BR112015021269B1

BR112015021269B1 - Polipeptídeo isolado, seu uso e composição farmacêutica

Info

Publication number: BR112015021269B1
Application number: BR112015021269-7A
Authority: BR
Inventors: Kristen Johnson; Jian Shi
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 2013-03-08
Filing date: 2014-03-07
Publication date: 2023-04-11
Also published as: KR102267341B1; JP2021178841A; US20170252407A1; PE20151528A1; ECSP15042898A; SG11201506490TA; US20200268849A1; AU2014225348A1; EA035158B1; EA201591661A1; PH12015501983A1; TWI634124B; WO2014138687A1; BR122016021558A2; AU2016203028A1; CA2903448A1; JP6918871B2; CA2903448C; SI2964250T1; HK1214754A1

Abstract

PEPTÍDEOS E COMPOSIÇÕES PARA TRATAMENTO DE DANO ARTICULAR. A presente invenção se refere a novos polipeptídeos resistentes à protease, bem como composições e métodos para tratamento, melhora ou prevenção de condições relacionadas a dano articular, incluindo dano agudo de articulação e artrite. A invenção se refere ainda ao usos e composições farmacêuticas compreendendo os referidos polipeptídeos.

Description

PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica prioridade e o benefício do Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos No. 61/775.400, depositado em 8 de março de 2013, e Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos No. 61/938.123, depositado em 10 de fevereiro de 2014, cada um do qual é, desse modo, incorporado por referência em sua totalidade.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] A osteoartrite (OA) representa o distúrbio do musculoesque- letal mais comum. Aproximadamente 40 milhões de americanos são atualmente afetados; um número previsto para aumentar para 60 milhões dentro dos próximos vinte anos como um resultado de envelhecimento da população e um aumento na expectativa de vida, tornando-a a quarta causa condutora de deficiência. A OA é caracterizada por uma baixa quebra degenerativa de uma articulação, incluindo ambas cartilagem articular (contendo as células e matriz que produzem lubrificação e amortecimento para a articulação) e osso subcondral subjacente à cartilagem articular. A OA pode ser considerada uma consequência de vários fatores etiológicos. Por exemplo, ela pode ser causada por estresse biomecânico anormal ou anormalidades genéticas ou adquiridas de cartilagem articular ou osso. As terapias de OA atuais incluem alívio de dor com NSAIDs orais ou inibidores seletivos de ciclo-oxigenase 2 (COX-2), injeção intra-articular (IA) com agentes, tais como corticosteroides e hi- aluronano, e abordagens cirúrgicas.

[003] Dano articular, por exemplo, dano agudo da articulação, tal como um desgaste de menisco ou de ligamento, ou uma fratura intraarticular, podem também conduzir a artrite, por exemplo, artrite pós-trau- mática. Devido a cartilagem articular ter uma capacidade limitada de se reparar, mesmo dano não detectável pequeno pode, frequentemente, piorar com o tempo, e conduzir a OA. Os tratamentos atuais para dano da articulação podem incluir cirurgia e outros procedimentos invasivos focalizados na regeneração de articulações danificadas, bem como tratamento com agentes para reduzir dor e inflamação.

[004] As células troncos mesenquimais (MSCs) estão presents em cartilagem articular de adulto e, sob isolamento, podem ser programadas in vitro para suportar diferenciação a condrócitos, e outras linhagens de célula mesenquimal, e podem ser usadas para regeneração de cartilagem. Em parte, o processo é regulado por fatores de crescimento (TGFβs, BMPs), condições de soro, e contato célula-célula. O documento WO2011/008773 descreve composições de peptídeo e uso destas composições para tratamento ou prevenção e dano de articulação, e para indução de diferenciação de células mesenquimais em condróci- tos. Adicionalmente, o documento WO2012/129562 descreve compostos de molécula pequena, composições e uso destas composições para melhora de artrite e dano de articulação, e para indução de diferenciação de células mesenquimais em condrócitos.

[005] Embora as técnicas cirúrgicas e tecnologia regenerativa te nham feito algum progresso na restauração de cartilagem, diminuição da degeneração, e reparo aperfeiçoado de dano articular, existe uma necessidade continuada de aperfeiçoamento de composições e métodos para regeneração efetiva de cartilagem, tratamento de dano articular, e melhora ou prevenção de OA.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[006] A presente invenção se relaciona a identificação de novos polipeptídeo e variantes de proteína semelhante a angiopoietina 3 (AN- GPTL3) que têm propriedades farmacêuticas aperfeiçoadas, por exemplo, são mais estáveis, menos susceptíveis a proteólise e degradação enzimática do que ANGPTL3 tipo selvagem. Também proporcionados são composições farmacêuticas e métodos para tratamento de dano articular ou dano de articulação, e métodos de melhora ou prevenção de artrite, dano articular, ou dano de articulação em um mamífero.

[007] Desse modo, são proporcionados polipeptídeos resistentes à protease compreendendo uma sequência de aminoácido que tem pelo menos 95% de identidade de sequência de aminoácido, ou pelo menos 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência de aminoá- cido para uma sequência de aminoácido selecionada de qualquer uma ou mais das sequências da TABELA 1, e conforme adicionalmente aqui descrito. Os polipeptídeos modificados da TABELA 1 incluem um ami- noácido que é um aminoácido polar outro do que K ou R na posição 423, conforme determinado com referência à sequência de polipeptídeo de ANGPTL3 de comprimento total, SEQ ID NO:1. Em algumas concretizações, o aminoácido na posição 423, conforme determinada com referência à SEQ ID NO:1, é Q ou S. Em certas concretizações, o amino- ácido na posição 423, conforme determinada com referência à SEQ ID NO:1, é Q. Em certas concretizações, o aminoácido na posição 423, conforme determinada com referência à SEQ ID NO:1, é S. Em certas concretizações, o aminoácido na posição 423, conforme determinada com referência à SEQ ID NO:1, é anulado. Em adição, os polipeptídeos proporcionados têm atividade condrogênica.

[008] Em algumas concretizações, o polipeptídeo compreende uma sequência tendo pelo menos 95% de identidade, ou pelo menos 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% para qualquer uma de SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, e SEQ ID NO:70. Em algumas concretizações, o polipeptídeo compreende uma sequência tendo pelo menos 95% de identidade, ou pelo menos 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% para qualquer uma de SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, e SEQ ID NO:64. Em algumas concretizações, o polipeptídeo compreende qualquer uma das sequências da TABELA 1. Em algumas concretizações, o polipeptídeo compreende qualquer uma de SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, e SEQ ID NO:70. Em algumas concretizações, o polipeptídeo compreende qualquer uma de SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, e SEQ ID NO:64. Em algumas concretizações, o polipeptídeo é qualquer um das sequências da TABELA 1. Em algumas concretizações, o polipeptídeo é qual-quer uma de SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, e SEQ ID NO:70. Em algumas concretizações, o polipeptídeo é qualquer uma de SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, e SEQ ID NO:64.

[009] Os polipeptídeos da invenção podem incorporar uma ou mais modificações químicas (por exemplo, PEGilação). Em algumas concretizações, os polipeptídeos da invenção podem compreender um peptídeo heterólogo como uma proteína de fusão, que pode, opcionalmente, ser fundido na extremidade amino-terminal ou na extremidade carbóxi-terminal do polipeptídeo. Também proporcionados são polinu- cleotídeos que codificam os polipeptídeos da invenção; vetores contendo polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos; e células hospedeiras compreendendo tais vetores.

[0010] A presente invenção também proporciona composições far macêuticas compreendendo os polipeptídeos da invenção, e um transportador farmaceuticamente aceitável. Tais composições podem ser usadas em métodos aqui proporcionados para tratar, melhorar ou prevenir artrite ou dano articular em um paciente, onde o método compreende administrar a uma articulação de um paciente uma quantidade te- rapeuticamente efetiva de uma composição farmacêutica da invenção. Exemplos de condições que podem se beneficiar de tais métodos incluem, mas não limitados a, artrite (por exemplo, osteoartrite, artrite traumática), e dano articular (por exemplo, dano agudo da articulação).

[0011] A presente invenção proporciona adicionalmente métodos de tratamento de um indivíduo compreendendo administrar uma método terapeuticamente efetivo de um polipeptídeo da invenção. Os métodos proporcionados incluem tratamento de um indivíduo tendo ou em risco de ter dano articular e/ou artrite, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente efetiva de um ou mais polipeptí- deos da invenção, ou uma composição farmacêutica destes. Ainda adicionalmente proporcionados são métodos de indução de diferenciação de células troncos mesenquimais em condrócitos, compreendendo contatar células troncos mesenquimais com uma quantidade efetiva de um polipeptídeo da invenção para induzir diferenciação das células troncos mesenquimais em condrócitos.

[0012] Estes e outros aspectos da invenção, incluindo característi cas, vantagens e concretizações adicionais da invenção, serão descritos e elucidados em detalhe adicional na seguinte descrição detalhada e reivindicações em anexo da invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0013] Figura 1 representa um esquemático de proteínas de hANG- PTL3 projetadas para aperfeiçoar a estabilidade da proteína e intensificar a resistência proteolítica. Durante produção de proteína de proteína tipo selvagem e sequências de peptídeo, 100% de clivagem foi observada entre Lys423 e Ser424. Para evitar proteólise, vários peptídeos mutantes foram gerados, no qual Lys 423 foi mutado para Gln ou Ser; ou Ser424 foi mutado para Thr; ou Lys 423 foi anulado.

[0014] Figura 2A e B representam representações gráficas de ex pressão de proteínas específicas de cartilagem na presença ou ausência de ANGPTL3 e construtos projetados. As células fixadas foram manchadas com quantificação Tipo 2A Pró-colágeno 2A (PIIANP) ou quantificação de colágeno Tipo II 2B para determinar a % de células que se diferenciam em condrócitos seguindo tratamento conforme descrito na Exemplificação. Figura 2C representa representação gráfica de quantificação de ensaios de angiogênese na presença ou ausência de ANG- PTL3, ou construtos projetados, conforme comparado a uma proteína de controle positivo, bFGF. Comprimento e número de tubo total de pontos de ramificação foram medições quatitativas de angiogênese. Embora outros tenham reportado atividade angiogênica em ANGPTL3, e este estudo confirme atividade, bem como aquele de FGF; os resultados indicam que nenhuma atividade significante é retida em um construto de C terminal ANGPTL3.

[0015] Figura 3 são representações gráficas mostrando um au mento na expressão de proteínas específicas de cartilagem na presença de ANGPTL3 ou construtos projetados. 3A. Células foram avaliadas dez dias seguindo tratamento usando qRT-PCR para medir expressão de RNA para proteínas específicas de cartilagem seguindo tratamento conforme descrito. Lubricina, aggrecan e Sox9 representam proteínas relacionadas a cartilagem; IGF e IFITM1 representam potencial de diferenciação, e osteocalcina e colágeno tipo X representam proteínas relacionadas a osso/fibrose. 3B. Células foram avaliadas três dias seguindo tratamento conforme descrito. A expressão aumentada de aggrecan foi vista seguindo tratamento com construto projetado ou polipeptídeo de região C-terminal de ANGPTL1 tipo selvagem.

[0016] Figura 4 representa representações gráficas de atividade condro-protetora de ANGPTL3 e construtos projetados. 4A: Liberação de glicosaminoglicano (GAG), um indicador de dano de matriz, foi inibida com quantidade aumentada de ANGPTL3 e construtos mutantes. Ensaios de inibição de liberação de GAG ex vivo (um indicador de dano de matriz) foram realizados usando cartilagem bovina tratada na presença ou ausência de construtos conforme descrito. 4B e 4C: NENHUMA liberação foi inibida com quantidade aumentada de ANGPTL3 e construtos projetados, conforme indicado. Condrócitos foram tratados na presença ou ausência de construtos conforme descrito, seguido por ensaios de reação de Greiss para determinar a inibição de NENHUMA liberação como um indicador de condro-proteção.

[0017] Figura 5 representa uma representação gráfica mostrando uma inibição de expressão de colágeno tipo X (um indicador de atividade de formação de cartilagem fibrótica) na presença de construtos sob condições hipertróficas. Os condrócitos primários foram tratados na presença de ausência de construtos sob condições hipertróficas, conforme descrito, seguido por determinação de expressão de colágeno tipo X, ensaiada por imunofluorescência, como uma medição de formação de cartilagem fibrótica e hipertrófica/diferenciação de condrócito. 5A representa os resultados de ANGPTL3 C-terminal tipo selvagem, ou construto projetado. 5B representa resultados de ANGPTL3 C-terminal (WT) ou construtos projetados 242KQ ou 242Kdel ou ANGPTL1 C-ter- minal.

[0018] Figura 6 representa uma representação esquemática do pa radigma de dosagem (6A), seguido por uma representação gráfica (6B) do aperfeiçoamento na severidade de articulação após tratamento com ANGPTL3 (17-460) de camundongo, conforme medido por classificação de erosão de cartilagem do côndilo femoral lateral.

[0019] Figura 7. é uma representação gráfica de medições de inca- pacitância (um indicador de dor) em camundongos seguindo indução cirúrgica de dano de cartilagem, e subsequente tratamento com cons- trutos de ANGPTL3 uma vez semanalmente por três semanas (começando no dia 7). 7A representa medições de incapacitância no dia 35 seguindo cirurgia; e 7B representa medições tomadas no dia 56 seguindo cirurgia.

[0020] Figura 8. é uma representação gráfica da classificação de severidade de articulação total e aperfeiçoamento na severidade para dano de cartilagem induzida por colagenase em camundongos seguindo 3 tratamentos uma vez semanalmente (dias 7, 14 e 21) de cons- trutos de ANGPTL3 (indicado).

[0021] Figura 9. representa resultados em um modelo de desgaste do menisco de rato de dano articular seguindo tratamento com construto de ANGPTL3 projetado. Figura 9A é uma representação gráfica do teor de proteoglicano em articulações cinco semanas seguindo tratamento; Figura 9B é uma representação gráfica da classificação de severidade de articulação femoral cinco semanas seguindo tratamento. Os resultados ilustram o aperfeiçoamento do dano de cartilagem induzido por ruptura cirúrgica do menisco em ratos seguindo 3 tratamentos uma vez por semana (dias 7, 14 e 21) de construtos de ANGPTL3 (indicado).

[0022] Figura 10 representa os resultados em modelo de desgaste de menisco de rato de dano articular seguindo tratamento com construto de ANGPTL3 projetado. Figura 10A é uma representação gráfica de percentagem de reparo in vivo conforme medida por severidade, intensidade de safranina O, área da cartilagem e espessura da cartilagem. Figura 10B é uma representação gráfica de medições de incapacitância (um indicador de dor) em ratos seguindo indução cirúrgica de dano de cartilagem e subsequente tratamento.

[0023] Figura 11 é uma representação gráfica da classificação de severidade total bruta para ilustrar aperfeiçoamento de dano de cartilagem induzido por rompimento cirúrgico do menisco medial em cães seguindo bimensalmente dosagem começando no dia 4 (cada da 1,5 ug/dose ou 15 ug/dose), ou uma dose única 30 ug) dada no dia 7 somente.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0024] A presente invenção é baseada, pelo menos em parte, na identificação de polipeptídeos similares a Angiopoietina 3 (ANGPTL3) que estimulam diferenciação de condrócito de células troncos mesen- quimais, e que são resistentes a clivagem por proteases (por exemplo, proteases similares á tripsina). O documento WO2011/008773 descreve composições de peptídeo de ANGPTL3 e uso de composições de pep- tídeo para tratamento ou prevenção de artrite e dano da articulação, e para indução de diferenciação de células mesenquimais em condróci- tos. Nós verificamos que proteínas de ANGPTL3 tipo selvagem são submetidas a corte e instabilidade de protease e têm variantes de sequência identificadas para evitar este efeito. A presente invenção, desse modo, proporciona composições de peptídeo aperfeiçoadas para reparo da cartilagem. Em particular, são proporcionados peptídeos de ANG- PTL3 modificados de acordo com a presente invenção para terem resis-tência aumentada á protease conforme comparada a um polipeptídeo de ANGPTL3 tipo selvagem. Também proporcionados são composições e métodos para administração de polipeptídeos de ANGPTL3 para impedir ou melhorar artrite ou dano da articulação por administração de um polipeptídeo da invenção em uma articulação, um tecido de cartilagem, ou um tecido de cartilagem proximal, ou sistemicamente. Ainda, a invenção proporciona composições e métodos para indução de diferenciação de célula tronco mesenquimal em condrócitos.

[0025] Definições

[0026] O termo "resistente à protease", conforme aqui usado, se re fere a um polipeptídeo compreendendo uma modificação que torna o polipeptídeo menos susceptível a clivagem por uma protease similar á tripsina do que um polipeptídeo tipo selvagem não modificado correspondente. Em concretizações específicas, um polipeptídeo resistente à protease é um polipeptídeo de ANGPTL3 que tem uma substituição de aminoácido, relativa a uma sequência de peptídeo tipo selvagem nativa, em um resíduo R ou a K.

