CN87102497A - α干扰素类似物 - Google Patents

Abstract

一种新的在22—23位上缺乏二氨基肽酶部位的α干扰素类似物，可以完整无损地在宿主中表达，其对天然种的主要蛋白水解活性是在该部位上。最佳宿主是带有PEP3—4突变的啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株。类似物在22位上具有丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或甘氨酸。

Description

本发明涉及对许多种天然α干扰素在22和23位上的ARG-ARG或ARG-LYS二元氨基酸部位的蛋白酶专一性有抗性的α干扰素类似物。

在本申请中，标准的干扰素术语于后说明。α干扰素是具有能够在免疫和结构两方面不同于其他干扰素的干扰素活性的一个族系的蛋白质。许多α干扰素的顺序都是由Pestka（Sci.Am.249（2）∶37-43，1983）给出的。关于干扰素的命名，参阅“Nature”286∶110（1980）和“ASM    News”，50∶68（1984）。

人体干扰素α-2（2A）已知有165个氨基酸组成的一级顺序，一般是由二硫桥将CYS    1与CYS    98、CYS    29和CYS    138偶联。α-2的三个等位变体如下：

（1）LYS    23，HIS    34变体（Goeddel等，Nature，287∶411-416，1980），由KG-1成髓细胞状细胞得到;

（2）ARG    23，HIS    34变体（Streuli等，Science，209∶1343-47，1980），由白细胞得到;

（3）ARG    23，ARG    34变体（Dworkin-Rastl等，Gene    21∶237-48，1983）

干扰素已经表达在酵母中，但是在该细胞环境中，其对二氨基肽酶活性的易感性并无特殊的识别（Hitzeman等，Science，219∶620，1983;Kramer等，PNAS，81∶367，1984;Dobson等，Nucl    Acids    Res.，11∶2287，1987;Tuite等，EMBO    J.，1∶603，1982;Lee等，NMucl    Acids    Res.，12∶6797，1984;Bowden等，Gene，27∶87    1984）。在异源宿主中，例如在酵母中产生人体α干扰素则是令人极其感兴趣的。因为α干扰素不是一种天然酵母产物，它并不确保对由酵母蛋白水解酶引起的反应会具有抗性。

在酵母中已经发现大量的蛋白水解酶（Archstetter等，Arch    Biochem    Biophys.，207∶445-54，1981）。酵母接合信息素α因子表达为由3种酶活性处理的前体蛋白，3种酶活性为：Lys-Arg上的类胰蛋白酶或组织蛋白酶的类B型裂解;由切割肽得到的碱基残基的羧肽酶类B型裂解;由二肽氨基肽酶A脱Glu-Ala二肽或脱Asp-Ala二肽。假定的切割Lys-Arg的肽链内切酶的结构基因（KEX2）已由Julis等分离得到（Julis等，Cell，37∶1075-89，1984）。

Bitter等（PNAS，81∶5330-34，1984年）构建一个融合基因，包括酵母α因子前导物（leader）和一个166-氨基酸α干扰素类似物（IFN-α-Con）。在α因子直接由酵母分泌而干扰素部分未发生内部裂解时，95%以上的干扰素的分泌完整无损，裂解的部位还未确定。

Horwich等（PNAS，82∶4930-33，1985）报导，线粒体蛋白质的前导物肽在整个氨基酸组分中所显示的碱性令人惊奇。在OTC酸前体的前导物肽的三个位置上，甘氨酸同时取代精氨酸导致由间质蛋白酶切割的前导物肽的断裂，即使留下8个残基，其最近1个精氨酸残基也远离蛋白水解裂解的部位。其他的研究同样也认为，远离裂解部位的氨基酸可以影响蛋白质水解作用（Hurt等，FEBS    Lett.，178∶306-10，1984;Horwich等，EMBO    J.，4∶1129-35，1985）。（（据Horwich推测，精氨酸对由间质酶识别的二级结构或三级结构是有影响的）。这些观察说明预测修饰多肽顺序对蛋白质水解反应易感性的困难。

关于干扰素在其他宿主中的表达也存在着类似问题。据Braude等报导（Biochem.&    Biophys.Comm.，89∶612，1979），主要切割色氨酰基、苯丙氨酰基和酪氨酰基羧基侧链的蛋白水解酶α胰凝乳蛋白酶可认为是一种特殊失活的干扰素。

