の非限定的な例は、ヒトＧＤＦ－５の前駆体及び成熟タンパク質（国際公開第９５／０４８１９号パンフレットではＭＰ５２として、Ｈｏｔｔｅｎら、１９９４年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０４巻、６４６～６５２頁ではヒトＧＤＦ－５として開示されている）、組換えヒト（ｒｈ）ＧＤＦ－５／ＭＰ５２（国際公開第９６／３３２１５号パンフレット）、ＭＰ５２Ａｒｇ（国際公開第９７／０６２５４号パンフレット）；ＨＭＷヒトＭＰ５２ｓ（国際公開第９７／０４０９５号パンフレット）、ＣＤＭＰ－１（国際公開第９６／１４３３５号パンフレット）、マウス（Ｍｕｓ筋肉）ＧＤＦ－５（米国特許第５，８０１，０１４号明細書）、ウサギ（オリクトラグス・クニクルス（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ））ＧＤＦ－５（Ｓａｎｙａｌら、２０００年、Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６巻．２０３～２１０頁）、ニワトリ（ガルス・ガルス（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ））ＧＤＦ－５（ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿９８９６６９）、アフリカツメカエル（ゼノパス・ラエビス（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ））ＧＤＦ－５（ＮＣＢＩ受入番号ＡＡＴ９９３０３）、モノマー性ＧＤＦ－５（国際公開第０１／１１０４１号パンフレット及び国際公開第９９／６１６１１号パンフレット）、ヒトＧＤＦ－６／ＢＭＰ－１３（米国特許第５，６５８，８８２号明細書）、マウスＧＤＦ－６（ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿０３８５５４）、ＧＤＦ－６／ＣＤＭＰ－２（国際公開第９６／１４３３５号パンフレット）、ヒトＧＤＦ－７／ＢＭＰ－１２（米国特許第５，６５８，８８２号明細書）、マウスＧＤＦ－７（ＮＣＢＩ受入番号ＡＡＰ９７７２１）、ＧＤＦ－７／ＣＤＭＰ－３（国際公開第９６／１４３３３５号パンフレット）である。置換、付加、及び欠失などの追加の変異を有するＧＤＦ－５関連タンパク質も、こうした追加の変異が生物学的タンパク質活性を完全に消失させない限り、本発明により包含される。

背景技術に関する考察
ＯＡ患者の疼痛及び炎症を迅速に及び持続的に、並びに同時に関節組織及び形態学的特徴（軟骨、骨、滑膜、半月板、靭帯）の構造変化を継続的に、両方とも治療するために利用可能な薬物は存在しない。

変形性関節症の症状及び主に疼痛の軽減を支援することはできるが、構造に対しては効果を示さないか又は否定的な効果を示すことさえある薬剤としては、以下のものが挙げられる：
アセトアミノフェン。アセトアミノフェン（タイレノールなど）は、軽度～中程度の疼痛を有する、変形性関節症の一部の人々を助けることが示されている。推奨用量よりも多くのアセトアミノフェンを服用すると、肝臓損傷を引き起こす可能性がある。
非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）。推奨用量で服用したイブプロフェン（アドビル、モトリンＩＢなど）及びナプロキセンナトリウム（アリーブなど）などの市販のＮＳＡＩＤは、典型的には、変形性関節症疼痛を軽減する。より強力なＮＳＡＩＤは処方箋に基づいて入手可能である。ＮＳＡＩＤは、胃の不調、心臓血管の問題、出血の問題、並びに肝臓及び腎臓の損傷を引き起こす可能性がある。患部関節を覆う皮膚に塗布されるゲルとしてのＮＳＡＩＤは、副作用がより少なく、疼痛を同様に軽減することができる。
デュロキセチン（シンバルタ）。通常は抗うつ薬として使用されるこの薬剤は、変形性関節症疼痛を含む慢性疼痛の治療にも承認されている。
コルチゾン注射。コルチコステロイド薬剤の注射は、関節の疼痛を軽減することができる。患者が毎年受けることができるコルチゾン注射の数は、この薬剤が経時的には関節損傷を悪化させる可能性があるため、一般に３～４回の注射に制限されている。
抗ＮＧＦ（神経成長因子）抗体（タネズマブ、Ｐｆｉｚｅｒ社）は、現在、ＯＡに関して臨床開発中である。この化合物は、ＯＡ患者の疼痛治療に非常に効率的であるが、他の鎮痛薬のように、この疾患の根本原因には有益な効果を示さない。対照的に、抗ＮＧＦで治療された相当数の患者では、疾患進行が有意に加速した（ＲＰＯＡ＝急速進行ＯＡ）。ＲＰＯＡの全体発生率は、タネズマブ５ｍｇ群では６．３パーセント、タネズマブ２．５ｍｇ群では３．２パーセント、ＮＳＡＩＤ群では１．２パーセントだった。本発明者らは、ラット及びウサギのＯＡ動物モデルにおいて、抗ＮＧＦ治療のこうした否定的な効果を確認した。

ＯＡ疼痛を治療するために利用可能な鎮痛薬は、著しい副作用及び有害事象を示す。これらはいずれも、疾患進行を緩徐することも阻止することもなく、関節構造に対して有益な効果を示すこともない。これらはいずれも、軟骨基質産生に対して治癒的な生物学的活性も有益な生物学的活性も示さず、関節恒常性の病理学的シフトのバランスを取り戻すこともない。一部は（タネズマブ）、ＯＡ患者の疾患進行を加速させさえした。

他の利用可能なＯＡ療法は、外科的手技であるか、又は疾患修飾効果を示さない：
潤滑剤注射。ヒアルロン酸の注射は、膝に幾らかのクッション性を提供することにより沈痛をもたらすことができるが、研究によると、こうした注射は、プラセボよりも大きな軽減をもたらさず、構造変化及び組織病理に全く効果を示さないことが示唆されている。
関節置換。関節置換術（関節形成術）では、外科医が損傷した関節表面を除去し、それらをプラスチック部品及び金属部品で置き換える。外科的リスクとしては、感染症及び血栓が挙げられる。人工関節は摩耗又は緩む可能性があり、最終的には交換が必要となる場合がある。

ＯＡに関して臨床開発中である構造修飾因子が１つ存在するが、この分子は、ＯＡ疼痛に有益な効果を示さない。線維芽細胞成長因子１８（ＦＧＦ１８、スプリフェルミン、Ｍｅｒｃｋ社）は、軟骨細胞の増殖を誘導することが示された。スプリフェルミンは、第ＩＩ相治験において、２年後にＯＡ患者の総大腿脛骨関節軟骨厚を０．５ｍｍ増加させた。どのスプリフェルミン群でも、プラセボと比較して、総ＷＯＭＡＣ疼痛スコアの基線からの平均絶対変化に統計的有意差はなかった。

ＯＡ疾患進行を緩徐又は停止させるか、軟骨基質産生に治癒的な又は有益な生物学的活性を示すか、関節恒常性の病理学的シフトのバランスを取り戻し、同時にＯＡ疼痛に影響を及ぼす治療は存在しない。
有効な疾患修飾ＯＡ治療は、特に全身性又は解剖学的な変化に関連付けられる場合、繰り返し投与する必要があると考えられるため、生涯にわたる治療として安全でなければならない。全身治療後の高い全身薬物曝露は、望ましくない全身的影響又は非疾患関節の軟骨、滑膜、及び骨に対する影響のリスクを増加させるだろう。一方で、関節内注射は、年間６回よりも多くの頻度で推奨されることはない。
ＯＡの構造及び疼痛に有益な効果を示し、断続的な治療で有効な化合物は存在しない。

Ｒ３９９Ｅは、疼痛に対して迅速で持続的な効果を示し、同時に同じ用量で、軟骨破壊を低減し、軟骨基質の産生を誘導し、ＯＡ動物モデル及びヒト組織の関節恒常性を正常化することにより、疾患進行を阻止する最初の治療手法である。ＯＡの疼痛に対するＲ３９９Ｅのｉｎ ｖｉｖｏでの有益な効果は、２つの種で確認された（図１及び２）。また、ＯＡの軟骨構造に対するＲ３９９Ｅの有益な効果は、２つの種で確認された（図１５、１６、１７）。他の既知分子、タンパク質、又は先行技術の組合せは、ＯＡの疼痛及び軟骨構造に対して有益な効果を示さない。更に、Ｒ３９９Ｅは、健常動物に由来する組織及び初代細胞を使用した関連ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験、及び関節恒常性の正常化を可能にするヒトＯＡ関節置換術において、炎症及びサイトカイン放出を低減する（図８、９、１０、１１、１３）。Ｒ３９９Ｅは、関連健常動物及びヒトＯＡ ｉｎ ｖｉｖｏ実験においてＰＧＥ２放出を阻害し、更にはＯＡ半月板細胞においてはＮＧＦ誘導性ＰＧＥ２産生を阻害する（図８、１２）。ＰＧＥ２は、軟骨分解及び疼痛の重要なメディエーターである（Ｌｅｅら、Ｇｅｎｅ．２０１３年９月２５日；５２７巻（２号）：４４０～７頁）。Ｒ３９９Ｅは、ＧＡＧの放出を防止することにより抗異化効果を示し（Ｃｈｕｎら、Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ． Ｒｅｇｅｎ Ｍｅｄ ２０１９年７月５日；１６巻（４号）：３８５～３９３頁）、ヒトＯＡ組織及び細胞培養並びに健常ブタ細胞でのｉｎ ｖｉｔｒｏ実験では、ＡＤＡＭＴＳ５、ＭＭＰ１３、及びＭＭＰ１を放出し発現を低減させる（図８、１３、１４）。ＡＤＡＭＴＳ５のようなメタロプロテイナーゼ及びＭＭＰ１３のようなマトリックスメタロプロテイナーゼは、ＯＡの発症に重要な役割を果たす（Ｂｏｎｄｅｓｏｎら、Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２００８年１月～２月；２６巻（１号）：１３９～４５頁、及びＸｉｅら、ＣｈｅｍＭｅｄＣｈｅｍ．２０１７年８月８日；１２巻（１５号）：１１５７～１１６８頁）。Ｒ３９９Ｅは、健常動物及びヒトＯＡ組織及び細胞培養において同化促進効果を示す（図１８、１９、２０、２１、２２）。Ｒ３９９Ｅは、免疫組織学及び遺伝子発現分析では、グリコサミノグリカン及びヒドロキシプロリン合成の誘導、並びにコラーゲン－ＩＩ、コラーゲン－ＶＩ、Ｓｏｘ９、及びアグリカンの遺伝子発現を示す（図２１）。ヒトＯＡの軟骨細胞細胞培養物をＲ３９９Ｅで処理すると、Ｒ３９９Ｅの投与頻度が低い場合でも軟骨形成に効果を示す。

Ｒ３９９Ｅの同化促進効果は、ｐｒｏＣ２、ｐｒｏＣ６、及びＣＩＬＰ－２のような、ＯＡに肯定的な傾向を示すことが想定されるバイオマーカーの上方制御によっても示されている。これは、図２３ではヒトＯＡ組織に関して示されている。
Ｒ３９９Ｅは、軟骨へと容易に浸透し、ＩＡ注射の７日後に細胞付近の軟骨基質内に見出すことができる。ＩＡウサギＰＫ研究では、Ｒ３９９Ｅは、滑液及び軟骨に見出され、６μｇの注射Ｒ３９９Ｅが３日目までに検出可能だった。６０μｇのＲ３９９Ｅの注射は、滑液では１４日間、軟骨では最大７日間検出することができた。ＧＤＦ５野生型と比較して分子の安定性が増加しているにも関わらず、血清半減期は３．２０時間を超えず、ミニブタ及びウサギでは７２時間まで定量可能だった。また、薬物動態学的及び非臨床安全性研究では、ラット、ミニブタ、及びウサギにＩＡ及びＩＶ適用しても安全性プロファイルには問題がなかった。生理学的ｐＨでの生物学的液体への溶解度がおよそ１μｇ／ｍＬと低いことを合わせて考えると、本発明者らは、安定性の増加による安全性リスクの増加は想定していない。

