CN1281623C - 抗病毒活性的人α干扰素衍生物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种由171个氨基酸组成的具有抗病毒比活性的人α干扰素衍生物(IFN-SA)及其重组制备。IFN-SA比天然人α干扰素的抗病毒比活性强50-100倍，达到5-10×109IU/mg，可望成为治疗病毒性疾病的新一代干扰素产品。
Description
技术领域
本发明涉及一种新型的具有抗病毒比活性的人α干扰素衍生物(IFN-SA)及其制备方法和用途，其特征在于它具有的抗病毒比活性高达5-10×109IU/mg，具有治疗和预防病毒感染性疾病方面的巨大潜力。
背景技术
干扰素是一类由单键分子组成的相对小分子量的蛋白多肽，它由体内多种细胞在受到病毒感染和抗原刺激后产生。干扰素具有抗病毒、抗增殖和免疫调节的功能，因此具有巨大的临床应用价值，如治疗病毒性疾病和肿瘤、多发性硬皮病等。虽然干扰素发现已有数十年，但其蛋白质和基因结构等研究是近二十年的工作，有许多问题尚待深入。人干扰素分为三大类即α、β和γ型，分别由白细胞、成纤维细胞和淋巴细胞产生而命名。人α干扰素由166个氨基酸组成，分子量在19000道尔顿左右，虽然证明含有糖基，但与其抗原性和生物活性无关。目前已经克隆并确定出氨基酸序列的人α型干扰素亚成员有约20种，可能还会有新的亚型出现。如果将经突变或改造的人α干扰素衍生物加上，要经基因工程手段生产出相当数量的各种人α干扰素衍生物或类似物。其中最引人注目的是复合型α干扰素(concensus interferon)。复合型α干扰素是一种新型干扰素，它是根据已知的人α干扰素亚型的氨基酸序列中氨基酸同源性高的原则组合而成，再经人工合成其相对应的基因，经大肠肝菌表达纯化而得。重组复合型干扰素的抗病毒比活性是目前发现的任何一种天然α型干扰素的10倍，达到比活性1.0×109单位以上。重组复合型α干扰素(商品名Infergen)已批准用于治疗慢性丙型病毒性肝炎，疗效显著。
重组复合型α干扰素由美国Amgen公司发明，它仍由166个氨基酸组成，但有三种形式即甲硫氨酰型(methionyl)、去甲硫氨酰型(des-methionyl)和N-乙酰化甲硫氨酰型(N-acytaled methionyl)，即具有结构不均一性的缺陷。重组天然的α型干扰素如IFN-α2a、1b和2b，同样由166个氨基酸组成，它们是一种重要的抗病毒和抗肿瘤的治疗药物。但现有的α干扰素制剂的临床治疗效果尚不理想其抗病毒比活性仅为1.0×108IU/mg左右，存在着大剂量时副作用较大的缺点。
发明内容
本发明所述的抗病毒活性α干扰素衍生物由171个氨基酸组成，具有的抗病毒比活性达到5-10×109IU/mg，比复合型α干扰素强5-10倍，比天然α干扰素强50-100倍。抗病毒活性α干扰素衍生物IFN-SA其氨基酸序列特征在于其N-末端比天然α干扰素多出5个氨基酸是Gly Ser Gly Gly Gly，从第6位到171位氨基酸序列以14种人α干扰素的氨基序列为基础，采用同源性组合原则设计而成。
人α干扰素和复合型α干扰素均含有二对二硫键，即Cys1和Cys29及Cys99和Cys139组成。本发明中抗病毒活性α干扰素衍生物的二对二硫键位于Cys7与cys34，Cys104与Cys144之间，由于二硫键不处于其N末端第一氨基酸位置，十分有利于二硫键的形成和稳定。
目前重组α干扰素和复合型α干扰素的制备多采用变性和复性的方案，加再加上在N末端会出现甲硫氨酰或修饰的甲硫氨酰，推测对第一对二硫键(Cys1和Cys29)的构象形成十分不利。本发明所述的重组抗病毒活性α干扰素衍生物IFN-SA采用分泌型融合表达的方式，加上第一对二硫键位于Cys7和Cys34之间，因此有效地避免了变性和复性的过程，保证了二硫键的最佳构象形成，其N末端不含有甲硫氨酰，终产物是单一的由171个氨基酸的重组IFN-SA。
本发明提供的重组强抗病毒活性α干扰素衍生物IFN-SA具有抗病毒作用更强，副作用更小，病毒消除更有效，更适合于病毒性感染疾病如病毒性肝炎、单纯疱疹病毒感染和病毒性流感、EB病毒感染等的治疗和预防。
本发明中抗病毒活性α干扰素衍生物IFN-SA的蛋白质氨基酸序列如下：
