JP2000053579A - 軟骨誘導のための骨誘導タンパク質およびド―サライジング因子の組合せの使用 - Google Patents
軟骨誘導のための骨誘導タンパク質およびド―サライジング因子の組合せの使用Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明は、骨誘導タンパク質とドーサライジ
ング因子との組合せを用いて、間葉幹細胞から軟骨細胞
を誘導するための方法および組成物を提供することを課
題とする。 【解決手段】 軟骨形成に有用な薬剤である、10：1か
ら1：10までの比率の骨誘導タンパク質およびドーサラ
イジング因子の組成物が提供された。
ング因子との組合せを用いて、間葉幹細胞から軟骨細胞
を誘導するための方法および組成物を提供することを課
題とする。 【解決手段】 軟骨形成に有用な薬剤である、10：1か
ら1：10までの比率の骨誘導タンパク質およびドーサラ
イジング因子の組成物が提供された。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、骨誘導タンパク質
とドーサライジング因子との組合せを用いて、間葉幹細
胞から軟骨細胞を誘導するための方法および組成物に関
する。
とドーサライジング因子との組合せを用いて、間葉幹細
胞から軟骨細胞を誘導するための方法および組成物に関
する。
【０００２】
【従来の技術】骨誘導タンパク質とは、間葉幹細胞の軟
骨細胞および骨細胞への分化を誘導するタンパク質であ
り、例えば、ヘッジホッグ・タンパク質（ソニック（Sh
h）、インディアン（Ihh）、デザート（Dhh）；Kinto
ら、FEBS Letters 404(1997)319-323）またはBMP（bone
morphogenetic protein）である。
骨細胞および骨細胞への分化を誘導するタンパク質であ
り、例えば、ヘッジホッグ・タンパク質（ソニック（Sh
h）、インディアン（Ihh）、デザート（Dhh）；Kinto
ら、FEBS Letters 404(1997)319-323）またはBMP（bone
morphogenetic protein）である。
【０００３】BMPは、骨、軟骨、腱、および骨中に存在
するその他の組織を形成させる分子である。これらのタ
ンパク質には特有の誘導活性があり、骨中に存在してい
るということから、これらは骨修復過程の重要な制御因
子であり、骨組織の正常な維持に関与しているというこ
とが示唆される。そのようなタンパク質は数多く知られ
ており、いくつかのサブファミリーに分類することがで
きる（Reddi,A.H.,Cytokine & Growth Factor Reviews
8(1997)11-20）。そのようなBMPは、例えば、BMP-2から
BMP-14、およびGDF-1からGDF-14である。
するその他の組織を形成させる分子である。これらのタ
ンパク質には特有の誘導活性があり、骨中に存在してい
るということから、これらは骨修復過程の重要な制御因
子であり、骨組織の正常な維持に関与しているというこ
とが示唆される。そのようなタンパク質は数多く知られ
ており、いくつかのサブファミリーに分類することがで
きる（Reddi,A.H.,Cytokine & Growth Factor Reviews
8(1997)11-20）。そのようなBMPは、例えば、BMP-2から
BMP-14、およびGDF-1からGDF-14である。
【０００４】BMPは多面発現性の制御因子であり、その
ため、走化性、マイトーシス、および分化のような、骨
および軟骨の形成における多段階の連続的カスケードを
制御する。特に、BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-7は軟骨形
成および骨形成を開始させる。
ため、走化性、マイトーシス、および分化のような、骨
および軟骨の形成における多段階の連続的カスケードを
制御する。特に、BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-7は軟骨形
成および骨形成を開始させる。
【０００５】しかし、BMP-2、BMP-4、BMP-5、およびBMP
-7は、同時に骨形成を誘導せずに、軟骨形成のみを誘導
することはできない。従って、軟骨性骨形成に関してBM
P-2、BMP-4、BMP-5、およびBMP-7を薬学的に適用した場
合には、必ず、軟骨細胞および骨細胞が誘導されること
になる。しかし、軟骨組織の修復に関しては、同時に骨
形成を誘導することなく、軟骨形成の開始を達成するこ
とが有利であると考えられる。
-7は、同時に骨形成を誘導せずに、軟骨形成のみを誘導
することはできない。従って、軟骨性骨形成に関してBM
P-2、BMP-4、BMP-5、およびBMP-7を薬学的に適用した場
合には、必ず、軟骨細胞および骨細胞が誘導されること
になる。しかし、軟骨組織の修復に関しては、同時に骨
形成を誘導することなく、軟骨形成の開始を達成するこ
とが有利であると考えられる。
【０００６】BMPアンタゴニストとは、BMPの骨形成性を
阻害する物質であり、例えば、ノギン（noggin）、コー
ジン（chordin）、またはフォリスタチン（follistati
n）である。
阻害する物質であり、例えば、ノギン（noggin）、コー
ジン（chordin）、またはフォリスタチン（follistati
n）である。
【０００７】ノギンは、成長因子であり、かつBMPアン
タゴニストであり、例えば、米国特許第5,670,481号に
開示されている。ノギンは、シュペーマン形成体（Spem
ann organizer）に発現しており、シュペーマン形成体
の効果、即ち、神経誘導および中胚葉のドーサライゼー
ションのメディエーターであると考えられる。ノギンは
脊索および頭中胚葉に発現しているため、神経板の背側
／腹側パターンまたは前方／後方パターンのいずれかに
影響を与えていると考えられる。ノギンは鰓弓神経堤に
発現しているため、神経堤細胞が軟骨に沈積するか否か
に影響を与え、後の鰓弓の成長およびリモデリングにも
影響を与えていると考えられる。ノギンは尾びれ神経堤
に発現しており、神経提は、ひれの成長に必要であるた
め、表皮または間葉の成長因子として機能しているのか
もしれない。
タゴニストであり、例えば、米国特許第5,670,481号に
開示されている。ノギンは、シュペーマン形成体（Spem
ann organizer）に発現しており、シュペーマン形成体
の効果、即ち、神経誘導および中胚葉のドーサライゼー
ションのメディエーターであると考えられる。ノギンは
脊索および頭中胚葉に発現しているため、神経板の背側
／腹側パターンまたは前方／後方パターンのいずれかに
影響を与えていると考えられる。ノギンは鰓弓神経堤に
発現しているため、神経堤細胞が軟骨に沈積するか否か
に影響を与え、後の鰓弓の成長およびリモデリングにも