Ｒ３９９Ｅによる断続的な局所（関節内）治療は、疼痛及び構造に対して有益な効果を示すのに十分であり、全身曝露は低く、非常に短期間である。ＧＤＦ５野生型とは対照的に、Ｒ３９９Ｅは、軟骨が存在すると周囲液体から急速に吸収される。これにより、Ｒ３９９Ｅによる関節内治療が非常に効果的になるだけでなく、安全にもなる。
Ｒ３９９Ｅは、構造に対して有益な効果をもたらすものと同じ用量及びレジメンで、トランスレーショナル変形性関節症モデルにおいて疼痛に対して迅速で持続的な効果を示す。薬力学的効果を、疼痛（抗ＮＧＦ抗体、トリアムシノロン）又は構造（スプリフェルミン）のいずれかに対して臨床的に効果的である薬物の薬力学的効果と比較することができるモデルを使用した。

本発明の好ましい実施形態は、炎症及び疼痛を低減し、関節組織構造を改善するために、関節炎症を伴う及び伴わない変形性関節症患者の関節にＲ３９９ＥをＩＡ注射することである。
更に、Ｒ３９９Ｅは、局所的サイトカイン及びプロスタグランジンＥ２産生を低減し、それにより関節の炎症及び疼痛を低減することになる。Ｒ３９９Ｅは、局所的ＡＤＡＭＴＳ５及びＭＭＰ－１３産生を低減し、それにより軟骨切断を防止するだけでなく、ＤＡＭＰ放出を防止することにより関節炎症及び疼痛を更に低減することになり、それによりニューロンのＤＡＭＰ感作を防止することもできる。また、サイトカイン産生の低減は、ＢＭＰＲ発現に対する下方制御効果を低減することにより、内因性ＢＭＰ及び治療自体に対する応答性を回復させることができる。Ｒ３９９Ｅは、変形性関節症軟骨細胞の細胞外基質形成を直接的に誘導し、それにより変形性関節症関節の構造的修復を支援することができる。

外傷性事象後にＲ３９９Ｅを関節にＩＡ注射して、軟骨分解又は半月板分解を防止し、炎症を低減させる。これにより、後に変形性関節症を発症するリスクが低減されることになる。
本発明は、ＢＭＰＲ－ＩＢ及び／又はＢＭＰＲ－ＩＡとの結合に関与するＧＤＦ－５関連タンパク質のアミノ酸配列の領域に特定の修飾をなすことより、軟骨形成を誘導する能力が向上し、骨形成を誘導する能力が低減するようにこのタンパク質を変更することが可能であるという本発明者らの知見に基づく。
ＢＭＰＲ－ＩＢに対する親和性が増加したタンパク質及び／又はＢＭＰＲ－ＩＡに対する親和性が低減したタンパク質は、骨の形成を低減させつつ、軟骨形成をより良好に誘導することが可能であることが見出された。こうした特性は、ＢＭＰＲ－ＩＢに対する親和性の増加及びＢＭＰＲ－ＩＡに対する親和性の低減を両方とも示すタンパク質で特に顕著である。
本発明のＧＤＦ－５関連タンパク質は、化学修飾又は遺伝子工学技術により得ることができ、組換えタンパク質が好ましい。タンパク質は、ＧＤＦ－５関連タンパク質のアミノ酸配列中の、ＢＭＰＲ－ＩＢ及び／又はＢＭＰＲ－ＩＡ結合部位に関連する少なくとも１つのアミノ酸残基を置き換えることにより得ることができる。

ＯＡ又は他の炎症性疾患を罹患している患者への注射に使用されるタンパク質は、３９９位のアルギニン残基がグルタミン酸に交換されているヒトＧＤＦ－５のバリアントである（Ｒ３９９Ｅ）。ＧＤＦ－５の成熟配列を参照すると、これは、１８位における置換に対応する。驚くべきことに、このタンパク質バリアントは、ＢＭＰＲ－ＩＡに対する親和性がかなり低減されていることが見出された。対照的に、ＢＭＰＲ－ＩＢに対する親和性はほとんど影響を受けない。
好ましくは、本発明のＧＤＦ－５関連タンパク質（Ｒ３９９Ｅ）は、「単離された」タンパク質として存在する。これは、本発明のタンパク質が、単離されたタンパク質の天然供給源に存在する他のタンパク質及びペプチド分子（例えば、天然供給源のタンパク質の他のポリペプチド）から実質的に分離されていることを意味する。例えば、組換え発現ペプチドは、単離されているとみなされる。本発明の好ましい実施形態によると、バリアントタンパク質は、組換えタンパク質である。更に、ペプチドは、人為的な介入により変更されている場合又はその天然供給源ではない生物により発現された場合も、単離されているとみなされる。更に、「単離された」タンパク質は、天然で付随する他の細胞性物質、又は組換え技法により産生される場合は細胞培養培地、又は化学合成の場合は化学前駆体若しくは他の化学物質の一部を含まない。特に、未精製の混合物又は組成物は、「単離された」タンパク質の定義から除外される。

本出願の更なる主題は、本発明による組換えＧＤＦ－５関連タンパク質又は核酸又はベクター又は宿主細胞を含む医薬組成物である。原則として、ＧＤＦ－５関連タンパク質の状況で既に公開されているあらゆる医薬組成物が好適である。発現ベクター又は宿主細胞は、医薬組成物中の活性物質として有利であるとみなすことができる。また、本発明によるタンパク質と他のタンパク質との組合せを、好ましい医薬組成物に使用することができる。無論、本発明は、例えば、薬理学的に許容される添加剤又は担体のような更なる物質を含む医薬組成物も含む。製剤は、抗酸化剤、保存剤、着色剤、香味料及び乳化剤、懸濁剤、溶媒、充填剤、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、賦形剤、及び／又は医薬アジュバントを含んでいてもよい。例えば、好適な担体又はビヒクルは、注射用の水、生理食塩水、又は血清アルブミンなどの好適な担体タンパク質と混合された生理食塩水であってもよい。本発明の組成物を調製するための好ましい抗酸化剤は、アスコルビン酸である。

医薬組成物の溶媒又は希釈剤は、水性又は非水性のいずれであってもよく、ｐＨ、浸透圧、粘度、透明度、規模、無菌性、安定性、溶解速度、又は製剤の香気を改変及び／又は維持することが可能である他の薬学的に許容される賦形剤を含んでいてもよい。同様に、本発明による医薬組成物には、薬学的に効果的な物質の放出速度を改変及び／又は維持するために他の成分が含まれていてもよい。そのような改変成分は、非経口投与用の投薬量を単位剤形又は多用量剤形のいずれかに製剤化するために当技術分野で通常使用される物質である。

本発明に従って調製される最終製剤化医薬組成物は、溶液、懸濁物、ゲル、エマルジョン、固形物、又は脱水若しくは凍結乾燥粉末の形態で、滅菌バイアルに保存することができる。こうした製剤は、すぐに使用できる形態、又は例えば投与前に再構成が必要である凍結乾燥粉末の場合の形態のいずれかで保存することができる。上記の及び更なる好適な医薬製剤は当技術分野で公知であり、例えば、Ｇｕｓ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１８版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｅｒｎ、ペンシルベニア州、１９９０年、１４３５～１７１２頁）に記載されている。そのような製剤は、薬学的に効果的な成分の物理的状態、安定性、ｉｎ ｖｉｖｏ放出速度、及びｉｎ ｖｉｖｏクリアランス速度に影響を及ぼすことができる。

他の効果的な投与形態は、非経口の徐放性、つまり遅延性製剤、吸入ミスト、又は経口的活性製剤を含む。例えば、徐放性製剤は、ポリマー性化合物（ポリ乳酸、ポリグリコール酸など）又はリポソームの粒子状調製物に結合又は組み込まれているタンパク質を含んでいてもよい。
また、本発明による医薬組成物は、例えば、輸注又は注射による非経口投与のために製剤化されていてもよく、また、徐放性又は持続性循環製剤を含んでいてもよい。そのような非経口的に投与される療法用組成物は、典型的には、薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤中に薬学的に効果的な成分を含む、発熱物質を含まない非経口的に許容される水性溶液の形態である。
医薬組成物は、例えば、軟骨の再生が意図されている場合は、基質材料を含んでいてもよい。生体適合性基質材料内及び／又は上に適用される場合、タンパク質、核酸、発現ベクター、又は宿主細胞が有利である。基質材料は、本明細書で使用される場合、細胞動員、付着、増殖、及び分化のための足場として、及び／又は本発明の組換えＧＤＦ－５関連タンパク質の潜在的な送達及び貯蔵デバイスとして作用する担体又は基質を意味する。固体基質とは対照的に、担体は、明確に画定された表面を有しておらず、特定の形状を欠くアモルファス材料、つまりアルキルセルロース、プルロニック（登録商標）、ゼラチン、ポリエチレングリコール、デキストリン、植物油、糖、並びに他の液体及び粘性物質で構成される。

例示的な基質材料は、例えば、国際公開第９８／２１９７２号パンフレットに記載されている。そうした基質材料も本発明によるタンパク質に等しく好適である。基質材料は、例えば外科的に患者へと移植することができ、その場合タンパク質又はタンパク質をコードするＤＮＡは、基質材料からゆっくりと放出され得、その後長期間にわたって効果的であり得る。生体適合性であり、目的の領域又は使用適応症のために選択される限り、全てのタイプの基質材料が本発明に有用である。基質材料は、天然材料、改変天然材料であってもよく、同様に合成材料であってもよい。形態形成タンパク質の全ての既知基質が包含される。例えば、細胞外基質は、例えば、Ｉ、ＩＩ、Ｖ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、及びＸＩＩＩ型のような種々のコラーゲン、例えば、コンドロイチン硫酸、ビグリカン、デコリン、及び／若しくはヒアルロン酸のようなさらなるプロテオグリカン及びグリコサミノグリカン、又は例えば、オステオポンチン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、及び軟骨基質タンパク質のような非コラーゲンタンパク質を含む。また、言及されている天然材料は全て、人工的に改変された形態で使用することができる。有用な担体及び基質の非限定的なリストについては、Ｋｉｒｋｅｒ－Ｈｅａｄ、２０００年、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ４３巻、６５～９２頁を更に参照されたい。

更なる可能性は、本発明による組換えＧＤＦ－５関連タンパク質を含むリポソーム製剤に関する。上記製剤で使用されるリポソームは、当業者に一般的に公知である。特に、好ましいリポソーム製剤は、国際公開第２００８／０４９５８８号パンフレットに開示されている。より好ましいリポソーム製剤は、国際公開第２００８／０４９５８８号パンフレットの９～１３ページに記載されている。
更に、本発明のＧＤＦ－５バリアントタンパク質（Ｒ３９９Ｅ）は、他の薬学的に活性な物質と組み合わせて投与することができる。上記の薬学的に活性な物質は、例えば、局所的に効果的な鎮痛剤などの鎮痛剤、又はプロテアーゼ阻害剤のような、軟骨の形成が望ましい疾患に対して肯定的な効果を示す他の物質であってもよい。これらは、考え得る添加剤の単なる例であり、当業者であれば、医薬調製物に使用されているか、又は一般に安全であるとみなされている他の賦形剤を容易に添加することができる。