[0027] "ANGPTL3" se refere a um membro da família de proteína de angoipoietina. Uma sequência de aminoácido de ANGPTL3 (No. de Acesso no Banco de Genes NP_055310.1) é colocada em SEQ ID NO:1; e a sequência de polinucleotídeo correspondente da qual é colocada como SEQ ID NO: 2 (número de sequência de referência NCBI NM014495.2, no qual a sequência de codificação de ANGPTL3 compreende nt 52-1434 de SEQ ID NO:2). O "polipeptídeo de ANGPTL3" se refere a um polipeptídeo expresso que ocorre naturalmente. Para a proposta da presente revelação, a numeração de um aminoácido é tipicamente determinada com referência à sequência de polipeptídeo de AN- GPTL3 humana tipo selvagem de comprimento total (SEQ ID NO:1). Desse modo, em concretizações em que um polipeptídeo da invenção contém somente uma porção C-terminal de ANGPTL3 de comprimento total, mas não a porção N-terminal, embora o peptídeo seja menos do que 460 aminoácidos de comprimento, a numeração das posições é baseada em SEQ ID NO:1. Por exemplo, referência à posição 423 de um polipeptídeo de ANGPTL3 da invenção se refere a posição 423 de SEQ ID NO:1, mesmo embora o polipeptídeo de ANGPTL3 da invenção em si pode somente ser de 200 aminoácidos de comprimento. Na determinação de um aminoácido em uma sequência de interesse que "corresponde a" uma posição em uma sequência de referência, tal como SEQ ID NO:1, isto é realizado por alinhamento otimamente das sequências, por exemplo, usando os parâmetros de alinhamento default CLUSTAL, ou parâmetros de alinhamento default BLAST 2, e comparando as sequências. Por exemplo, a posição 423 em uma sequência de interesse que é "determinada com referência a SEQ ID NO:1", ou um aminoácido que "corresponde a" posição 423 de SEQ ID NO:1, significa o aminoá- cido que se alinha com a posição 423 de SEQ ID NO:1 quando a se-quência de interesse é otimamente alinhada com SEQ ID NO:1.

[0028] Os termos "peptidomimético" e "mimético" se referem a um composto químico sintético que tem substancialmente as mesmas ca-racterísticas funcionais de um polipeptídeo que ocorre naturalmente ou não naturalmente (por exemplo, ANGPTL3), mas características estruturais diferentes (embora tipicamente similares). Os análogos de peptí- deo são comumente usados no campo como compostos ativos de não peptídeo (por exemplo, drogas) com propriedades análogas àquelas de um peptídeo gabarito. Tal compostos de não peptídeo são denominados "miméticos de peptídeo", ou "peptidomiméticos" (Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber and Freidinger TINS p. 392 (1985); e Evans et al. J. Med. Chem. 30:1229 (1987)). Os miméticos de peptídeo que são estruturalmente similares a peptídeos terapeuticamente úteis podem ser usados para produzir um efeito terapêutico ou profilático equivalente ou intensificado. Geralmente, os peptidomiméticos são estruturalmente similares a um polipeptídeo de paradigma (isto é, um polipeptídeo que tem uma atividade biológica ou farmacológica), tal como encontrado em um polipeptídeo de interesse, mas tem uma ou mais ligações de peptí- deo opcionalmente substituídas por uma ligação selecionada a partir do grupo consistindo em, por exemplo, -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, - CH=CH- (cis e trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2-, e -CH2SO-. Um mimético pode ser, ou totalmente composto de análogos não naturais sintéticos de aminoácidos, ou, é uma molécula quimérica de aminoácidos de pep- tídeo parcialmente naturais e análogos de aminoácidos parcialmente não naturais. Um mimético pode também incorporar qualquer quantidade de substituições conservativas de aminoácido naturais, considerando-se que tais substituições também não alteram substancialmente a estrutura mimética e/ou atividade. Por exemplo, uma composição mi- mética está dentro do escopo da invenção se ela é capaz de atividade condrogênica de um polipeptídeo de ANGPTL3.

[0029] Os termos "polipeptídeo", "peptídeo" e "proteína" são usados intercambiavelmente aqui para se referir a um polímero de resíduos de aminoácido. Os termos se aplicam a polímeros de aminoácido em que um ou mais resíduos de aminoácido é um mimético químico artificial de um aminoácido que ocorre naturalmente correspondente, bem como polímeros de aminoácido que ocorrem naturalmente correspondente e polímeros de aminoácido que ocorrem não naturalmente. Os polipeptí- deos, peptídeos, e proteínas da invenção compreendem peptidomimé- ticos de ANGPTL3 resistentes à protease tendo atividade condrogênica.

[0030] O termo "aminoácido" se refere a aminoácidos sintéticos e que ocorrem naturalmente, bem como análogos de aminoácido, e mi- méticos de aminoácido que funcionam em uma maneira similar a ami- noácidos que ocorrem naturalmente. Os aminoácidos que ocorrem naturalmente são aqueles codificados pelo código genético, bem como aqueles aminoácidos que são mais tarde modificados, por exemplo, hi- droxiprolina, Y-carboxiglutamato, e O-fosfoserina. Os análogos de ami- noácido se referem a compostos que têm a mesma estrutura química básica como um aminoácido que ocorre naturalmente, isto é, um carbono α que é ligado a um hidrogênio, um grupo carboxila, um grupo amino, e um grupo R, por exemplo, homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metionina metil sulfônico. Tais análogos têm grupos R modificados (por exemplo, norleucina), ou suportes de peptídeo modificados, mas retêm a mesma estrutura química básica como um aminoácido que ocorre naturalmente. Os aminoácidos naturalmente codificados são os 20 aminoácidos comuns (alanina, arginina, asparagina, ácido aspár- tico, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, propina, serina, treonina, tripto- fano, tirosina, e valina), bem como pirrolisina, pirrolina-carbóxi-lisina, e selenocisteína.

[0031] "Variantes conservativamente modificadas" se aplicam a am bas sequências de aminoácido e de ácido nucleico. Com relação às se-quências de ácido nucleico particulares, variantes conservativamente modificadas se referem àqueles ácidos nucleicos que codificam sequências de aminoácido idênticas ou essencialmente idênticas, ou onde o ácido nucleico não codifica uma sequência de aminoácido, para sequências essencialmente idênticas. Devido a degeneração do código genético, um grande número de ácidos nucleicos funcionalmente idênticos codifica qualquer dada proteína. Por exemplo, os códons GCA, GCC, GCG e GCU todos codificam o aminoácido alanina. Desse modo, em toda posição onde uma alanina é especificada por um códon, o códon pode ser alterado a qualquer dos códons correspondentes descritos sem alterar o polipeptídeo codificado. Tais variações de ácido nucleico são "variações silenciosas", que são uma espécie de variações conser- vativamente modificadas. Toda sequência de polipeptídeo aqui que é codificada por um polinucleotídeo envolve toda variação silenciosa possível do ácido nucleico. Um técnico no assunto reconhecerá que cada códon em um ácido nucleico (exceto AUG, que é ordinariamente o único códon para metionina, e TGG, que é ordinariamente o único códon para triptofano), pode ser modificado para produzir uma molécula funcionalmente idêntica. Consequentemente, cada variação silenciosa de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo está implícita em cada sequência descrita.

[0032] Um versado reconhecerá que substituições, anulações ou adições adicionais a um ácido nucleico, peptídeo, polipeptídeo, ou sequência de proteína que altera, adiciona ou anula um aminoácido único, ou uma percentagem pequena de aminoácidos com referência a uma sequência de aminoácido codificada original resultam em uma "variante conservativamente modificada" onde a alteração produz substituição de um aminoácido com um aminoácido quimicamente similar e/ou uma sequência de polipeptídeo que produz uma proteína estruturalmente similar tendo atividade funcional similar para a proteína original. Tabelas de substituição conservativa que proporcionam aminoácidos funcionalmente similares são bem conhecidas na técnica. Tais variantes conser- vativamente modificadas são em adição a, e não excluem variantes po- limórficas, homólogos de interespécie, e alelos da invenção.

[0033] O termo "substituições conservativas de aminoácido" se re fere a substituição (conceitualmente ou de outro modo) de um aminoá- cido de um tal grupo com um aminoácido diferente a partir do mesmo grupo. Um exemplo de substituições é baseado na análise das frequências normalizadas de mudanças de aminoácido entre proteínas correspondentes de organismos homólogos (ver, por exemplo, Schulz, G. E. and R. H. Schirmer, Principles of Protein Structure, Springer-Verlag). De acordo com tais análises, grupos de aminoácidos podem ser definidos onde os aminoácidos dentro de um grupo trocam preferencialmente entre si e, portanto, se assemelham entre si principalmente em seu impacto na estrutura de proteína total (ver, por exemplo, Schulz, G. E. and R. H. Schirmer, Principles of Protein Structure, Springer-Verlag). Um exemplo de um conjunto de grupos de aminoácido definido nesta maneira incluem: (i) um grupo carregado, consistindo em Glu e Asp, Lys, Arg e His; (ii) um grupo positivamente carregado, consistindo em Lys, Arg e His; (iii) um grupo negativamente carregado, consistindo em Glu e Asp; (iv) um grupo aromático, consistindo em Phe, Tyr e Trp; (v) um grupo de anel de nitrogênio, consistindo em His e Trp; (vi) um grupo não polar alifático grande, consistindo em Val, Leu e Ile; (vii) um grupo levemente polar, consistindo em Met e Cys; (viii) um grupo de resíduo pequeno, consistindo em Ser, Thr, Asp, Asn, Gly, Ala, Glu, Gln e Pro; (ix) um grupo alifático consistindo em Val, Leu, Ile, Met e Cys; e (x) um grupo hidroxila pequeno consistindo em Ser e Thr. Outros exemplos de substituições conservativas baseados em propriedades físicas compartilhadas são as substituições dentro dos seguintes grupos :1) Alanina (A), Glicina (G); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutâmico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W); 7) Serina (S), Treonina (T); e 8) Cisteína (C), Metionina (M) (ver, por exemplo, Creighton, Proteins (1984)).

[0034] "Percentagem de identidade de sequência" é determinada por comparação de duas sequências otimamente alinhadas sobre uma janela de comparação, no qual a porção da sequência de aminoácido, ou da sequência de polinucleotídeo, na janela de comparação, pode compreender adições ou anulações (isto é, folgas), conforme comparadas à sequência de referência (por exemplo, um polipeptídeo da invenção), que não compreende adições ou anulações, para alinhamento ótimo das duas sequências. A percentagem é calculada pela determinação do número de posições nas quais a base de ácido nucleico idêntica, ou resíduo de aminoácido, ocorre em ambas sequências para produzir o número de posições equiparadas, dividindo o número de posições equiparadas pelo número total de posições na janela de comparação, e multiplicando o resultado por 100 para produzir a percentagem de identidade de sequência.

[0035] Os termos "idêntico" ou percentagem de "identidade", no contexto de duas ou mais sequências de ácidos nucleicos ou de poli- peptídeo, se referem a duas ou mais sequências ou subsequências que são as mesmas sequências. Duas sequências são "substancialmente idênticas" se duas sequências têm uma percentagem especificada de resíduos de aminoácido ou nucleotídeos que são os mesmos (isto é, 95% de identidade, opcionalmente, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade sobre uma região especificada, ou, quando não especificada, sobre a sequência total), quando comparada e alinhada para correspondência máxima sobre uma janela de comparação, ou região designada conforme medida usando um dos seguintes algoritmos de comparação de sequência, ou por alinhamento manual e inspeção visual. A invenção proporciona polipeptídeos que são substancialmente idênticos aos poli- peptídeos, respectivamente, aqui exemplificados (por exemplo, qualquer de SEQ ID NOs: 11-42), bem como usos destes incluindo, mas não limitados a, uso para tratamento ou prevenção de artrite ou dano da articulação. Opcionalmente, para ácidos nucleicos, a identidade existe sobre uma região que é pelo menos cerca de 150 nucleotídeos de comprimento, ou mais, de preferência, sobre uma região que é 300 a 450 ou 600 ou mais nucleotídeos de comprimento, ou o comprimento total da sequência de referência. Para a sequência de aminoácido, opcionalmente, a identidade existe sobre uma região que é pelo menos cerca de 50 aminoácidos de comprimento, ou, mais de preferência, sobre uma região que é 100 a 150 ou 200 ou mais aminoácidos de comprimento, ou o comprimento total da sequência de referência.

[0036] Para comparação de sequência, tipicamente uma sequência age como uma sequência de referência a qual sequências testes são comparadas. Quando se usa um algoritmo de comparação de sequência, sequências de teste e de referência são admitidas em um computador, coordenadas de subsequência são designadas, se necessário, e parâmetros de programa de algoritmo de sequência são designados. Os parâmetros de programa default podem ser usados, ou parâmetros alternativos podem ser designados. O algoritmo de comparação de sequência, em seguida, calcula a percentagem de identidades de sequência para as sequências de teste relativa à sequência de referência, baseado nos parâmetros do programa.

[0037] Uma "janela de comparação", conforme aqui usado, inclui re ferência a um segmento de qualquer um do número de posições contíguas selecionadas a partir do grupo consistindo em 50 a 600, usualmente cerca de 75 a cerca de 200, mais usualmente cerca de 100 a cerca de 150, em que uma sequência pode ser comparada a uma sequência de referência do mesmo número de posições contíguas após as duas sequências serem otimamente alinhadas. Métodos de alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica. O alinhamento ótimo de sequências para comparação pode ser conduzido, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c, pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443, pela pesquisa para método de similaridade de Pearson and Lipman (1988) Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444, por implementações computadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA), ou por alinhamento manual e inspeção visual (ver, por exemplo, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995 suplemento)).

[0038] Dois exemplos de algoritmos que são adequados para deter minação da percentagem de identidade de sequência e similaridade de sequência são os algoritmos BLAST e BLAST 2.0, que são descritos em Altschul et al. (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, and Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410, respectivamente. Software para realização de análise de BLAST é publicamente disponível através do National Center for Biotechnology Information. Este algoritmo envolve primeiro identificação de pares de sequência de alta classificação (HSPs) por identificação de palavras curtas de comprimento W na sequência de pesquisa, que, ou se equipara, ou satisfaz alguma classificação de limite de valor positivo T quando alinhada com uma palavra do mesmo comprimento em uma sequência de base de dados. T é referido como o limite de classificação de palavra vizinho (Altschul et al., supra). Estes acessos de palavra vizinha iniciais agem como sementes para iniciar pesquisas para encontrar HSPs mais longos contendo as mesmas. A palavra acessis são estendidas e, ambas as direções ao longo de cada sequência para, já que a classificação de alinhamento cumulativa pode ser aumentada. As classificações cumulativas são calculadas usando, para sequências de nucleotídeo, os parâmetros M (classificação de retribuição para um par de resíduos de equiparação; sempre > 0) e N (classificação de penalidade para resíduos de desequiparação; sempre < 0). Para sequências de aminoácido, uma matriz de classificação é usada para calcular a classificação cumulativa. A extensão dos acessos de palavra em cada direção é interrompida quando: a classificação de alinhamento cumulativo falha pela quantidade X de seu valor alcançado máximo; a classificação cumulativa vai a zero ou abaixo de zero, devido ao acúmulo de um ou mais alinhamentos de resíduo de classificação negativos; ou a extremidade de qualquer sequência é alcançada. Os parâmetros de algoritmo BLAST W, T, e X determinam a sensibilidade e velocidade do alinhamento. O programa BLASTN (para sequências de nucleotídeo) usa como defaults um comprimento de palavra (W) de 11, uma expectativa (E) ou 10, M=5, N=-4, e uma comparação de ambos trançados. Para sequências de aminoácido, o programa BLASTP usa como defaults um comprimento de palavra de 3, e expectativa (E) de 10, e a matriz de classificação BLOSUM62 (ver Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915) alinhamentos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=-4, e uma comparação de ambos os trançados.

[0039] O algoritmo BLAST também realiza uma análise estatística da similaridade entre duas sequências (ver, por exemplo, Karlin and Al- tschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787). Uma medida de similaridade proporcionada pelo algoritmo BLAST é a menor probabilidade de soma (P(N)), que proporciona uma indicação da probabilidade pela qual uma equiparação entre dois nucleotídeos ou sequências de aminoácido ocorrerá por chance. Por exemplo, um ácido nucleico é considerado similar a uma sequência de referência se a probabilidade de soma menor em uma comparação do ácido nucleico teste para o ácido nucleico de referência é menor do que cerca de 0,2, mais de preferência, menor do que cerca de 0,01, e, mais de preferência, menor do que cerca de 0,001.

[0040] O termo "isolado", quando aplicado a um ácido nucleico ou proteína, denota que o ácido nucleico ou proteína é purificado para ser essencialmente livre de outros componentes celulares que ele é associado no estado natural. Ele está frequentemente em um estado homogêneo ou quase homogêneo. Ele pode estar em, ou uma solução seca, ou em solução aquosa. A pureza e homogeneidade pode ser determinada usando técnicas de química analítica conhecidas e usadas tipicamente na técnica, por exemplo, eletroforese de gel de poliacrilamida, cromatografia líquida de alto desempenho, etc. Uma proteína que é a espécie predominante presente em uma preparação é substancialmente purificada. O termo "purificada", em algumas concretizações, denota que uma proteína dá ocorrência a essencialmente uma faixa em um gel eletroforético. Tipicamente, significa que uma proteína é pelo menos 85% pura, mais de preferência, pelo menos 95% pura, e, mais de preferência, pelo menos 99% pura.

[0041] O termo "ácido hialurônico" é aqui usado para incluir derivados de ácido hialurônico que incluem ésteres de ácido hialurô- nico, sais de ácido hialurônico, e também incluem o termo hialuro- nan. A designação também inclui ambas formas de baixo e alto peso molecular de hialuronans e hialuronans reticuladas, ou hi- lans. Exemplos de tais hialuronans são Synvisc™ (Genzyme Corp. Cambridge, Mass.), ORTHOVISC™ (Anika Therapeutics, Woburn, Mass.), HYALGAN™ (Sanofi-Synthelabo Inc., Malvern, Pa.), e Pro- Visc (Alcon/Novartis).

[0042] Conforme usado neste relatório descritivo e nas reivindica ções em anexo, as formas singulares "um", "uma", e "o" incluem referentes plurais, a menos que o contexto determine claramente de outro modo.