影響を与えていると考えられる。ノギンは尾びれ神経堤
に発現しており、神経提は、ひれの成長に必要であるた
め、表皮または間葉の成長因子として機能しているのか
もしれない。
【０００８】ノギンは、高親和性でBMP-4に結合するこ
とができ（Piccolloら、Cell 86(1996)12141-12145）、
BMPのアンタゴニストである（Re'em-Kalmaら、Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA 92(1995)12141-12145; Sasaiら、Natur
e 376(1995)333-336; Fainsodら、Mechanisms of Devel
opment 63(1997)39-50）。
とができ（Piccolloら、Cell 86(1996)12141-12145）、
BMPのアンタゴニストである（Re'em-Kalmaら、Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA 92(1995)12141-12145; Sasaiら、Natur
e 376(1995)333-336; Fainsodら、Mechanisms of Devel
opment 63(1997)39-50）。
【０００９】コージンは、分泌型ポリペプチドであり、
強力なドーサライジング／神経誘導因子である（米国特
許第5,679,783号; Sasaiら、Cell 79(1994)779-790）。
コージンは、シュペーマン形成体に発現している。コー
ジンの過剰発現は、脊索と神経組織を誘導するが、中胚
葉は誘導しない。しかし、コージンは、中胚葉の分化
（specification）を修飾することはできる。コージン
の発現はノギンと重複しており、ノギンと類似の機能を
有する。コージンはBMP-4に対して拮抗的に作用し（Fai
nsodら、EMBO 13(1994)5015-5025）、高親和性でBMP-4
に結合することができる（Piccolloら、Cell 86(1996)5
89-598）。
強力なドーサライジング／神経誘導因子である（米国特
許第5,679,783号; Sasaiら、Cell 79(1994)779-790）。
コージンは、シュペーマン形成体に発現している。コー
ジンの過剰発現は、脊索と神経組織を誘導するが、中胚
葉は誘導しない。しかし、コージンは、中胚葉の分化
（specification）を修飾することはできる。コージン
の発現はノギンと重複しており、ノギンと類似の機能を
有する。コージンはBMP-4に対して拮抗的に作用し（Fai
nsodら、EMBO 13(1994)5015-5025）、高親和性でBMP-4
に結合することができる（Piccolloら、Cell 86(1996)5
89-598）。
【００１０】フォリスタチンは、分泌型ポリペプチドで
あり、シュペーマン形成体に発現しており、ドーサライ
ジング／神経誘導因子として機能する。最初は、アクチ
ビン（activin）の結合タンパク質であり、アクチビン
機能を阻害するものとして記載された（Nakamuraら、Sc
ience 247(1990)836-838; Hemmati-Brivanlouら、Cell
79(1994)169-179）。フォリスタチンも、BMPに結合する
ことができる（Fainsodら、Mechanisms of Development
63(1997)39-50）。
あり、シュペーマン形成体に発現しており、ドーサライ
ジング／神経誘導因子として機能する。最初は、アクチ
ビン（activin）の結合タンパク質であり、アクチビン
機能を阻害するものとして記載された（Nakamuraら、Sc
ience 247(1990)836-838; Hemmati-Brivanlouら、Cell
79(1994)169-179）。フォリスタチンも、BMPに結合する
ことができる（Fainsodら、Mechanisms of Development
63(1997)39-50）。
【００１１】軟骨の欠陥に関しては、限られた成功しか
達成されていない。標準的な方法は、原線維からなる関
節軟骨の剥離（shaving）、挫滅組織切除、スポンギオ
ラジエーション（spongiolaziation）、剥離軟骨整復
術、骨切り術、微小骨折（microfracture）、および軟
骨移植術、例えば軟骨膜の自家移植、骨膜の自家移植で
ある。簡便で有効な治療法は、未だ存在しない（Heath
およびMargari,Biotechnology and Bioengineering 50
(1996)430-437のレビューを参照）。新規な治療法とし
ては、軟骨細胞移植、成長因子治療、細胞治療（米国特
許第5,486,359号）、遺伝子治療、新規な生体材料など
が考えられる。現在のところ、これらは未だ利用可能で
ない。
達成されていない。標準的な方法は、原線維からなる関
節軟骨の剥離（shaving）、挫滅組織切除、スポンギオ
ラジエーション（spongiolaziation）、剥離軟骨整復
術、骨切り術、微小骨折（microfracture）、および軟
骨移植術、例えば軟骨膜の自家移植、骨膜の自家移植で
ある。簡便で有効な治療法は、未だ存在しない（Heath
およびMargari,Biotechnology and Bioengineering 50
(1996)430-437のレビューを参照）。新規な治療法とし
ては、軟骨細胞移植、成長因子治療、細胞治療（米国特
許第5,486,359号）、遺伝子治療、新規な生体材料など
が考えられる。現在のところ、これらは未だ利用可能で
ない。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明
は、骨誘導タンパク質とドーサライジング因子との組合
せを用いて、間葉幹細胞から軟骨細胞を誘導するための
方法および組成物を提供することを課題とする。
は、骨誘導タンパク質とドーサライジング因子との組合
せを用いて、間葉幹細胞から軟骨細胞を誘導するための
方法および組成物を提供することを課題とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】本発明は、骨形成因子お
よびBMPアンタゴニストの組成物を用いた、軟骨修復の
ための方法を提供する。
よびBMPアンタゴニストの組成物を用いた、軟骨修復の
ための方法を提供する。
【００１４】驚くべきことに、骨誘導（骨形成）タンパ
ク質、好ましくはBMP-2、4、5、および7、またはヘッジ
ホッグ・タンパク質は、10：1から1：10までの比率（BM
P：ノギン）で存在する場合、ノギン、コージン、およ
びフォリスタチンのようなBMPアンタゴニストによりイ
ンビボで完全には阻害されないことが見出された。しか
し、ここで、骨形成の開始は大きく阻害されるが、軟骨