軟骨形成を誘導する能力が向上されているため、本発明の組換えＧＤＦ－５バリアントタンパク質は、軟骨の形成は望ましいが骨の形成は望ましくない疾患の治療に使用するために特に好適である。
従って、本発明の別の態様は、こうした疾患の治療における、本タンパク質（Ｒ３９９Ｅ）、核酸、ベクター、又は宿主細胞の使用である。特に、本タンパク質、核酸、ベクター、又は宿主細胞は、軟骨欠損の治療に使用するための、又は軟骨の外傷性断裂若しくは剥離、特に例えば摩耗に起因する加齢性軟骨欠損、変形性関節症、関節リウマチ、半月板傷害若しくは靭帯断裂のようなスポーツ疾患関連傷害、軟骨異栄養症のような軟骨に影響を及ぼす可能性のある疾患、成長障害及びその後の軟骨骨化を特徴とする疾患、軟骨形成不全、肋軟骨炎、椎間板ヘルニア及び椎間板修復、再発性多軟骨炎の治療に、軟骨腫又は軟骨肉腫のような良性若しくは悪性のいずれかの腫瘍に関連付けられる軟骨欠損の修復に使用するためのものである。
別の態様は、軟骨の形成は望ましいが骨の形成は望ましくない疾患を治療するための方法であって、本発明によるタンパク質、核酸、ベクター、又は宿主細胞を、そのような治療を必要とする患者に投与するステップを含む方法である。

本明細書で使用される場合、「治療する」という用語は、疾患、障害、若しくは状態、又はそのような用語が適用されるそのような疾患、障害、若しくは状態の１つ若しくは複数の症状の進行を逆転、緩和、又は阻害することを指す。また、本明細書で使用される場合、「治療する」は、未治療対照集団と比較して、又は治療前の同じ哺乳動物と比較して、哺乳動物において疾患、障害、又は状態が発生する確率又は発生率を減少させることを指すことができる。例えば、本明細書で使用される場合、「治療する」は、疾患、障害、若しくは状態を予防することを指し、疾患、障害、若しくは状態の発症を遅延若しくは予防すること、又は疾患、障害、若しくは状態に関連付けられる症状を遅延若しくは予防することを含んでいてもよい。また、本明細書で使用される場合、「治療する」は、哺乳動物が、疾患、障害、若しくは状態に苦痛を感じる前に、疾患、障害、若しくは状態、又はそのような疾患、障害、若しくは状態に関連付けられる症状の重症度を低減することを指すことができる。苦痛を感じる前の疾患、障害、又は状態の重症度のそのような予防又は低減は、投与時に疾患、障害、又は状態に苦痛を感じていない対象への、本明細書に記載の通り本発明の組成物を投与することに関する。また、本明細書で使用される場合、「治療する」は、疾患、障害、若しくは状態の再発、又はそのような疾患、障害、若しくは状態に関連付けられる１つ若しくは複数の症状の再発を予防することを指すことができる。

ラット変形性関節症モデルにおける疼痛読み取りを示す図である。 外科的ラット変形性関節症モデルの後期慢性期での疼痛に対する数日以内の有意な効果。 ラット変形性関節症モデルにおける疼痛読み取りを示す図である。 ラットＡＣＬＴ＋ｐＭＸ ＯＡモデルでは、６週間毎のＩＡ治療レジメンは、手術１週間後の初期で治療を開始すると、４週間毎又は２週間毎の治療レジメンよりも有利である（Ｂ）。 ウサギ変形性関節症モデルにおける疼痛読み取りを示す図である。 Ｒ３９９Ｅによる最初のＩＡ注射の６時間後の、ウサギＡＣＬＴ＋ｐＭｘ変形性関節症モデルにおける疼痛に対する有意な効果 基線インキャパシタンス測定を手術前に２回行った。ウサギの右膝関節のＡＣＬＴ＋ｐＭｘ膝手術により０週目にＯＡを誘導した。１週目にＲ３９９Ｅを関節内（ＩＡ）注射し、６時間後に静的体重負荷を測定した。体重負荷は、手術及び注射した右後肢にかかる圧力を左未手術後肢と比較してプレートで測定する非接触型静的インキャパシタンス測定法を用いて測定した。データは、左後肢に対して右後肢にかかる体重のパーセントであり、５０％は、両肢に均等な負荷がかかっていることに相当し、０％は未手術左肢にのみ負荷がかかっていることに相当する。 ウサギ変形性関節症モデルにおける疼痛読み取りを示す図である。 最初の注射の６時間後のウサギＡＣＬＴ＋ｐＭｘ変形性関節症モデルにおける疼痛に対する有意な効果を第２の独立研究で確認し、１回のＲ３９９Ｅ注射の効果を、臨床的に効果的なトリアムシノロンと比較した。 基線インキャパシタンス測定を手術前に２回行った。ウサギの右膝関節のＡＣＬＴ＋ｐＭｘ膝手術により０週目にＯＡを誘導した。１週目にＲ３９９Ｅを関節内（ＩＡ）注射し、６時間後に静的体重負荷を測定した。体重負荷は、手術及び注射した右後肢にかかる圧力を左未手術後肢と比較してプレートで測定する非接触型静的インキャパシタンス測定法を用いて測定した。データは、左後肢に対して右後肢にかかる体重のパーセントであり、５０％は、両肢に均等な負荷がかかっていることに相当し、０％は未手術左肢にのみ負荷がかかっていることに相当する。効果量を、臨床的に効果的なトリアムシノロン治療と比較した。１．４１ｍｇトリアムシノロンが、代謝体重、滑液容積、及び軟骨表面積に基づくヒト等価用量計算に相当する。 ウサギ変形性関節症モデルにおける疼痛読み取りを示す図である。 最初の注射後の最初の２週間中のＯＡウサギモデルにおけるＯＡ疼痛に対する１回のＲ３９９Ｅ注射又はトリアムシノロン治療の効果。 基線インキャパシタンス測定を手術前に２回行った。ウサギの右膝関節のＡＣＬＴ＋ｐＭｘ膝手術により０週目にＯＡを誘導した。１週目及び３週目にＲ３９９Ｅを関節内（ＩＡ）注射し、常に注射前に及び最初の注射の６時間後に静的体重負荷を測定した。体重負荷は、手術及び注射した右後肢にかかる圧力を左未手術後肢と比較してプレートで測定する非接触型静的インキャパシタンス測定法を用いて測定した。データは、左後肢に対して右後肢にかかる体重のパーセントであり、５０％は、両肢に均等な負荷がかかっていることに相当し、０％は未手術左肢にのみ負荷がかかっていることに相当する。効果量を、臨床的に効果的なトリアムシノロン治療と比較した。１．４１ｍｇトリアムシノロンが、代謝体重、滑液容積、及び軟骨表面積に基づくヒト等価用量計算に相当する。トリアムシノロン（Trimacinolone）。 ウサギ変形性関節症モデルにおける疼痛読み取りを示す図である。 １回のＩＡ Ｒ３９９Ｅ注射のＯＡ疼痛に対する有意な効果は、ウサギの外科的ＯＡモデルでは、次の注射まで少なくとも２週間持続する。また、このモデルの慢性期では、Ｒ３９９Ｅは、疼痛に対して持続的で有意な効果を示す。 基線インキャパシタンス測定を手術前に２回行った。ウサギの右膝関節のＡＣＬＴ＋ｐＭｘ膝手術により０週目にＯＡを誘導した。手術後１、３、５、７、９、及び１１週目にＲ３９９Ｅを関節内（ＩＡ）注射し、常に注射前に及び最初の注射の６時間後に静的体重負荷を測定した。体重負荷は、手術及び注射した右後肢にかかる圧力を左未手術後肢と比較してプレートで測定する非接触型静的インキャパシタンス測定法を用いて測定した。データは、左後肢に対して右後肢にかかる体重のパーセントであり、５０％は、両肢に均等な負荷がかかっていることに相当し、０％は未手術左肢のみに負荷がかかっていることに相当する。Ｒ３９９Ｅの試験用量は全て、関節痛に対する有意な有益効果を急速に示し、効果は、次の注射まで及び研究終了まで少なくとも１４日間持続した。 ウサギ変形性関節症モデルにおける疼痛読み取りを示す図である。 疼痛に対するＲ３９９Ｅの長期効果は、ウサギＡＣＬＴ＋ｐＭｘ ＯＡモデルの慢性期中の臨床的に効果的な抗ＮＧＦ抗体治療の効果量と同等である。 基線インキャパシタンス測定を手術前に２回行った。ウサギの右膝関節のＡＣＬＴ＋ｐＭｘ膝手術により０週目にＯＡを誘導した。手術後１、３、５、７、９、及び１１週目にＲ３９９Ｅを関節内（ＩＡ）注射し、常に注射前に及び最初の注射の６時間後に静的体重負荷を測定した。体重負荷は、手術及び注射した右後肢にかかる圧力を左未手術後肢と比較してプレートで測定する非接触型静的インキャパシタンス測定法を用いて測定した。データは、左後肢に対して右後肢にかかる体重のパーセントであり、５０％は、両肢に均等な負荷がかかっていることに相当し、０％は未手術左肢のみに負荷がかかっていることに相当する。Ｒ３９９Ｅの試験用量は全て、関節痛に対する有意な有益効果を急速に示し、効果は、次の注射まで及び研究終了まで少なくとも１４日間持続した。慢性疼痛に対する効果量を、ＯＡ進行の慢性期の５週目及び９週目に臨床的に効果的な抗ＮＧＦ－ＡＢ治療で到達された効果量と比較した。抗ＮＧＦ－ＡＢは、１週目にトリアムシノロンを受けた同じ動物に２回投与した。 ヒト変形性関節症滑膜及び軟骨外植片の共培養を示す図である。 ヒト変形性関節症滑膜及び軟骨共培養では、Ｒ３９９Ｅは、基質ＧＡＧ喪失、インターロイキン－１及びプロスタグランジン２放出を低減させる。 ヒトＯＡ軟骨細胞３Ｄアルギネートビーズ培養を示す図である。 リポ多糖（Lipopolysacharid）（ＬＰＳ）、インターロイキン－１ベータ（ＩＬ１β）、腫瘍壊死因子－アルファ（ＴＮＦａ）、又はインターロイキン－６（ＩＬ６）で恒久的に処理された初代ヒトＯＡ軟骨細胞（アルギネートビーズ培養、３８０ｍＯｓｍ、３００ｎｇ／ｍｌ、７日間）は、骨形態形成タンパク質受容体（ＢＭＰＲ）発現の障害を示す。ＢＭＰＲは、軟骨恒常性、骨恒常性、及び半月板恒常性に重要である。ＢＭＰＲは、ＢＭＰ２又はＢＭＰ７のような骨形態形成タンパク質の主な受容先であるが、ＧＤＦ５及びＲ３９９Ｅの受容先でもある。ＡＧ－ＡＬＧＩＮ－１７－００８：５人のドナーの単層ヒトＯＡ軟骨細胞。ＩＬ１ｂ １０ｎｇ／ｍＬ、ＴＮＦａ １０ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ６ １００ｎｇ／ｍＬ、又はＬＰＳ １μｇ／ｍＬと共に４８時間。統計：一元配置ＡＮＯＶＡ、続いてダネット検定（多重比較の補正）。＊は、統計的に異なることを意味し、ｐ＜０．０５である。 ブタ半月板培養を示す図である。 Ｒ３９９Ｅは、ブタ半月板培養における基質喪失及びサイトカイン産生を減少させる。 滑膜細胞細胞株ＳＷ９８２及び初代ヒト変形性関節症滑膜細胞培養を示す図である。 滑膜細胞細胞株ＳＷ９８２及び初代ＯＡ滑膜細胞（Ｃ、Ｄ）におけるＩＬ－１（Ａ）及びＩＬ－６（Ｂ）放出 ＳＷ９８２（滑膜細胞細胞株）細胞を、３つの異なる濃度のＲ３９９Ｅで７２時間処理した。Ｒ３９９Ｅは、３００ｎｇ／ｍｌでＩＬ－１β（Ａ）レベル及びＩＬ６（Ｂ）レベルを有意に低減させた。人工膝関節全置換術から得た滑膜試料から回収した初代ＯＡ滑膜細胞を、３つの異なる濃度のＲ３９９Ｅで７２時間処理した。Ｒ３９９Ｅは、９００ｎｇ／ｍｌでＩＬ－１β（Ｃ）を有意に低減させ、ＩＬ６レベル（Ｄ）を低減させた。 初代ヒト変形性関節症半月板細胞培養を示す図である。 Ｒ３９９Ｅは、初代ヒト半月板細胞でのＮＧＦ刺激性ＰＧＥ２放出をｉｎ ｖｉｔｒｏで阻害する。 初代ブタ健常軟骨細胞培養を示す図である。Ｒ３９９Ｅは、ブタ軟骨細胞でのＡＤＡＭＴＳ５（Ａ）発現及びＭＭＰ１（Ｂ）放出のＩＬ－１ベータ刺激性上方制御を阻害する。 初代ヒト変形性関節症軟骨細胞培養を示す図である。Ｒ３９９Ｅは、３８０ｍＯｓｍでの２週間アルギネートビーズ培養において、ヒトＯＡ軟骨細胞でのＭＭＰ１３発現及びＡＤＡＭＴＳ５発現を低減させる。両プロテアーゼは、コラーゲン及びアグリカンを切断することによる、ＯＡ疾患進行の主要な駆動因子である。その結果生じたＤＡＭＰ（ダメージ関連分子パターン）は、疼痛（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１７年１２月；４３６巻（１～２号）：５９～６９頁。ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１１０１０－０１７－３０７８－ｘ．Ｅｐｕｂ ２０１７年６月１日）及び炎症媒介性Ｔｏｌｌ様受容体に結合する。Ｍｉｌｌｅｒら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ。著者原稿；ＰＭＣ ２０１６年１１月１日。最終編集形態はＡｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ。２０１５年１１月；６７巻（１１号）：２９３３～２９４３頁。ｄｏｉ：１０．１００２／ａｒｔ．３９２９１としと出版された。 ウサギ変形性関節症モデルにおける構造読み取りを示す図である。Ｒ３９９Ｅは、組織学（Ａ）読み取り及びマイクロＣＴ（Ｂ、Ｃ）読み取りでは、ＯＡのウサギＡＣＬＴ＋ｐＭｘモデルの軟骨構造に対して有意な有益効果を示す。マイクロＣＴでは、軟骨の厚さ及び容積を、造影増強関節腔の区分化により定量化した。 ヒツジ変形性関節症モデルにおける構造読み取りを示す図である。 Ｒ３９９Ｅは、ＯＡのヒツジ関節不安定性の組織学的予備研究において、軟骨構造に対して有意な有益効果を示す。Ｒ３９９Ｅを、手術１週間後から開始して４週間毎に３回注射した。 ヒツジ変形性関節症モデルにおける構造読み取りを示す図である。 Ｒ３９９Ｅは、ＯＡのヒツジ関節不安定性のＭＲＩ予備研究において、軟骨構造に対して有益効果を示す（統計的に有意ではない）。Ｒ３９９Ｅを、手術１週間後から開始して４週間毎に３回注射した。 初代ブタ健常軟骨細胞培養を示す図である。 恒久的なＲ３９９Ｅ処理を用いたか又は用いなかった３８０ｍＯｓｍでのブタ健常軟骨細胞の軟骨組織アナログ（ＣＴＡ、Cartilage Tissue Analogue）３Ｄ培養における細胞外基質産生は、有意な同化促進効果を示す。初代ブタ健常軟骨細胞（４週間３Ｄ培養軟骨組織アナログ、３８０ｍＯｓｍ、３００ｎｇ／ｍｌ）。 初代ヒト変形性関節症軟骨細胞３Ｄアルギネートビーズ培養を示す図である。Ｒ３９９Ｅは、ヒトＯＡ軟骨細胞ＧＡＧ、ＨＰｒｏ、ｐｒｏＣ２の細胞外基質産生を用量依存的に増加させる。 初代ヒト変形性関節症軟骨細胞３Ｄアルギネートビーズ培養を示す図である。Ｒ３９９Ｅは、ヒトＯＡ軟骨細胞のアグリカン産生を用量依存的に増加させる。 ヒトＯＡ軟骨細胞アルギネートビーズでのアグリカン産生に対する化合物の効果。軟骨細胞を、３人の独立ドナーから単離した。細胞を、異なる濃度の化合物で７日間刺激した。ビーズ解重合後に領域間基質のアグリカンを測定し、７日目の対照レベルと比較した。 初代ヒト変形性関節症軟骨細胞３Ｄアルギネートビーズ培養を示す図である。 Ｒ３９９Ｅを用いた又は用いなかった３８０ｍＯｓｍでのヒトＯＡ軟骨細胞の２週間アルギネート封入３Ｄ培養における細胞外基質産生。初代ヒトＯＡ軟骨細胞（２週間アルギネートビーズ培養、３８０ｍＯｓｍ、３００ｎｇ／ｍｌ） 初代ヒト変形性関節症軟骨細胞３Ｄアルギネートビーズ培養を示す図である。 Ｒ３９９Ｅによる断続的な治療は、経時的に有意な同化促進効果に到達するのに十分である。ヒトＯＡ軟骨細胞を、上述のようにアルギネート中で培養し、１か月当たり１週間、２週間、３週間、若しくは４週間にわたってＲ３９９Ｅ ３００ｎｇ／ｍＬで処理したか、又は未処理のままにして、終了時にＧＡＧ含有量を定量化した。初代ヒトＯＡ軟骨細胞（アルギネートビーズ培養、３８０ｍＯｓｍ、３００ｎｇ／ｍｌ）；細胞＝軟骨細胞の数、ＧＡＧ＝アグリカンの成分、Ｈｐｒｏ（ヒドロキシプロリン）＝コラーゲンＩＩ型の成分、ｐｒｏＣ２＝コラーゲンＩＩ型産生のバイオマーカー。 初代ヒト変形性関節症軟骨細胞３Ｄアルギネートビーズ培養を示す図である。Ｒ３９９Ｅを用いたか又は用いなかった３８０ｍＯｓｍでのヒトＯＡ軟骨細胞の４週間アルギネート封入３Ｄ培養における、ｐｒｏＣ２（Ａ）、ｐｒｏＣ６（Ｂ）、及びＣＩＬＰ－２（Ｃ）の同化促進バイオマーカー測定。