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以上蛋白质氨基酸相对应的基因序列用人工合成而得(详见实例)，所述表达载体的宿主细胞包括细菌、酵母和哺乳动物细胞。重组抗病毒活性α干扰素衍生物IFN-SA的制备方法包括相对应的基因人工构建，含其DNA序列的重组表达载体的筛选，宿主细胞的转化，发酵和纯化等步骤。
由上述制备方法制取的重组抗病毒活性α干扰素衍生物IFN-SA具有5-10×109IU/mg的抗病毒比活性，通过相应的制剂技术制备成注射用水针或冻干粉针、外用型的膏剂或乳剂以及口服型的含化片或胶囊、片剂等。
下面通过本发明的实例，对本发明作更详细的描述。
附图说明
图1：pUC-IFN-SA重组质粒构建图，人工合成的8段互补IFN-SA寡核苷酸片段，经递归PCR扩增出530bp的IFN-SA cDNA全基因片段，IFN-SA基因片段和pUC-18质粒经BamHI和HindIII双酶切后，琼脂糖胶电泳回收酶切片段。pUC18双酶切回收的大片段与IFN-SA双酶切回收的基因片段，经T4连接酶连接。命名为pUC-IFN-SA。经测序证实其IFN-SA基因序列与设计的序列完全一致，用于PLK-IFN质粒构建。
图2：pUC-LK重组质粒构建图，人工合成的69bp Linker双链DNA片段与pUC18质粒经EcoRI和BamHI双酶切，回收相似片段。含Linker外源片段的重组质粒命名为pUC-LK。
图3：pUC-LK-IFN重组质粒构建图，将pUC-LK和pUC-IFN-SA重组质粒分别用BamHI和HindIII双酶切，回收pUC-LK的大片段和pUC-LK-IFN的小片段，经T4连接酶连接后，经酶切鉴定筛选出pUC-LK含IFN-SA外源基因的重组质粒，命名为pLK-IFN。此质粒成功地在pUC-LK的Linker 5’端连接上IFN-SA基因。
图4：pMAL-IFN重组质粒构建图，构建IFN-SA融合表达载体。pMAL-P2是以胞周质形式表达含MBP(麦芽糖结合蛋白)的融合表达高效大肠杆菌质粒。将pLK-IFN和pMAL-P2质粒分别用BamHI和HindIII双酶切，回收pMAL-P2酶切的大片段和pLK-IFN的小片段，经T4连接酶连接后，经酶切鉴定筛选出LK-IFN外源基因的重组质粒命名为pMAL-IFN。
具体实施方式
实例1.抗病毒活性α干扰素衍生物IFN-SA的基因人工构建
根据本发明的抗病毒活性α干扰素衍生物IFN-SA蛋白质的氨基酸序列选择大肠杆菌偏爱密码子，消除不利于表达的二级结构设计和密码子的简异性，设计出如下优选的DNA序例(513bp)：
GGATCCGGTGGTGGTTGTGACCTGCCGCAGACTCATTCCCTGGGTAACCGTCGCGCTC
TGATCCTGCTGGCACAAATGCGTCGTATCAGCCCGTTTTCTTGTCTGAAGGATCGTCAC
GACTTTGGCTTTCCGCAAGAAGAGTTCGATGGCAACCAGTTCCAGAAAGCACAGGCT
ATCAGCGTACTGCATGAAATGATCCAGCAAACCTTCAACCTGTTCTCCACTAAAGATAG
CTCTGCTGCATGGGACGAAAGCCTGCTGGAGAAATTCTACACCGAACTGTATCAGCAG
CTGAACGATCTGGAAGCATGCGTAATTCAGGAAGTAGGTGTAGAAGAGACTCCGCTGA
TGAACGTCGATTCTATCCTGGCAGTTAGAAAGTACTTCCAGCGTATCACCCTGTACCTG
ACTGAAAAAAAGTACTCTCCGTGCGCTTGGGAAGTAGTTCGTGCTGAAATCATGCGTT
CCTTCTCTCTGTCTACTAACCTGCAAGAGCGTCTGCGTCGTAAGGAC
根据上述设计的DNA序列，分别合成8个DNA片段，相互依次重叠20碱基，其退火温度为62℃。再合成两个33bp的上游引物和下游引物，分别与5`端和3`端配对，分别含有BamHI和HindIII两个限制性的酶切位点。应用PCR反应体系扩增出530bp大小的DNA片段，经回收纯化后由BamHI和HindIII双酶切，构建PBC18载体的BamHI和HindIII之间。含IFN-SA外源基因的重组质粒命名为pUC-IFN-SA(图例1)，经自动测序证实其DNA序列的正确性后用于表达载体的构建。8个DNA片段序列是：