形成はさほど影響を受けずに進行する。本発明による効
果のためには、BMPアンタゴニストがBMP-2、BMP-4、BMP
-5、およびBMP-7に対して高い結合親和性を示すことが
必要不可欠である。
ク質、好ましくはBMP-2、4、5、および7、またはヘッジ
ホッグ・タンパク質は、10：1から1：10までの比率（BM
P：ノギン）で存在する場合、ノギン、コージン、およ
びフォリスタチンのようなBMPアンタゴニストによりイ
ンビボで完全には阻害されないことが見出された。しか
し、ここで、骨形成の開始は大きく阻害されるが、軟骨
形成はさほど影響を受けずに進行する。本発明による効
果のためには、BMPアンタゴニストがBMP-2、BMP-4、BMP
-5、およびBMP-7に対して高い結合親和性を示すことが
必要不可欠である。
【００１５】「骨誘導タンパク質」とは、好ましくは、
間葉幹細胞に基づくBMP依存的な骨形成を誘導する骨形
成タンパク質と理解される。それによりBMPはアップレ
ギュレートされ、これが最終的に軟骨細胞の形成をもた
らす。そのようなBMP依存的な骨形成の誘導は、例え
ば、BMP自体を介して、または細胞内でBMPの発現を誘導
する物質、例えばヘッジホッグ・タンパク質を介して達
成されうる。
間葉幹細胞に基づくBMP依存的な骨形成を誘導する骨形
成タンパク質と理解される。それによりBMPはアップレ
ギュレートされ、これが最終的に軟骨細胞の形成をもた
らす。そのようなBMP依存的な骨形成の誘導は、例え
ば、BMP自体を介して、または細胞内でBMPの発現を誘導
する物質、例えばヘッジホッグ・タンパク質を介して達
成されうる。
【００１６】物質がBMP依存的な骨形成を誘導する能力
は、簡便に試験することができる。この目的のために
は、例えば、間葉細胞、例えばC3H10T1/2細胞を骨誘導
タンパク質候補の存在下および非存在下で培養する。対
照および処理済細胞のオステオカルシンおよびアルカリ
ホスファターゼの活性を測定する。オステオカルシン
は、例えばダコー社（Dako Co.）などの市販されている
ELISAにより測定することができる。アルカリホスファ
ターゼは、例えばリン酸p-ニトロフェニルのような適当
な比色用基質を用いた測光法により測定することができ
る。オステオカルシンおよび／またはアルカリホスファ
ターゼの活性の増大を、骨誘導としてスコア化する。ま
たは、オステオカルシンおよびアルカリホスファターゼ
のアップレギュレーションを、オステオカルシンおよび
アルカリホスファターゼのための適当なプライマーを用
いたRT-PCRにより測定する。
は、簡便に試験することができる。この目的のために
は、例えば、間葉細胞、例えばC3H10T1/2細胞を骨誘導
タンパク質候補の存在下および非存在下で培養する。対
照および処理済細胞のオステオカルシンおよびアルカリ
ホスファターゼの活性を測定する。オステオカルシン
は、例えばダコー社（Dako Co.）などの市販されている
ELISAにより測定することができる。アルカリホスファ
ターゼは、例えばリン酸p-ニトロフェニルのような適当
な比色用基質を用いた測光法により測定することができ
る。オステオカルシンおよび／またはアルカリホスファ
ターゼの活性の増大を、骨誘導としてスコア化する。ま
たは、オステオカルシンおよびアルカリホスファターゼ
のアップレギュレーションを、オステオカルシンおよび
アルカリホスファターゼのための適当なプライマーを用
いたRT-PCRにより測定する。
【００１７】本発明に係る「ドーサライジング因子」と
は、BMPアンタゴニストのようにBMP、好ましくはBMP-2
またはヘッジホッグの骨誘導性を阻害する物質、好まし
くはタンパク質と理解される。そのような阻害は、例え
ば骨髄間質細胞系アッセイで決定することができる（Zi
mmermannら、Cell 86(1996)599-606）。ドーサライジン
グ因子は、ツメガエルにおける背側構造の形成を促進す
る性質を有する。ドーサライジング活性は、ツメガエル
・アニマル・キャップ・アッセイ（Xenopus animal cap
assay）により決定することができる。ツメガエル・ア
ニマル・キャップ・アッセイ（Ruiz i Altaba,Essentia
l Developmental Biology,A PracticalApproach,IRL Pr
ess,1993,IRL Press,pp.147-152; Lambら、Science 262
(1993)713-718）は、神経誘導を決定するために使用さ
れる。処理後、アニマル・キャップを神経マーカー、例
えばNCAMの存在、中胚葉マーカー、例えば筋肉アクチン
の非存在に関して染色する。そのような因子は、例え
ば、ノギン、コージン、およびフォリスタチンである
（Fainsodら、Mechanisms of Development 63(1997)39-
50）。BMPアンタゴニストは、例えば、[Re'em-Kalma
ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92(1995)12141-12145]、
[Sasaiら、Nature 376(1995)333-336]、および[Fainsod
ら、Mechanisms of Development 63(1997)39-50]に開示
されている。
は、BMPアンタゴニストのようにBMP、好ましくはBMP-2
またはヘッジホッグの骨誘導性を阻害する物質、好まし
くはタンパク質と理解される。そのような阻害は、例え
ば骨髄間質細胞系アッセイで決定することができる（Zi
mmermannら、Cell 86(1996)599-606）。ドーサライジン
グ因子は、ツメガエルにおける背側構造の形成を促進す
る性質を有する。ドーサライジング活性は、ツメガエル
・アニマル・キャップ・アッセイ（Xenopus animal cap
assay）により決定することができる。ツメガエル・ア
ニマル・キャップ・アッセイ（Ruiz i Altaba,Essentia
l Developmental Biology,A PracticalApproach,IRL Pr
ess,1993,IRL Press,pp.147-152; Lambら、Science 262
(1993)713-718）は、神経誘導を決定するために使用さ
れる。処理後、アニマル・キャップを神経マーカー、例
えばNCAMの存在、中胚葉マーカー、例えば筋肉アクチン
の非存在に関して染色する。そのような因子は、例え
ば、ノギン、コージン、およびフォリスタチンである
（Fainsodら、Mechanisms of Development 63(1997)39-
50）。BMPアンタゴニストは、例えば、[Re'em-Kalma
ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92(1995)12141-12145]、