表１ ＫＫ－ラット－１４－０９の治療スキーム及び研究概要
３つの異なるレジメン及び９つの用量を、ラットＡＣＬＴ＋ｐＭｘ ＯＡモデルで試験した。研究は、１群当たりｎ＝１０匹の動物で実施した。灰色セルの数字は、関節内（ＩＡ）に適用された用量を、３０μｌ総容積中のｎｇで示している。歩行分析を２週間毎に実施し、ｖｏｎＦｒｅｙ過敏症試験を１５週目又は１６週目に実施した。
表２ ラット変形性関節症モデルにおける疼痛読み取り
ラットＯＡ不安定性モデルにおける異なる用量及びレジメンのＩＡ Ｒ３９９Ｅ治療の症候性利益。この表には、プラセボよりも＞３０％良好だった効果のみが列挙されている。最も有効で持続可能な効果は、ラットに１３５０ｎｇを６週間毎に２回注射した場合に見られた。

［実施例１］
外科的誘導慢性ラットＯＡモデルでは、１回のＲ３９９Ｅ関節内（ＩＡ）注射は、関節不安定化手術の１２週間後に投与すると、後期疾患において１４日以内に疼痛に対して有意な効果を示す（ＣＢ－ラット－１４－０２９、図１を参照）。
関節の変化はＯＡ患者に見出されるもの（軟骨損傷、骨棘、軟骨下硬化症、歩行障害、及び炎症に基づく過敏症）と同等であるため、内側半月板（ｐＭｘ）の切除による前十字靭帯切断（ＡＣＬＴ）をげっ歯動物の不安定性ＯＡモデルとして組織内で確立した。ｃａｔｗａｌｋ試験により決定した歩行困難症状を、平坦表面を歩いている間に経験した疼痛を評価するように患者に求める臨床質問票に類似の一次読み取りとして使用した（Ｆｅｒｒｅｉｒａ－Ｇｏｍｅｓら、Ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐａｉｎ：ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐａｉｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ。２００８年１０月；９巻（１０号）：９４５～５４頁。ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：１８６５０１３１を参照）。ＡＣＬＴ＋ｐＭｘ手術誘導性関節不安定性は、軟骨侵食を引き起こす点状異常負荷を内側脛骨顆に早くも１週間以内にもたらした（Ｎａｖｅｅｎら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃａｌ ｓｃｉｅｎｃｅｓ。２０１４年；１１巻（１号）：９７～１０５頁。ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２４３９６２９１。Ｐｕｂｍｅｄ Ｃｅｎｔｒａｌ ＰＭＣＩＤ：３８８０９９６を参照）。

歩行困難は、典型的には手術１週間後に生じ（術後疼痛）、その後は無症状期間が続き、最終的には後期慢性ＯＡ期中に再発する。この後期歩行困難期は、ＯＡ疼痛期であると理解されている。Ｒ３９９Ｅの単回注射が、構造的修復効果前に症候性利益を生み出すことができるか否かを調査するため、ＣＢ－ラット－１４－０２９では、慢性ＯＡ疼痛による歩行困難が十分に確立された際のＡＣＬＴ＋ｐＭｘ手術の１２週間後に、Ｒ３３９９Ｅを単回注射（３用量ＩＡの）として投与した。試験施設に３週間馴化させた後、ラットを偽手術（皮膚切開）又はＡＣＬＴ＋ｐＭｘ手術のいずれかに供した。ＯＡ疼痛関連症状を決定するため、手術の１０、１１、及び１２週間後にＣａｔＷａｌｋ試験で歩行困難を決定した。歩行困難症状を示した全てのラットを４つの治療群（Ｒ３９９Ｅの用量が異なる３群及びプラセボ対照）に無作為化し、ＡＣＬＴ＋ｐＭｘ手術後の８１日目にＩＡ注射を１回行った。この３週間の期間中にＡＣＬＴ＋ｐＭｘ手術に対して最も感受性が高かった歩行パラメーターに基づき、本発明者らは、８匹のラットを無症候性であると特定し、研究から除外した。残りの４０匹のラットを、歩行困難に基づいて４群に無作為化し、手術後８０日目にＩＡプラセボ又はＲ３９９Ｅ（９０ｎｇ、９００ｎｇ、又は９０００ｎｇ／関節）のいずれかを投与した。分析計画で事前に規定されているように、治療効果を、この単回注射の１、３、７、及び１４日後にＣａｔＷａｌｋ試験で決定し、４回の測定全ての平均を群間で比較した。この期間では、６つの歩行パラメーターが、偽＋プラセボ群とＡＣＬＴ＋ｐＭｘ＋プラセボ群との間で有意に異なることを特定し、従ってＯＡ疾患関連症状を説明するためにそれらを使用した。本発明者らは、この期間では注射直後に、こうした疾患関連歩行パラメーターは全て、Ｒ３９９Ｅの注射により肯定的な影響を受けたことを見出した。全ての適格なパラメーターのプラセボに対する利益パーセントは、９００ｎｇ／関節のＲ３９９Ｅが最も効率的な用量であり、６０％の症候性利益を生み出すことを明らかにした。最も低い用量［９０ｎｇ／関節］は効果をほとんど示さず、最も高い用量［９０００ｎｇ／関節］は、プラセボに対して４０％利益を生み出した（図１を参照）。

［実施例１．１］
実施例１で使用したものと同じラットモデルでは、ＯＡ疼痛に対するＲ３９９Ｅの効果は、次の注射まで少なくとも６週間持続する（ＫＫ－ラット－１４－００９、図２及び表１及び表２を参照）。ＫＫ－ラット－１４－００９は、同じ外科ラットＯＡモデルを使用し、Ｒ３９９Ｅの慢性関節内（ＩＡ）注射を異なる用量及びレジメンで常に投与した場合、慢性ラット変形性関節症疼痛モデルにおいて症候性利益を示すか否かを調査するために設計した。軟骨基質産生に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ ＥＣ５０が１０８ｎｇ／ｍｌだったこと（図２０を参照）及びウサギ予備研究では２週間毎に２０００ｎｇの用量が効果的だったこと（データ非表示）に基づき、毎月０．９～９０００ｎｇの用量、並びに６週目毎に１３５ｎｇ、１３５０ｎｇ、並びに２週間毎に４５ｎｇ及び４５０ｎｇの用量をそれぞれ選択した（表１を参照）。ラットを手術後１７週間にわたって治療し、症状をＣａｔＷａｌｋ歩行分析装置及びｖｏｎ－Ｆｒｅｙ痛覚過敏試験で測定した。慢性疾患の経過（手術後１２～１６週目）では、未治療ラットは、ＣａｔＷａｌｋ装置による歩行障害又はｖｏｎ－Ｆｒｅｙ試験による機械的痛覚過敏として測定することできる症状を発症する。事前に規定した分析計画に従って、本発明者らは、１２週目～１６週目のキャットウォーク測定の平均を計算し、ビヒクルよりも３０％高い値を有意義であるとみなした。１６週目のｖｏｎ－Ｆｒｅｙ測定では、対ビヒクル利益限界を同じく３０％と規定した。

