CN1191088C - vMIP衍生物在防治艾滋病及炎性病变药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及vMIP衍生物在制药领域中的用途，尤其涉及在防治艾滋病及炎性病变药物中的应用。本发明用HHV8 vMIP的人工突变基因产物或/和人工合成短肽，可体外封闭HIV感染靶细胞的主要共受体，具有不引起靶细胞粘附反应、释放介质等人源趋化因子的功能，防治艾滋病的药品。由于这些人工突变物封闭了趋化因子受体，使趋化因子受体不能正常结合内源性趋化因子而具有抑制炎症反应的作用，可作为抗炎治疗性药物。本发明在制药工业上产业化前景好。

Description

vMIP的衍生物在制备防治艾滋病或由趋化因子介导的炎性病变药物中的应用

本发明涉及HHV8的MIP同源物的突变体或人工合成物的用途，尤其涉及HHV8的vMIP衍生物在防治艾滋病及炎性病变药物中的应用。

联合国1999年11月23公布，1999年死于艾滋病人数达二百六十万，新增感染者为五百六十万，其中半数为25岁以下青年，他们一般在35岁前发病死亡。在艾滋病预防方面，主要依据有针对HIV的有关疫苗。由于HIV基因变异问题，这些疫苗诱导的体液或细胞免疫都是型(Type)特异性的，似乎不能得到具有广泛保护性的疫苗抗原。单纯应用疫苗预防艾滋病效果不理想。在艾滋病治疗方面，目前主要用逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂(“鸡尾酒”疗法)拮抗病毒的增殖。已证明在用强有力的“鸡尾酒”疗法抗HIV治疗时，病毒水平仅短暂下降，大多数患者病毒浓度保持潜伏期的水平，而且是耐药的突变株病毒。况且此疗法虽可推迟艾滋病发病，但副作用很大，患者难以坚持终生用药。

人们也曾希望用人体内具有杀伤毒性的淋巴细胞、NK细胞等来消灭被HIV感染的细胞，但是这些细胞消灭HIV的同时也杀伤了免疫细胞，未能取得令人满意的效果。

近些年来，先后发现HIV进入细胞的近10种共受体，几乎都是细胞膜上的趋化因子受体，主要有CCR和CXCR两大类。共受体的发现对于抗HIV的药物设计和新型“疫苗”的研制具有重要意义。近两年来，陆续发现一些共受体的变异可明显阻止艾滋病的发生。例如，编码CCR5第二胞外区的核苷酸中缺矢32个碱基(Δ32)的纯合子对HIV的感染有很强的抵抗力，杂合子在感染HIV后长期不发病。当一个人的CCR5的第303位核苷酸从T突变为A时(m303)，他们的外周血单核细胞对HIV的感染产生抗性。同时具有Δ32和m303的人不会被性伙伴经性途径感染HIV。趋化因子(作为共受体的配体)的突变如SDF-1基因第801位的G突变为A时，亦能明显延缓HIV阳性者艾滋病的发生。所以，共受体或配体的突变都会显著抵抗或延迟HIV感染者艾滋病的发生，而且，这些人群虽有这些辅助受体或其配体的突变，无明显的健康障碍。

最近研究显示，HIV的变异可影响到所结合的共受体类型，如结合CC共受体的M向性HIV株，在体内可变异为T向性HIV株的特征即-结合CXC共受体。这进一步说明从HIV方面进行艾滋病防治的困难性。所以，目前从共受体方面进行艾滋病防治的研究倍受关注。目前国际上基于共受体防治艾滋病的包括：共受体抑制剂和趋化因子物。共受体抑制剂主要有共受体的中和抗体，共受体对其中和抗体很敏感，但抗体分子量过大，具有免疫源性，即负面作用较大。防治艾滋病的趋化因子物包括正常人源趋化因子、改造的人源趋化因子及病毒来源的趋化因子同源物，这些趋化因子物可以作为配体与共受体结合，从而封闭受体，使HIV不能与共受体结合。而且趋化因子均为小分子蛋白，至今未发现其有明显免疫源性。所以是目前理想的艾滋病防治物。