已知α干扰素在离体ARG-ARG和ARG-LYS部位上易受胰蛋白酶裂解（美国专利4503035）。即使离体的许多胰蛋白酶裂解部位被确定，而干扰素分子在所有这些部位上的性质究竟有否受到损害仍不清楚。我们发现：22和23位上的部位是在缺乏蛋白酶酵母菌株中发现的新的二氨基肽酶的初级裂解部位，而且该部位上的裂解对生物活性有不利的影响。

可以预料蛋白质水解作用，会降低活性干扰素的总得率。蛋白水解片段使提高干扰素分子（活化种是单聚体）聚集倾向的纯化方法复杂化，并且可以预料直接或间接诱发免疫反应。在其他表达系统中也可以预料到存在类似问题。

至今还没有人认识到在许多α干扰素的22和23位上ARG-LYS或ARG-ARG二氨基肽酶裂解部位的重要意义，或者还没有发现一种方法来修饰这些干扰素，使其对这种二氨基肽酶的作用很自然具有抗性但不失去生物活性。

遗传修饰要胜过使用缺乏蛋白酶菌株的蛋白水解酶抑制因子或分离完整无损的单聚体干扰素的连续纯化方法。

蛋白水解酶抑制因子已为公众所知（Pringle，细胞生物学方法，12卷）。通过加蛋白水解酶抑制因子以避免蛋白水解，由于其毒性大，如临床应用干扰素，必须先予以除去，所以这种方法并不受欢迎。另外，这类抑制因子也并不总是有效。

当然，也可以转化“缺乏蛋白酶”的宿主酵母系统。这方面可参阅《酵母遗传学的基础和应用》（167～203页，1983年）和《酵母（Yeast    Saccharomyces）分子生物学》（74～75页，1982年）两本著作。于是，正如我们在这样一种菌株中，发现去除大量蛋白水解酶，可以简单地揭示其他更具专一性的蛋白水解酶，如本文中所述的一种具有最新特征的酶。

我们发现，啤酒酵母（Saccharomyces    cerevisiae）菌株进行PEP    3-4突变后，导致若干主要蛋白酶的不足，从而具有ARG-ARG和ARG-LYS内蛋白水解的活性，在存在正常蛋白酶的情况下，不能检测出这种活性。这种蛋白酶切割19K干扰素，从而产生一个16.25K片段。当发现在该菌株中表达的重组体干扰素α进行着专一的蛋白水解作用时，观测到了这种活性。我们鉴定其初级裂解部位在二元肽ARG    22-ARG    23（已知α-2干扰素种的部位为ARG    22-ARG    23或ARG    22-LYS    23）。

在由宿主有机体产生重组体分子时，二元部位的存在导致从分子中除去氨基末端22个氨基酸的专一内蛋白水解现象，这种现象在酵母、大肠杆菌和哺乳动物系统都已观测到。因此，Bodo和Fogy在“干扰素系统”（意大利罗马，1985年5月8～11日）一文中提出“在亲和性纯化的重组体人体干扰素α2中的不同种分子的特征”把在大肠杆菌中表达的重组体α-2干扰素（ARG    23，ARG    34）分为7个峰，其中之一K7被确定为还原态α-2IFN（23-165）。正如用标准干扰素生物测定方法所得到的结果，这个蛋白水解的产物中没有一个产物显示其有任何抗病毒活性。

从用α干扰素表达载体转化的酵母中得到的亲和性纯化产物在其最终产物中可高达14%（用考马斯兰染色测定）的经蛋白水解处理的干扰素。在干扰素分子上这个部位的存在，直接导致由酵母溶菌液中得到的活化干扰素总产量的显著减低。

此外，产物中截断干扰素的存在使纯化方法大为复杂。

干扰素分子的聚集倾向在大量文献中也颇有记载。这种现象的主要原因可以认为是由于分子的“混乱”，使正常的分子间二硫键导致分子内二硫桥的生成。

除了α-1外，所有干扰素都具有4个半胱氨酰基，他们导致2个内二硫桥的生成。产物混合物中蛋白水解大片段的存在，造成一个分子含有一个游离半胱氨酰基。这个游离半胱氨酰基可以加剧产物的聚集倾向。对此提供的有关证明的事实是，在非还原和非变性的条件下，分析产物时发现蛋白水解的大片段仅仅存在于聚集群体中。

据证明，αIFN分子的活化种是单聚体。于是由于蛋白水解作用增强失活聚集体的生成，从而间接导致总得率的进一步减低。

另外，蛋白水解大片段可以直接或通过诱发聚集，从而导致干扰素产物抗原性的提高。

为此，从比活性和免疫遗传性观点来规，需要把单聚体干扰素从蛋白水解片段中提纯出来，而且聚集体的生成也与该片段有关。这就要求把先进的价值很高的高压液体色谱的纯化方法引入常规的纯化方案中。另外，寡聚体IFN也可以降低单聚体的生成（美国专利4432895和欧洲专利申请128467）。