ＣａｔＷａｌｋ試験で決定した歩行困難の分析は、２週間毎に４５ｎｇのレジメンが、ＡＣＬＴ＋ｐＭｘ＋ビヒクル群に対して１６％利益をもたらしたことを明らかにした。２週間毎に注射した４５０ｎｇでは２０％利益に到達したが、それでも統計的に有意でも意味のあるものでもなかった。４週間レジメンでは、０．９ｎｇは、ＡＣＬＴ＋ｐＭｘ＋ビヒクルに対して５２％有意義な利益をもたらし、９ｎｇは、４．４％と効果を示さず、９０ｎｇは、８２％と統計的に有意な効果を示し、９００ｎｇは、ＡＣＬＴ＋ｐＭｘ＋ビヒクルに対して１．４％と効果を示さず、９０００ｎｇは、１７％と意味のある効果を示さなかった。６週間毎に１３５ｎｇ／注射のレジメンにおける対応する用量は、ＡＣＬＴ＋ｐＭｘ＋ビヒクルに対して２２％利益という傾向を示したが、より高い用量の１３５０ｎｇ／注射は、ＡＣＬＴ＋ｐＭｘ＋ビヒクルに対して４７％という統計的に有意であり意味のある利益を示した（図２及び表２を参照）。

ｖｏｎ－Ｆｒｅｙ痛覚過敏試験では、２週間毎の注射は、４５ｎｇではＡＣＬＴ＋ｐＭｘ＋ビヒクルと比較して１０４％過敏症低減をもたらし、これは両側ｔ検定で有意であり、４５０ｎｇでは６８％利益をもたらした。４週間レジメンでは、この場合も、０．９ｎｇ（７１％利益）及び９０ｎｇ（９１％利益）は、過敏症を有意に低減したが、９ｎｇ（－５％）及び９０００ｎｇ（－１２％）は、効果を示さなかった。しかしながら、ｖｏｎ－Ｆｒｅｙ試験では、９００ｎｇ群もビヒクルに対して９０％利益に到達したが、統計的有意性はなかった。６週間毎のレジメンでは、ビヒクル（ビヒクル）群はより少ない過敏症を示し、変動性は、より頻繁に治療され偽群に対して統計的有意差に到達しなかったビヒクル群よりも高かった。６週間毎の１３５ｎｇ注射は、ビヒクルに対して１６％利益を示し、１３５０ｎｇは７０％効果を示した（表２を参照）。

［実施例２］
外科的誘導ウサギＯＡモデルでは、１回の関節内Ｒ３９９Ｅ注射は、疼痛に対して６時間以内に有意な効果を示す。この効果は、次の注射まで少なくとも２週間持続する。この結果は、２つの独立研究で確認された（図３及び４を参照）。
ＫＫ－ウサギ－１６－０１では、麻酔をかけたウサギを加温パッドに位置決めし、手術中は５％グルコース溶液をゆっくりと静脈内に輸注した。右膝関節を削り、消毒した。メス及びはさみを使用して、皮膚、筋肉、及び嚢を開いた。膝蓋骨を側方に位置決めし、脂肪体を切開して前十字靭帯を露出させた。小型留め金及びメスを使用して靭帯を切断した。半月板の前角を露出させ、半月板－脛骨靭帯から外した。小型鉗子を使用して固定したうえで、半月板の前半分を切除した。関節を滅菌生理食塩溶液で洗浄し、吸収性縫合材料を使用して嚢及び皮膚を３層に閉じた。麻酔から完全に回復するまでウサギをケージに入れたままにし、その後群に戻した。研究が終了するまで、ウサギは、５６ｍ²の小屋で自由に動き、ジャンプすることができた。関節荷重を評価するために、インキャパシタンス試験を実施した。各後肢の体重負荷を圧力プレートで測定し、以下の通り、左未手術膝関節の右手術膝関節に対する比として電子的に記録した：右肢／（右肢＋左肢）＊１００。使用したインキャパシタンスデバイスは、扱いやすく、静止させるために固定する必要がない、よく訓練された群飼育ウサギ用に特別に作られていた。ウサギをこのデバイスに置き、後肢を圧力測定プレートの中央に位置決めした。観察者による影響を防ぐため、観察者は、測定中に動物を固定することも触れることもなかった。測定は接続されていたＰＣにより制御され、データは自動的に収集され、観察者には依存しなかった。各測定にはおよそ５秒間かかり、最低で３秒間を超える安定データが得られたら手動で停止させた。希に、動物が静止しなかった場合、測定を停止し、その後繰り返した。

ＡＣＬＴ＋ｐＭｘ手術は、手術後の１、２、３、５、７、９、１１、及び１２週目に、有意な右後肢の除荷をもたらした。関節荷重は、右後肢対左後肢の５０：５０％負荷から、左（未手術）対右（手術）後肢のおよそ６６：３４％負荷へとシフトした。
動物に、プラセボ（Ｒ３９９Ｅビヒクル）、０．６、６、又は６０μｇのＲ３９９Ｅを、手術１週間後から開始してその後１４日毎に合計６回、関節内（ＩＡ）に注射した。最後の注射の２週間後である１３週目に動物を安楽死させた。
最初の注射（最初の測定）の６時間後には既に、Ｒ３９９Ｅの試験用量は全て、右後肢の負荷を有意に回復させ、およそ６０：４０の左：右負荷比をもたらした。これは、０．６μｇで３６．５％利益（ｐ＝０．００２３）、６μｇで４５．２％利益（ｐ＝０．０００２）、及び６０μｇで３８．９％利益（ｐ＝０．００１６）を意味する（図３を参照）。

［実施例３］
外科的誘導ウサギＯＡモデルでは、１回の関節内注射後の疼痛に対するＲ３９９Ｅ効果の発生は、手術１週間後の急性及び炎症初期で臨床的に効果的なトリアムシノロンと同様に即効性だった。疼痛に対するＲ３９９Ｅの効果は、全ての用量で統計的有意性に到達するが、トリアムシノロンの効果はわずかにより低い（図４）。
ＫＫ－ウサギ－１７－０１では、ＫＫ－ウサギ－１６－０１と同じ外科的誘導ＯＡモデル及び研究設計を使用し、Ｒ３９９Ｅの効果を、手術１週間後の初期及び急性期で臨床的に効果的なトリアムシノロンの効果量と比較することを目的とした。
上記に記載の通り、変形性関節症様軟骨分解を、前十字靭帯の切断（ＡＣＬＴ）及び内側半月板の部分的前側切除（ｐＭｘ）により、６２匹の雌３６～３７週齢ニュージーランドホワイト（ＮＺＷ）ウサギに実験的に誘導した。動物を体重により５群に無作為分配した。４群は、１注射当たり２００μｌビヒクル中０μｇ（ビヒクル対照、ｎ＝１３）、０．６μｇ（ｎ＝１２）、６μｇ（ｎ＝１３）、及び６０μｇ（ｎ＝１３）のＲ３９９Ｅを受け取った。追加の実験第５群（ｎ＝１１）にトリアムシノロンを注射して（手術後１週目に１×ＩＡ注射）、Ｒ３９９Ｅの薬理学的効果を、ＯＡ患者において症候性有効性を示しているトリアムシノロンと比較した。関節内（ＩＡ）治療は、手術１週間後に最初の注射を行うことから開始した。
トリアムシノロン及び全ての試験用量０．６μｇ（ビヒクルに対して３８．３％、ｐ＜０．０１）、６μｇ（ビヒクルに対して４８％、ｐ＜０．００１）、及び６０μｇ（ビヒクルに対して４２．７％、ｐ＜０．０１）は、最初の注射から６時間後に既に疼痛に対して有意な効果を示した（図４を参照）。

［実施例４］
ウサギＯＡモデルの手術後急性初期中に手術膝にＩＡ注射した６及び６０μｇのＲ３９９Ｅの疼痛軽減効果は、次の注射まで少なくとも２週間持続するが、１．４１ｍｇのトリアムシノロンの効果は、最初の注射の１週間後には既になくなっている（図５）。
ＫＫ－ウサギ－１７－０１では、上記に記載のように、前十字靭帯の切断（ＡＣＬＴ）及び内側半月板の部分的前側切除（ｐＭｘ）により変形性関節症様軟骨分解を雌ウサギに実験的に誘導した。
手術後２週目には、プラセボと比較して＞３０％の症候性効果は、６μｇ（３５．７％、ｐ＝０．０８０２）及び６０μｇ（４０．８％、ｐ＝０．０４１７）のＲ３９９Ｅにより説明され、トリアムシノロンの症候性効果（－１１．６％、ｐ＝０．８９）は完全になくなり、動物はその時点でプラセボ治療動物よりも更により高い軽減傾向を示した（図５を参照）。

［実施例５］
Ｒ３９９ＥのＩＡ注射は、ウサギの外科的誘導ＯＡモデルの慢性期中も疼痛に対して有益な効果を示す（図６）。
上記に記載のＫＫ－ウサギ－１６－０１実験全体を通して、６μｇの中用量は、最も高い観察された平均効果を経時的に示し、２週目に４９％、３週目に５７％、５週目に５５％、７週目に６０％、９週目及び１１週目に６９％、並びに１２週目に７２％（全ての時点でｐ＝０．０００１）の効果を発揮した。０．６μｇ（ｐ＝０．００２７）群及び６０μｇ（ｐ＝０．０００１）群は、５週目～７週目に、ビヒクルに対しておよそ４０％の最大効果レベルに到達した。その後、この効果量は研究終了まで安定していたが、０．６μｇの効果（約５０％利益）は、９週目から始まりそれ以降の時点で６０μｇの効果（約４０％）よりもわずかにより高かった（図６を参照）。

［実施例６］
外科的誘導ウサギＯＡモデルでは、１回の関節内注射後の疼痛に対するＲ３９９Ｅの効果量は、疾患進行の慢性期中の臨床的に効果的な抗ＮＧＦ抗体治療の大きさと同等である（図７）。
実施例５（ＫＫ－ウサギ－１６－０１の時間経過）と同様に、ＫＫ－ウサギ－１７－０１では、Ｒ３９９Ｅ ＩＡ治療の症候性利益は研究全体を通して持続した。注射は手術１週間後に開始し、その後隔週で合計６回行った。この研究の群１～３をＲ３９９Ｅ ＩＡで治療し、群４をプラセボＩＡで治療した。群５では、上記に記載の通り、トリアムシノロンを１週目にＩＡ注射した。同じ動物は、トリアムシノロン効果が完全になくなった後５週目及び９週目にヒト等価用量の臨床的に効果的な抗ＮＧＦ抗体をＩＶで受け取った。加えて、この群に、プラセボＩＡ注射を３、５、７、９、及び１１週目に投与した。観察者非依存性無接触インキャパシタンスデバイス測定を、最初の注射の６時間後に及びその後は隔週で常に注射前に上記の実施例と同様に実施した。
１ｍｇ／ｋｇの抗ＮＧＦ抗体によるＩＶ治療は、疼痛に対して最大で５６％効果をもたらした（ｐ＝０．０１９５）。この効果量は、同じ時点における３用量のＲ３９９Ｅで達成された、疼痛に対する４７．１％（ｐ＝０．０４２６）、５７．８％（ｐ＝０．００９１）、及び７５．７％（ｐ＝０．００１１）効果と同等である（図７を参照）。