趋化因子是氨基酸序列高度保守的一类与炎症有关的细胞因子，分子量为8-10KD左右，主要由淋巴细胞、单核巨噬细胞、中性白细胞等分泌。趋化因子分为CXC、CC、～C和CX3C四类。CXC类中已发现的成员有IL-8、GROα、CROβ、CROγ、NAP-2、NAP-4、SDF-1、γIP-10、PF4、Mig等；CC类中已发现的有MCP1-5、MIP-1α、MIP-1β、RANTES、I³⁰⁹、STCP-1等；所有趋化因子均有可诱导性。趋化因子受体位于胞膜，以趋化因子为配体。趋化因子受体是单链的有7个跨膜结构域的G蛋白偶联蛋白质，通过与G-蛋白偶联进行信号传导的。CC趋化因子受体有CCR1-CCR5等；CXC类受体有CXCR1-CXCR4等。各趋化因子之间有交叉结合受体的特性。研究证明，CC和CXC类趋化因子如IL-8、PF4、MIP-1等的单聚体三维结构很相似，但这些趋化因子在晶体条件下形成各自不相同的二聚体。MIP-1β和MCP1的二聚体是拉长的圆柱形结构。趋化因子引起白细胞粘附或激活特异类型的白细胞如NK细胞的功能，已证明与许多疾病有关。MIP-1和MCP-1与动脉粥样硬化、风湿病、结核病等发生有关；IL-8、γIP-10、GRO等与急性炎症反应有关；SDF-1可刺激NK细胞产生，与某些变态反应有关，等等。

关于趋化因子的人工突变，对于人源性趋化因子的人工突变形式、突变体的作用等已有较多研究，如去除N-末端保守序列可得到趋化因子的抑制物，有的抑制物除抑制其来源的趋化因子本体外，也可抑制结合同一受体的其他趋化因子，因为他们均具有较高同源性。去掉N末端一段氨基酸突变的MCP-1，不但具有抑制内源性MCP-1的作用，而且也可以抑制与MCP-1结合相同受体的MCP-2、MCP-3、MIP-1α，MIP-1β、RANTES、PF-4、IP-10、GROα、GROβ、GROγ、NAP-2、ENA-78、CTAP-III、MIG、I-309等CC类趋化因子。对人趋化因子的研究也显示，去掉C末端部分氨基酸区域，还可保持趋化因子的全部活性，但若去除N末端部分氨基酸后，一般会改变趋化因子的活性。

中国专利申请，99116283.8，公开了一种名称为HHV8的MIP同源物在防治艾滋病的药物中的应用。该专利报导了由人疱疹病毒8(HHV8)编码的人MIP(macrophage infllamatory protein，MIP)同源物(简称vMIP)具有明显的封闭HIV共受体(CC类)作用，但不具备人MIP功能，即不激活共受体，是天然的HIV共受体封闭剂，可用于预防和治疗艾滋病。具有明显的应用价值。该发明用vMIP封闭HIV的CCR5，即封闭CC类趋化因子受体，为防治艾滋病提供了良好应用途径。但是，HIV病毒株除以CCR为共受体的M-向性株外，还存在有以CXCR为共受体的T-向性株如HIV-1等。而且由于近两年发现的HIV变异程度也涉及了其利用共受体的种类，如以CCR为共受体的HIV病毒株在体内可变异为用CXCR为共受体。

本发明的主要目的在于寻找能封闭CXCR的物质或同时封闭两类趋化因子受体即CCR、CXCR的物质，以对付以CXCR为共受体的HIV病毒株和/或变异株，并将其应用于防治艾滋病及炎性病变药物中。另一目的是寻找比天然vMIP基因工程产品更为简单化的小分子共受体封闭物，并将其应用于防治艾滋病及炎性病变药物中。

本发明的主要内容如下：

HHV8的vMIP的衍生物在防治艾滋病和由趋化因子介导的炎性病变药物中的应用。HHV8的vMIP的衍生物是指DNA分子或短肽分子，其序列是vMIP的DNA序列的不同人工突变物或vMIP氨基酸序列的不同人工合成物。这些衍生物是具有结合细胞的CXC类趋化因子受体或/和CC类趋化因子受体作用的去掉一段含有两个半胱氨酸的氨基酸序列或人工合成其中一段有一个半胱氨酸的8残基短肽。vMIP-II’是HHV8的K4基因去除第91-123位核苷酸即去除相应的11个氨基酸，vMIP-II”去除第91-156位核苷酸即去除相应的22个氨基酸，vMIP-I’HHV8的K6基因保留第94-240位核苷酸即保留相应的第32-80位氨基酸的DNA分子。它们是用载体-工程菌表达为所编码的蛋白质产物。vMIP-人工肽衍生物是HHV8的K6基因编码的氨基酸序列中第56-62位或第58-65位或第73-80位的氨基酸序列的人工合成短肽。

通过计算机分子模拟得出可结合CXCR的人工改造的vMIP-II’、vMIP-II”、vMIP-I’序列，其序列分别为：

vMIP-II’的DNA序列：

 1  atggacacca agggcatcct gctcgtcgct gtgctgactg ccttgctttg tttgcaatct

61  ggggacacgc tgggagcgtc ctggcataga ..........