[0043] Polipeptídeos resistentes à protease similares à angiopoie- tina 3

[0044] Tipo Angiopoietina 3 é um membro da família similar á angi-opoietina de fatores secretados. Ela é predominantemente expressa no fígado, e tem a estrutura característica de angiopoietinas, consistindo em um peptídeo de sinal, domínio coiled-coil N-terminal (CCD), e o domínio similar à fibronogênio (FBN) C-terminal. A tipo angiopoietina 3 mostrou-se ligar αV/β3 integrinas, e domínio similar a FBN sozinho foi suficiente para induzir adesão de célula endotelial e angiogênese in vivo (Camenisch et al., J. Biol. Chem. 277: 17281-17290, 2002). A ANGPTL3 endógena é geralmente clivada in vivo em fragmentos amino-terminal e carbóxi-terminal. Conforme resumido e adicionalmente aqui descrito, a presente invenção contempla o uso de várias proteínas de ANGPTL3 resistentes à protease tendo atividade condrogênica.

[0045] Em algumas concretizações, um polipeptídeo isolado compreende uma sequência de aminoácido que tem pelo menos 95% de identidade, ou pelo menos 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade, a uma sequência de aminoácido selecionada de qualquer uma das sequências da TABELA 1, no qual o polipeptídeo compreende um amino- ácido que é um aminoácido polar outro do que K ou R na posição 423, ou o polipeptídeo compreende uma anulação na posição 423, conforme determinada com referência à SEQ ID NO:1. Os polipeptídeos da invenção têm atividade condrogênica. Em algumas concretizações, um poli- peptídeo compreende a sequência de aminoácido que tem pelo menos 95% de identidade, ou pelo menos 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade, para uma sequência de aminoácido selecionada de qualquer uma de SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, ou SEQ ID NO:70, no qual o polipeptídeo compreende um aminoácido que é um aminoácido polar outro do que K ou R na posição 423, ou o polipeptídeo compreende uma anulação na posição 423, conforme determinada com referência à SEQ ID NO:1, e o polipeptídeo tem atividade condrogênica. Em uma concretização adicional, um polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido que tem pelo menos 95% de identidade, ou pelo menos 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade, para uma sequência de aminoácido selecionada de qualquer uma de SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ IDNO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, ou SEQ ID NO:64, no qual o polipeptídeo compreende um aminoácido que é um aminoácido polar outro do que K ou R na posição 423, conforme determinada com referência à SEQ ID NO:1, e o polipeptídeo tem atividade condrogênica.

[0046] Em algumas concretizações, um polipeptídeo isolado compreende uma sequência de aminoácido selecionada de qualquer uma das sequências da TABELA 1, no qual o polipeptídeo compreende um aminoácido que é um aminoácido polar outro do que K ou R na posição 423, ou o polipeptídeo compreende uma anulação na posição 423, conforme determinada com referência à SEQ ID NO:1, e o polipeptídeo tem atividade condrogênica. Em algumas concretizações, um polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácido selecionada de qualquer uma de SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:65,SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, ou SEQ ID NO:70, no qual o polipeptídeo compreende um aminoácido que é um aminoácido polar outro do que K ou R na posição 423, ou o polipeptídeo compreende uma anulação na posição 423, conforme determinada com referência à SEQ ID NO:1, e o polipeptídeo tem atividade condrogênica. Em uma concretização adicional, um polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácido selecionada de qualquer uma de SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60,SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, ou SEQ ID NO:64, no qual o polipeptídeo compreende um aminoácido que é um aminoácido polar outro do que K ou R na posição 423, conforme determinada com referência à SEQ ID NO:1, e o polipeptídeo tem atividade condrogênica.

[0047] Em algumas concretizações, um polipeptídeo isolado tem pelo menos 95% de identidade, ou pelo menos 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade, para uma sequência de aminoácido selecionada de qualquer uma das sequências da TABELA 1, no qual o polipeptídeo compreende um aminoácido que é um aminoácido polar outro do que K ou R na posição 423, ou o polipeptídeo compreende uma anulação na posição 423, conforme determinada com referência à SEQ ID NO:1, e o po- lipeptídeo tem atividade condrogênica. Em algumas concretizações, um polipeptídeo tem pelo menos 95% de identidade, ou pelo menos 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade, para uma sequência de aminoácido selecionada de qualquer uma de SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, ou SEQ ID NO:70, no qual o polipeptídeo compreende um aminoácido que é um aminoácido polar outro do que K ou R na posição 423, ou o polipeptídeo compreende uma anulação na posição 423, conforme determinada com referência à SEQ ID NO:1, e o polipeptídeo tem atividade condrogênica. Em uma concretização adicional, um polipeptídeo tem pelo menos 95% de identidade, ou pelo menos 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade, para uma sequência de aminoácido selecionada de qualquer uma de SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, ou SEQ ID NO:64, no qual o polipeptídeo compreende um aminoácido que é um aminoácido polar outro do que K ou R na posição 423, conforme determinada com referência à SEQ ID NO:1, e o polipeptídeo tem atividade condrogênica.

[0048] Em algumas concretizações, um polipeptídeo isolado é uma sequência de aminoácido selecionada de qualquer uma das sequências da TABELA 1. Em algumas concretizações, um polipeptídeo é uma sequência de aminoácido selecionada de qualquer uma de SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, ou SEQ ID NO:70. Em uma concretização adicional, um polipeptídeo é uma sequência de aminoácido selecionada de qualquer uma de SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, ou SEQ ID NO:64.TABELA 1: Construtos variantes de ANGPTL3

[0049] Os polipeptídeos de ANGPTL3 modificados da invenção têm pelo menos uma substituição na porção C-terminal do polipeptídeo para tornar o polipeptídeo resistente à protease. A substituição é em um re-síduo R ou K, de modo que os polipeptídeos aumentam a resistência, por exemplo, para proteases similares á tripsina. Qualquer aminoácido pode ser substituído por um R ou K em um polipeptídeo de ANGPTL3 resistente à protease da invenção. Em algumas concretizações, uma substituição é um aminoácido polar, por exemplo, H, N, Q, S, T, A, ou Y. Em algumas concretizações, uma substituição é H, N, Q, S, T, ou Y. Em algumas concretizações, uma substituição é S ou Q. Em algumas con-cretizações, a substituição é Q. Em algumas concretizações, a substi-tuição é S. Em algumas concretizações, um peptídeo resistente à pro-tease tem um aminoácido na posição 423, com referência à SEQ ID NO:1, que é outro do que K ou R. Em algumas concretizações, um po- lipeptídeo da invenção compreende um aminoácido na posição 423 que é um aminoácido polar. Por exemplo, o aminoácido na posição 423 pode ser Q ou S, ou outro aminoácido polar. Em certas concretizações, um polipeptídeo da invenção tem um Q na posição 423. Em outras concre-tizações, um polipeptídeo da invenção tem um S na posição 423. Em algumas concretizações, em adição à substituição em 423, o peptídeo resistente à protease tem uma substituição de outro R ou K na C-termi- nal de SEQ ID NO:1, ou uma variante desta, no qual a substituição é um aminoácido polar outro do que R ou K. Em algumas concretizações, a substituição na posição 423, conforme determinada com referência à SEQ ID NO:1, é Q ou S. Em ainda outras concretizações, um polipeptí- deo da invenção tem uma anulação na posição 423, conforme determi-nada com referência à SEQ ID NO:1.

[0050] Em algumas concretizações, um polipeptídeo da invenção é 250 aminoácidos ou menos de comprimento, e compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, ou SEQ ID NO:70.

[0051] Em algumas concretizações, a invenção proporciona uso de proteínas de ANGPTL3 condrogênica resistente à protease de compri-mento total. Em algumas concretizações, a invenção proporciona prote-ínas de ANGPTL3 resistente à protease compreendendo uma porção C- terminal da sequência de ANGPTL3, ou uma variante condrogênica des-tas. Em certas concretizações, as proteínas de ANGPTL3 carecem da extremidade amino-terminal da proteína nativa. Em algumas concretiza-ções, as proteínas de ANGPTL3 resistentes à protease da invenção ca-recem de domínio de CCD e/ou carecem de atividade significante de CCD. Desse modo, em algumas concretizações, as proteínas de ANG- PTL3 resistentes à protease da invenção compreendem pelo menos um fragmento (por exemplo, pelo menos 100, 150, 200, 220 ou 215 amino- ácidos contíguos) de um domínio carbóxi-terminal de proteína de ANG- PTL3 humana, ou uma sequência substancialmente idêntica para a se-quência de proteína de ANGPTL3 carbóxi-terminal humana, no qual o polipeptídeo e variantes deste retêm atividade condrogênica. Em algu-mas concretizações, um polipeptídeo resistente à protease da invenção carece pelo menos de uma porção da sequência C-terminal, por exemplo, carece de 5, 10, 15, ou 20 aminoácidos a partir da extremidade C- terminal de SEQ ID NO:1 (isto é, carece de 456-460, 451-460, 446-460 ou 441-460 de SEQ ID NO:1).

[0052] Em algumas concretizações, um polipeptídeo de ANGPTL3 resistente à protease da invenção compreende aminoácidos contíguos correspondentes às regiões de aminoácido: aminoácidos 241-455, ou 241-460 de SEQ ID NO:1; aminoácidos 242-455, ou 242-460 de SEQ ID NO:1; aminoácidos 233-455 ou 233-460 de SEQ ID NO:1; aminoáci- dos 228-455 ou 228-460 de SEQ ID NO:1, aminoácidos 226-455- ou 226-260 ou aminoácidos 225-455- ou 225-260 de SEQ ID NO:1, em que um aminoácido é substituído por um R ou K, ou um resíduo único é anulado. Em algumas concretizações, uma substituição está na posição 423, conforme determinada com referência à SEQ ID NO:1. Em algumas concretizações, uma anulação está na posição 423, conforme de-terminada com referência à SEQ ID NO:1. Em algumas concretizações, um polipeptídeo resistente à protease compreende aminoácidos contí-guos correspondentes às regiões de aminoácido 207-455 ou 207-460 de SEQ ID NO:1, em que um aminoácido é substituído por R ou K, ou um resíduo único é anulado. Em algumas concretizações, uma substituição ou anulação está na posição 423. Em algumas concretizações, uma substituição é um aminoácido polar, por exemplo, H, N, Q, S, T, A, ou Y. Em algumas concretizações, uma substituição é H, N, Q, S, T, ou Y. Em algumas concretizações, uma substituição é S ou Q. Em algumas concretizações, uma substituição é Q. Em certas concretizações, uma anulação na posição 423 relativa a SEQ ID NO:1 é incluída.

[0053] A invenção adicionalmente proporciona um polipeptídeo resistente à protease, no qual o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 95% de identidade, ou pelo menos 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade, para aminoácidos 240-454 de SEQ ID NO:1, aminoácidos 241-455 de SEQ ID NO:1, ou aminoácidos 242-455 de SEQ ID NO:1 com uma substituição ou anulação no amino- ácido correspondente à posição 423 de SEQ ID NO:1, onde o aminoá- cido substituído não é R, e no qual o polipeptídeo tem atividade condro- gênica. Em outras concretizações, o polipeptídeo compreende aminoá- cidos 240-454 de SEQ ID NO:1, aminoácidos 241-455 de SEQ ID NO:1, ou aminoácidos 242-455 de SEQ ID NO:1, cada polipeptídeo com uma substituição ou anulação no aminoácido correspondente á posição 423 de SEQ ID NO:1, onde o aminoácido substituído é Q ou S.

[0054] Em algumas concretizações, um polipeptídeo de ANGPTL3 resistente à protease da invenção compreende uma sequência de ami- noácido tendo pelo menos 95%, ou pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade para aminoácidos 242-455 ou 242-460 de SEQ ID NO:1; 241-455 ou 241-460 de SEQ ID NO:1; aminoácidos 233-455 ou 233-460 de SEQ ID NO:1; aminoácidos 228-455 ou 228-460 de SEQ ID NO:1, aminoácidos 226-455- ou 226260 de SEQ ID NO:1, ou aminoácidos 225-455- ou 225-260 de SEQ ID NO:1 em que um aminoácido é substituído por um R ou K, ou um R ou K é anulado. Em algumas concretizações, a substituição ou anulação está na posição 423. Em algumas concretizações, uma substituição é um aminoácido polar, por exemplo, H, N, Q, S, T, A, ou Y. Em algumas concretizações, uma substituição é H, N, Q, S, T, ou Y. Em algumas concretizações, a substituição é S ou Q. Em algumas concretizações, a substituição é a Q. Em certas concretizações, existe um resíduo anulado na posição 423 relativa a SEQ ID NO:1.

[0055] Em algumas concretizações, um polipeptídeo de ANGPTL3 resistente à protease da invenção é 250 ou 240 ou menos aminoácidos de comprimento, e compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, e SEQ ID NO:70. Em algumas concre-tizações, um polipeptídeo de ANGPTL3 resistente à protease da invenção é 230 ou 225 ou menos aminoácidos de comprimento, e compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40,SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, ou SEQ ID NO:70.

[0056] Em algumas concretizações, as proteínas de ANGPTL3 resistentes à protease da invenção compreendem uma sequência de ami- noácido tendo pelo menos 95% de identidade, ou pelo menos 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade, para a sequência de proteína de AN- GPTL3 C-terminal canina, bovina, ou equina. Em algumas concretizações, as proteínas de ANGPTL3 resistentes à protease da invenção compreendem pelo menos um fragmento (por exemplo, pelo menos 100, 150, 200, 215 aminoácidos contíguos) de uma sequência de proteína de ANGPTL3 nativa canina (SEQ ID NO:4), equina (SEQ ID NO:5), ou bovina (SEQ ID NO:6)e, ou uma sequência substancialmente idêntica para a sequência de proteína de ANGPTL3 nativa canina, bovina, ou equina no qual o polipeptídeo compreende um aminoácido que é um aminoácido polar outro do que K ou R na posição 423, ou o polipeptídeo compreende uma anulação na posição 423, conforme determinada com referência à SEQ ID NO:1, e o polipeptídeo tem atividade condrogênica. Em algumas concretizações, um polipeptídeo isolado compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 95% de identidade, ou pelo menos 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade, para SEQ ID NO:42 ou SEQ ID NO:43, no qual o polipeptídeo compreende um aminoácido que é um aminoácido polar outro do que K ou R na posição 423, ou o poli- peptídeo compreende uma anulação na posição 423, conforme deter-minada com referência à SEQ ID NO:1, e o polipeptídeo tem atividade condrogênica. Em algumas concretizações, um polipeptídeo tem pelo menos 95% de identidade, ou pelo menos ou pelo menos 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade, para SEQ ID NO:42, ou SEQ ID NO:43, no qual o polipeptídeo compreende um aminoácido que é um aminoácido polar outro do que K ou R na posição 423, ou o polipeptídeo compreende uma anulação na posição 423, conforme determinada com referência à SEQ ID NO:1, e o polipeptídeo tem atividade condrogênica. Em certas concretizações, um polipeptídeo compreende SEQ ID NO:42, ou SEQ ID NO:43. Em uma concretização adicional, um polipeptídeo é SEQ ID NO:42, ou SEQ ID NO:43.

[0057] Em algumas concretizações, uma ANGPTL3 resistente à protease da invenção compreende uma sequência de aminoácido que tem pelo menos 95%, ou pelo menos 96%, 97%, 98%, ou pelo menos 99% de identidade para aminoácidos 232-454 de SEQ ID NO:4, amino- ácidos 240-454 de SEQ ID NO:4, aminoácidos 227-454 de SEQ ID NO:4, ou aminoácidos 224-454 de SEQ ID NO:4, em que um aminoá- cido é substituído por um R ou K, ou existe uma anulação de um R ou K. Em algumas concretizações, a substituição ou anulação está na posição 422 de SEQ ID NO:4, que corresponde à posição 423 de SEQ ID NO:1. Em algumas concretizações, uma substituição é um aminoácido polar, por exemplo, H, N, Q, S, T, A, ou Y. Em algumas concretizações, uma substituição é H, N, Q, S, T, ou Y. Em algumas concretizações, a substituição é S ou Q. Em algumas concretizações, a substituição é a Q. Em algumas concretizações, uma anulação de aminoácido está na posição 422 de SEQ ID NO:4.

[0058] Em algumas concretizações, uma ANGPTL3 resistente à protease da invenção compreende uma sequência de aminoácido que tem pelo menos 95%, ou pelo menos 96%, 97%, 98%, ou pelo menos 99% de identidade para aminoácidos 233-455 de SEQ ID NO:5, amino- ácidos 241-455 de SEQ ID NO:5, aminoácidos 228-455 de SEQ ID NO:5, ou aminoácidos 225-455 de SEQ ID NO:5, em que um aminoá- cido é substituído por um R ou K, ou existe uma anulação de um R ou K. Em algumas concretizações, a substituição ou anulação está na posição 423 de SEQ ID NO:5, que corresponde à posição 423 de SEQ ID NO:1. Em algumas concretizações, uma substituição é um aminoácido polar, por exemplo, H, N, Q, S, T, A, ou Y. Em algumas concretizações, uma substituição é H, N, Q, S, T, ou Y. Em algumas concretizações, a substituição é S ou Q. Em algumas concretizações, a substituição é a Q. Em algumas concretizações, uma anulação de aminoácido está na posição 423 de SEQ ID NO:5.