［実施例７］
ヒト滑膜＋軟骨外植片培養では、Ｒ３９９Ｅは、基質喪失（ＧＡＧ放出）を低減し、それにより関節恒常性の有意な正常化に寄与する。加えて、Ｒ３９９Ｅは、ＯＡの疼痛及び炎症の原因となり、関節恒常性を損なうサイトカイン：ＩＬ１及びＰＧＥ２の放出を低減する（図８）。こうしたサイトカインは、ＯＡ患者の疼痛及び炎症を直接的に誘導するだけでなく、軟骨細胞でのＢＭＰ受容体発現を下方制御する。その結果としてＢＭＰに対する軟骨細胞の応答性が低減するため、疾患進行が加速する可能性がある（図９）。
基質モジュレーション（ＧＡＧ放出）、ＰＧＥ２、及び炎症促進性サイトカインに対するＲ３９９Ｅの効果を、軟骨外植片＋滑膜、又は滑膜のみで構成されるヒトＯＡ共培養モデルで調査した。組織を７日間共培養し、１、４、７日後に試料採取した。ＯＡ軟骨外植片とＯＡ滑膜との共培養は、上清へのＧＡＧ放出を有意に誘導した。Ｒ３９９Ｅ（１００及び３００ｎｇ／ｍＬ）による治療は、ＧＡＧ放出を阻害し、３００ｎｇ／ｍＬで統計的有意性に到達した（ｐ＝０．０１６）。滑膜のみの培養はＧＡＧ放出を誘導しなかった。これは、ＯＡ軟骨が共培養系におけるＧＡＧの主な供給源であることを示している（図８）。
ＯＡ軟骨とＯＡ滑膜とを一緒に共培養すると、ＩＬ１β及びＰＧＥ２の上清への放出がロバストに誘導された。Ｒ３９９Ｅは、共培養系では、ＩＬ１β（１００ｎｇ／ｍＬでｐ＝０．０２４５及び３００ｎｇ／ｍＬでｐ＝０．０１５９、図１１を参照）産生及びＰＧＥ２（１００ｎｇ／ｍＬでｐ＝０．９８７２及び３００ｎｇ／ｍＬでｐ＝０．００５７）産生を阻害した。滑膜のみの培養は、外植片のみの培養よりも有意により多くのＰＧＥ２を上清中にもたらした（ｐ＝０．０００１）。これは、滑膜がこの系におけるＰＧＥ２の主要な供給源であることを示している。試験したＲ３９９Ｅ用量は両方とも、滑膜による未刺激ＰＧＥ２放出を阻害した（１００ｎｇ／ｍＬでｐ＝０．００７及び３００ｎｇ／ｍＬでｐ＝０．０２７）。
まとめると、Ｒ３９９Ｅは、ヒトＯＡ軟骨及び滑膜の共培養において基質分解を阻害した。加えて、Ｒ３９９Ｅは、炎症性サイトカイン及び疼痛媒介性ＰＧＥ２の阻害として表されるように、ＯＡ軟骨とＯＡ滑膜との間のオートクリン及び／又はパラクリンシグナル伝達を妨害した。

［実施例８］
ＴＮＦアルファ＋オンコスタチンで刺激した半月板組織培養では、Ｒ３９９Ｅは、ＯＡの疼痛及び炎症の原因となり、関節恒常性を損なうサイトカインの放出を低減し（ＴＮＦａ、ＩＬ６）、基質喪失を防止する（ＧＡＧ、図１０）。
プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）及びサイトカインＩＬ１β、ＩＬ６、ＩＬ８、及びＴＮＦαの放出に対するＲ３９９Ｅの効果を調査することを目的として、ブタ半月板を培養した。ブタ半月板（半月板外植片）の完全スライスをＴ＋Ｏ（２０ｎｇ／ｍＬ ＴＮＦα＋１０ｎｇ／ｍＬ ＯＳＭ（オンコスタチンＡ））で刺激した。加えて、半月板外植片を、異なる濃度のＲ３９９Ｅ（３００、９００、１２００ｎｇ／ｍＬ）で処理した。全インキュベーション時間は７日間であり、２、５、７日後に試料採取した。対照として、半月板外植片は、刺激したが未処理（Ｔ＋Ｏ）だったか又は未刺激だった（外植片のみ）。Ｔ＋Ｏによる刺激は、ブタ半月板からＩＬ６を誘導した。Ｒ３９９Ｅによる処理は、Ｔ＋Ｏ誘導性ＩＬ６放出を阻害した（９００ｎｇ／ｍＬ研究バッチでｐ＝０．０００１、３００及び１２００ｎｇ／ｍＬ ｔｏｘバッチでｐ＜０．０１５、３００及び９００ｎｇ／ｍＬ ＧＭＰバッチでｐ＜０．００５）。Ｒ３９９Ｅは、Ｔ＋Ｏ誘導性ＰＧＥ２放出をＧＭＰバッチで最大４４％、研究バッチで最大７２％、ＧＬＰバッチで４９％阻害したが、ｐ＜０．０５の統計的有意性には到達しなかった。バッチ間に有意差は観察されなかった。ＩＬβ、Ｉｌ－８、及びＴＮＦ－アルファ放出に対するＲ３９９Ｅの効果には一貫性がなく、この実験設定では用量依存的ではなかった（図１０を参照）。
まとめると、こうしたデータは、半月板が膝ＯＡの炎症環境に寄与すること、及びＲ３９９Ｅによる処理が、半月板に由来する炎症促進性サイトカイン及びＰＧＥ２の濃度を低減し、それによりＯＡ動物モデル及びＯＡ患者においてＩＡ注射後に鎮痛をもたらすことができることを示す。

［実施例９］
また、滑膜細胞細胞株（ＳＷ９８２）及び初代ヒト変形性関節症滑膜細胞細胞培養では、Ｒ３９９Ｅは、インターロイキン－６（図１１Ａ、Ｃ）及びインターロイキン－１（図１１Ｂ、Ｄ）のサイトカイン放出を低減させ、それにより関節恒常性の正常化、並びに疼痛、炎症、及び更には疾患進行の防止を助長する（図１１）。

［実施例１０］
神経成長因子（ＮＧＦ）で刺激した初代ヒト半月板細胞培養では、Ｒ３９９Ｅは、ＯＡの疼痛及び炎症の原因となるＰＧＥ２の放出を低減させる。人工膝関節全置換術に由来する初代半月板細胞を、倫理的許可の枠内で手術１日後に新たに調製した。まず、皮膚及び筋肉を除去して半月板を単離した。半月板を、ＨＡＭ Ｆ１２＋１％Ｐ／Ｓ＋１％アンホテリシンＢで満たした１０ｃｍ皿に移した。組織を、およそ３×３ｍｍの小片に切断し、消化のために滅菌ビーカーに移した。消化は、ＨＡＭ Ｆ１２＋１％Ｐ／Ｓ＋１％アンホテリシン溶液中０．４％の５０ｍｌコラゲナーゼ中で、３７℃、７．５％ＣＯ２にて絶えず撹拌しながら１６時間実施した。１６時間後、溶液をピペットで１００μｍフィルターに、続いて４０μｍフィルターに通し、その後１４００ｇで５分間遠心分離した。細胞を含む残留ペレットを、２０ｍｌのＨＡＭ Ｆ１２＋１％Ｐ／Ｓ＋１％アンホテリシン＋１０％ＦＣＳに再懸濁した。細胞数を計数し、細胞生存率を決定した。最後に、１ウェル当たり１０，０００個の細胞を９６ウェルプレートに播種した。細胞を、コンフルエンシーに到達するまで最大１週間培養した。その間に培地を１回交換しました。細胞がコンフルエンシーに到達したら、１０ｎｇ／ｍｌ ｒｈＮＧＦで刺激し、及び／又は０．１μＭデキサメタゾン、０．１μＭトリアムシノロン、３７５ｎｇ／ｍｌ抗ベータＮＧＦ抗体、３００ｎｇ／ｍｌ Ｒ３９９Ｅで処理したか、又は未処理のままにした（陰性対照）。個々の化合物の効果を、ｒｈＮＧＦのみで刺激した細胞と比較した。２日間のインキュベーション後、培地中のプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）を決定するために、上清を除去した。初代半月板細胞をｒｈＮＧＦで処理するとＰＧＥ２が誘導されたが、これは全ての試験化合物により有意に阻害された。Ｒ３９９Ｅの効果を、臨床的に効果的なデキサメタゾン、トリアムシノロン、及び抗ＮＧＦ抗体処理の効果と比較する（図１２）。

［実施例１１］
Ｒ３９９Ｅは、ブタ健常軟骨細胞（図１３）及びヒトＯＡ軟骨細胞（図１４）においてＡＤＡＭＴＳ５（トロンボスポンジンモチーフ５を有するディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ）発現及びマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）放出を低減させる。ＡＤＡＭＴＳ５は、ＯＡ進行中の軟骨基質の病理学的切断の原因である異化プロテアーゼである。それにより、Ｒ３９９Ｅは更なる軟骨破壊を防止し、内因性ＤＮＡ及び他の軟骨基質分解産物などの損傷関連分子パターン分子（ＤＡＭＰ）の産生を低減する。こうした分子は、ＯＡ病理の加速に関連しており、ＯＡ関連炎症及び疼痛並びにニューロン感作の原因である。

ブタ軟骨細胞を、地元食肉処理場（Ａｒｒａｓ、Ｒｅｉｃｈｅｌｓｈｅｉｍ－Ｂｅｅｒｆｕｒｔｈ）から得たおよそ１歳のブタの大腿骨頭から単離した。軟組織から細胞を取り出すために、軟骨を、ＨＡＭ Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カタログ番号２１７６５）中０．２５％質量／容積コラゲナーゼ（Ｓｅｒｖａ ＧｍｂＨ社、カタログ番号１７４６５）で４５分間室温にて、及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を有するＨＡＭ Ｆ１２中０．１％質量／容積コラゲナーゼで一晩３７℃にて連続消化した。得られた細胞懸濁物を、１００μｍ、次いで４０μｍのセルストレーナー（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＧｍｂＨ社）で濾過し、遠心分離により数回洗浄し、培養培地に再懸濁した。新たに単離したブタ軟骨細胞を、まずＤＭＥＭＨＧ、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ ＧｍｂＨ社）、５０μｇ／ｍＬアスコルビン酸－２－リン酸塩、及び０．４ｍＭプロリン（Prolin）中で７日間にわたって単層で培養し、次いで１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１βが添加された同じ培地中で、ｑＰＣＲ分析用には１５０００細胞／ウェルで、又はＭＭＰ１測定用には２０００００細胞／ウェルで培養し、３０、３００、及び９００ｎｇ／ｍＬのＲ３９９Ｅで、３日間（ＭＭＰ１）又は７日間（ｑＰＣＲ）にわたって２４ウェルプレートにて処理したか又は未処理のままにした。

遺伝子発現のため、Ｑｉａｇｅｎ社のＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを使用してＲＮＡを単離した。ｍＲＮＡの濃度及び品質を、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ社のＡｇｉｌｅｎｔ ＲＮＡ ６０００ナノチップを用いてＡｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｓｅｒで分析した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ社のＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＳｕｐｅｒＭｉｘで逆転写を実現させ、続いてＲＮＡｓｅＨ処理を行った。ｑＰＣＲは、ブタＡＤＡＭＴＳ５に対するプライマー（’ＴＣＡＣＡＣＴＧＣＴＣＡＴＧＡＣＧＡＡＡ； ＧＣＡＡＧＴＧＴＧＴＧＧＡＣＡＡＡＡＣＣ）を使用して、Ｓｉｇｍａ社のＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＪｕｍｐＳｔａｒｔ Ｔａｑ Ｒｅａｄｙ Ｍｉｘで実施した。６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ１３ａ（ＲＰＬ１３Ａ）をハウスキーピング遺伝子として使用した。