另一条途径是防止片段的生成。一般说来，关于用宿主酶对重组体产物进行蛋白水解处理，已经提到过可通过用蛋白酶抑制因子和/或用缺乏主要蛋白酶的宿主有机体。在生产重组体药物时，加入高毒性的蛋白酶抑制因子存在一系列的困难。必须说明，把材料去除到可以接受的水平经常会遇到的困难。而且这也并不代表最佳手段。蛋白水解方面使用缺陷型菌株通常是一种有效的决策。因此，就干扰素而言，分子自身的结构似乎起着更为重要的作用。通常有效的这个方法也并不足以完全保护产物的分子。我们在自己所拥有的宿主有机体中观测到，这是由于干扰素蛋白水解作用的程度所证明的;含有70%主要蛋白酶活性，在酵母属中一个菌株也没有。

显然，防止这些蛋白水解片段的生成在干扰素生产的收获和纯化阶段中将有裨益。

由于上面已经提及的在我们拥有的宿主中蛋白酶的初级裂解部位是在22-23位上的ARG-ARG或ARG-LYS部位，所以我们力图肯定饰变不太会对生物活性有不利的影响。正如下文将要详细说明的，在22位上取代Ser、Thr、Asn、Gln或Gly将会破坏二元部位，但仍保持着活化分子的构象。

在具有特征的α干扰素中，α-2在22-23位的ARG-LYS;α-6、α-8和α-H都在ARG-ARG上;α-1在SER-ARG上;α-C、α-F、α-5、α-I、α-7和α-10都在GLY-ARG上;α-4B在GLY-LYS（Pestka，Sci.Am.;249（2）∶37，42，1983年8月）。

当本发明的α干扰素类似物最佳表达在宿主系统中，在该系统中对天然种具有初级ARG-ARG或ARG-LYS的裂解活性是在22-23位时，由于减少了必然被连续纯化方法排除的蛋白裂解产物的数量和变种，它可能在其他系统中是有价值的。在αIFN22部位上单独裂解的16K裂解产物与不受欢迎的聚集体的生成尤其有关。

附图简介：

图1：19K干扰素及其16.25K片段的氨基末端的分析。

图2：标有裂解部位的重组体α-2干扰素的已知氨基酸顺序。

由含有PEP3-4蛋白酶突变（ISI013）和URA3-50、GAL及GAL80突变（CGY306）的啤酒酵母菌株制备酵母溶菌液。用球状打浆机将细胞置于10毫摩尔EDTA、100毫摩尔N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙基磺酸（HEPES）pH（7.5）和选用0.5%表面活性剂X-100（TRITON    X-100）中，在4℃下溶解。溶菌液用13000X克离心机离心澄清2分钟，然后按20微升一份分成各等份，在-70℃下冷藏。

每份溶菌液制备成含有或不含有0.5%TRITON    X-100（+，-），每份试样都离心澄清。

溶菌液都按如上所述，“掺加”重组体α-2IFN进行制备，在“16.25K”肽片段中掺加量低于4%。将溶菌液中的IFN水平调整到反映按常规由实际分批试样中得到的浓度，即约为2×10⁶单位/毫升。溶菌液在25℃下保温16小时，然后取出一份溶菌液，用抗α-2IFN抗体通过Western斑迹法（Western blotting）进行分析。

显然，TRITON    X-100的存在与16.25K片段一致。通过离心澄清溶菌液看来毫无作用，在含有正常蛋白酶水平的CGY306菌株中不能检测出片段。

在我们的酵母菌株中，我们部分纯化了对α-2干扰素的蛋白水解有反应的酶。有一层膜隔，在溶解细胞时由存在的TRITON    X-100活化。活性并不受我们所检查的蛋白酶抑制因子很广的抑制范围的影响，其特征促使我们相信，这是一个有待在文献中描述的新的酶。

我们得到的纯度使我们可以在α干扰素族系中研究培养物的专一性。我们分离了产物并对裂解部位进行了详细的分析。

重组体α-2，α-1和α-8IFN都是由酵母产生的，在特殊的单克隆抗体层析柱上进行亲和性色谱分析，继之以用筛析高压液体色谱方法进行分析。

特殊的αIFN₅蛋白酶消化是按下述方法进行的：将1微克αIFN加到40微升酵母溶菌液，两者的制备方法如前所述。混合物在25℃下保温16小时（大约1小时就可开始看到裂解）。继保温后，将6微升试样加到20微升Laemmli试样缓冲液。试样在100℃下加热5分钟，在还原条件下，在20%丙烯酰胺凝胶上电脉。