[0059] Em algumas concretizações, uma ANGPTL3 resistente à protease da invenção compreende uma sequência de aminoácido que tem pelo menos 95%, ou pelo menos 96%, 97%, 98%, ou pelo menos 99% de identidade para aminoácidos 233-455 de SEQ ID NO:6, amino- ácidos 241-455 de SEQ ID NO:6, aminoácidos 228-455 de SEQ ID NO:6, ou aminoácidos 225-455 de SEQ ID NO:6, em que um aminoá- cido é substituído por um R ou K, ou existe uma anulação de um R ou K. Em algumas concretizações, a substituição ou anulação está na posição 422 de SEQ ID NO:6, que corresponde à posição 423 de SEQ ID NO:1. Em algumas concretizações, uma substituição é um aminoácido polar, por exemplo, H, N, Q, S, T, A, ou Y. Em algumas concretizações, uma substituição é H, N, Q, S, T, ou Y. Em algumas concretizações, a substituição é S ou Q. Em algumas concretizações, a substituição é um Q. Em algumas concretizações, uma anulação de aminoácido está na posição 422 de SEQ ID NO:6.

[0060] Em algumas concretizações, um polipeptídeo de ANGPTL3 resistente à protease da invenção compreende aminoácidos contíguos correspondentes às regiões de aminoácido: aminoácidos 240-454 de SEQ ID NO:4; aminoácidos 232-454 de SEQ ID NO:4; aminoácidos 227-454 de SEQ ID NO:4, ou aminoácidos 224-454 de SEQ ID NO:4, em que um aminoácido é substituído por um R ou K, ou existe uma anulação de um R ou K. Em algumas concretizações, a substituição ou anulação está na posição 422 de SEQ ID NO:4 (que é posição 423, conforme determinada com referência à SEQ ID NO:1). Em algumas con-cretizações, uma substituição é um aminoácido polar, por exemplo, H, N, Q, S, T, A, ou Y. Em algumas concretizações, uma substituição é H, N, Q, S, T, ou Y. Em algumas concretizações, a substituição é S ou Q. Em algumas concretizações, a substituição é Q. Em algumas concreti-zações, uma anulação de aminoácido está na posição 422 de SEQ ID NO:4.

[0061] Em algumas concretizações, um polipeptídeo de ANGPTL3 resistente à protease da invenção compreende aminoácidos contíguos correspondentes às regiões de aminoácido: aminoácidos 241-455 de SEQ ID NO:5; aminoácidos 233-455 de SEQ ID NO:5; aminoácidos 228-455 de SEQ ID NO:5, ou aminoácidos 225-455 de SEQ ID NO:5, em que um aminoácido é substituído por um R ou K, ou existe uma anulação de um R ou K. Em algumas concretizações, a substituição ou anulação está na posição 423 (que corresponde à posição 423, conforme determinada com referência à SEQ ID NO:1). Em algumas concretiza-ções, uma substituição é um aminoácido polar, por exemplo, H, N, Q, S, T, A, ou Y. Em algumas concretizações, uma substituição é H, N, Q, S, T, ou Y. Em algumas concretizações, a substituição é S ou Q. Em algu-mas concretizações, a substituição é Q. Em algumas concretizações, uma anulação de aminoácido está na posição 423 de SEQ ID NO:5.

[0062] Em algumas concretizações, um polipeptídeo de ANGPTL3 resistente à protease da invenção compreende aminoácidos contíguos correspondentes às regiões de aminoácido: aminoácidos 241-455 de SEQ ID NO:6; aminoácidos 233-455 de SEQ ID NO:6; aminoácidos 228-455 de SEQ ID NO:6, ou aminoácidos 225-455 de SEQ ID NO:6, em que um aminoácido é substituído por um R ou K, ou existe uma anulação de um R ou K. Em algumas concretizações, a substituição ou anulação está na posição 422 de SEQ ID NO:6 (que é posição 423, conforme determinada com referência à SEQ ID NO:1). Em algumas con-cretizações, uma substituição é um aminoácido polar, por exemplo, H, N, Q, S, T, A, ou Y. Em algumas concretizações, uma substituição é H, N, Q, S, T, ou Y. Em algumas concretizações, a substituição é S ou Q. Em algumas concretizações, a substituição é Q. Em algumas concreti-zações, existe uma anulação na posição 422 de SEQ ID NO:6.

[0063] As proteínas de ANGPTL3 da invenção, conforme descrito acima, podem incluir sequências de proteína de ANGPTL3 nativas que flanqueiam as regiões descritas acima. Alternativamente, em algumas concretizações, as proteínas de ANGPTL3 da invenção podem incluir sequências de flanqueamento de proteína de ANGPTL3 não nativas. Por exemplo, a porção ativa condrogênica de uma proteína de ANG- PTL3 pode ser fundida a um ou mais padrões de fusão e/ou aminoáci- dos heterólogos para formar uma proteína de fusão. As sequências de padrão de fusão podem incluir, mas não limitadas a, etiquetas de ami- noácido, não L (por exemplo, D-) aminoácidos, ou outros aminoácido miméticos para prolongar meia-vida in vivo e/ou resistência á protease, sequências alvos, ou outras sequências.

[0064] Em algumas concretizações, um polipeptídeo da invenção é PEGilatado. Em algumas concretizações, um polipeptídeo da invenção é fundido a um peptídeo heterólogo. Em certas concretizações, um po- lipeptídeo é fundido a qualquer um de albumina do soro humano (HSA), uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina (Fc), uma poli-histidina, uma glutationa S transferase (GST), uma tioredoxina, uma proteína A, uma proteína G, uma proteína de ligação de maltose (MBP), ou um fragmento de qualquer do(s) polipeptídeo(s) heterólogo(s) prece- dente(s). Em concretizações particulares, um polipeptídeo heterólogo é fundido na extremidade amino-terminal do polipeptídeo da invenção. Em concretizações adicionais ou alternativas, um polipeptídeo heteró- logo é fundido na extremidade carbóxi-terminal do polipeptídeo da invenção.

[0065] As proteínas de ANGPTL3 da invenção têm atividade con-drogênica, e são resistentes à protease. Conforme aqui definido, con- drogênese ou atividade condrogênica se refere ao desenvolvimento de condrócitos de MSCs. Os indicadores de atividade condrogênica incluem, mas não são limitados a, produção de matriz de cartilagem. A produção de matriz de cartilagem pode ser medida por vários marcadores, por exemplo, tais como Sox9, colágeno tipo II, ou produção de gli- cosaminoglicano (GAG). Em algumas concretizações, a produção de GAG é medida como um marcador para produção de matriz de cartila-gem. Em algumas concretizações, um aumento de 3 vezes na produção de GAG com expressão de proteína específica de cartilagem indica pro-dução positiva de matriz de cartilagem.

[0066] Um polipeptídeo pode ser avaliado para resistência à pro tease usando qualquer ensaio conhecido que mede a clivagem por uma serina protease, tal como tripsina. Em algumas concretizações, a pro-tease empregada para avaliar a susceptibilidade de proteólise é a serina protease tripsina. Um polipeptídeo é considerado ser resistente à pro-tease se ele tem sensibilidade reduzida para tripsina quando comparado a sua contraparte tipo selvagem. Um exemplo de um ensaio é medir a quantidade de produto clivado que é gerada quando um polipeptídeo é exposto a tripsina por um período de tempo em comparação a um pepi- tídeo humano nativo correspondente. A clivagem pode ser medida usando qualquer ensaio conhecido, por exemplo, SDS PAGE ou LCMS. Um ensaio ilustrativo é proporcionado na seção de Exemplos.

[0067] Em um ensaio ilustrativo, proteólise limitada por tripsinólise é realizada por incubação de 10 ng da proteína a ser avaliada com trip- sina a razão de massa de 8000:1 (Proteína:Tripsina) por 1 hora à tem-peratura ambiente. A reação de tripsinólise pode, em seguida, ser supri-mida por adição de ácido acético para trazer a reação a pH 3,0. As amostras suprimidas são, em seguida, separada e analisada por SDS- PAGE, por exemplo, em 4-12% de gel Tris-Bis para identificar proteínas que são resistentes a clivagem daquelas que são clivadas pelo apareci-mento de um fragmento que é gerado por clivagem de tripsina. O produto de clivagem é ausente ou reduzido nos polipeptídeos resistentes à protease em comparação às suas contrapartes tipo selvagem.

[0068] Em algumas concretizações, o polipeptídeo de ANGPTL3s da invenção compreenderá pelo menos um aminoácido codificado não naturalmente. Em algumas concretizações, um polipeptídeo compreende 1, 2, 3, 4, ou mais aminoácidos não naturais. Métodos de produção e introdução de um aminoácido que ocorre não naturalmente em uma proteína, são conhecidos. Ver, por exemplo, Patente dos Estados Unidos Nos. 7.083.970; e 7.524.647. Os princípios gerais para a produção de sistemas de translação ortogonal que são adequados para produção de proteínas que compreendem um ou mais aminoácido não natural de-sejados são conhecidos na técnica, como são os métodos gerais para produção de sistemas de translação ortogonal. Por exemplo, ver Publi-cações Internacionais Números WO 2002/086075, intitulado "MÉTODOS E COMPOSIÇÃO PARA A PRODUÇÃO DE PARES ORTOGONAIS DE tRNA-AMINOACIL-tRNA;" WO 2002/085923, intitulado "IN-CORPORAÇÃO IN VIVO DE AMINOÁCIDOS NÃO NATURAIS"; WO 2004/094593, intitulado "EXPANSÃO DE CÓDIGO GENÉTICO EUCA- RIÓTICO"; WO 2005/019415, depositada em 7 de julho de 2004; WO 2005/007870, depositado em 7 de julho de 2004; WO 2005/007624, de-positado em 7 de julho de 2004; WO 2006/110182, depositado em 27 de outubro de 2005, intitulado "COMPONENTES DE TRANSLAÇÃO ORTOGONAL PARA INCORPORAÇÃO IN VIVO DE AMINOÁCIDOS NÃO NATURAIS", e WO 2007/103490, depositado em 7 de março de 2007, intitulado "SISTEMAS PARA A EXPRESSÃO DE COMPONENTES DE TRANSLAÇÃO ORTOGONAL EM CÉLULAS HOSPEDEIRAS EUROBACTERIAIS". Para discussão de sistemas de translação ortogo-nal que incorporam aminoácidos não naturais, e métodos para sua pro-dução e uso, ver também, Wang and Schultz, (2005) "Expanding the Genetic Code." Angewandte Chemie Int Ed 44: 34-66; Xie e Schultz, (2005) "An Expanding Genetic Code". Methods 36: 227-238; Xie and Schultz, (2005) "Adding Amino acids to the Genetic Repertoire". Curr Opinion in Chemical Biology 9: 548-554; e Wang, et al., (2006) "Expand-ing the Genetic Code." Annu Rev Biophys Biomol Struct 35: 225-249; Deiters, et al, (2005) "In vivo incorporation of an alkyne into proteins in Escherichia coli". Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 15:15211524; Chin, et al., (2002) "Addition of p-Azido-L-phenylalanine to the Genetic Code of Escherichia coli." J Am Chem Soc 124: 9026-9027; e Publicação Internacional No. WO2006/034332, depositada em 20 de setembro de 2005. Detalhes adicionais são encontrados nas Patentes dos Estados Unidos No. 7.045.337; No. 7.083.970; No. 7.238.510; No. 7.129.333; No. 7.262.040; No. 7.183.082; No. 7.199.222; e No. 7.217.809.

[0069] Um "aminoácido codificado não naturalmente" se refere a um aminoácido que não é um dos aminoácidos comuns ou pirolisina, pirro- lina-carbóxi-lisina, ou selenocisteína. Outros termos que podem ser usa-dos sinonimamente com o termo "aminoácido codificado não natural-mente" são "aminoácido não naturais," "aminoácido não natural," "ami- noácido que ocorre não naturalmente," e versões diversamente hifeni- zadas e não hifenizadas destes. O termo "aminoácido codificado não naturalmente" também inclui, mas não é limitado a, aminoácidos que ocorrem por modificação (por exemplo, modificações pós-translacio- nais) de um aminoácido codificado naturalmente (incluindo, mas não li-mitado a, os 20 aminoácidos comuns ou pirrolisina, pirrolina-carbóxi-li- sina, e selenocisteína), mas não são por si naturalmente incorporados em uma cadeia de polipeptídeo em crescimento pelo complexo de trans-lação. Exemplos de tais aminoácidos que ocorrem não naturalmente in-cluem, mas não são limitados a, N-acetilglucosaminil-L-serina, N-acetil- glucosaminil-L-treonina, e O-fosfotirosina.

[0070] Um aminoácido codificado não naturalmente é tipicamente qualquer estrutura tendo qualquer cadeia lateral substituinte outra do que uma usada nos vinte aminoácidos naturais. Devido aos aminoáci- dos codificados não naturalmente da invenção tipicamente diferirem dos aminoácidos naturais somente na estrutura da cadela lateral, os amino- ácidos codificados não naturalmente formam ligações de amida com ou-tros aminoácidos, incluindo, mas não limitado a, natural ou não natural-mente codificados, na mesma maneira em que eles são formados em polipeptídeos que ocorrem naturalmente. Contudo, os aminoácidos co-dificados não naturalmente têm grupos de cadeia lateral que se distin-guem dos mesmos a partir dos aminoácidos naturais. Por exemplo, R opcionalmente compreende um grupo alquila, arila, acila, ceto, azido, hidroxila, hidrazina, ciano, halo, hidrazida, alquenila, alquinila, éter, tiol, seleno, sulfonila, borato, boronato, fosfo, fosfono, fosfina, heterocíclico, enona, imina, aldeído, éster, tioácido, hidroxilamina, amino, ou similares, ou qualquer combinação destes. Outros aminoácidos que ocorrem não naturalmente de interesse que podem ser adequados para uso na presente invenção incluem, mas não são limitados a, aminoácidos com-preendendo um reticulador fotoativável, aminoácidos etiquetados por centrifugação, aminoácidos fluorescentes, aminoácidos de ligação de metal, aminoácidos contendo metal, aminoácidos radioativos, aminoá- cidos com novos grupos funcionais, aminoácidos que interagem cova- lentemente ou não covalentemente com outras moléculas, aminoácidos fotoengaiolados e/ou foto isomerizáveis, aminoácidos compreendendo biotina ou um análogo de biotina, aminoácidos glicosilatados, tais como serina substituída com açúcar, outros aminoácidos modificados com hi-drato de carbono, aminoácidos contendo ceto, aminoácidos compreen-dendo polietileno glicol ou poliéter, aminoácidos substituídos com átomo pesado, aminoácidos quimicamente cliváveis e/ou fotocliváveis, amino- ácidos com cadeias laterais alongadas conforme comparados a amino- ácidos naturais, incluindo, mas não limitados a, poliéteres ou hodrocar- bonetos de cadeia longa, incluindo, mas não limitados a, maiores do que cerca de 5 ou maiores do que cerca de 10 carbonos, aminoácidos con-tendo açúcar ligados a carbono, aminoácidos redox-ativos, aminoácidos contendo amino tioácido, e aminoácidos compreendendo uma ou mais fração tóxica.

[0071] Os aminoácidos codificados não naturalmente exemplars que podem ser adequados para uso na presente invenção, e que são úteis para reações com polímeros solúveis em água, incluem, mas não são limitados a, aqueles com grupos carbonila, amino-óxi, hidrazina, hi- drazida, semicarbazida, azida e grupos reativos de alquino. Em algumas concretizações, aminoácidos codificados não naturalmente compreendem uma fração de sacarídeo. Exemplos de tais aminoácidos incluem N-acetil-L-glucosaminil-L-serina, N-acetil-L-galactosaminil-L-serina, N- acetil-L-glucosaminil-L-treonina, N-acetil-L-glucosaminil-L-asparagina e O-manosaminil-L-serina. Exemplos de tais aminoácidos também incluem exemplos onde a ligação-O ou -N que ocorre naturalmente entre o aminoácido e o sacarídeo é substituída por uma ligação covalente não comumente encontrada na natureza, incluindo, mas não limitada a, um alqueno, uma oxima, um tioéter, uma amida e similares. Exemplos de tais aminoácidos também incluem sacarídeos que não são comumente encontrados em proteínas que ocorrem naturalmente, tais como 2- deóxi-glicose, 2-deoxigalactose, e similares.

[0072] Outro tipo de modificação que pode opcionalmente ser intro duzido nas proteínas de ANGPTL3 da invenção (por exemplo, dentro da cadeia de polipeptídeo, ou em ou N- ou C-terminal), por exemplo, para prolongar meia-vida in vivo, é PEGilação ou incorporação de polímeros de polietileno glicol de cadeia longa (PEG). A introdução de PEG ou po-límeros de cadeia longa de PEG aumenta o peso molecular efetivo dos presentes polipeptídeos, por exemplo, para impedir rápida filtração na urina. Em algumas concretizações, um resíduo de Lisina na sequência de ANGPTL3 é conjugado em PEG diretamente, ou através de um liga- dor. Tal ligador pode ser, por exemplo, um resíduo Glu, ou um resíduo acila contendo um grupo funcional tiol para ligação à cadeia de PEG apropriadamente modificada. Um método alternativa para introdução de uma cadeia de PEG é primeiro introduzir um resíduo de Cys no C-ter- minal ou em resíduos expostos a solvente, tais como substituições para resíduos de Arg ou Lys. Este resíduo de Cys é, em seguida, fixado es-pecificamente por local a uma cadeia de PEG contendo, por exemplo, uma função de maleimida. Métodos para incorporação de PEG ou de polímeros de cadeia longa de PEG são bem conhecidos na técnica (des-critos, por exemplo, em Veronese, F. M., et al., Drug Disc. Today 10: 1451-8 (2005); Greenwald, R. B., et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 55: 21750 (2003); Roberts, M. J., et al., Adv. Drug Deliv. Rev., 54: 459-76 (2002)), os conteúdos dos quais são incorporados aqui por referência. Outros métodos de conjugações de polímero conhecidos na técnica podem também serem usados na presente invenção. Em algumas concre-tizações, poli(2-metacriloiloxietil fosforilcolina) (PMPC) é introduzida como um conjugado de polímero com as proteínas de ANGPTL3 da in-venção (ver, por exemplo, WO2008/098930; Lewis, et al., Bioconjug Chem., 19: 2144-55 (2008)). Em algumas concretizações, um conjugado de polímero contendo fosforilcolina com as proteínas de ANGPTL3 pode ser usado na presente invenção. Um técnico no assunto reconhecerá prontamente que outros conjugados de polímero biocompatíveis podem ser utilizados.