Seq1：
GGA TCC GGT GGT GGT TGT GAC CTG CCG CAG ACT CAT TCC CTG GGT AAC CGT CGC GCT CTG
ATC CTG CTG GCA CAA ATG CGT CG
Seq2：
GAC GAC CGT GTT TAC GCA GCA TAG TCG GGC AAA AGA ACA GAC TTC CTA GCA GTG CTG AAA CCG
AAA GGC GTT CTT CTC AAG CT
Seq3：
TTT CCG CAA GAA GAG TTC GAT GGC AAC CAG TTC CAG AAA GCA CAG GCT ATC AGC CTA CTG CAT
GAA ATG ATC CAG CAA ACC TT
Seq4：
CTT TAC TAG GTC GTT TGG AAG TTG GAC AAG AGG TGA TTT CTA TCG AGA CGA CGT AAC CTG CTT
TCG GAC GAC CTC TTT AAG AT
Seq5：
AGC CTG CTG GAG AAA TTC TAC ACC GAA TCG TAT CAG CAG CTG AAC GAT CTG GAA GCA TGC GTA
ATT CAG GAA GTA GGT GTA GA
Seq6：
TAA GTC CTT CAT CCA CAT CTT CTC TGA GGC GAC TAC TTG CAG CTA AGA TAG GAC CGT CAA TCT
TTC ATG AAG GTC GCA TAG TG
Seq7：
AAG TAC TTC CAG CGT ATC ACC CTG TAC CTG ACT GAA AAA AAG TAC TCT CCG TGC GCT TGG
GAA GTA GTT CGT GCT GAA ATC AT
Seq8：
CAT CAA GCA CGA CTT TAG TAC GCA AGG AAG AGA GAC AGA TGA TTG GAC GTT CTC GCA GAC
GCA GCA TTC CTG ATC ATT CGA A
根据IFN-SA的DNA序列设计出一对PCR引物是：
5`端引物：5`-GC GGA TCC GGT GGT GGT TGT GAC CTG CCG CAG ACT-3`
3`端引物：5`-CG AAG CTT ACT AGT CCT TAC GAC GCA GAC GCT CTT-3`
实例2.融合表达IFN-SA的重组载体的构建
分泌型融合表达载体是PMAL-P2(Bio-lab公司)，启动子为Ptac，IFN-SA与其载体的malE的C末端融合相连，其中含有蛋白酶TEV(烟草蚀刻病毒蛋白酶)的特异识别位点Glu Asn LeuTyr Phe Gln ↓Gly，↓是酶切位点。TEV的识别位点前加入带6个组氨酸的spacer间隔区的氨基酸序列为：His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr Thr。由人工合成含TEV蛋白酶识别位点和spacer区的氨基酸相应的DNA序列linker如下：
EcoRI
5`-GAA TTC CAC CAT CAC CAT CAC CAT GAC TAC GAT ATC CCA ACT ACT GAG AAC CTG TACGlu Phe His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr Thr Glu Asn Leu Tyr
BamHI
TTT CAA GGA TCC-3`
Phe Gln Gly Ser