[Sasaiら、Nature 376(1995)333-336]、および[Fainsod
ら、Mechanisms of Development 63(1997)39-50]に開示
されている。
【００１８】本発明のさらなる好ましい態様において、
骨形成タンパク質およびドーサライジング因子は、遺伝
子治療により細胞内に導入されうる。この方法のために
は、骨形成タンパク質およびドーサライジング因子をコ
ードする遺伝子を、好ましくは同一プロモーターの調節
下、一つのベクターに導入することもできるし、または
別々のベクターに導入することもできる。従って、本発
明は、骨誘導タンパク質およびドーサライジング因子を
発現可能な発現ベクター、または骨誘導タンパク質を発
現可能なベクターとドーサライジング因子を発現可能な
ベクターとの組合せが組成物の必須成分として使用され
ることを特徴とする、軟骨修復の必要がある患者の治療
を目的とする薬学的組成物の製造法について開示する。
骨形成タンパク質およびドーサライジング因子は、遺伝
子治療により細胞内に導入されうる。この方法のために
は、骨形成タンパク質およびドーサライジング因子をコ
ードする遺伝子を、好ましくは同一プロモーターの調節
下、一つのベクターに導入することもできるし、または
別々のベクターに導入することもできる。従って、本発
明は、骨誘導タンパク質およびドーサライジング因子を
発現可能な発現ベクター、または骨誘導タンパク質を発
現可能なベクターとドーサライジング因子を発現可能な
ベクターとの組合せが組成物の必須成分として使用され
ることを特徴とする、軟骨修復の必要がある患者の治療
を目的とする薬学的組成物の製造法について開示する。
【００１９】骨形成因子およびドーサライジング因子の
効率的な発現のためには、ベクター内に強力なプロモー
ターを使用する必要がある。そのようなプロモーター
は、例えばPGKプロモーターまたはCMVプロモーターであ
る。好ましくは、発現ベクターは、そのような強力なプ
ロモーター、選択された遺伝子、例えばBMP-2、BMP-4、
BMP-5、BMP-7、Shh、Ihh、またはDhh、ノギン、コージ
ン、またはフォリスタチンの全長mRNA、人工的なイント
ロン、およびポリA部位を含む。適用のためには、DNA
を、コラーゲン・スポンジ内に凍結乾燥させるか、また
は他の適当な担体、好ましくはヒアルロン酸もしくはア
ルギン酸塩と共に適用する。
効率的な発現のためには、ベクター内に強力なプロモー
ターを使用する必要がある。そのようなプロモーター
は、例えばPGKプロモーターまたはCMVプロモーターであ
る。好ましくは、発現ベクターは、そのような強力なプ
ロモーター、選択された遺伝子、例えばBMP-2、BMP-4、
BMP-5、BMP-7、Shh、Ihh、またはDhh、ノギン、コージ
ン、またはフォリスタチンの全長mRNA、人工的なイント
ロン、およびポリA部位を含む。適用のためには、DNA
を、コラーゲン・スポンジ内に凍結乾燥させるか、また
は他の適当な担体、好ましくはヒアルロン酸もしくはア
ルギン酸塩と共に適用する。
【００２０】本発明に係る薬学的製剤は、例えば、組成
物の輸送および／または支持のため、および／または軟
骨形成のための表面を提供するため、適当なマトリック
スを含んでいてもよい。マトリックスは、骨誘導タンパ
ク質およびBMPアンタゴニストを徐放するものであって
もよい。好ましくは、組成物は、生体適合性および／ま
たは生分解性のマトリックスを含む。組成物のための可
能性のあるマトリックスには、例えば、ヒアルロン酸、
アルギン酸塩、硫酸カルシウム、リン酸三カルシウム、
ハイドロキシアパタイト、ポリ乳酸、ポリ無水物、また
はコラーゲンが含まれる。
物の輸送および／または支持のため、および／または軟
骨形成のための表面を提供するため、適当なマトリック
スを含んでいてもよい。マトリックスは、骨誘導タンパ
ク質およびBMPアンタゴニストを徐放するものであって
もよい。好ましくは、組成物は、生体適合性および／ま
たは生分解性のマトリックスを含む。組成物のための可
能性のあるマトリックスには、例えば、ヒアルロン酸、
アルギン酸塩、硫酸カルシウム、リン酸三カルシウム、
ハイドロキシアパタイト、ポリ乳酸、ポリ無水物、また
はコラーゲンが含まれる。
【００２１】用量計画は、本発明の製剤の作用を修飾す
る様々な要因を考慮して、担当の医師が決定する。製剤
の作用を修飾する可能性のある因子には、形成させたい
軟骨の量、適用部位、損傷の状態、患者の年齢、性別、
および食事、感染の重度、投与時間、ならびにその他の
臨床的な要因が含まれる。用量は、軟骨の再構築に使用
されるマトリックスの型によっても変化しうる。
る様々な要因を考慮して、担当の医師が決定する。製剤
の作用を修飾する可能性のある因子には、形成させたい
軟骨の量、適用部位、損傷の状態、患者の年齢、性別、
および食事、感染の重度、投与時間、ならびにその他の
臨床的な要因が含まれる。用量は、軟骨の再構築に使用
されるマトリックスの型によっても変化しうる。
【００２２】本発明のさらなる目的は、BMPおよびBMPア
ンタゴニストを組合せることにより、10：1から1：10ま
での比率のBMPおよびBMPアンタゴニストを含む薬学的組
成物を製造するための方法、および、インビボにおける
軟骨形成のため、特に、軟骨欠陥を患い、そのため軟骨
修復の必要がある患者の治療のための、該薬学的組成物
の使用である。
ンタゴニストを組合せることにより、10：1から1：10ま
での比率のBMPおよびBMPアンタゴニストを含む薬学的組
成物を製造するための方法、および、インビボにおける
軟骨形成のため、特に、軟骨欠陥を患い、そのため軟骨
修復の必要がある患者の治療のための、該薬学的組成物
の使用である。
【００２３】本発明に係る薬学的組成物においては、
（１）10：1から1：10までの比率の骨誘導タンパク質お
よびドーサライジング因子を含む薬学的組成物であるこ
とを特徴とする。
（１）10：1から1：10までの比率の骨誘導タンパク質お
よびドーサライジング因子を含む薬学的組成物であるこ
とを特徴とする。
【００２４】また、本発明に係る薬学的組成物において
は、（２）骨誘導タンパク質がBMP-2、BMP-4、BMP-5、B
MP-7、またはヘッジホッグ・タンパク質である、上記
(1)記載の薬学的組成物であることを特徴とする。
は、（２）骨誘導タンパク質がBMP-2、BMP-4、BMP-5、B
MP-7、またはヘッジホッグ・タンパク質である、上記
(1)記載の薬学的組成物であることを特徴とする。
【００２５】また、本発明に係る薬学的組成物において
は、（３）ドーサライジング因子がノギン（noggin）、
コージン（chordin）、またはフォリスタチン（follist
atin）である、上記(1)または(2)記載の薬学的組成物で
あることを特徴とする。