[0073] Uma abordagem alternativa mais recentemente reportada para incorporação de PEG, ou de polímeros de PEG, através da incor-poração de aminoácidos não naturais (conforme descrito acima), pode ser realizada com o presente polipeptídeos. Esta abordagem utiliza um par de tRNA/tRNA sintetase desenvolvido, e é codificado no plasmídeo de expressão pelo códon de supressor âmbar (Deiters, A, et al. (2004). Bio-org. Med. Chem. Lett. 14, 5743-5). Por exemplo, p-azidofenilalanina pode ser incorporada nos presentes polipeptídeos e, em seguida, reagida com um polímero de PEG tendo uma fração de acetileno na presença de um agente de redução e íons de cobre para facilitar uma reação orgânica conhecida como "Huisgen [3+2]cicloadição".

[0074] Em certas concretizações, a presente invenção também con templa mutações específicas das proteínas de ANGPTL3, de modo a alterar a glicosilação do polipeptídeo. Tais mutações podem ser seleci- onadas de modo a introduzir ou eliminar um ou mais locais de glicosila- ção, incluindo, mas não limitados a, locais de ligação O-ligados ou N- ligados. Em certas concretizações, as proteínas de ANGPTL3 da pre-sente invenção têm locais de glicosilação e padrões inalterados relativos às proteínas de ANGPTL3 que ocorrem naturalmente. Em certas concretizações, uma variante de proteínas de ANGPTL3 inclui uma va-riante de glicosilação no qual o número e/ou tipo de locais de glicosila- ção foram alterados relativos às proteínas de ANGPTL3 que ocorrem naturalmente. Em certas concretizações, uma variante de um polipeptí- deo compreende um maior ou um menor número de locais de glicosila- ção N-ligados relativos a um polipeptídeo nativo. Um local de glicosila- ção N-ligado é caracterizado pela sequência: Asn-X-Ser ou Asn-X-Thr, no qual o resíduo de aminoácido designado como X pode ser qualquer resíduo aminoácido, exceto prolina. A substituição de resíduos de ami- noácido para criar esta sequência proporciona um potencial novo local para a adição de uma cadeia de hidrato de carbono N-ligada. Alternati-vamente, as substituições que eliminam esta sequência removerão uma cadeia de hidrato de carbono N-ligada existente. Em certas concretiza-ções, um rearranjo de cadeias de hidrato de carbono N-ligadas é pro-porcionado, no qual um ou mais locais de glicosilação N-ligados (tipica-mente aqueles que estão ocorrendo naturalmente) são eliminados e um ou mais novos locais N-ligados são criados.

[0075] Variantes de proteínas de ANGPTL3 exemplares incluem variantes de cisteína no qual um ou mais resíduos de cisteína são anulados de ou substituídos por outro aminoácido (por exemplo, serina) relativos à sequência de aminoácido das proteínas de ANGPTL3 que ocorrem naturalmente. Em certas concretizações, variantes de cisteína podem ser úteis quando as proteínas de ANGPTL3 devem ser redobradas em uma conformação biologicamente ativa, tal como após o isolamento de corpos de inclusão insolúveis. Em certas concretizações, as variantes de cisteína têm menos resíduos de cisteína do que o polipeptídeo nativo. Em certas concretizações, as variantes de cisteína têm um ainda número de resíduos de cisteína para minimizar interações resultantes de cisteínas não emparelhadas.

[0076] Em algumas concretizações, variantes funcionais ou formas modificadas das proteínas de ANGPTL3 incluem proteínas de fusão de uma proteína de ANGPTL3 da invenção e um ou mais domínios de fusão. Exemplos bem conhecidos de domínios de fusão incluem, mas não são limitados a, poli-histidina, Glu-Glu, glutationa S transferase (GST), tioredoxina, proteína A, proteína G, uma região constante de cadeia pe-sada de imunoglobulina (Fc), proteína de ligação de maltose (MBP), e/ou albumina do soro humano (HSA). Um domínio de fusão, ou um fragmento deste, pode ser selecionado de modo a conferir uma propriedade desejada. Por exemplo, alguns domínios de fusão são particularmente úteis para o isolamento das proteínas de fusão por cromatografia de afinidade. Para a proposta de purificação de afinidade, matrizes re-levantes para cromatografia de afinidade, tais como resinas conjugadas a glutationa, amilase, e níquel ou cobalto, são usadas. Muitas de tais matrizes são disponíveis em forma de "kit", tal como o sistema de puri-ficação Pharmacia GST e o sistema QLAexpressTM (Qiagen) úteis com padrões de fusão (HIS6). Como outro exemplo, um domínio de fusão pode ser selecionado de modo a facilitar a detecção das proteínas de ANGPTL3. Exemplos de tais domínios de detecção incluem as várias proteínas fluorescentes (por exemplo, GFP) bem como "etiquetas de epítopo", que são usualmente sequências de peptídeo curtas para qual um anticorpo específico é disponível. Etiquetas de epítopo bem conhe-cidas para qual anticorpos monoclonais específicos são principalmente disponíveis incluem FLAG, hemaglutinina do vírus da gripe (HA), e eti-quetas c-myc. Em alguns casos, os domínios de fusão têm um local de clivagem de protease, tais como para Fator Xa ou Trombina, que permi-tem que a protease relevante digira parcialmente as proteínas de fusão e, desse modo, liberem as proteínas recombinantes destas. As proteínas liberadas podem, em seguida, serem isoladas a partir do domínio de fusão por separação cromatográfica subsequente. Em certas concre-tizações, uma proteína de ANGPTL3 é fundida com um domínio que estabiliza a proteína de ANGPTL3 in vivo (um domínio "estabilizador"). Por "estabilização" é significativo que o aumento da meia-vida do soro, indiferente de se este é devido a destruição diminuída, diminui a liberação pelo rim, ou outro efeito farmacocinético. Fusões com a porção Fc de uma imunoglobulina são conhecidas por conferir propriedades far- macocinéticas desejáveis em uma ampla faixa de proteínas. Do mesmo modo, fusões em albumina do soro humano podem conferir propriedades desejáveis. Outros tipos de domínios de fusão que podem ser sele-cionados incluem domínios de multimerização (por exemplo, dimeriza- ção, tetramerização) e domínios funcionais (que conferem uma função biológica adicional, conforme desejado). Fusões podem ser construídos tal que o peptídeo heterólogo é fundido no amino terminal de um poli- peptídeo da invenção e/ou no carbóxi terminal de um polipeptídeo da invenção.

[0077] Ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos resistentes à protease similares à angiopoietina-3

[0078] A invenção também proporciona ácidos nucleicos que codifi cam polipeptídeos resistentes à protease da invenção e vetores de ex-pressão e células hospedeiras para expressão de um polipeptídeo re-sistente à protease. Em outros aspectos, a invenção proporciona um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo da invenção e vetores de expressão e células hospedeiras compreendendo tal polinucleotídeo. Em algumas concretizações, o polinucleotídeo é otimizado para expressão nas células hospedeiras. Em algumas concretizações, a invenção proporciona um método de melhora ou prevenção de artrite ou dano da articulação em um paciente humano, o método compreendendo: admi-nistrar a uma articulação do paciente um vetor de expressão que codifica um polipeptídeo da invenção, pelo que a expressão do polipeptídeo melhora ou impede artrite ou dano da articulação no paciente. Em algu-mas concretizações, o paciente tem artrite ou dano da articulação. Em algumas concretizações, o indivíduo não tem, mas está em risco de ar-trite ou dano da articulação. Em algumas concretizações, a artrite é os- teoartrite, artrite por trauma, ou artrite autoimune.

[0079] A expressão de polipeptídeos da invenção emprega técnicas de rotina no campo de genéticos recombinantes. Textos básicos reve-lando os métodos gerais nesta invenção incluem Sambrook and Russell eds. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition; as séries Ausubel et al. eds. (2007 com atualização a 2010) Current Proto-cols in Molecular Biology, entre outros conhecidos na técnica.

[0080] A expressão pode empregar quaisquer células hospedeiras apropriadas conhecidas na técnica, por exemplo, células hospedeiras de mamífero, células hospedeiras bacteriais, células hospedeiras de le-vedura, células hospedeiras de inseto, etc. Ambos sistemas de expres-são procarióticos e eucarióticos são amplamente disponíveis. Em algu-mas concretizações, o sistema de expressão é uma expressão de célula de mamífero, tal como um sistema de expressão de célula CHO. Em algumas concretizações, um ácido nucleico pode ser otimizado por có- don para facilitar expressão em uma célula hospedeira desejada.

[0081] Vetores e sistemas não virais incluem vetores de plasmídeo e epissomal, tipicamente compreendendo um cassete de expressão para expressão de uma proteína ou RNA, e cromossomos artificiais humanos (ver, por exemplo, Harrington et al., Nat Genet 15:345, 1997). Por exemplo, vetores não virais úteis para expressão do polipeptídeos da invenção em células de mamífero (por exemplo, humani) incluem pThioHis A, B & C, pcDNA3. I/His, pEBVHis A, B & C (Invitrogen, San Diego, CA), vetores de MPSV, e numerosos outros vetores conhecidos na técnica para expressão de outras proteínas. Vetores virais úteis in-cluem, mas não são limitados a, vetores baseados no adenovírus, vírus adenoassociados, vírus da herpes, vetores baseados no SV40, vírus papiloma, vírus HBP Epstein Barr, vetores de fowpox, vetores de vírus de vaccinia e vírus Semliki Forest (SFV).

[0082] A escolha de vetor de expressão depende das células hos pedeiras pretendidas em que o vetor é para ser expresso. Tipicamente, os vetores de expressão contêm um promotor e outras sequências re- gulatórias (por exemplo, intensificadores) que são operavelmente ligadas aos polinucleotídeos que codificam um polipeptídeo da invenção. Em algumas concretizações, um promotor induzível é empregado para impedir expressão das sequências inseridas, exceto sob condições de indução. Os promotores indizíveis incluem, por exemplo, arabinose, lacZ, um promotor de metalotioneina, promotores de glucocorticoide, ou um promotor de choque de calor. Em adição, outros elementos regula- tórios podem também serem incorporados para aperfeiçoar expressão de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo da invenção, por exemplo, intensificadores, local de ligação ribossomal, sequências de terminação de transcrição, e similares.

[0083] Em algumas concretizações, um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo da invenção pode também incluir uma sequência que codifica uma sequência de sinal de secreção de modo que o polipeptí- deo é secretado a partir da célula hospedeira. Tal sequência pode ser proporcionada pelo vetor, ou como parte do ácido nucleico de ANGPTL3 que está presente no vetor.

[0084] Métodos para introdução de vetores de expressão contend a sequência de polinucleotídeos de interesse variam dependendo do tipo de hospedeiro celular. Por exemplo, transfecção de cloreto de calico é comumente utilizada para células procarióticas, onde tratamento com fosfato de cálcio, ou eletroporação, pode ser usado para outros hospe-deiros celulares (ver geralmente Sambrook et al., supra). Outros méto-dos incluem, por exemplo, eletroporação, tratamento com fosfato de cál-cio, transformação mediada por lipossoma, injeção e microinjeção, mé-todos balísticos, virossomos, imunolipossomos, policátion: conjugados de ácido nucleico, DNA nu, virions artificiais, fusão à proteína estrutural do vírus da herpes VP22, entrada intensificada de agente de DNA, e transição ex vivo. Para longo prazo, a produção de alto rendimento de proteínas recombinantes, expressão estável será frequentemente dese-jada. Por exemplo, linhas de célula que expressam estavelmente os po- lipeptídeos da invenção podem ser preparadas usando vetores de ex-pressão da invenção que contêm origens virais de replicação ou ele-mentos de expressão endógenos e um gene de marcador selecionável.

[0085] Em algumas concretizações, os ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos resistentes à protease de ANGPTL3 da invenção po-dem ser distribuídos a um paciente para tratamento de um dano ou do-ença relacionada à articulação. A distribuição de tais ácidos nucleicos pode ser alcançada usando qualquer meio conhecido na técnica, mas é tipicamente realizada usando injeção direta na articulação afetada. Em algumas concretizações, um DNA é distribuído como DNA nu usando injeção direta na articulação. Em algumas concretizações, um vetor viral é empregado, incluindo, mas não limitado a, um adenovírus ou vetor associado a adenovírus, um vetor do vírus da herpes, um vírus de fowl-pox, ou um vetor de vírus de vaccinia.

Métodos de uso terapêutico de polipeptídeos, e indicações

[0086] Os métodos proporcionados da invenção incluem um método de tratamento de um indivíduo compreendendo administrar ao in-divíduo uma quantidade terapeuticamente efetiva de um polipeptídeo da invenção, no qual o indivíduo tem ou está em risco de dano articular ou artrite. A invenção também proporciona um método de melhora ou pre-venção de artrite ou dano da articulação em um paciente humano, o método compreendendo: administrar a uma articulação do paciente uma composição compreendendo uma quantidade efetiva de um poli- peptídeo da invenção, melhorando ou impedindo, desse modo, artrite ou dano da articulação no paciente. Em algumas concretizações, o paciente tem artrite ou dano da articulação. Em algumas concretizações, o indivíduo não tem, mas está em risco de, artrite ou dano da articulação. Em algumas concretizações, a artrite é osteoartrite, artrite por trauma, ou artrite autoimune. Em algumas concretizações, a composição administrada compreende adicionalmente ácido hialurônico.

[0087] Em outro aspecto, a invenção proporciona um método de in dução de diferenciação de células tronco mesenquimais em condróci- tos, o método compreendendo contatar células tronco mesenquimais com uma quantidade suficiente de um polipeptídeo da invenção para induzir diferenciação das células troncos em condrócitos. Em algumas concretizações, o método é realizado in vivo, e as células troncos estão presentes em um paciente humano.

[0088] É contemplado que polipeptídeos, composições, e métodos da presente invenção podem ser usados para tratar, melhorar ou prevenir qualquer tipo de dano de cartilagem articular (por exemplo, dano articular ou injúria) incluindo, por exemplo, dano que ocorre de um evento traumático ou desgaste de tendão ou de ligamento. Em algumas con-cretizações, as proteínas da invenção são administradas para prevenir ou melhorar artrite ou dano articular, por exemplo, onde existe uma história genética ou de família de artrite ou dano articular, ou dano da articulação, ou antes ou durante cirurgia de articulação. Em algumas concretizações, polipeptídeos, composições e métodos são usados para tratar dano articular. Em concretizações particulares, dano articular é dano da articulação traumático. Em outras concretizações, dano articular é dano que ocorre da idade ou inatividade. Em ainda outras concre-tizações, dano articular é dano que ocorre de um distúrbio autoimune. Em algumas concretizações da invenção, polipeptídeos, composições, e métodos da presente invenção podem ser usados para tratar, melhorar ou prevenir osteoartrite. Em algumas concretizações, os polipeptí- deos, composições e métodos são usados para melhorar ou prevenir artrite em um indivíduo em risco de ter ou adquirir artrite. Em algumas concretizações, os polipeptídeos, composições e métodos são usados para melhorar ou prevenir dano articular em um indivíduo em risco de ter ou adquirir dano articular.

[0089] Em algumas concretizações, polipeptídeos, composições, e métodos da presente invenção proporcionam um método para estimu-lação de proliferação de condrócito e produção de cartilagem em tecidos cartilagenosos que foram danificados, por exemplo, devido a dano trau-mático ou condropatia. Em concretizações particulares, polipeptídeos, composições, e métodos da presente invenção são úteis para tratamento de dano de cartilagem em articulações, por exemplo, em superfícies articuladas, por exemplo, coluna, ombro, cotovelo, pulso, articulações dos dedos, quadril, joelho, tornozelo, e articulações dos pés. Exemplos de doenças ou distúrbios que podem se beneficiar de tratamento incluem osteoartrite, artrite reumatoide, outras doenças autoimu- nes, ou osteocondrite. Em adição, dano ou rompimento da cartilagem ocorre como um resultado de certos distúrbios genéticos ou metabólicos, malformação da cartilagem é frequentemente vista em formas de nanismo em humanos, e/ou dano ou rompimento de cartilagem é fre-quentemente um resultado de cirurgia reconstrutiva; desse modo, poli- peptídeos, composições, e métodos seriam terapia útil nestes pacientes, se sozinha ou em conjunto com outras abordagens.