凝胶被电渗开（electroblot）到硝化纤维，图形用DeBlos和Cherwinski免疫染色法显色（Anal    Biochem.133∶214-219，1983）。染色处理中所用的主要抗体就是使用上面讨论过的在αIFN亲和性色谱法中所用的那些抗体。

用α-2干扰素作为酶的作用物，进行了一系列试验。重组体α-2IFN（制备方法如前所述）在C18U    Bordopok层析柱（WATERS）上进行逆相高压液体色谱分析，并在有0.1%TFA存在的条件下，用乙腈在1小时内以0～95%的线性梯度显色。

收集1-3份试样用丙烯酰胺凝胶电泳（按Laemmli法），在还原（C）和非还原（B）两种条件下进行分析。

在还原和非还原两种条件下，主峰（试样1）近似在19K单聚体。在非还原条件下分析的试样2，主峰表现为单聚体和二聚体的混合物。在还原条件下，试样2中16.25K片段的存在是显而易见的。

分析非还原条件下的峰3，显示有单聚体、二聚体和高序聚集体存在。还原条件说明，在这个聚集中群体中也存在有16.25K片段。

从化学和酶学分析反应产物，测定他们的氨基酸顺序，我们发现在22和23位之间的肽键上，干扰素分子被水解，二者都被ARG占领（图1和图2）。此外，在裂解过程中，ARG    23被修饰，在新生氨基末端位置上生成ORN残基。

用α-8干扰素作为酶的作用物以扩大试验。在已知α干扰素族系中，只有一种干扰素在22-23位上有ARG-ARG构型。正如所预料的那样，该分子也以在α-2干扰素中所观测到的同样方式被水解。

氨基酸的硷基对一般都代表类似胰蛋白酶的裂解部位。对特殊裂解部位的专一性是许多蛋白水解酶的一个特征。为此，我们认为第22或23位的饰变可以大大降低酶对该分子的亲和力。

用α-1干扰素作为对酶的作用物，分析这个假说。

在其他的差异中，α-1干扰素在22-23位上含有SER-ARG。对含有蛋白酶的这个作用物保温后，检测不到任何水解。看来在22位上SER取代ARG，抑制了上面所述的由新的酵母二氨基肽酶所取代的那个部位上α干扰素分子的蛋白降解作用。

总之，我们现有的资料，对于在22位上修饰α-2干扰素，使其对该位置上的蛋白水解作用具有抗性的观点加深了。此外，正如在α-1干扰素中所发现的，在生物化学上并无任何理由来限制仅对SER的取代。

用于α-2干扰素基因中ARG22的密码子是AGG。在该密码子内，单个硷基变化的取代（统计学上最可能发生的自然事件）会导致22位上7个不同残基可能发生变化（Arg，GLY，lys，Ser，Met，Trp，Thr）。实际上，在天然分子的22位上，仅有4个会发生这种可能性。在自然界所观测到的残基为：Lys，Arg，Gly和Ser。这些取代包括嘌呤对嘌呤和嘌呤对嘧啶硷基的改变。然而形成的所有氨基酸的特征为极性R基因。因此，为了保持22位上极性氨基酸，还可能有某种压力可供选择。

在用于该饰变时，两个极性残基（Arg和Lys）必须排除，因为在其R基团上是正电荷。他们的用途仅仅是重新创造二氨基肽酶的识别部位。还有两个残基（Glu和Asp）也要被排除，他们的侧基是负电荷。至今还未曾知道，α干扰素在这个位置上会带有负电荷的氨基酸，而且这些残基还以不适宜的方法与其他残基相互作用（如盐桥）。在已知α干扰素中，仅有一种干扰素在22位上发现有Ser。许多种α干扰素在这个位置上都有Gly。

6个氨基酸以非常明显的局限性即具有不带电荷的极性R基团，成为可被取代的候选者（Ser，Thr，Cys，Tyr，Asn和Gln）。考虑到三级结构推断的重要意义就产生对Cys和Tyr的否定。在保留的残基中，天然α干扰素中Ser的存在有助于它的选择。所以没有理由认为，Thr，Asn或Gln不太适宜取代。从甘氨酸存在于若干α干扰素的这个位置的观点看来，人们也可把非极性氨基酸即甘氨酸加入此列。