121  ...ccattac cacaggtgct tctgtccagc tggtacccca cctcccaact gtgcagcaag

181  ccgggtgtga tatttttgac aaagcgtggt cgccaggtgt gtgccgacaa atcgaaagac

241  tgggtgaaga agctgatgca gcaattacca gtcactgctc gctga

vMIP-II’的氨基酸序列：

MDTKGILLVAVLTALLCLQSGDTLGASWHR...PLPQVLLSSWY

PTSQLCSKPGVIFLTKRGRQVCADKSKDWVKKLMQQLPVTAR

vMIP-II”的DNA序列：

 1  atggacacca agggcatcct gctcgtcgct gtgctgactg ccttgctttg tttgcaatct

61  ggggacacgc tgggagcgtc ctggcataga ...ccca cctcccaact gtgcagcaag

181  ccgggtgtga tatttttgac aaagcgtggt cgccaggtgt gtgccgacaa atcgaaagac

241  tgggtgaaga agctgatgca gcaattacca gtcactgctc gctga

vMIP-II”的氨基酸序列：

MDTKGILLVAVLTALLCLQSGDTLGASWHR...YPTSQL

CSKPGVIFLTKRGRQVCADKSKDWVKKLMQQLPVTAR

vMIP-I’的DNA序列：

 94  acgccta atagctgctg ctacgggttc

121  cagcagcacc caccgcccgt ccaaattcta aaagagtggt atcccacgtc cccagcgtgc

181  ccaaaacccg gagttatttt gctgaccaag cgagggcgtc agatctgcgc agacccttcc

vMIP-I’的氨基酸序列：

TPNSCCYGFQQHPPPVQILKEWYPTSPACPKPGVIL

LTKRGRQICADPS

用PCR定点缺失方法获取vMIP-II’、vMIP-II”和vMIP-I’序列片断，克隆于表达载体，经I¹²⁵SDF-1α竞争结合法已初步证明这些突变体可结合CXCR4，且不引起细胞粘附反应。同时，为了寻找人工小分子肽作为HIV共受体封闭剂，以K6氨基酸序列为基础，用空间结构模拟、人工合成肽库等法，确定了三个人工化学合成的8残基肽，其序列分别为：PTSPACPK、PACPKPGV和RQICADPS，并证明它们也具有结合CCR5的作用。

本发明具有如下突出优点：

1、为预防与治疗艾滋病开辟了一条新途径。

本发明用病毒来源的基因产物的衍生物封闭HIV感染的共受体，具有不引起宿主细胞粘附反应、释放介质等人源趋化因子的功能。从目前的试验看，此病毒趋化因子的衍生物可有效地封闭HIV两类主要共受体，不引起细胞粘附反应等优点。而其他人源趋化因子虽封闭HIV辅助受体，但也引起不必要的细胞粘附反应。所以这些HHV8的vMIP衍生物在趋化因子类物质防治HIV感染中具有明显的优点和较好效果。比HHV8的天然vMIP作用更宽，可与天然vMIP相互补充，有效地封闭HIV的共受体，使有效控制艾滋病成为可能。

2、HHV8的vMIP的人工衍生物可用于趋化因子介导疾病的防治。

本发明用HHV8的vMIP基因衍生出的人工突变物或人工化学合成物具有结合CXC受体和/或CC受体，不引起受体激活反应，既具有封闭受体作用。此作用可使人体内的同源性趋化因子不能正常结合于相应的CXC受体或CC受体，不能发挥其引起细胞游走、粘附及释放介质等作用，即抑制了人体内的内源性趋化因子的正常作用。因此，这些HHV8的vMIP基因的衍生物可用于需拮抗炎症反应治疗的药物或用于由于炎症细胞如单核细胞、淋巴细胞引起病损的疾病如动脉粥样硬化、风湿病、单核细胞增多症等的治疗用药物中。

3、实现本发明前景好，可以用基因工程方法和人工化学合成等方法得到纯的HHV8的vMIP的衍生物，这些衍生物为小分子肽，极少引起机体的免疫反应。

4、HHV8的vMIP基因的衍生物可单独用作封闭受体抑制HIV感染或抗炎性治疗药物中，也可与其天然vMIP基因产物一同应用或与其他药物联合应用。

5、本发明所用的基因工程生产重组蛋白技术较成熟，成本低廉，终产物为分泌型蛋白故工艺程序较简单。这些基因工程等生物技术难度不大，根据目前技术水平在制药工业上能够工业化生产。人工合成方法已普及化、容易掌握。