[0090] É adicionalmente contemplado que polipeptídeos, composições, e métodos da presente invenção podem ser usados para tratar, melhorar ou prevenir vários distúrbios cartilagenosos e/ou sintomas as-sociados, ou efeitos de tais condições. Condições ou distúrbios exem-plares para tratamento, melhora e/ou prevenção com polipeptídeos, composições, e métodos da invenção, incluem, mas não são limitados a, lúpus sistêmico eritematoso, artrite reumatoide, artrite crônica juvenil, osteoartrite, doença de disco degenerativa, espondiloartropatias, sín- drome de Ehlers Danlos, esclerose sistêmica (escleroderma), ou doença de tendão. Outras condições ou distúrbios que podem se beneficiar de tratamento com polipeptídeos para melhora de efeitos associados incluem miopatias inflamatórias idiopáticas (dermatomiosite, polimi- osite), síndrome de Sjogren, vasculite sistêmica, sarcoidose, anemia he- molítica autoimune (pancitopenia imune, hemoglobinúria noturna paro-xismal), trombocitopenia imune (púrpura trombocitopênica idiopática, trombocitopenia imune-mediada), tiroidite (doença Grave, tiroidite de Hashimoto, tiroidite linfocítica juvenil, tireoidite atrófica), diabetes melli- tus, doença renal imune-mediada (glomerulonefrite, nefrite tubulointers- ticial), doenças de demielinação dos sistemas nervosos central e peri-férico, tais como esclerose múltipla, polineuropatia de demielinação idi- opática ou síndrome de Guillain-Barr, e polineuropatia de demielinação inflamatória crônica, doenças hepatobiliares, tais como hepatites infeci-osas (hepatite A, B, C, D, E e outros vírus não hepatotrópicos), hepatite ativa crônica autoimune, cirrose biliar primária, hepatite granulomatosa, e colangite esclerosante, doença inflamatória do intestino (colite ulcera- tiva: doença de Crohn), enteropatia sensível á glúten, e doença de Whipple, doenças da pele autoimune ou imune-mediada, incluindo do-enças da pele bulhosa, eritema multiforme e dermatite de contato, pso- ríase, doenças alérgicas, tais como asma, rinite alérgica, dermatite ató- pica, hipersensibilidade a alimento, e urticária, doenças imunológicas do pulmão, tais como pneumonias eosinofílicas, fibrose pulmonar idiopá- tica e pneumonite de hipersensibilidade, doenças associadas a transplante, incluindo rejeição de enxerto, e doença de enxerto-versus-hos- pedeiro.

[0091] Um "paciente", conforme aqui usado, se refere a qualquer indivíduo que é administrado um polipeptídeo terapêutico da invenção. É contemplado que polipeptídeos, composições, e métodos da presente invenção podem ser usados para tratar um mamífero. Conforme aqui usado, um "indivíduo" se refere a qualquer mamífero, incluindo humanos, animais domésticos e de fazenda, e zoo, esportes ou animais de estimação, tal como gado (por exemplo, vacas), cavalos, cães, ovelha, porcos, coelhos, cabras, gatos, etc. Em algumas concretizações da in-venção, o indivíduo é um humano. Em certas concretizações, o indivíduo é um cavalo. Em outras concretizações, o indivíduo é um cão.

[0092] Em algumas concretizações, os polipeptídeos da invenção podem ser heterolólogos ao mamífero a ser tratado. Por exemplo, uma proteína de ANGPTL3 humana ou fragmentos desta, uma proteína ou peptídeo derivado de uma proteína de ANGPTL3 humana (por exemplo, uma proteína de ANGPTL3 humana modificada, uma variante conser- vativa de proteína de ANGPTL3 humana, um peptidomimético derivado de uma proteína de ANGPTL3 humana) são usados no tratamento de um animal, tal como um equino, bovino ou canino. Em algumas concre-tizações, uma proteína de ANGPTL3 heterólodga pode ser usada para expandir populações de condrócito em cultura para transplante. Em al-gumas concretizações, as culturas expandidas, em seguida, serão op-cionalmente misturadas com polipeptídeos e composições homólogos ao mamífero a ser tratado, e colocados no espaço da articulação, ou diretamente no defeito da cartilagem. Alternativamente, os polipeptídeos da invenção são derivados a partir da mesma espécie, isto é, uma pro- teína de ANGPTL3 humana, ou fragmentos desta, uma proteína ou pep- tídeo derivado de uma proteína de ANGPTL3 humana (por exemplo, uma proteína de ANGPTL3 humana modificada, uma variante conser- vativa de proteína de ANGPTL3 humana, um peptidomimético derivado de uma proteína de ANGPTL3 humana), é usado no tratamento de um paciente humano. Pelo uso de uma proteína derivada a partir da mesma espécie de mamífero conforme está sendo tratada, respostas imunes inadvertentes podem ser evitadas.

[0093] Em algumas concretizações, polipeptídeos e composições da presente invenção são aplicados por injeção direta no fluido sinovial de uma articulação, administração sistêmica (oral ou intravenosamente), ou diretamente em um defeito de cartilagem, ou sozinhos ou complexados com um transportador adequado para liberação prolongada de proteína. Em algumas concretizações, os polipeptídeos ou composições são administrados em uma matriz biocompatível ou su-porte. Os polipeptídeos, composições, e métodos da presente invenção podem também serem usados em conjunto com um procedimento cirúr-gico a uma articulação afetada. A administração de um polipeptídeo da invenção pode ocorrer antes de, durante, ou em conjunto com, e/ou após um procedimento cirúrgico. Por exemplo, polipeptídeos, composições e métodos da invenção podem ser usados para expandir populações de condrócito em cultura para implante de condrócito autólogo ou alogênico (ACI). Os condrócitos podem ser opcionalmente implantados com tratamento concorrente consistindo em administração de polipeptí- deos e composições da presente invenção. Nestes procedimentos, por exemplo, os condrócitos podem ser coletados artroscopicamente de uma área de suporte de carga menor que não sofreu dano de uma articulação danificada, e podem ser cultivados in vitro, opcionalmente na presença de polipeptídeos e composições da presente invenção, e/ou outros fatores de crescimento para aumentar o número de células antes do transplante. As culturas expandidas são, em seguida, opcionalmente misturadas com polipeptídeos e composições da presente invenção, e/ou colocadas no espaço da articulação, ou diretamente no defeito. Em certas concretizações, as culturas expandidas (opcionalmente com po- lipeptídeos da presente invenção), são colocadas no espaço da articu-lação suspensa em uma matriz ou membrana. Em outras concretizações, os polipeptídeos e composições da presente invenção podem ser usadas em combinação com um ou mais enxertos periosteal ou peri- condrial que contêm células de formação de cartilagem, e/ou ajudam manter os condrócitos transplantados ou células precursoras de condró- cito no lugar. Em algumas concretizações, os polipeptídeos e composições da presente invenção são usados para reparar dano da cartilagem em conjunto com outros procedimentos, incluindo, mas não limitados a, lavagem de uma articulação, estimulação da medula óssea, artroplastia de abrasão, perfuração subcondral, ou microfratura de osso subcondral proximal. Opcionalmente, seguindo administração de polipeptídeos e composições da presente invenção e crescimento de cartilagem, trata-mento cirúrgico adicional pode ser benéfico para contornar adequada-mente superfície(s) de cartilagem recentemente formada(s).

Composições farmacêuticas

[0094] Composições terapêuticas compreendendo os polipeptídeos proporcionados estão dentro do escopo da presente invenção, e são especificamente contemplados à luz da identificação de várias sequên-cias de polipeptídeo que exibem estabilidade intensificada e resistência á protease. Desse modo, em um aspecto adicional, a invenção proporciona uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente efetiva de um polipeptídeo da invenção. Em certas concretizações, composições farmacêuticas compreendem adicional-mente um transportador farmaceuticamente ou fisiologicamente aceitá- vel. Em algumas concretizações, uma composição farmacêutica com-preende adicionalmente um ácido hialurônico ou um derivado deste.

[0095] Em adição, a invenção proporciona um método de melhora ou prevenção de artrite ou dano da articulação em um paciente humano, o método compreendendo: administrar a uma articulação do paciente uma composição compreendendo uma quantidade efetiva de um poli- peptídeo da invenção, desse modo, melhorando ou prevenindo artrite ou dano da articulação no paciente. Em algumas concretizações, o paciente tem artrite ou dano da articulação. Em algumas concretizações, o indivíduo não tem, mas está em risco de, artrite ou dano da articulação. Em algumas concretizações, a artrite é osteoartrite, artrite por trauma, ou artrite autoimune. Em algumas concretizações, a composição administrada compreende adicionalmente ácido hialurônico.

[0096] Em outro aspecto, a invenção proporciona um método de in dução de diferenciação de células troncos mesenquimais em condróci- tos, o método compreendendo, contatar células troncos mesenquimais com uma quantidade suficiente de um polipeptídeo da invenção, para induzir diferenciação das células troncos em condrócitos. Em algumas concretizações, o método é realizado in vivo, as células troncos estão presentes em um paciente humano, e o contato compreende administrar a uma articulação do paciente uma composição compreendendo uma quantidade efetiva de um polipeptídeo da invenção, induzindo, desse modo, diferenciação de células troncos em condrócitos, e geração de cartilagem.

[0097] As composições terapêuticas compreendendo ácidos nuclei-cos que codificam polipeptídeos da invenção podem ser distribuídas a um paciente para tratamento de um dano ou doença relacionada à arti-culação, e estão também dentro do escopo da presente invenção. Em algumas concretizações, as composições farmacêuticas compreendem um DNA nu que codifica um polipeptídeo da invenção. Em algumas con-cretizações, um vetor viral é empregado para efetuar distribuição, e uma composição farmacêutica compreende um vetor que codifica um poli- peptídeo da invenção, incluindo, mas não limitados a, um adenovírus ou vetor associado a adenovírus, um vetor do vírus da herpes, vírus de fowlpox, ou um vetor de víruis da vaccinia. As composições farmacêuti-cas compreendem uma quantidade terapeuticamente efetiva de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo da invenção com um transportador farmaceuticamente ou fisiologicamente aceitável.

[0098] Em outro aspecto da presente invenção, polipeptídeos pro porcionados para uso como um medicamento para tratamento de dano articular, são contemplados. Em certas concretizações, polipeptídeos da invenção para uso como um medicamento para melhora de artrite ou dano articular, são proporcionados. Em algumas concretizações, a artrite é osteoartrite, artrite por trauma, ou artrite autoimune. Em algumas concretizações, o dano articular é dano da articulação traumático, dano autoimune, dano relacionado a idade, ou dano relacionado a inatividade. Em outras concretizações, o ácido nucleico que codifica um poli- peptídeo da invenção para uso em um medicamento, é proporcionado.

[0099] Formulações adequadas para administração incluem excipi-entes, incluindo, mas não limitados a, soluções aquosas e não aquosas, soluções estéreis isotônicas, que podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostatos, e solutos que tornam a formulação isotônica, e suspen-sões estéreis aquosas e não aquosas que podem incluir agentes de suspensão, solubilizadores, agentes de espessamento, estabilizadores, e conservantes. Em certas concretizações, as composições farmacêuticas compreendem uma quantidade terapeuticamente efetiva de um peptídeo em mistura com um agente de formulação farmaceuticamente acetável selecionado para adequabilidade com o modo de administração, formato de distribuição, e dosagem desejada. Ver, por exemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences (18th Ed., A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company 1990), e edições subsequentes do mesmo. O veículo primário ou transportador em uma composição farmacêutica pode ser aquoso ou não aquoso na natureza. Por exemplo, um veículo ou transportador adequado para injeção pode ser água, solução de salina fisiológica, ou fluido artificial cérebro-espinhal, opcionalmente suple-mentado com outros materiais comuns em composições para adminis-tração parenteral. Por exemplo, tampões podem ser usados, por exem-plo, para manter a composição a pH fisiológico, ou a um pH levemente mais baixo, tipicamente dentro de uma faixa de cerca de pH 5 a cerca de pH 8, e pode, opcionalmente, incluir sorbitol, albumina de soro, de-tergente, ou outro componente adicional. Em certas concretizações, as composições farmacêuticas compreendendo polipeptídeos, ou um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo da invenção, podem ser preparadas para armazenagem em uma forma liofilizada usando excipi- entes apropriados (por exemplo, sacarose).

[00100] Em ainda outras concretizações, a formulação com um agente, tais como microesferas injetáveis, partículas bioerodíveis, compostos poliméricos, contas, ou lipossomos, ou outra matriz biocompatí- vel que proporcionam liberação controlada ou sustentada do polipeptí- deo ou um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo da invenção, pode, em seguida, ser distribuída, via uma injeção de depósito. Por exemplo, os polipeptídeos ou ácido nucleico que codifica um polipeptí- deo da invenção, podem ser encapsulados em lipossomos, ou formulados como micropartículas ou microcápsulas, ou podem ser incorporados em outros veículos, tais como polímeros biodegradáveis, hidrogéis, ciclodextrinas (ver, por exemplo, Gonzalez et al., 1999, Bioconjugate Chem., 10, 1068-1074; Wang et al., Publicações Internacionais PCT Nos. WO 03/47518 e WO 03/46185), ácido poli(láctico-co-glicólico) (PLGA), e microesferas de PLCA (ver, por exemplo, Patente dos Estados Unidos No. 6.447.796 e Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos No. US 2002130430), nanocápsulas biodegradáveis, e mi- croesferas bioadesivas, ou por vetores proteináceos (O'Hare and Nor-mand, Publicação Internacional PCT No. WO 00/53722), ou pelo uso de conjugados. Ainda outros mecanismos de distribuição adequados in-cluem dispositivos de distribuição implantáveis.

[00101] A dose de um composto da presente invenção para tratamento das doenças ou distúrbios acima mencionados varia, dependendo da maneira de administração, a idade e/ou o peso corpóreo do indivíduo, e a condição do indivíduo a ser tratada, e finalmente será decidida pelo médico ou veterinário. A dose administrada a um indivíduo, no contexto da presente invenção, deve ser suficiente para afetar uma resposta benéfica no indivíduo com o tempo. Tal dose é uma "quantidade terapeuticamente efetiva". Consequentemente, uma dose apropriada pode ser determinada pela eficiência da proteína particular ou um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo da invenção empregado, e a condição do indivíduo, bem como o peso corpóreo ou área superficial da área a ser tratada. O tamanho da dose também será determinado pela existência, natureza, e extensão de qualquer efeito colateral adverso que acompanha a administração da propeína particular ou vetor em um indivíduo particular. A administração pode ser acompanhada, via doses únicas ou divididas, ou como uma infusão contínua, via um dispositivo de implantação ou cateter. A frequência de dosagem depende dos parâmetros farmacocinéticos do polipeptídeo ou um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo da invenção na formulação usada. Um clínico pode titular a dosagem e/ou modificar a administração, para alcançar os efeitos terapêuticos desejados. Uma dosagem típica varia de cerca de 0,01 μg/kg a cerca de 100 mg/kg, dependendo dos fatores. Em certas concretizações, uma dosagem varia de cerca de 0,1 μg/kg até cerca de 10 mg/kg; ou cerca de 0,1 μg/kg; cerca de 0,5 μg/kg; cerca de 1 μg/kg; cerca de 2 μg/kg; cerca de 5 μg/kg; cerca de 10 μg/kg; cerca de 15 μg/kg; cerca de 20 μg/kg; cerca de 25 μg/kg; cerca de 30 μg/kg; cerca de 35 μg/kg; cerca de 40 μg/kg; cerca de 45 μg/kg; cerca de 50 μg/kg; cerca de 55 μg/kg; cerca de 60 μg/kg; cerca de 65 μg/kg; cerca de 75 μg/kg; cerca de 85 μg/kg; cerca de 100 μg/kg. Em certas concre-tizações, uma dosagem é cerca de 50 μg/kg; cerca de 100 μg/kg; cerca de 150 μg/kg; cerca de 200 μg/kg; cerca de 250 μg/kg; cerca de 300 μg/kg; cerca de 350 μg/kg; cerca de 400 μg/kg; cerca de 450 μg/kg; cerca de 500 μg/kg; cerca de 550 μg/kg; cerca de 600 μg/kg; cerca de 650 μg/kg; cerca de 700 μg/kg; cerca de 750 μg/kg; cerca de 800 μg/kg; cerca de 850 μg/kg; cerca de 900 μg/kg; cerca de 950 μg/kg; cerca de 1 mg/kg; cerca de 2 mg/kg; cerca de 3 mg/kg; cerca de4 mg/kg; cerca de 5 mg/kg; cerca de 6 mg/kg; cerca de 7 mg/kg; cerca de 8 mg/kg; cerca de 9 mg/kg; cerca de 10 mg/kg.

Métodos de Administração

[00102] Qualquer método para distribuição das proteínas ou um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo da invenção a uma articulação afetada, pode ser usado. Na prática desta invenção, as composições podem ser parenteralmente administradas, por exemplo, injetadas, por exemplo, intra-articularmente (isto é, em uma articulação), intrave-nosamente, intramuscularmente, subcutaneamente; infundida, ou im-plantada, por exemplo, em uma membrana, matriz, dispositivo, etc. Quando injetada, infundida ou implantada, a distribuição pode ser dire-cionada no tecido adequado ou articulação, e distribuição pode ser dis-tribuição de bolo direta ou distribuição contínua. Em algumas concreti-zações, a distribuição pode ser em um tecido adequado localizado em proximidade a uma articulação afetada. Em algumas concretizações, a distribuição pode ser, via difusão, ou via bolo de liberação regulada. Em algumas concretizações, um sistema de liberação controlada (por exemplo, uma bomba) pode ser colocado em proximidade do alvo tera-pêutico, por exemplo, a articulação a qual o polipeptídeo é administrado. Em outras concretizações, as composições podem ser selecionadas para ingestão, por exemplo, inalação ou distribuição oral.

[00103] Os polipeptídeos terapêuticos, ou um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo da invenção, podem também serem usados efetivamente em combinação com um ou mais agentes ativos adicionais (por exemplo, ácido hialurônico, ou um derivado ou sal deste, fator de crescimento (por exemplo, FGF18, BMP7), agente condrogênico (por exemplo, calcitonina de salmão oral, SD-6010 (inibidor de iNOS), vitamina D3 (coliecalciferol), hidrolisato de colágeno, rusalatide acetato, in- saponificáveis de abacate-soja (ASU), um composto descrito em WO2012/129562, cartogenina), um esteroide, um agente anti-inflama- tório não esteroidal (NSAID), etc.), dependendo da terapia desejada, ou efeito para aperfeiçoar ou intensificar o efeito terapêutico destes. Este processo pode envolver administrar ambos agentes ao paciente ao mesmo tempo, ou como uma composição simples, ou formulação farmacológica que inclui ambos agentes, ou por administração de duas composições ou formulação distintas, no qual uma composição inclui um polipeptídeo ou um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo da invenção, e o outro inclui o(s) segundo(s) agente(s). A administração de uma composição terapêutica compreendendo um polipeptídeo ou um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo da invenção pode preceder, ou seguir administração do segundo agente por intervalos variando de minutos a semanas.