は、（３）ドーサライジング因子がノギン（noggin）、
コージン（chordin）、またはフォリスタチン（follist
atin）である、上記(1)または(2)記載の薬学的組成物で
あることを特徴とする。
【００２６】また、本発明に係る薬学的組成物において
は、（４）生体適合性マトリックスを含む、上記(1)か
ら(3)記載の薬学的組成物であることを特徴とする。
は、（４）生体適合性マトリックスを含む、上記(1)か
ら(3)記載の薬学的組成物であることを特徴とする。
【００２７】また、本発明に係る薬学的組成物において
は、（５）生体適合性マトリックスがヒアルロン酸、ア
ルギン酸塩、またはコラーゲンである、上記(1)から(4)
記載の薬学的組成物であることを特徴とする。
は、（５）生体適合性マトリックスがヒアルロン酸、ア
ルギン酸塩、またはコラーゲンである、上記(1)から(4)
記載の薬学的組成物であることを特徴とする。
【００２８】また、本発明に係る製造法においては、
（６）骨誘導タンパク質およびドーサライジング因子を
組合せることにより、10：1から1：10までの比率の骨誘
導タンパク質およびドーサライジング因子を含む薬学的
組成物を製造するための方法であることを特徴とする。
（６）骨誘導タンパク質およびドーサライジング因子を
組合せることにより、10：1から1：10までの比率の骨誘
導タンパク質およびドーサライジング因子を含む薬学的
組成物を製造するための方法であることを特徴とする。
【００２９】また、本発明に係る製造法においては、
（７）骨誘導タンパク質がBMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-
7、またはヘッジホッグ・タンパク質である、上記(6)記
載の方法であることを特徴とする。
（７）骨誘導タンパク質がBMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-
7、またはヘッジホッグ・タンパク質である、上記(6)記
載の方法であることを特徴とする。
【００３０】また、本発明に係る製造法においては、
（８）ドーサライジング因子がノギン（noggin）、コー
ジン（chordin）、またはフォリスタチン（follistati
n）である、上記(6)または(7)記載の方法であることを
特徴とする。
（８）ドーサライジング因子がノギン（noggin）、コー
ジン（chordin）、またはフォリスタチン（follistati
n）である、上記(6)または(7)記載の方法であることを
特徴とする。
【００３１】また、本発明に係る製造法においては、
（９）骨誘導タンパク質およびドーサライジング因子が
生体適合性マトリックスと組み合わされている、上記
(6)から(8)記載の方法であることを特徴とする。
（９）骨誘導タンパク質およびドーサライジング因子が
生体適合性マトリックスと組み合わされている、上記
(6)から(8)記載の方法であることを特徴とする。
【００３２】また、本発明に係る製造法においては、
（１０）生体適合性マトリックスがヒアルロン酸、アル
ギン酸塩、またはコラーゲンである、上記(9)記載の方
法であることを特徴とする。
（１０）生体適合性マトリックスがヒアルロン酸、アル
ギン酸塩、またはコラーゲンである、上記(9)記載の方
法であることを特徴とする。
【００３３】また、本発明に係る使用においては、（１
１）軟骨修復の必要がある患者の治療のための、骨誘導
タンパク質およびドーサライジング因子の組合せの使用
であることを特徴とする。
１）軟骨修復の必要がある患者の治療のための、骨誘導
タンパク質およびドーサライジング因子の組合せの使用
であることを特徴とする。
【００３４】また、本発明に係る薬学的組成物において
は、（１２）骨誘導タンパク質およびドーサライジング
因子の発現ベクター、または骨誘導タンパク質の発現ベ
クターとドーサライジング因子を発現可能なベクターと
の組合せを含む薬学的組成物であることを特徴とする。
は、（１２）骨誘導タンパク質およびドーサライジング
因子の発現ベクター、または骨誘導タンパク質の発現ベ
クターとドーサライジング因子を発現可能なベクターと
の組合せを含む薬学的組成物であることを特徴とする。
【００３５】また、本発明に係る製造法においては、
（１３）軟骨修復の必要がある患者の治療のための薬学
的組成物を製造する方法であって、骨誘導タンパク質お
よびドーサライジング因子を発現可能なベクター、また
は骨誘導タンパク質を発現可能なベクターとドーサライ
ジング因子を発現可能なベクターとの組合せが該組成物
の必須成分として使用される方法であることを特徴とす
る。
（１３）軟骨修復の必要がある患者の治療のための薬学
的組成物を製造する方法であって、骨誘導タンパク質お
よびドーサライジング因子を発現可能なベクター、また
は骨誘導タンパク質を発現可能なベクターとドーサライ
ジング因子を発現可能なベクターとの組合せが該組成物
の必須成分として使用される方法であることを特徴とす
る。
【００３６】
【発明の実施の形態】以下の実施例および文中の参考文
献は、本発明の理解を助けるためのものであり、本発明
の真の範囲は特許請求の範囲に記載されている。本発明
の精神を逸脱することなく、記載された方法を修飾でき
ることを理解されたい。
献は、本発明の理解を助けるためのものであり、本発明
の真の範囲は特許請求の範囲に記載されている。本発明
の精神を逸脱することなく、記載された方法を修飾でき
ることを理解されたい。
【００３７】
【実施例】実施例１． マイクロマス・マウス四肢アッセイ（Micromass mouse
limb assay） 顕微解剖用鋏および時計製造用鉗子を用いて、無菌条件
下で、E11マウス胚（NMRI）から肢芽を単離する。カル
シウムおよびマグネシウムを含まない生理食塩水で洗浄
し、インキュベートすることにより細胞懸濁液を得た
後、1％トリプシン溶液中で37℃で20分間インキュベー
トし、1mlピペットで繰り返し吸引することにより凝集
物を分離させる。細胞をハム培地中1ml当たり2×107個
に調整し、10μlの画分5つを無菌ペトリ皿に置く。2時
間の培養後、2mlのハム培地を単独で、または試験化合
物と共に添加する。該試験化合物は、10ng/ml未満から
約100μg/mlまでの様々な用量の（a）BMPアンタゴニス
ト、ノギン、コージン、またはフォリスタチン単体、
（b）BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-7、またはShh、および
（c）BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-7、またはShhとアンタ
ゴニストとの組合せからなる。5日間の培養期間中、培
地は交換しない。その後、培養物を固定化し、アルシア
ンブルーまたはクリスタルバイオレットで染色し、水道