附图1为HHV8的vMIP的人工衍生物阻断HIV进入靶细胞以及拮抗细胞炎症反应的示意图。

附图2为PCR人工突变方法的突变引物位置示意图。

通过如下实施例及其附图对本发明作进一步的描述。

实验证明HHV8的vMIP基因K4或K6的人工突变物或人工合成物具有结合HIV共受体的作用和抑制白细胞炎性反应作用。如图1所示，这些人工突变物或人工合成物通常与趋化因子受体包括CXCR和CCR结合，从而阻断HIV感染进入靶细胞内，或抑制炎症细胞在内源趋化因子作用下的炎性反应。实验过程的主要步骤如下：

1、应用计算机软件Primer3设计的HHV8开放读框K4、K6全长基因的引物为：

K4：    5’-atggacaccaagggcatcc--3’   (5’端引物)

        5’-tcagcgagcagtgactggtaa--3’ (3’端引物)

K6：    5’-atggcccccgtccacgtttt--3’  (5’端引物)

        5’-ctaagctatggcaggcagc--3’   (3’端引物)

并分别用BLAST软件检查无人源相似序列。

2、从一证实有HHV8病毒而无EB病毒感染的淋巴瘤细胞株BCBL基因组DNA中扩增出全长K4或K6基因片断，约290bp。T/A法将K4或K6片段克隆于扩增载体pUC19质粒。

3、K4的人工突变序列vMIP-II’为其缺失第91-123位核苷酸(即缺失第31-41位氨基酸的突变体)和vMIP-II”为其缺失第91-156位核苷酸(即缺失第31-52位氨基酸的突变体)，应用PCR定点突变方法，使中部缺失一段序列，所用突变引物位置如图2所示。K6的人工突变序列vMIP-I’为其第94-240位核苷酸(即第32-80位氨基酸的突变体)应用PCR方法去掉两端的部分序列，突变引物位置如图2所示。

4、所得突变DNA片断克隆于哺乳类表达载体pDEST26(K4突变物vMIP-II’)、pDEST12.2(K6突变物vMIP-I’)和原核表达载体pDESF14(K4突变物vMIP-II”)。

5、用脂质包裹法转染pDEST26-vMIP-II’和pDEST12.2-vMIP-I’载体到NIH3T3的细胞。用RT-PCR法测得转染的3T3细胞有vMIP-II’或vMIP-I’的mRNA转录。

6、pDESF14-vMIP-II”用DH5α菌株表达，分子量约为7KD，过柱纯化。

7、K6基因编码的氨基酸序列中N末端区域(第31-91位)用多个8联氨基酸的人工合成产物，通过计算机模拟显示和体外外周血白细胞受体结合试验(下述)证实，具有结合受体活性的8残基短肽如下：PTSPACPK、PACPKPGV和RQICADPS。

8、密度梯度(Ficoll-Hypaque)离心法分离正常人外周血淋巴细胞，含10％小牛血清的1640培养基在37℃，8％CO₂，30min条件下培养以分离单核细胞，分离的淋巴细胞和单个核细胞培养24小时后用于试验。

9、配体-受体结合实验：用转染及未转染(作为对照)的NIH3T3细胞的培养上清液(换液后24hrs)作为条件培养基及正常PRMI1640培养基培养的外周血淋巴细胞与I¹²⁵标记的人源趋化因子SDF-1α(10cpm/ml)共同孵育37℃、30min，用含2mg/ml葡萄糖和1mg/ml BSA的PBS洗去未结合的I¹²⁵-SDF-1α。γ计数测得两种培养条件下淋巴细胞的I¹²⁵结合率。结果表明，在用转染条件培养基的细胞I¹²⁵吸收率明显地降低(见表1)说明转染的3T3细胞培养液中的vMIP-I’、vMIP-II’可与I¹²⁵-SDF-1α竞争结合受体。

表1 I¹²⁵-SDF-1α和vMIP-I’、vMIP-II’在外周血淋巴细胞的配体-受体结合率(％)

处理条件    未转染条件培养基    转染后的条件培养基

vMIP-I’      63.8±12.5^a           40.4±8.6^a

vMIP-II’     58.5±9.4^b            28.5±4.9^b

a，p≤0.05；b，p＜0.05  n＝9

用I¹²⁵标记的SDF-1α与大肠杆菌表达的vMIP-II”共同孵育外周血淋巴细胞30min，洗去未结合I¹²⁵-SDF-1α，测得淋巴细胞的I¹²⁵结合率如表2所示。

表2 I¹²⁵-SDF-1α和vMIP-II”在外周血淋巴细胞的配体结合率(％)