ＭＭＰ１測定の場合、上清を収集し、ヒトＭＭＰ３－Ｐｌｅｘ超高感度キット（ＭＳＤ社）を使用してＭＭＰ１を測定した。

ヒト軟骨細胞を、人工膝又は股関節全置換術を受けた３人のＯＡ患者から採取した軟骨から単離した。患者は全員、インフォームドコンセントに署名した。細胞単離は、０．２５％コラゲナーゼ（ＨＡＭ Ｆ１２中２．５％のＳｅｒｖａでコラゲナーゼＮＢＧ４を１／１０に希釈した）で４５分間消化することから構成されていた。ほぐれた細胞を廃棄し、軟骨を０．１％コラゲナーゼ（１％ペニシリン／ストレプトマイシンを有するＨＡＭ Ｆ１２で２．５％コラゲナーゼＮＢＧ４を１／２５に希釈した）で一晩更に消化して軟骨細胞を抽出した。

新たに単離したヒトＯＡ軟骨細胞を、まず、１０％ＦＢＳ、０．４ｍＭプロリン、及び５０μｇ／ｍＬアスコルビン酸－２－リン酸塩、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを有するＤＭＥＭ高グルコース中で５日間にわたって単層で培養し、次いで２０００００細胞／ウェルにて２４ウェルプレートの同じ培地中で培養し、３０、３００、１０００ｎｇ／ｍＬのＲ３９９Ｅで７日間処理したか又は未処理のままにした。遺伝子発現のため、Ｑｉａｇｅｎ社のＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを用いてＲＮＡを単離した。ｍＲＮＡの濃度及び品質を、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ社のＡｇｉｌｅｎｔ ＲＮＡ ６０００ナノチップを用いてＡｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｓｅｒで分析した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ社のＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＳｕｐｅｒＭｉｘで逆転写を実現させ、続いてＲＮＡｓｅＨ処理を行った。ｑＰＣＲは、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＴａｑｍａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘを用いて、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社の対応するＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイで実施した。ＥＦ１アルファをハウスキーピング遺伝子として使用した。

［実施例１２］
外科的誘導ウサギ不安定性ＯＡモデル（ＡＣＬＴ＋ｐＭｘ、ＫＫ－ウサギ－１６－０１）では、０．６（ｐ＝０．２０５）及び６μｇ（ｐ＝０．０４０４）が、肉眼的形態学的分析において軟骨形態に意味のある＞３０％有益効果を示した（図１５Ａ）。６μｇ群（肉眼的形態が最良の結果）の軟骨容積のマイクロＣＴに基づく定量化は、軟骨容積及び厚さがプラセボ群と比較して有意により高いことを明らかにした（図１５Ｂ及び１５Ｃ）。
実施例２で説明したように、雌ウサギの前十字靭帯を切断し（ＡＣＬＴ）、内側半月板のおよそ半分を切除した（ｐＭｘ）。動物に、プラセボ（Ｒ３９９Ｅビヒクル）０．６、６、又は６０μｇのＲ３９９Ｅを、手術１週間後から開始してその後１４日毎に合計６回、関節内（ＩＡ）に注射した。最後の注射の２週間後、１３週目に動物を安楽死させた。

マイクロＣＴ分析のため、剖検プロセス中に膝関節を大腿骨及び脛骨で分離した。その後、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ、Ｍｅｒｃｋ社、ダルムシュタット、ドイツ、１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４中、Ｇｉｂｃｏ社、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ウォルサム、米国）で、完全に固定されるように少なくとも５日間固定した。マイクロＣＴ画像を得る前に、関節を１×ＰＢＳですすいでＰＦＡ残留物を洗浄し、気泡を含まないＭｏｌｔｏｆｉｌｌ（商標）ｅｌａｓｔｉｃ（Ａｋｚｏ Ｎｏｂｅｌ Ｄｅｃｏ ＧｍｂＨ社、ケルン、ドイツ）で満たされた小さなプラスチックショットグラス（２ｃｌ、ＥＤＥＫＡ ＧＵＴ＆ＧＵＥＮＳＴＩＧ、ドイツ）に個々に充填した。６５ｋＶ／３８４μＡのＸ線源、１７．６０μｍのピクセルサイズ、及び１ｍｍのアルミニウムフィルターを有するマイクロＣＴ装置（ＳｋｙＳｃａｎ１１７６；Ｂｒｕｋｅｒ社、コンティフ、ベルギー）を使用して、標本をスキャンした。スキャン後、ＮＲｅｃｏｎソフトウェア（Ｂｒｕｋｅｒ社）を用いて断面スライスを生成した。規定の閾値を使用して各スキャンを再構築して、ｂｏｎｅ＆Ｍｏｌｔｏｆｉｌｌ（商標）（同じ骨様造影剤）を、ビーム硬化及びリングアーチファクト補正が適用された軟骨の負のコントラストと区別した。均一な分析を確実にするためにＤａｔａＶｉｅｗｅｒソフトウェア（Ｂｒｕｋｅｒ社）を同じように使用して、全てのデータセットを解剖学的マーカーに対して調整した。ＣＴＡｎソフトウェア（Ｂｒｕｋｅｒ社）を使用して３次元分析を実施した。関心容積（ＶＯＩ）を、寸法が直径３５０２．８μｍ（１９９ピクセル）の内側大腿顆の体重負荷領域に適用した。このＶＯＩ内の左及び右（対側）内側大腿顆の軟骨容積及び軟骨厚を計算し、対応する対側関節の％値として表した（図１５Ｂ、１５Ｃ）。

肉眼的形態学的調査のため、脛骨及び大腿骨の関節表面をトルイジンブルー（０．０５％）で３０秒間室温にて染色し、続いて脱塩水に浸漬し、１５～２０分間空気乾燥した。滑面組織と線維状組織とのコントラストを増加するために、染色した表面を黒色インク（Ｈｉｇｇｉｎｓ ｂｌａｃｋ Ｉｎｄｉａインク（Ｃｈａｒｔｐａｋ Ｉｎｃ社、リーズ、マサチューセッツ州、米国）に１秒間浸漬し、続いて３秒間待機し、水道水で３秒間すすいだ。１５分間の追加の空気乾燥期間後、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｖ１２顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ＧｍｂＨ社、イエナ、ドイツ）を使用して表面を画像化し、Ａｘｉｏｃａｍ ＨＲＣカメラ及び適切なソフトウェアＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ４．８．２（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ社、イエナ、ドイツ）で撮影した。倍率は、関節表面全体が画像形式を満たすように選択した。取得したＺステープルからの３Ｄ画像の再構成には電動光学系を使用した。Ｚステープルの高さは、各関節の関心領域をスクロールすることにより手動で決定した。Ｚスタックの１０～２０枚の単一画像を取得し、Ｃａｖａｌｅｒｉ分析用の最終画像に結合した。

画像解析ソフトウェアを使用して総関節表面積を測定し、スコアを使用して形態学的変化を定量化した。総関節表面積は、手術により増加した。この知見は予想されており、このモデル並びに他の外科モデル及び異なる種を使用した他の研究とも一致する。Ｒ３９９Ｅは、このパラメーターに対して効果を示さなかった。肉眼的形態合計スコアでは、１００％の改善が対側平均レベルに対応し、０％がビヒクル平均レベルに対応することになることを考慮すると、３つの治療群全ての平均は投薬とは無関係におよそ３０％改善した。スコアが１と評価された軽度変化のみの領域は、ビヒクル処理動物よりもＲ３９９Ｅ処理群の方が多かった。この場合も、３つの用量全てが、ビヒクル群の平均よりも３０％改善という意味のある効果に到達した。中程度の損傷軟骨の量を表すスコア２の領域では、０．６μｇ群の平均は、ビヒクル群の平均と比較して３０％利益を示した。亀裂を伴う重度損傷軟骨（スコア３）の量に注目すると最も明確な構造的効果が見られた。０．６μｇのＲ３９９Ｅは、およそ４０％少ないスコア３の領域をもたらし、６μｇは、５０％の効果量で亀裂を有する領域を低減させ、統計的有意性（ｐ＝０．０４０４）に到達し、６０μｇは、ビヒクル群の平均と比較して３０％改善した平均値をもたらしたが、統計的有意性に到達しなかった（図１５Ａ）。

［実施例１３］
外科的誘導ヒツジＯＡモデルでは、１群当たり７匹のみの動物を用いた予備研究において既に、Ｒ３９９Ｅを４週間毎に３回関節内注射することにより、傾向として、プラセボと比較して組織学的スコアの有意な改善（図１６）及びより良好なＭＲＩスコア（図１７）がもたらされていた。
この実験では、内側半月板切断モデル（Ｃａｋｅ、２０１３年 Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ ２０１３年；２１巻：２２６～２３６頁）を使用して、１２週間の「生存」期で変形性関節症（ＯＡ）様変化を誘導した。試験品目であるＲ３９９Ｅを、手術後７日目から開始して３つの異なる用量（１２、１２０、及び１２００μｇ／関節）の月１回レジメンで関節内（ＩＡ）投与した。この研究の主要評価項目は、組織学的切片の定量的スコアリングにより決定される内側及び外側大腿骨顆軟骨の構造的改善だった。Ｒ３９９Ｅは、この転帰を有意に改善した。ここでは、Ｒ３９９Ｅは、１２０μｇ／関節の中用量が最も有効だった。

骨軟骨試料（６×６ｍｍ）を、外側及び内側大腿骨顆並びに外側及び内側近位脛骨顆の荷重負荷軟骨領域から収集した。各関節の測定値を使用して決定した関節の中央部分から各試料を得た。定規を使用して顆状突起の中点に印を付け、中点を骨軟骨試料の中心として使用した。試料を１０％緩衝生理食塩水で固定し、１０％ＥＤＴＡ溶液で４週間、続いて５％ギ酸で１週間脱灰した。パラフィン包埋切片（厚さ５μｍ）を調製した。切片をトルイジンブルー及びサフラニンＯ－ファストグリーンで染色して、構造及び軟骨を強調した（Ｓｃｈｍｉｔｚら、２０１０年 Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｔｉｓ ａｎｄ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ。１８巻Ｓ３号 Ｓ１１３～１１６頁）。改変マンキンスコアを使用して、軟骨の組織学的変化を定量化した。

手術した関節の４つの区画から切片を得、改変マンキンスコアを使用してスコア付けした。組織学的スコアを合計すると、ビヒクル対照と比較して、１２、１２０μｇ／関節のＲ３９９Ｅを受け取った動物には統計的に有意な損傷の低減が存在した（図１６を参照）。マンキンスコアの様々な成分を部分的に分析すると、損傷の低減がいずれか１つの測定されたパラメーターによるものではなく、低減は全てのパラメーターにわたって広がっていることが示された。
低磁場ＭＲＩ（Ｅｓｏａｔｅ社）を使用して、死後に各手術肢から磁気共鳴画像（ＭＲＩ）を得た。ＭＲ画像は、改変ｓＭＯＡＫＳスコアを使用してヨーロッパイメージングスペシャリスト（European Imaging Specialist）により盲検的にスコア付けされた（Ｍｏｙａ－Ａｎｇｅｌｅｒ、２０１６年３月；２３巻（２号）：２１４～２０頁。ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｋｎｅｅ．２０１５．１１．０１７。Ｅｐｕｂ ２０１６年１月２７日を参照）。
ＭＲＩの場合、関節には、３つの単位－内側及び外側大腿脛骨関節並びに大腿膝蓋骨関節があるとみなした。関節の各領域について、以下のもの：関節軟骨喪失、骨棘、関節滲出液、骨髄病変（高強度軟骨下骨（subchondral bone hyperintensity））をスコア付けした。
ＭＲＩは、死後に低磁場磁石を使用して全ての手術肢から得た。ＭＲ画像は、改変ｓＭＯＡＫＳスコアを使用して、ヨーロッパイメージングスペシャリストにより盲検的にスコア付けされた。完全な関節の３つの区画全てのスコア又は内側大腿骨－脛骨区画のみのスコアを分析したところ、１２０μｇ及び１２００μｇのＲ３９９Ｅ／関節で治療した動物のｓＭＯＡＫスコアには、対照と比較して傾向が存在した（図１７を参照）。