水で洗浄し、乾燥させる（SteeleおよびCopping,Postim
plantation Mammalian Embryos,A PracticalApproach,I
RL Press 1990,229-232）。軟骨形成のためのアルシア
ンブルー染色、繊維芽細胞様細胞のためのクリスタルバ
イオレット染色の後、分化を調べる。さらに、軟骨マー
カー（例えば、コラーゲンII、MIA、コラーゲンX）およ
び骨マーカー（例えば、オステオカルシン、アルカリホ
スファターゼ、オステオポンチン）の発現に関して、定
量的RT-PCR分析を行う。
limb assay） 顕微解剖用鋏および時計製造用鉗子を用いて、無菌条件
下で、E11マウス胚（NMRI）から肢芽を単離する。カル
シウムおよびマグネシウムを含まない生理食塩水で洗浄
し、インキュベートすることにより細胞懸濁液を得た
後、1％トリプシン溶液中で37℃で20分間インキュベー
トし、1mlピペットで繰り返し吸引することにより凝集
物を分離させる。細胞をハム培地中1ml当たり2×107個
に調整し、10μlの画分5つを無菌ペトリ皿に置く。2時
間の培養後、2mlのハム培地を単独で、または試験化合
物と共に添加する。該試験化合物は、10ng/ml未満から
約100μg/mlまでの様々な用量の（a）BMPアンタゴニス
ト、ノギン、コージン、またはフォリスタチン単体、
（b）BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-7、またはShh、および
（c）BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-7、またはShhとアンタ
ゴニストとの組合せからなる。5日間の培養期間中、培
地は交換しない。その後、培養物を固定化し、アルシア
ンブルーまたはクリスタルバイオレットで染色し、水道
水で洗浄し、乾燥させる（SteeleおよびCopping,Postim
plantation Mammalian Embryos,A PracticalApproach,I
RL Press 1990,229-232）。軟骨形成のためのアルシア
ンブルー染色、繊維芽細胞様細胞のためのクリスタルバ
イオレット染色の後、分化を調べる。さらに、軟骨マー
カー（例えば、コラーゲンII、MIA、コラーゲンX）およ
び骨マーカー（例えば、オステオカルシン、アルカリホ
スファターゼ、オステオポンチン）の発現に関して、定
量的RT-PCR分析を行う。
【００３８】実施例２． 軟骨細胞培養 2ヶ月齢のマウス（NMRI）から単離された関節軟骨細胞
のため、膝関節から外科的に頸骨プラトー（tibial pla
teau）を除去し、関節組織から、滑膜腔（synovial cav
ity）に面する線維軟骨層を含む接着組織夾雑物を注意
深く除去する。組織を外科用ナイフで細かく刻み、0.25
％トリプシンおよび0.1％粗コラゲナーゼ混合物を含む
ハンク緩衝生理食塩水中で16時間インキュベートする。
細胞を、単層またはアガロース培養物（3次元マトリッ
クス）として、血清を含まない高グルコース・ダルベッ
コ改変イーグル培地（DMEM）中で9日間培養する（d'Ang
eloおよびPacifici,J.Bone and Min.Res.12(1997)1368-
1377）。細胞を、10ng/ml未満から約100μg/mlまでの様
々な用量の（a）BMPアンタゴニスト単体、（b）誘導ま
たは修飾因子単体、および（c）誘導または修飾因子と
アンタゴニストとの組合せ、で処理する。9日間の処理
後、初期の増殖軟骨マーカー（例えば、コラーゲンII、
MIA）、後期の成熟軟骨マーカー（例えば、コラーゲン
X）、および線維組織マーカー（例えば、コラーゲンI）
の発現に関して、定量的RT-PCR分析を行う。
のため、膝関節から外科的に頸骨プラトー（tibial pla
teau）を除去し、関節組織から、滑膜腔（synovial cav
ity）に面する線維軟骨層を含む接着組織夾雑物を注意
深く除去する。組織を外科用ナイフで細かく刻み、0.25
％トリプシンおよび0.1％粗コラゲナーゼ混合物を含む
ハンク緩衝生理食塩水中で16時間インキュベートする。
細胞を、単層またはアガロース培養物（3次元マトリッ
クス）として、血清を含まない高グルコース・ダルベッ
コ改変イーグル培地（DMEM）中で9日間培養する（d'Ang
eloおよびPacifici,J.Bone and Min.Res.12(1997)1368-
1377）。細胞を、10ng/ml未満から約100μg/mlまでの様
々な用量の（a）BMPアンタゴニスト単体、（b）誘導ま
たは修飾因子単体、および（c）誘導または修飾因子と
アンタゴニストとの組合せ、で処理する。9日間の処理
後、初期の増殖軟骨マーカー（例えば、コラーゲンII、
MIA）、後期の成熟軟骨マーカー（例えば、コラーゲン
X）、および線維組織マーカー（例えば、コラーゲンI）
の発現に関して、定量的RT-PCR分析を行う。
【００３９】実施例３． 軟骨、骨、腱、および靱帯の誘導に関するマウス・バイ
オアッセイ サンパス（Sampath）およびレディ（Reddi）のラット異
所性移植アッセイ法と同様の、マウス異所性移植アッセ
イを、2ヶ月齢の異系交配（outbred）NMRIマウスまたは
同系交配C3Hマウスを用いて行う（SampathおよびReddi,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80(1983)6591-6595；国際公開
公報第95/16035号）。（a）BMPアンタゴニスト単体、
（b）誘導または修飾因子単体、および（c）誘導または
修飾因子とアンタゴニストとの組合せを、適当な緩衝
液、例えばBMPタンパク質の場合には0.1％トリフルオロ
酢酸で凍結乾燥させる。因子の組合せの場合には、緩衝
液は安定性に基づき選択される。生体適合性、生分解
性、安定性、および機械的性質に基づき、例えば、I型
コラーゲン・マトリックス、コラーゲン−ヘパリン混合
物、ゼラチン・カプセル、ヒアルロン酸、またはその他
の機能的に等価な装置など、任意の適当な担体を使用す
ることができる。
オアッセイ サンパス（Sampath）およびレディ（Reddi）のラット異
所性移植アッセイ法と同様の、マウス異所性移植アッセ
イを、2ヶ月齢の異系交配（outbred）NMRIマウスまたは
同系交配C3Hマウスを用いて行う（SampathおよびReddi,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80(1983)6591-6595；国際公開
公報第95/16035号）。（a）BMPアンタゴニスト単体、
（b）誘導または修飾因子単体、および（c）誘導または
修飾因子とアンタゴニストとの組合せを、適当な緩衝
液、例えばBMPタンパク質の場合には0.1％トリフルオロ