含限制性内切酶EcoRI和BamHI的linker序列首选插入PBC18的EcoRI和BamHI之间，构建成PBC-LK。如图例3所示，将PBC-IFN的IFN-SA用BamHI和HindIII双酶切后，插入PBC-LK的BamHI和HindIII之间构建成PBC-LK-IFN。此重组载体是含有TEV蛋白酶识别位点的IFN-SA的DNA重组子可用于与PMBP-P2进行重组表达载体构建。
PMAL-P2载体属于分泌型表达，所表达的重组融合蛋白位于大肠杆菌的胞周质。PMAL-IFN的构建方法(图4)是将PMAL-P2用EcoRI和HindIII双酶切后，回收大片段，将PBC-LK-IFN用EcoRI和HindIII双酶切后，回收约0.6kb的小片段。在T4连结酶下连结，转化大肠杆菌BL21，筛选重组子。经酶切鉴定和序列分析确证后的克隆命名为PMAL-IFN。
实例3.重组IFN-SA的融合表达与发酵
将含IFN-SA基因的重组表达载体PMAL-IFN转化大肠杆菌Top10F`，单菌落在含100ug/mlAmp(氨苄青霉素)的LB(10％Yeast extract，5％Trypton，0.15M NaCl)培养基中37℃摇瓶过夜，按1∶30接种后培养2-3小时，加入0.3mM IPTG后诱导4小时。菌体用2×电泳上样缓冲被菌后，10％SDS-PAGE电泳后染色，显示在68KD处有一明显的融合蛋白表达带，表达量占菌体蛋白的10-15％。
30升体系发酵罐发酵条件为：含PMAL-IFN的工程菌单菌落，经活化后在37℃，250rpm下含100ug/ml Amp和0.5％葡萄糖的LB培养基中过夜培养的种子液1000ml，按1∶20接种于20升的M9CA(M9基础培养基+2％Casamino acids)培养基中。37℃、500rpm、60％的溶氧、pH7.0条件下培养至OD到6.0，加入IPTG终浓度0.5mM，继承诱导表达4小时。菌体经10％SDS-PAGE电泳证实表达量在12％以上。
实例4.重组IFN-SA的纯化及鉴定
离心收集菌体→渗透压破菌→离心保留上清→过Q-Sepharose柱→过Amylose resin层析柱→融合蛋白加入TEV蛋白酶(GIBCO产品)4℃酶切6小时→Ni+-chelating Sepharose层析→分子筛Sephacryl S-200→重组IFN-SA。
通过上述纯化方法获得的重组IFN-SA经15％SDS-PAGE电泳银染显示分子量约20KD的单一蛋白带，经MALDI-TOF质谱测定其分子量为19,723dalton。HPLC显示单一蛋白峰，纯度大于99％，经N末端测序分析结果为GSGGGCDLPQTHSLQ，经理论设计值完全一致。
重组IFN-SA经Lowry法蛋白浓度测定后，用0.15M NaCL、20mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)稀释并无菌过滤后可制成水针；加入2.5％甘露醇后经冻干成白色粉针。
实例5.重组IFN-SA的抗病毒活性测定
重组IFN-SA抗病毒比活性的测定应用Wish细胞病变法，攻击病毒为VSV。按标准方法计算其抗病毒比活性。参照品重组干扰素为Schering公司的IFN-α1a和Amgen公司的复合型α干扰素Infergen。
| 干扰素类别 | 抗病毒比活性(IU/mg) |
| IFN-SAIFN-α1aInfergen | 8.1×1090.8×1081.1×109 |
以上为三次测定结果的平均值。
Claims (4)
1.一种具有抗病毒活性的人α干扰素衍生物，具有如下的氨基酸序列：
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2.一种权利要求1所述的具有抗病毒活性的人α干扰素衍生物的制备方法，其特征是通过人工构建相应的基因序列，构建重组表达载体，重组表达载体经转化宿主细胞、发酵和纯化而获得所述人α干扰素衍生物。
3.根据权利要求2所述的具有抗病毒活性的人α干扰素衍生物的制备方法，其中重组表达载体的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞。
4.权利要求1所述的具有抗病毒活性的人α干扰素衍生物在制备治疗和预防病毒感染性疾病的药物中的应用。
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