［実施例１４］
ブタ健常軟骨細胞細胞培養実験では、Ｒ３９９Ｅは、軟骨細胞外基質産生及び細胞増殖を有意に増加させる（図１８）。
ブタ軟骨細胞を単離し、他所で説明されている通りに（Ｇｉｇｏｕｔら、２０１７年 Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ ｃａｒｔｉｌａｇｅ、２５巻：１８５８～１８６７年）無足場３Ｄ培養系（軟骨組織アナログ、ＣＴＡ）で培養した。１００万個細胞／３Ｄ構築物を、１０％ＦＣＳ、０．４ｍＭプロリン、及び５０μｇ／ｍＬアスコルビン酸－２－リン酸塩で補完されたＤＭＥＭ高グルコースに播種し、Ｎ＝３で４週間、３００ｎｇ／ｍＬのＲ３９９Ｅで処理したか又は未処理のままにした。

培養の終了時に、３Ｄ細胞構築物を収集して、それらのＤＮＡ、ＧＡＧ、及びヒドロキシプロリンの含有量又は遺伝子発現をｑＰＣＲで評価した。また、各条件毎に試料を固定し、組織学用にパラフィンに包埋した（Ｎ＝３）。ＧＡＧ、ヒドロキシプロリン、及びＤＮＡを測定する前に、３Ｄ細胞構築物をパパインで消化した（パパイン緩衝液中の０．１２５ｍｇ／ｍＬパパイン、５ｍＭ Ｌ－システインと共に６０℃で一晩）。ＤＮＡは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＱｕａｎｉＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓ ＤＮＡキットを用いて製造業者の推奨に従って測定した。ＧＡＧは、ジメチルメチレンブルー（ＤＭＭＢ）アッセイ（Ｆａｒｎｄａｌｅら、１９８６年 Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ８８３巻：１７３～１７７頁）、及びＧｉｇｏｕｔら、２００７年に記載の通りのＨＰＬＣによるＨＰｒｏで定量化した。

遺伝子発現のため、Ｑｉａｇｅｎ社のＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを使用してＲＮＡを単離した。ｍＲＮＡの濃度及び品質を、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ社のＡｇｉｌｅｎｔ ＲＮＡ ６０００ナノチップを用いてＡｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｓｅｒで分析した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ社のＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＳｕｐｅｒＭｉｘで逆転写を実現させ、続いてＲＮＡｓｅＨ処理を行った。ｑＰＣＲは、２００ｎＭのリバースプライマー及びフォワードプライマーを用いて、Ｓｙｂｒ－Ｇｒｅｅｎ Ｊｕｍｐｓｔａｒｔ Ｔａｑ Ｒｅａｄｙ Ｍｉｘ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）で実施した。ＥＦ１アルファをハウスキーピング遺伝子として使用した。
組織学的評価のため、３Ｄ細胞構築物を４％パラホルムアルデヒドで３０分間室温にて固定し、ＰＢＳで３回洗浄し、細胞外基質をサフラニン－Ｏで又はコラーゲン２型を染色した。

［実施例１５］
ヒトＯＡ軟骨細胞細胞培養実験では、Ｒ３９９Ｅに対する恒久的な曝露は、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、ヒドロキシプロリン（ＨＰｒｏ）、及びプロコラーゲン２型（ｐｒｏＣ２）の産生を有意に及び用量依存的に増加させる（図１９）。
ヒト軟骨細胞を、人工膝又は股関節全置換術を受けた３人のＯＡ患者から採取した軟骨から単離した。患者は全員、インフォームドコンセントに署名した。細胞単離は、０．２５％コラゲナーゼ（ＨＡＭ Ｆ１２中２．５％のＳｅｒｖａでコラゲナーゼＮＢＧ４を１／１０に希釈した）で４５分間消化することから構成されていた。ほぐれた細胞を廃棄し、軟骨を０．１％コラゲナーゼ（１％ペニシリン／ストレプトマイシンを有するＨＡＭ Ｆ１２で２．５％コラゲナーゼＮＢＧ４を１／２５に希釈した）で一晩更に消化して軟骨細胞を抽出した。各条件をＮ＝４で実施した。

新たに単離したヒトＯＡ軟骨細胞を、まず、１０％ＦＢＳ、０．４ｍＭプロリン、及び５０μｇ／ｍＬアスコルビン酸－２－リン酸塩、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを有し、３８０ｍＯｓｍに調整された（浸透圧は浸透圧計で確認した）ＤＭＥＭ高グルコースで５日間単層で培養した。次いで細胞を回収し、２×１０６個の細胞をアルギネート溶液（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ社の０．２Ｍ ＨＥＰＥＳ及びＭｅｒｃｋ社の１．５Ｍ ＮａＣｌ中のＦｌｕｋａ社の１．２５％アルギネート、ｐＨ７．４に調整）に再懸濁し、細胞懸濁物を、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ社）を含む１２０ｍＭ ＣａＣｌ２（Ｍｅｒｃｋ社）に１滴ずつ注いだ。細胞液滴を撹拌しながら１５分間重合させてアルギネートビーズを形成し、１５０ｍＭ ＮａＣｌ溶液で３回洗浄した。アルギネートビーズを、まず、３８０ｍＯｓｍに調整した培養培地中で処理せずに７日間培養した。続いて、ビーズを、３００ｎｇ／ｍＬ Ｒ３９９Ｅ又は１２．５μＭ ＨＣＬ（対照）で補完した３８０ｍＯｓｍの培養培地１ｍＬ中に５ビーズ／ウェルで２４ウェル超低結合プレート（ＶＷＲ社）に移した。１４日後、アルギネートビーズを、ｐＨ８の１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び４０μＬの２．５％コラゲナーゼを有する４６０μＬの５５ｍＭクエン酸Ｎａ（Ｍｅｒｃｋ社）に１時間溶解した。次に、５００μＬのＤＭＥＭ高グルコース又はＰＢＳを添加し、溶液を遠心分離した。溶解したアルギネート上清中のＧＡＧ、ＨＰｒｏ、及びＰｒｏＣ２を測定した。ＧＡＧ及びＨＰｒｏは、上記に記載の通りに分析した。ＰｒｏＣ２は、Ｇｕｄｍａｎｎら、２０１４年 Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ、１５巻：１８７８９～１８８０３頁に記載の通りに測定した。

［実施例１６］
ヒトＯＡ軟骨細胞細胞培養実験では、Ｒ３９９Ｅに対する恒久的な曝露は、１０８ｎｇ／ｍＬのＥＣ５０で、アグリカンタンパク質レベルを有意に及び用量依存的に増加させる（図２０）。
軟骨生検を、人工膝関節全置換術中に３人のヒトドナーから単離し、細かく刻んで消化した。細胞を培養し、Ｐ１で液体窒素（ＬＮ）にて凍結した。細胞をＬＮから解凍し、１００００個細胞／ｃｍ²の細胞密度で培養し、細胞がコンフルエンシーになるまで増殖させた。８日後、Ｐ２のコンフルエント細胞をトリプシン処理して計数し、ビーズを製作した（－５日目）。５日間の培養後（０日目）、ビーズを７日間で３回（０、２、４日目）刺激した。１週間後、ビーズを回収し、アグリカン含有量を分析した。
含まれている対照は、通常培養培地中の０日目ビーズ及びビヒクル対照培地（通常増殖培地による１０ｍＭ ＨＣｌ ｐＨ０．２の１：５０希釈）による７日目ビーズである。
試料のアグリカン含有量は、Ｄｉａｓｏｕｒｃｅ社の市販ＰＧ－ＥＬＩＳＡ（カタログ番号ＫＡＰ１４６１）を使用して決定した。実験ＯＤ値から、ブランク（blanco）対照を差し引いた。検量線式に基づいてアグリカンの絶対量を算出した。７日目ビーズ（刺激なし－ビヒクル対照培地のみ）と比較した比を算出し比較した。３人のドナーの平均比の４ＰＬフィッティングを使用してＥＣ５０値を算出した。

［実施例１７］
ヒトＯＡ軟骨細胞細胞培養実験では、Ｒ３９９Ｅに対する恒久的な曝露は、硝子軟骨基質産生を経時的に有意に増加させる（図２１）。
ヒトＯＡ軟骨細胞を、上記に記載の通りに、単離し、培養し、アルギネートに包埋し、３００ｎｇ／ｍＬのＲ３９９Ｅで処理したか又は未処理のままにした。ビーズ溶解後、細胞の含有量を、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社のＶｉＣｅｌｌで細胞分析した。溶解したアルギネート中のＧＡＧ、ＨＰｒｏ、及びＰｒｏＣ２を、上記に記載の通りに測定した。遺伝子発現分析を、上記に記載の通りに細胞に対して実施した。

［実施例１８］
Ｒ３９９Ｅによる断続的な治療は、経時的に有意な同化促進効果に到達するのに十分である。ヒトＯＡ軟骨細胞を、上述の通りにアルギネート中で培養し、１か月当たり１週間、２週間、３週間、若しくは４週間にわたってＲ３９９Ｅ ３００ｎｇ／ｍＬで処理したか又は未処理のままにした。８週間（２か月）後、細胞含有量、ＧＡＧ含有量、ＨＰｒｏ含有量、及びＰｒｏＣ２含有量は、有意に上昇した（図２２）。

［実施例１８］ヒトＯＡ軟骨細胞細胞培養実験では、Ｒ３９９Ｅに対する恒久的な曝露は、ｐｒｏＣ２、ｐｒｏＣ６、及びＣＩＬＰ－２の同化促進性バイオマーカー産生を有意に増加させる（図２３）。
ヒトＯＡ軟骨細胞を、上述の通りにアルギネート中で培養し、４週間にわたってＲ３９９Ｅ ３００ｎｇ／ｍＬで処理したか又は未処理のままにした。培養培地中のＰｒｏＣ２、Ｐｒｏｃ６、及びＣＩＬＰ２を、様々な時点で測定した。ＰｒｏＣ２は、上記で言及されている通りに測定し、Ｐｒｏｃ６は、Ｎｏｒｄｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅにより測定され、ＣＩＬＰ２は、Ａｂｂｅｘａ社のＥＬＩＳＡキットａｂｘ１５１０７３を用いて測定した。

Claims (7)

1. 軟骨欠損及び疼痛を治療するための、アミノ酸交換Ｒ３９９Ｅを有するＧＤＦ－５変異タンパク質の使用。
2. 前記軟骨欠損は、変形性関節症、関節リウマチ、半月板傷害又は靭帯断裂のようなスポーツ関連傷害、並びに軟骨異栄養症のような軟骨に影響を及ぼす可能性のある疾患、成長障害及びその後の軟骨骨化により特徴付けられる疾患、軟骨形成不全、肋軟骨炎、椎間板ヘルニア及び椎間板修復、再発性多軟骨炎、軟骨腫又は軟骨肉腫のような良性又は悪性のいずれかの腫瘍に関連付けられる軟骨欠損の修復、並びに疼痛である、請求項１に記載のタンパク質の使用。
3. 炎症及び疼痛を低減することにより軟骨分解又は半月板分解を防止するための、請求項１に記載のタンパク質の使用。
4. 軟骨欠損及び疼痛を罹患している患者に対する、患部関節への関節内注射による、請求項１に記載のタンパク質の投与。
5. 請求項１に記載のタンパク質、並びに軟骨欠損及び疼痛を治療するための少なくとも１つの他の薬理学的有効成分を含む薬理学的組成物。
6. 軟骨欠損及び疼痛を治療するための、請求項１に記載のタンパク質及びスプリフェルミンを含む薬理学的組成物。
7. 軟骨欠損及び疼痛を治療するための許容される添加剤又は担体を有する、請求項４又は５に記載の薬理学的組成物。

Images