酢酸で凍結乾燥させる。因子の組合せの場合には、緩衝
液は安定性に基づき選択される。生体適合性、生分解
性、安定性、および機械的性質に基づき、例えば、I型
コラーゲン・マトリックス、コラーゲン−ヘパリン混合
物、ゼラチン・カプセル、ヒアルロン酸、またはその他
の機能的に等価な装置など、任意の適当な担体を使用す
ることができる。
【００４０】移植物を7および14日間、マウスの後肢の
筋肉に筋肉内設置する。7および14日後、頸脱臼により
マウスを死亡させる。移植物を単離し、標準的な組織学
的手法を用いて処理する（Theory and Practice of His
tological Techniques,ed.BancroftおよびStevens,Chur
chill Livingstone,1996、参照）。各移植物において誘
導された腱、靱帯、軟骨、および骨組織の量を可視化
し、定量するため、パラフィン切片（8μm）またはグリ
コールメタクリレート切片（1μm）を、トルイジンブル
ー、アルシアンブルー、フォン・コッサ、モバット（Mo
vat）、またはヘマトキシリン／エオシンで染色する。
陽性移植物対照群（例えば、BMP-2、GDF-5）および陰性
移植物対照群（例えば、偽装置）を、実験移植物と比較
する。
筋肉に筋肉内設置する。7および14日後、頸脱臼により
マウスを死亡させる。移植物を単離し、標準的な組織学
的手法を用いて処理する（Theory and Practice of His
tological Techniques,ed.BancroftおよびStevens,Chur
chill Livingstone,1996、参照）。各移植物において誘
導された腱、靱帯、軟骨、および骨組織の量を可視化
し、定量するため、パラフィン切片（8μm）またはグリ
コールメタクリレート切片（1μm）を、トルイジンブル
ー、アルシアンブルー、フォン・コッサ、モバット（Mo
vat）、またはヘマトキシリン／エオシンで染色する。
陽性移植物対照群（例えば、BMP-2、GDF-5）および陰性
移植物対照群（例えば、偽装置）を、実験移植物と比較
する。
【００４１】誘導された軟骨および／または骨の性質を
調べるためには、前記のような軟骨および骨のマーカー
についてのRNAインサイチュー・ハイブリダイゼーショ
ンおよび定量的RT-PCRにより遺伝子発現を研究すること
ができる。
調べるためには、前記のような軟骨および骨のマーカー
についてのRNAインサイチュー・ハイブリダイゼーショ
ンおよび定量的RT-PCRにより遺伝子発現を研究すること
ができる。
【００４２】実施例４． 全厚関節軟骨修復モデル 成体ウサギの大腿膝蓋関節における全厚関節軟骨欠損モ
デルを用いて、BMPアンタゴニストと、誘導または修飾
因子と、担体との組合せが、軟骨および骨の修復に影響
を与える能力を調べる。成体ウサギに麻酔をかけ、無菌
的手術用に調製する。関節軟骨からその下の肋軟骨下骨
まで、最大4×4mmの欠損を、膝関節の膝蓋溝へと作製す
る。欠損は、空洞のままに放置するか、適当な担体を充
填するか、またはBMPアンタゴニストと誘導もしくは修
飾因子とを含む担体、または各因子単体を含む担体を充
填する。動物を4週間自由に行動させる。4週間後、動物
を無痛安楽死させ、関節軟骨／肋軟骨下骨の欠損部位
を、組織の構築、修復の質、および量について、組織学
的に評価する。
デルを用いて、BMPアンタゴニストと、誘導または修飾
因子と、担体との組合せが、軟骨および骨の修復に影響
を与える能力を調べる。成体ウサギに麻酔をかけ、無菌
的手術用に調製する。関節軟骨からその下の肋軟骨下骨
まで、最大4×4mmの欠損を、膝関節の膝蓋溝へと作製す
る。欠損は、空洞のままに放置するか、適当な担体を充
填するか、またはBMPアンタゴニストと誘導もしくは修
飾因子とを含む担体、または各因子単体を含む担体を充
填する。動物を4週間自由に行動させる。4週間後、動物
を無痛安楽死させ、関節軟骨／肋軟骨下骨の欠損部位
を、組織の構築、修復の質、および量について、組織学
的に評価する。
【００４３】実施例５． 部分厚関節軟骨修復モデル 成体ウサギの大腿膝蓋関節における部分厚関節軟骨欠損
モデルを用いて、BMPアンタゴニストと、誘導または修
飾因子と、担体との組合せが、軟骨および骨の修復に影
響を与える能力を調べる。成体ウサギに麻酔をかけ、無
菌的手術用に調製する。関節軟骨を通り膝関節の膝蓋溝
へと、最大4×4mmの孔を作製し、その下の肋軟骨下骨に
は損傷を与えないでおく。欠損は、空洞のままに放置す
るか、適当な担体を充填するか、またはBMPアンタゴニ
ストと誘導もしくは修飾因子とを含む担体、または各因
子単体を含む担体を充填する。動物を4週間自由に行動
させる。4週間後、動物を無痛安楽死させ、関節軟骨の
欠損部位を、組織の構築、修復の質、および量につい
て、組織学的に評価する。
モデルを用いて、BMPアンタゴニストと、誘導または修
飾因子と、担体との組合せが、軟骨および骨の修復に影
響を与える能力を調べる。成体ウサギに麻酔をかけ、無
菌的手術用に調製する。関節軟骨を通り膝関節の膝蓋溝
へと、最大4×4mmの孔を作製し、その下の肋軟骨下骨に
は損傷を与えないでおく。欠損は、空洞のままに放置す
るか、適当な担体を充填するか、またはBMPアンタゴニ
ストと誘導もしくは修飾因子とを含む担体、または各因
子単体を含む担体を充填する。動物を4週間自由に行動
させる。4週間後、動物を無痛安楽死させ、関節軟骨の
欠損部位を、組織の構築、修復の質、および量につい
て、組織学的に評価する。
【００４４】実施例６． DNAを用いた軟骨、骨、腱、および靱帯の誘導に関する
マウス・バイオアッセイ サンパス（Sampath）およびレディ（Reddi）のラット異
所性移植アッセイと同様の、マウス異所性移植アッセイ
を、2ヶ月齢の異系交配（outbred）NMRIマウスまたは同
系交配C3Hマウスを用いて行う（SampathおよびReddi,Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA 80(1983)6591-6595；国際公開公
報第95/16035号）。（a）ドーサライジング因子単体、
（b）骨誘導タンパク質単体、および（c）両方の組合
せ、のための発現ベクターを、適当な緩衝液、例えばTE
緩衝液で凍結乾燥させる（Fangら、Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 93(1996)5753-5758）。生体適合性、生分解性、
安定性、および機械的性質に基づき、例えば、I型コラ
ーゲン・マトリックス、コラーゲン−ヘパリン混合物、
ゼラチン・カプセル、ヒアルロン酸、またはその他の機
能的に等価な装置など、任意の適当な担体を使用するこ
とができる。
マウス・バイオアッセイ サンパス（Sampath）およびレディ（Reddi）のラット異