[00104] As formulações de compostos podem ser armazenadas em frascos estéreis como uma solução, suspensão, gel, emulsão, sólido, ou como um pó desidratado ou liofilizado. As formulações podem ser apresentadas em recipientes vedados de dose unitária ou de multidose, tais como ampolas e fracos. Em algumas concretizações, as formula-ções podem ser apresentadas em seringas simples ou de multicâmaras pré-enchidas (por exemplo, seringas de líquido, lisoseringas). Soluções e suspensões podem ser preparadas de pós estéreis, grânulos, e com-primidos do tipo previamente descritos.

[00105] Também proporcionados são kits compreendendo os poli- peptídeos, ou um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo da presente invenção. Em uma concretização, são proporcionados kits para produção de uma unidade de administração de dose única. O kit compreende um primeiro recipiente compreendendo um polipeptídeo secado, ou um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo da invenção, e um segundo recipiente tendo uma fórmula de reconstituição aquosa. Em certas concretizações, um recipiente compreende uma seringa pré-en- chida de câmara única. Em outras concretizações, os recipientes são envolvidos como uma seringa pré-enchida de câmaras múltiplas.

Exemplificação

[00106] Os seguintes exemplos são oferecidos para ilustrar, mas não limitar a invenção reivindicada.

Exemplo 1: Construtos de peptídeo de ANGPTL3 resistente à protease

[00107] Vários mutantes de truncamento N-terminais foram construídos para remover glicosilações O-ligadas e facilitar a caracterização de proteína biofísica. Para identificar os peptídeos resistentes à protease, as substituições de aminoácido foram introduzidas em várias posições de fragmentos de peptídeo de Angptl3 humana correspondente a região C-terminal do peptídeo. A Figura 1 mostra posições de mutações na An- gptl3 humana. Os construtos foram inicialmente preparados com etique-tas His. As proteínas mutantes foram: 225-460 K423Q (225KQ), 225460 S424T(225ST), 226-460 K423Q (226KQ), 226-460 K423S (226KS), 228-460 K423Q (228KQ), 228-460 S424T (228ST), 233-460 K423Q (233KQ), 233-460 K423S (233KS), 241-460 K423Q (241KQ), 241-460 K423S (241KS), 241-460 Kdel (241Kdel), 242-460 K423Q (242KQ), 242-460 K423S (242KS) e 242-460 Kdel (242Kdel).

[00108] As proteínas His-etiquetadas foram expressas em células HEK FreestyleTM e purificadas por cromatografia de coluna Ni-NTA. Os construtos C-terminais Tag-less foram também clonados, purificados pelo método previamente descrito (Gonzalez R et al PNAS 2010). Bre-vemente, a proteína alvo com sequência de sinal (1-16) foi clonada em um vetor de expressão de mamífero com promotor de citomegalovírus. A 96 horas após transfecção de DNA/PEI em HEK 293 Freestyle (Invi- trogen), meio contendo proteína alvo secretada foi coletado e purificado por coluna Hi-Trap SP (GE Healthcare). A proteína foi eluída entre 50 mM de MES (pH 6,0), 125 mM de NaCl a 50 mM de MES (pH 6,0), 150 mM de NaCl. SDS-PAGE confirmou que a proteína purificada foi pelo menos 95% pura.

[00109] A resistência á protease foi avaliada conforme segue. A trip- sinólise limitada foi realizada por incubação de 10 ng de cada proteína preparada com tripsina a razão de massa de 8000:1 (Proteína:Tripsina) por 1 hora à temperatura ambiente. A reação de tripsinólise foi, em se-guida, suprimida por adição de ácido acético para trazer a reação a pH 3,0, e as amostras suprimidas foram analisadas por LC/MS. Um pico de RP HPLC de 5 min correspondente a massa dos 43 aminoácidos C- terminais (S424-E460) foi evidente para os respectivos construtos de proteína tipo selvagem. O local de clip estava no mesmo local, isto é, entre K423 e S424, conforme observado durante a produção de proteína de ANGPLT3 tipo selvagem de comprimento total. Este pico estava ausente quando o Lys no local de clip site foi mudado para Gln. Cada um dos construtos de peptídeo 225KQ, 228KQ, 233KQ, 233KS, 241KQ, e 242KQ; e o peptídeo 225 tipo selvagem foram preparados e analisados. O pico correspondente à massa dos 43 aminoácidos C-terminais estava ausente quando o Lys no local de clip foi mutado para Gln, ou Ser para cada um dos construtos, ou quando o Lys na posição 423 foi anulado.

Exemplo 2: Ensaios de ligação de integrina

[00110] αVβ3 integrina Peptídeos 225KQ, 228KQ, 233KQ, 241KQ e 242KQ preparados foram testados in vitro para ligação a αVβ3 integrina. Brevemente, placas Maxisorp foram revestidas com 2 μg/ml de Integrina αVβ3, e várias concentrações de construto de polipeptídeo (indicadas) foram adicionadas. O peptídeo ligado foi detectado pela adição de Anti- ANGPTL3 mAb, seguido por anticorpo IgG de anti-Camundongo Cabra conjugado a peroxidase de rábano silvestre. Todos os peptídeos testados retiveram ou aperfeiçoaram a capacidade de ligação de integrina. O EC50 para cada um foi determinado a partir dos dados de ligação, e os resultados são mostrados na TABELA 2.TABELA 2: Ligação in vitro de ANGPTL3 e construtos de polipeptídeo projetados a Integrinas

[00111] α5β1 integrina Peptídeos 225KQ, 228KQ, 233KQ, 241KQ e 242KQ preparados foram testados in vitro para ligação a α5β1 integrina. As placas foram revestidas com 2 μg/ml conforme descrito acima, mas com Integrina α5β1, e várias concentrações de construto de polipeptí- deo (indicadas) foram adicionadas, e detecção efetuada conforme des-crito acima. Todos os peptídeos testados retiveram ou aperfeiçoaram a capacidade de ligação de integrina. O EC50 para cada um foi determi-nado a partir dos dados de ligação, e os resultados são mostrados na TABELA 2.

Exemplo 3: Análise funcional de construtos

[00112] Diferenciação e cultura de célula. Células tronco mesenqui- mais derivadas de medula óssea humana primária (hMSCs) foram clas-sificadas por FACS, e se comprovaram serem >98% positivas para CD29, CD44, CD166 e CD105, e <0,1% positivas para CD45; e células foram usadas das passagens 2-8 para experimentos. MSCs residentes de cartilagem humana (hCR-MSCs) foram derivados de condrócitos ar-ticulares primários humanos que foram separados em células únicas, clonalmente crescidas em MSCGM e validadas como MSCs através de diferenciação condrogênica, osteogênica e adipogênica. As células foram classificadas por FACS, e se comprovaram serem >98% positivas para CD166 e CD105. hCR-MSCs foram cultivados até 20 passagens com nenhuma alteração no perfil de célula, crescimento ou taxas de di-ferenciação identificadas.

[00113] Condrogênese. Construtos de peptídeo da invenção foram avaliados em ensaios físicos e funcionais para avaliar atividade de con- drogênese.

[00114] Construtos projetados aqui proporcionados são derivados de ANGPTL3 que pertencem a uma família de sete proteínas de ANGPTL identificadas que têm similaridade estrutural para as angiopoietinas, mas carecem de capacidade de ligar o receptor Tie2 e, desse modo, tem funções distintas. As proteínas de ANGPTL contêm um domínio N- terminal coiled-coil (CCD), e um domínio similar a fibrinogênio C-termi- nal (FLD), e são acreditadas serem apertadamente reguladas por seu microambiente e interações com a matriz extracelular (ECM), tais como fibronectina e integrinas. Conklin et al., Genomics 62(3): 477-482 (1999); Goh YY, et al., Am J Pathol 177(6): 2791-2803 (2010); Goh YY, et al J Biol Chem 285(43): 32999-33009(2010). Sequências para mem-bros da família de ANGPTL mais proximamente relacionadas a ANG- PTL3, ANGPTL1 (domínio de comprimento total e C-terminal) e ANG- PTL4 (domínio de comprimento total e C-terminal) são proporcionadas na Tabela 3; e a Tabela 5B representa um alinhamento através de domínios C-terminais destes membros de família. As identidades de sequência através de domínios extracelulares e domínios C-terminais AN- GPTL1, ANGPTL4, bem como outras proteínas de angiopoietina de AN- GPTL7, ANGPT1 e ANGPT2, são proporcionadas na Tabela 5A. O domínio C-terminal (CT) de ANGPTL3 compartilha 37% de identidade de sequência com CT ANGPTL1, e 40% de identidade de sequência com CT ANGPTL4.

[00115] Condrogênese 2D à base de célula foi induzida in vitro, e en-saiada conforme descrito previamente em Johnson, K., et al., (2012) Science 336, 717. Brevemente, células troncos mesenquimais derivadas de medula óssea humana primária (hMSCs) foram colocadas em meio de crescimento, em seguida, subsequentemente mudadas para um meio de estimulação condrogênico com e sem construtos.

[00116] Para formação inicialmente de nódulo de imagem, cavidades foram fixadas e manchadas com Rodamina B, onde os nódulos foram facilmente detectados pelo olho e imagens capturadas por microscopia de luz. Para facilitar a detecção à base de imagem de alta produção e quantificação, os nódulos condrogênicos foram manchados com Nile Vermelho que se liga não especificamente a colágenos. Os nódulos manchados com Nile Vermelho foram quantificados em um Acumen eX3 (dispositivo de imagem de alto teor) por excitação com um laser 488 para detecção rápida dos nódulos. TABELA 3: Sequências da Família de ANGPTL

TABELA 4: Condrogênese de proteínas de membro da família de ANG-PTL

[00117] Condrogênese 2D à base de célula foi induzida in vitro e en-saiada conforme descrito previamente em Johnson, K., et al., (2012) Science 336, 717. Brevemente, células tronco mesenquimais derivadas de medula óssea humana primária (hMSCs) foram colocadas em meio de crescimento em seguida subsequentemente mudadas a um meio de estimulação condrogênica com e sem construtos, e cultivadas por 7 ou 14 dias. As células foram, em seguida, fixadas com formaldeído, lavadas e, em seguida, manchadas usando técnicas imuno-citoquímicas padrões para detectar proteínas de cartilagem primárias Pró-colágeno Tipo 2A (PIIANP) (Figura 2A) e colágeno Tipo II (Figura 2B). Para detecção de colágeno tipo II, as células foram digeridas com 0,2% de Cola- genase II (Worthington Biochemical, Lakewood, NJ) que foi adicionada à solução de permeabilização. Imuno-fluorescência para cada proteína detectada foi quantificada através de imagem de alto teor (Image Express Ultra (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)), usando certificado de classificação de célula de multi comprimento de onda, e conforme descrito previamente. Ver Figura 2. A expressão de aggrecan foi monitorado por preparação de células conforme segue: brevemente, hMSCs primários (5000 células) foram colocados em uma placa Griener de 384 cavidades. Após 24 horas, o meio de crescimento foi removido e substituído com 25 μl de DMEM contendo 1% de FBS. Os constructos de proteína foram, em seguida, adicionados à cada cavidade na dose indicada, e culturas foram crescidas a 37°C por 3 dias. As células foram fixadas com 10% de formalina, e submetidas a métodos de imunocitoquímica, para detectar expressão de proteína Aggrecan. As cavidades foram submetidas à imagem no ImageXpress Ultra, e quantificadas com certificado de classificação de célula de multi comprimento de onda, n=6/concentra- ção de proteína. Os resultados são exemplificados na Figura 3B relativos ao controle (células estimuladas sem construto, diluente sozinho) para WT tipo selvagem C-terminal (225-460) ANGPTL3, construto pro-jetado 242KQ ou 242Kdel, ou ANGPTL1 de comprimento total, um mem-bro da família relacionada das proteínas de ANGPTL. Resultados simi-lares foram vistos com experimentos usando cada um dos construtos 225WT, 225KQ, 226KQ, 228KQ, 233KQ, 241KQ e 242KQ.

[00118] Ensaios de condrogênese foram efetuados usando ensaios e métodos descritos previamente e aqui para membros da família rela-cionada á ANGPTL adicional. Experimentos foram efetuados para exa-minar se as proteínas intimamente relacionadas conferem atividade condrogênica, e se a atividade foi retida na extremidade C-terminal da proteína. ANGPTL1 e ANGPTL4 demonstraram atividade em ensaios de formação de nódulo; contudo, somente ANGPTL1 mostrou uma indução de colágeno tipo II em ensaios de condrogênese. Ver Tabela 4. Os resultados de atividade de formação de nódulo e indução de ensaios de colágeno Tipo II são resumidos na Tabela 4. A caracterização adicional de ANGPTL1 é aqui descrita. Ver outras porções deste Exemplo e Figuras 3-5.TABELA 5: Homologia de sequência entre membros de família similares á angiopoeitina humana 5A: Identidade de sequência entre mem-bros da família similares à angiopoeitina humana (ECD ou CTD)

[00119] 5B: Alinhamento de sequência de domínios C-terminais de membros da família similares à angiopoeitinahANGPTL1(271-491)/hANGPTL3 (241-460)/hANGPTL4(179-406)

[00120] A análise de expressão de RNA foi também usada para avaliar expressão de proteínas específicas de cartilagem. Brevemente, qRT-PCR hMSCs foram crescidos em cultura de pelota (1x106 célu- las/pelota) por 3, 7, 10, 21 dias em DMEM livre de soro, 1X ITS mais construtos (conforme indicado). Meio foi substituído de 3 em 3 dias. Lu- bricin, Aggrecan, Sox9, IGF1, IFITM1, Osteocalcin, e expressão de mRNA de colágeno tipo X, foram quantificados usando Roche LightCycler (dados reunidos de 3 experimentos realizados em duplicata (n=6)). A Figura 3A representa dados de expressão no Dia 10 para 242KQ e 225WT. O dado de expressão de gene foi similar para todos os genes nos dias 3, 7 e 21.

[00121] A ANGPTL3 de comprimento total mostrou previamente ter atividade de condrogênese em ambas células tronco mesenquimais de camundongo e humanas. Os construtos foram testados para atividade em células tronco mesenquimais de humano, camundongo, rato, e ca-nino, para demonstrar a capacidade de espécies adicionais através de reatividade. CR-MSCs de camundongo, rato, humano e cão foram cul-tivadas com construtos, conforme descrito acima por 18 dias. As culturas foram fixadas e manchadas usando técnicas de imunocitoquímica padrões para detectar colágeno tipo II de proteína específica de condró- cito, e células positivas de colágeno tipo II foram quantificadas usando imagem de alto teor. Aumento do dobro similar na quantidade de colá- geno tipo II quantificado foi confirmado para cada espécie de células avaliada.

[00122] Condroproteção. Construtos de peptídeo foram avaliados em ensaios funcionais para avaliar atividade condroprotetora.

[00123] Um ensaio de inibição de liberação de glicosaminoglicano ex vivo (GAG) (um indicador de dano de matriz) foi realizado conforme descrito em Johnson, K., et al., (2012) Science 336, 717-721. Brevemente, a cartilagem bovina foi isolada, puncionada em círculos simétricos, e posta em cultura de órgão. Fatias foram tratadas por 48 horas com 20 ng/ml de TNFα e 10ng/ml de oncostatina M (OSM) (mediadores inflamatórios) para induzir degradação da matriz de cartilagem na presença ou ausência de construtos de proteína para identificar a percentagem de inibição de liberação de glicosaminoglicano (GAG). Os resultados mostrados na Figura 4A representam dados reunidos de 4 doadores, n=12 com os construtos projetados conforme indicado, e WT 225-460.

[00124] Um ensaio de inibição de óxido nítrico (NP) in vitro (um indicador de condro-proteção) foi realizado, conforme descrito em Johnson, K., et al., (2012) Science 336, 717-721. Brevemente, os condrócitos primários foram tratados por 48 horas com construtos de proteína, conforme indicado. A reação de Greiss foi realizada, para determinar o efeito de construtos na inibição de liberação de NO, à medida que os Resultados mostrados na Figura 4B representam resultados com os construtos projetados conforme indicado, e fragmento WT C-terminal 225-460. Os resultados na Figura 4C representam os resultados com ANGPTL1 C-terminal tipo selvagem, ANGPTL3 242KQ projetada, ou controle.

[00125] Inibição de formação de cartilagem fibrótica. Os condrócitos articulares humanos primários foram cultivados conforme descrito acima com a adição de ácido ascórbico e a presença ou ausência de construtos (indicado) por 14 dias para induzir hipertrofia, e expressão de colágeno tipo X foi avaliada por imunoflurescência. Os resultados mostrados na Figura 5A representam dados com construtos 225WT ou 242KQ, conforme indicado. Os resultados mostrados na Figura 5B representam dados com ANGPTL1 C-terminal tipo selvagem, ANGPTL3 242KQ ou 242Kdel projetados, ou fragmento C-terminal tipo selvagem de ANGPTL3 225-460, conforme indicado. A presença de construtos tipo selvagem ou ativos confere um efeito inibitório na formação de cartilagem fibrótica sob condições hipertróficas, conforme detectado por expressão de colágeno tipo X.