5个可能性最佳的Ser，Thr，Asn，Gln和Gly，用M13噬菌体系统，通过α-2干扰素部位的酸殊诱变，很容易测试一切。我们对α-2干扰素的DNA顺序已经测定，这使选择所需要的寡核苷酸主要顺序方面大为简化。M13诱变技术的其余部分包括常规技术。

许多适用的载体是由单链噬菌体M13衍生的，他们用于寡核苷酸定向部位的特殊诱变，并提供单链DNA简单快速的分离方法。

由Messing研究的若干M13菌株（Meth.Enzymol.101〔2〕，1984年）可通过商业途径得到，将片段克隆到M13的基本方法也由他作过介绍。

为了诱变α-2IFN，把含有整个编码区的HindⅢ片段插入到若干市售M13载体的HindⅢ部位，即MP8，9，10，11，18，19。有关M13克隆的译细讨论，可参阅Wasylyk等的报告（PNAS，77∶7024，1980）。

插入的取向和链位可用市售M13通用引物，借助Di-Deoxy顺序测定。可以选择所需的链的克隆并将其用作单链模板。例如，可以用αIFN插入的（-）链。

为了针对所述的诱变及其与α2-IFN的（-）链杂交而设计的若干例寡核苷酸就其有兴趣的方面列表如下：

ALA    GLN    MET    ARG＊    ARG    ILE    SER

α-2    IFN（-）    5′    GCA    CAG    ATG    AGG    AGA    ATC    TCT    3′

取代ARG＊者：

Gly    3′    CGT    GTC    TAC    CCA    TCT    TAG    AGA    5′

Ser    3′    〃    〃    〃    TCA    〃    〃    〃    5′

Thr    3′    〃    〃    〃    TGC    〃    〃    〃    5′

Asn    3′    〃    〃    〃    TTG    〃    〃    〃    5′

Gln    3′    〃    〃    〃    GTT    〃    〃    〃    5′

所需的诱变寡核苷酸和单链模板DNA，用DNA聚合酶的大片段进行退火和扩大。通常在15℃下保温12～20小时。当引物沿着环状模板扩大后，新合成的链的两端用T4    DNA连接酶连接。

然后将生成的封闭环状异源双链DNA用于转化JM    101反应潜能细胞，为Sanger等所介绍（J.Mol.Biol，143∶161，1981年）。

单链噬菌体的分离和检查可用适当的扫描方法，α-2    IFN的顺序编制是用Di-Deoxy方法。

然而申请人并无企图来限制为提供在22～23位上缺乏ARG-ARG或ARG-LYS蛋白裂解部位α干扰素类似物的任何特殊方法。

当我们提出为了破坏二氨基肽酶的识别部位而修饰22位时，我们并没有排除修饰23位同时仍保持其生物活性的可能性。虽然α干扰素族系的顺序资料对容许修饰23位而言，提供的指导还不多。

本文所述类似物的最佳表达的宿主，其对α干扰素的主要蛋白水解活性是在22～23位上的ARG-ARG或ARG-LYS部位上。这可以是带有PEP-3-4突变的啤酒酵母，也可以是缺乏其他蛋白酶的另一个宿主。

Claims (13)

1、一种具有α干扰素活性并且在22和23位上缺乏二元二氨基肽酶识别部位的α干扰素类似物，所述部位是在类似天然干扰素种中发现的部位。

2、根据权利要求1的类似物，其中所述部位是ARG-ARG或ARG-LYS。

3、根据权利要求1的类似物，在22位上具有选自由丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺组成的系列中不带电荷的极性氨基酸。

4、根据权利要求3的类似物，在22位上具有丝氨酸。

5、根据权利要求2的类似物，在22位上具有甘氨酸。

6、根据权利要求2的类似物，其中类似物是干扰素α-2的类似物。

7、根据权利要求2的类似物，其中类似物是干扰素α-8的类似物。

8、根据权利要求1的类似物，所述类似物是以完整无损的方式能在带有PEP3-4突变的啤酒酵母中表达的类似物。

9、一种生产具有α干扰素活性的蛋白质的方法，包括转化含有携带遗传信息的载体的宿主，为在有利于信息表达的条件下根据权利要求1的类似物编码，以及收集表达类似物。

10、根据权利要求9的方法，其中宿主细胞对相应的天然α干扰素的主要蛋白水解活性是在22-23位上。

11、根据权利要求10的方法，其中宿主是带有PEP3-4突变的啤酒酵母。

12、一种能够在适宜的宿主中表达权利要求1的类似物的表达载体。

13、一种通过权利要求12的表达载体转化的宿主。

Images