所性移植アッセイと同様の、マウス異所性移植アッセイ
を、2ヶ月齢の異系交配（outbred）NMRIマウスまたは同
系交配C3Hマウスを用いて行う（SampathおよびReddi,Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA 80(1983)6591-6595；国際公開公
報第95/16035号）。（a）ドーサライジング因子単体、
（b）骨誘導タンパク質単体、および（c）両方の組合
せ、のための発現ベクターを、適当な緩衝液、例えばTE
緩衝液で凍結乾燥させる（Fangら、Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 93(1996)5753-5758）。生体適合性、生分解性、
安定性、および機械的性質に基づき、例えば、I型コラ
ーゲン・マトリックス、コラーゲン−ヘパリン混合物、
ゼラチン・カプセル、ヒアルロン酸、またはその他の機
能的に等価な装置など、任意の適当な担体を使用するこ
とができる。
【００４５】移植物を7および14日間、マウスの後肢の
筋肉に筋肉内設置する。7および14日後、頸脱臼により
マウスを死亡させる。移植物を単離し、標準的な組織学
的手法を用いて処理する（Theory and Practice of His
tological Techniques,ed.BancroftおよびSteven,Churc
hill Livingstone,1996、参照）。各移植物において誘
導された腱、靱帯、軟骨、または骨組織の量を可視化
し、定量するため、パラフィン切片（8μm）またはグリ
コールメタクリレート切片（1μm）を、トルイジンブル
ー、アルシアンブルー、フォン・コッサ、モバット（Mo
vat）、またはヘマトキシリン／エオシンで染色する。
陽性移植物対照群（例えば、BMP-2、GDF-5）および陰性
移植物対照群（例えば、偽装置）を、実験移植物と比較
する。誘導された軟骨および／または骨の性質を調べる
ためには、前記のような軟骨および骨のマーカーについ
てのRNAインサイチュー・ハイブリダイゼーションおよ
び定量的RT-PCRにより遺伝子発現を研究することができ
る。
筋肉に筋肉内設置する。7および14日後、頸脱臼により
マウスを死亡させる。移植物を単離し、標準的な組織学
的手法を用いて処理する（Theory and Practice of His
tological Techniques,ed.BancroftおよびSteven,Churc
hill Livingstone,1996、参照）。各移植物において誘
導された腱、靱帯、軟骨、または骨組織の量を可視化
し、定量するため、パラフィン切片（8μm）またはグリ
コールメタクリレート切片（1μm）を、トルイジンブル
ー、アルシアンブルー、フォン・コッサ、モバット（Mo
vat）、またはヘマトキシリン／エオシンで染色する。
陽性移植物対照群（例えば、BMP-2、GDF-5）および陰性
移植物対照群（例えば、偽装置）を、実験移植物と比較
する。誘導された軟骨および／または骨の性質を調べる
ためには、前記のような軟骨および骨のマーカーについ
てのRNAインサイチュー・ハイブリダイゼーションおよ
び定量的RT-PCRにより遺伝子発現を研究することができ
る。
【００４６】
【発明の効果】本発明により、軟骨形成のために有用
な、10：1から1：10までの比率で骨誘導タンパク質とド
ーサライジング因子とを含む組成物が提供された。
な、10：1から1：10までの比率で骨誘導タンパク質とド
ーサライジング因子とを含む組成物が提供された。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 598170752 116 Ｓａｎｄｈｏｆｅｒ Ｓｔｒａｓｓ ｅ， Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎ ｙ (72)発明者 ドニー カローラ ドイツ ミュンヘン エンゲルストラッセ ７ (72)発明者 プレッツェル ガブリエル ドイツ ペンツベルク ノイエ ハイマー ト 24
Claims (13)
- 【請求項１】 10：1から1：10までの比率の骨誘導タン
パク質およびドーサライジング因子を含む薬学的組成
物。 - 【請求項２】 骨誘導タンパク質がBMP-2、BMP-4、BMP-
5、BMP-7、またはヘッジホッグ・タンパク質である、請
求項１記載の薬学的組成物。 - 【請求項３】 ドーサライジング因子がノギン（noggi
n）、コージン（chordin）、またはフォリスタチン（fo
llistatin）である、請求項１または２記載の薬学的組
成物。 - 【請求項４】 生体適合性マトリックスを含む、請求項
１から３記載の薬学的組成物。 - 【請求項５】 生体適合性マトリックスがヒアルロン
酸、アルギン酸塩、またはコラーゲンである、請求項１
から４記載の薬学的組成物。 - 【請求項６】 骨誘導タンパク質およびドーサライジン
グ因子を組合せることにより、10：1から1：10までの比
率の骨誘導タンパク質およびドーサライジング因子を含
む薬学的組成物を製造するための方法。 - 【請求項７】 骨誘導タンパク質がBMP-2、BMP-4、BMP-
5、BMP-7、またはヘッジホッグ・タンパク質である、請
求項６記載の方法。 - 【請求項８】 ドーサライジング因子がノギン（noggi
n）、コージン（chordin）、またはフォリスタチン（fo
llistatin）である、請求項６または７記載の方法。 - 【請求項９】 骨誘導タンパク質およびドーサライジン
グ因子が生体適合性マトリックスと組み合わされてい
る、請求項６から８記載の方法。 - 【請求項１０】 生体適合性マトリックスがヒアルロン
酸、アルギン酸塩、またはコラーゲンである、請求項９
記載の方法。 - 【請求項１１】 軟骨修復の必要がある患者の治療のた
めの、骨誘導タンパク質およびドーサライジング因子の
組合せの使用。 - 【請求項１２】 骨誘導タンパク質およびドーサライジ
ング因子の発現ベクター、または骨誘導タンパク質の発
現ベクターとドーサライジング因子を発現可能なベクタ
ーとの組合せを含む薬学的組成物。 - 【請求項１３】 軟骨修復の必要がある患者の治療のた
めの薬学的組成物を製造する方法であって、骨誘導タン
パク質およびドーサライジング因子を発現可能なベクタ
ー、または骨誘導タンパク質を発現可能なベクターとド
ーサライジング因子を発現可能なベクターとの組合せが
該組成物の必須成分として使用される方法。
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-
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-
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