[00126] Angiogênese. O domínio C-terminal WT da proteína de AN- GPTL3 foi reportado para ter atividades angiogênicas e propriedades in vitro e in vivo em um modelo corneal de rato. Ver Camenisch et al., J. Biol. Chem. 277(19): 17281-17290 (2002). Para determinar o risco pos-sível de indução de novos vasos sanguíneos seguindo administração in vivo de ANGPTL3 C-terminal, ensaios angiogênicos in vitro foram exa-minados. Brevemente, células endoteliais de veia umbilical humanas primárias (HUVECs) foram supridas com soro durante a noite com meio de célula endotelial basal. As células foram, em seguida, etiquetadas com rastreador de célula verde, e adicionadas a placas de matrigel pré- revestidas embebidas com construto de proteína (indicado). Seguindo cultura por 18 horas na presença de ANGPTL3 de comprimento total (50 ng/mL), ou 242KQ (50ng/mL), ou bFGF (50ng/mL), que foi usada como um controle positivo, o número de pontos de ramificação e o compri-mento de tubo total formado foi quantificado usando imagem de alto teor como uma medida de atividade angiogênica. Em contraste ao efeito visto na presença de ANGPTL3 de comprimento total ou controle positivo, nenhum aumento significante em qualquer parâmetro foi detectado quando as células foram incubadas com 242KQ. Ver Figura 2C.

[00127] CR-MSCs existem dentro da cartilagem articular de hialina e aumentam em número em resposta a dano. Seguindo o dano ao tecido de cartilagem, estas células têm a capacidade de participar dos processos de reparo, mas não conduzem suficientemente a reparo correto da cartilagem em si própria. Os pacientes são, portanto, deixados com car-tilagem articular que carece da capacidade correta de suportar movi-mentos da articulação sem dor e, frequentemente, requerem intervenção cirúrgica, e/ou uma substituição de articulação para manter sua qua-lidade de vida. Nós verificamos que ANGPTL3 e, em particular, peptí- deos de ANGPTL3 resistentes à protease projetados têm a capacidade de direcionar a diferenciação de CR-MSCs humanos em condrócitos, especificamente secretando colágeno tipo II de proteínas de cartilagem articular de hialina e Sox9, enquanto que inibem a formação de cartila-gem fibrótica notada por expressão de colágeno tipo X.

[00128] Nenhuma expressão de ANGPTL3 foi reportada a nosso co-nhecimento, nem observada em nossos estudos usando western blotting em condrócitos humanos, MSCs humanos, ou fibroblastos sinoviais humanos. Em articulações de roedores, pouca a nenhuma expressão foi encontrada através de imuno-histoquímica (IHC). Contudo, em fluido sinovial osteoartrítico humano (n=2), ANGPTL3 de baixo nível (1,3-6,0 ng/mL) foi detectada por ensaio imunoabsorvente ligado á enzima (ELISA), sugerindo em uma articulação comprometida, que proteína sis- temicamente circulante pode entrar na atividade sinovial.

Exemplo 4: Análise in vivo de construtos

[00129] Modelo cirúrgico de dano agudo de camundongo. Transec- ção cirúrgica do ligamento cruzado anterior (ACL), ligamento tibial do menisco médio (MMTL), e ligamento colateral médio (MCL) do joelho direito de camundongos C57BL/6 (n=12/grupo) foi realizada para induzir instabilidade na articulação do joelho, e, desse modo, conduz a um fe- nótipo OA, adaptado a partir do modelo previamente descrito Glasson, S.S., et al., Osteoarthritis Cartilage 15, 1061 (2007). Para avaliar um benefício terapêutico potencial de tratamento com ANGPTL3, 15 sema-nas em seguida a cirurgia, os camundongos foram dosados intra-articu- larmente conforme indicado na 6A uma vez / por semana nas semanas 17-19: dose de mANGPTL3 = 200 ng / joelho. As avaliações quantitativas da placa tibial foram feitas em uma escala 0-4, 0 sendo osteoartrite normal e 5 sendo osteoartrite severa (rompimento de espessura total da cartilagem). Duas seções de cada camundongo foram cegamente ava-liadas por 2 observadores independentes (Figura 6B).

[00130] O alívio de osteoartrite que induziu dor para os animais foi medido por teste de incapacitância, ou determinando a percentagem de tempo que o camundongo suportou em uma perna cirurgicamente tratada vs a perda não tratada usando um dispositivo de monitoramento de incapacitância. A Figura 7 representa os resultados de leituras, re-presentando respostas de dor nos dias 35 e 56 após cirurgia que foram reportadas como uma % de peso suportada no membro cirúrgico versus o membro não cirúrgico. O tratamento representa os resultados de ani-mais dosados conforme descrito acima com ANGPTL3 de murina de comprimento total (WT17-460), ou ANGPTL3 humana C-terminal (WT225-460).

[00131] Modelo de OA crônico de camundongo (induzido por colage- nase VII) Outro modelo de animal amplamente usado de osteoartrite, o modelo de dano de articulação crônico induzido por colagenase VII, foi usado para avaliar eficácia in vivo de construtos. O modelo e avaliação foram realizados conforme previamente descrito. Ver van der Kraan, P.M., et al., Am. J. Pathol. 135, 1001 (1989); e Johnson, K., et al., Science 336, 717 (2012). Brevemente, um período de três (3) dias de inflamação é seguido por desestabilização induzida por colagenase da articulação, resultando em destruição suave a moderada da cartilagem. A administração intra-articular de construtos foi efetuada seguindo indução no joelho uma vez/semana por três semanas, começando 3 semanas após adição de colagenase VII. Quarenta (40) dias em seguida ao tratamento, as articulações foram coletadas e seccionadas. A classificação da severidade da articulação histológica de placa femoral e tibial permitiu a quantificação do reparo do tecido. A severidade da classificação da articulação foi determinada através da classificação his-tológica conforme descrito acima. A Figura 8 representa o reparo com construtos 225WT, 225KQ, 228KQ, 233KQ, e 241KQ. Para confirmar a presença de proteína na articulação (retenção intra-articular de longo prazo), o tecido foi fixado e manchado para a presença do construto de proteína de WT através de imuno-histoquímica. A análise confirmou a presença de proteína indicando retenção intra-articular de ANGPTL3 (com nenhum efeito visto em lipídeo/triglicerídeo, avaliado usando um painel metabólico padrão, dados não mostrados).

[00132] A análise histológica e avaliação em seções manchadas com Safranin O da placa tibial média (para detecção de proteoglicano no local de dano, conforme descrito acima) revelou regeneração na matriz de cartilagem (dados não mostrados). A análise qualitativa confirmou substituição de proteoglicanos similar a níveis vistos em um camundongo ingênuo, enquanto que os controles de veícuilo não mostraram substituição similar. As seções de tecido foram também man-chadas conforme descrito acima para colágeno tipo II 8 semanas em seguida a injeção do dano. A análise qualitativa confirmou um aumento de colágeno tipo II em articulações tratadas com construto similares a níveis vistos em um camundongo ingênuo; enquanto que os controles tratados com veículo não mostram aumento similar (dados não mostra-dos).

Modelo de desgaste de menisco de rato

[00133] Um modelo de dano cirúrgico de rato foi também usado para avaliar eficácia in vivo de construtos. O modelo e avaliação foi inicial-mente realizadao conforme previamente descrito Gerwin N. et al. Oste-oarthritis Cartilage. Suppl 3: S24 (2010). Brevemente, a pele foi raspada em uma articulação do joelho, e ligamento colateral médio (MCL) foi isolado através de uma incisão, e o MCL foi estabilizado, e um corte distal do menisco feito usando um escalpe. Nas semanas 1, 2 e 3 em seguida à cirurgia, construto de proteína ou controle de veículo foi inje-tado intra-articular mente, em seguida, as articulações foram coletadas e seccionadas em 4 e 6 semanas após cirurgia. A classificação de se-veridade de articulação histológica de placa femoral e tibial foi realizada para quantificação do reparo de tecido, conforme descrito acima. O dado é mostrado para a análise de 6 semanas.

[00134] Cartilagem de hialina saudável substitui dano em seguida ao tratamento. A análise e classificação histológica da placa tibial lateral de cartilagem manchada com safranin O foram realizadas conforme descrito acima e quantificadas. Os Resultados demonstram que animais tratados com construto 242KQ revelaram regeneração em matriz de cartilagem e substituição de proteoglicanos similares a níveis vistos em um rato ingênuo, enquanto que os controles de veículo não mostraram substituição similar. Ver Figura 9. Resultados similares foram vistos com 225WT.

[00135] Um modelo de desgaste de menisco cirurgicamente induzido levemente alterado daquele acima descrito foi usado para iniciar dano de cartilagem em ratos Lewis machos de modo a testar a eficácia de 242KQ na promoção de reparo de cartilagem in vivo. A cirurgia em ratos foi realizada para cortar completamente o ligamento colateral médio e o menisco medial para desestabilizar a articulação de modo que suporte de peso futuro conduziria a rápida degeneração da cartilagem. Uma incisão foi feita para cortar o ligamento em ambos os lados da agulha, assegurando, desse modo, um corte completo. Uma lâmina de bisturi foi, em seguida, usada para deslizar sob o ligamento patelar no espaço sinovial, e a ponta afiada foi usada para cortar o menisco. Um corte bem sucedido foi efetuado quando a articulação se desloca lateralmente. Uma semana após cirurgia, os ratos foram dosados por injeção intraarticular de 242KQ ou salina em um volume de 25 uL no espaço sinovial intra-articular.

[00136] Vinte e oito dias após cirurgia de desgaste do menisco e vinte e um dia de injeção pós intra-articular de salina ou construto, os animais do estudo foram eutanizados, e as articulações afetadas foram coletadas para análise, fixadas em 10% de formalina em PBS, descalcificadas com ácido fórmico, e embebidas em parafina antes de seccionamento. Seções coronais foram cortadas e manchadas por Safrazinha O, ou deixadas para manchamento de imuno-histoquímico futuro. A análise revelou que a placa tibial média tem a maior quantidade de dano de cartilagem, e foi decidido avaliar somente esta área da articulação para eficácia de 242KQ. Usando o sistema de classificação de OARSI, as classificações de severidade da cartilagem foram verificadas para seis seções através da largura da cartilagem da tíbia para cada animal (N=10) em uma maneira blindada. A classificação foi feita duas vezes em pontos de tempo diferentes, e as classificações foram, em seguida, projetadas na média para criar uma classificação de dano de cartilagem. Adicional-mente, análises de classificação objetivas foram realizadas com um cer-tificado de costume gerado em Matlab. O algoritmo identifica as super-fícies da cartilagem articular e parâmetros de cartilagem objetivamente quantificados adicionais (análises zonais, intensidade de safranin O, área de cartilagem, espessura da cartilagem). Os resultados são repre-sentados na Figura 10A.

[00137] O reparo estrutural de cartilagem não está sempre associado com alívio de dor, pelo menos em humanos. Embora a fisiologia e mar-cha do roedor sejam significantemente diferentes da dos humanos, 242KQ foi avaliado para determinar se existe qualquer aperfeiçoamento na marcha ou comprimento de tempo gasto no membro cirúrgico após tratamento. O monitoramento da incapacitância foi realizado em ratos tratados com 242KQ. Os ratos foram submetidos a cirurgia de menisco modificada, conforme descrito acima. Uma semana em seguida a cirur-gia, 242KQ foi injetado no espaço sinovial. No dia 28, os ratos foram colocados em um monitor de incapacitância em seus membros posteri-ores e 30 leituras subsequentes foram tomadas por 10 minutos para cada rato para determinar a percentagem de tempo gasto (distribuição de peso) em cada membro posterior. Estes dados dão uma indicação da redistribuição de peso induzida por dor. Foi determinado que no modelo de desgaste de menisco do rato, o tratamento com 242KQ uma semana em seguida à cirurgia conduziu a uma restauração parcial da capacidade de suporte de peso igual dos ratos. Ver Figura 10B.

[00138] Um dos suportes primários durante reparo de cartilagem es-pontâneo ou cirúrgico é a substituição de cartilagem articular de hialina com cartilagem fibrótica. Para explorar o tipo de reparo de cartilagem mediada por ANGPTL3, seções a partir dos joelhos de rato coletadas a partir do estudo de desgaste do menisco do rato realizadas acima foram manchadas pela presença de colágeno tipo II (para indicar cartilagem articular de hialina) e colágeno tipo X (para indicar cartilagem fibrótica). Após uma injeção única de 20 μg de 242KQ, existe uma redução quali-tativa na quantidade de expressão de colágeno tipo X.

[00139] Retenção de longo prazo de 242KQ em seguida a injeção intravenosa e intra-articular em joelho de rato foi determinada através de etiquetação 124I de proteína, e administração, seguida por PET / imagem de uCT para monitorar retenção. Ver, Gerwin, N., et al. (2006) Advanced drug delivery reviews 58, 226-242. O tempo de residência médio (MRT) após injeção IA de 242KQ na articulação foi determinado para ser ~17,3 horas, que é significantemente aumentado sobre o padrão 2-3 horas reportado (Ver TABELA 6) TABELA 6: Persistência de 124I 242KQ

[00140] Mod elo de dano da articulação de menisecl omia parcial de cão Nós também avaliamos a atividade de ANGPTL3 em modelo de dano da articulação canino. O modelo foi realizado, e avaliações realizadas conforme descrito em Connor, J.R., et al., Osteoarthtitis and cartilage / OARS, Osteoarthtitis Research Society 17, 1236-1243 (2009). Brevemente, a pele foi raspada em uma articulação do joelho, e o ligamento colateral médio (MCL) foi isolado através de uma incisão, e o MCL foi estabilizado, e um corte distal do menisco feito usando um escalpe. Quatro (4) dias em seguida à cirurgia, os animais receberam, ou dosagem duas vezes semanalmente (1,5 ug ou 15 ug), ou uma dose única (30 ug) do construto de proteína (ANGPTL3 canina de comprimento total) no dia 7 ou controle de veículo (injetado intra-articular- mente). Os cães foram eutanizados no dia 28, e os joelhos foram submetidos a seccionamento e classificação histológica, conforme descrito acima para os experimentos com rato e camundongo. A Figura 10 representa a Classificação grosseira total do reparo associado com tratamento de ANGPTL3 canina. Após classificação e avaliação histológica das seções de articulação do cão manchadas com Safranin O, as áreas onde a perda de cartilagem mais severa ocorre nos grupos de salina foi a porção da articulação que tem a maior redução na área de lesão em seguida a uma dose única de 30 μg de cANGPTL3.

[00141] É compreendido que os exemplos e concretizações aqui descritos são para proposta ilustrativa, e que várias modificações ou mudanças à luz destes serão sugeridas àqueles técnicos no assunto, e são para serem incluídas dentro do espírito e âmbito deste pedido e escopo das reivindicações em anexo.SEQUÊNCIAS

Claims

1. Polipeptídeo isolado, caracterizado pelo fato de que com-preende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre qualquer uma de (i) SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, ou SEQ ID NO:70; ou (ii) SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63 ou SEQ ID NO:64.

2. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracteri-zado pelo fato de que o polipeptídeo consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada dentre qualquer uma das (i) SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69 ou SEQ ID NO:70; ou (ii) SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63 ou SEQ ID NO:64.

3. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um polipeptídeo, como definido na reivindicação 1 ou 2.

4. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um ácido hialurô- nico ou um derivado deste, ou um agente selecionado a partir do grupo consistindo em calcitonina oral de salmão, SD-6010 (inibidor de iNOS), vitamina D3 (coliecalciferol), hidrolisado de colágeno, FGF18, BMP7, acetato de rusalatide, insaponificáveis de abacate-soja (ASU), cartoge- nina, um esteroide, e um agente anti-inflamatório não esteroidal (NSAID).

5. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que é para uso no tratamento, melhoria ou prevenção de artrite ou dano nas articulações em um paciente.

6. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, ca-racterizado pelo fato de que é para uso em um método para indução da diferenciação de células-tronco mesenquimais em condrócitos.

7. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 6, caracteri-zado pelo fato de que o método é realizado in vivo e as células-tronco estão presentes em um indivíduo humano.

8. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 7, caracteri-zado pelo fato de que o indivíduo tem artrite ou dano nas articulações ou o indivíduo está em risco de, artrite ou dano nas articulações.

9. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 5, ou polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a artrite é osteoartrite, artrite de trauma ou artrite auto- imune.

10. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 5, ou polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo fato de que a administração da composição farmacêutica ou polipeptídeo ocorre (i) durante ou após um procedimento cirúrgico, (ii) em conjunto com um ou mais fatores condrogênicos adicionais, (iii) em conjunto com qualquer estímulo da medula óssea, substituição da cartilagem, implante autólogo de condrócitos (ACI), im-plante autólogo de condrócitos induzidos por matriz (MACI) ou (iv) em uma matriz ou suporte biocompatível.

11. Uso de um polipeptídeo, como definido na reivindicação 1 ou 2, ou de uma composição farmacêutica, como definida na reivindicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um medicamento para tratamento, melhora ou prevenção de artrite ou dano articular em um paciente.

12. Uso, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o paciente tem ou está em risco de ter artrite ou dano articular.

13. Uso, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a artrite é osteoartrite, artrite por trauma, ou artrite au- toimune.

14. Uso de um polipeptídeo, como definido na reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que é para preparação de uma com-posição farmacêutica para a indução de diferenciação de células tronco mesenquimais em condrócitos.

15. Uso, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o tratamento é realizado in vivo, e as células troncos mesenquimais estão presentes em um indivíduo humano.

16. Uso, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a administração do medicamento ocorre (i) durante ou após um procedimento cirúrgico, (ii) em conjunto com um ou mais fato-res condrogênicos adicionais, (iii) em conjunto com qualquer estímulo da medula óssea, substituição da cartilagem, implante autólogo de con- drócitos (ACI), implante autólogo de condrócitos induzidos por matriz (MACI) ou (iv) em uma matriz ou suporte biocompatível.