条件          对照组       vMIP-II”(1μg/μl)      vMIP-II”(5μg/μl)

          (仅I¹²⁵-SDF-1α)

vMIP-II”    68.0±11.2      31.2±10.2^a               12.6±4.2^b

a，b，p＜0.01； n＝9

同样方法证明，vMIP-I’、vMIP-II’、vMIP-II”可与I¹²⁵-MIP-1α竞争结合外周血单个核细胞的CCR5，但其竞争作用弱于天然的vMIP-I或vMIP-II。

10、细胞粘附实验：外周血淋巴细胞对细胞间粘附分子(ICAM-1)的粘附，用新鲜分离的外周血淋巴细胞，以10⁴细胞/孔密度接种于ICAM包被(约1000个点/mm3)的24孔培养板，分别用转染vMIP-I’或vMIP-II’(换液后48hr)的条件培养基和含人SDF-1α(1μm)的培养基孵育不同时间(5分、15分、30分)后洗去未结合细胞，光镜下计数每孔细胞数，每组六个孔，计算结合细胞占输入细胞总数的百分率。重复实验三次，结果如表3所示。

表3 vMIP-I’、vMIP-II’和人MIP-1α引起的外周血淋巴细胞对ICAM的粘附率(％)

时间         对照(0分)      5分         15分          30分

人MIP-1α    5.0±1.3    35.0±11.3   45.5±9.6    39.2±10.8

vMIP-I’       6.5±1.5    13.5±2.5    21.0±3.8    18.2±4.2^a

vMIP-II’      6.4±2.1    18.9±6.2    22.8±5.6    16.4±7.8^b

与人MIP-1α相比，a，b，p＜0.01；n＝18

同样的方法获得vMIP-II”与人SDF-1α引起外周血淋巴细胞粘附的结果如表4所示。可知vMIP-II’具有较强抑制人SDF-1α引起靶细胞粘附的能力。

表4 vMIP-II”和人SDF-1α引起外周血淋巴细胞对ICAM的粘附率(％)

时间         对照(0分)       5分          15分         30分

人SDF-1α    3.6±0.7    66.3±13.1    51.2±11.6    38.7±9.3

vMIP-II”    4.5±1.1    7.6±4.2      9.7±3.1      13.4±4.7^a

与人SDF-1α相比，a，p＜0.01；n＝18

11、人工合成的K6的8残基短肽，同样应用细胞粘附方法和配体受体结合实验证明此三个短肽具有与人MIP-1α竞争结合受体的作用，且不引起明显细胞粘附反应。此三个短肽竞争结合受体的作用用结合抑制率表示，即结合抑制率＝人MIP-1α结合率-合成肽的结合率/人MIP-1α结合率x100％。在5μg/ml合成肽作用1hr时的结合抑制率(n＝9)为：PTSPACPK52.5％；PACPKPGV 30.2％；RQICADPS 41.6％。在合成肽为5μg/ml，MIP-1α为1μM，作用时间为10分钟的条件下，各合成肽与人MIP-1α的粘附抑制率(n＝9)为：PTSPACPK 80.2％；PACPKPGV26.6％；RQICADPS35.7％。粘附抑制率＝人MIP-1α粘附率-合成肽的粘附率/人MIP-1α粘附率×100％。

以上实验证明：HHV8的K4人工突变物vMIP-II’、vMIP-II’、K6的人工突变物vMIP-I’均可不同程度地结合外周血淋巴细胞的SDF-1α受体(CXCR4)和外周血单个核细胞的MIP-1α受体(CCR5)，且极少引起细胞粘附反应。K6的三个人工合成8肽也具有较明显结合CCR5、不激活受体的作用。由于CCR5和CXCR4均是HIV感染的主要共受体，所以，这些人工衍生物具有抑制HIV感染靶细胞的作用。艾滋病的特征为HIV病毒的快速增殖并感染淋巴细胞而导致的机体免疫功能减弱，抑制HIV与其共受体结合，对艾滋病具有预防和治疗的作用。

外周血单核淋巴细胞均为主要炎症细胞，MIP-1α、SDF-1α也为主要炎症介质，由于这些K4、K6的人工突变体或人工合成物可抑制这些炎症介质引起的细胞粘附等炎症反应，故可用于某些抗炎治疗，如喉头急性炎症、慢性单核细胞增生等疾病，以及某些与白细胞有关的疾病如动脉粥样硬化、风湿病等的防治。这些人工突变体或合成物封闭受体，故可抑制结合此类受体的所有炎症介质，而且可能也可结合同类的其他受体，具有广泛的抗炎作用。

Claims (2)

1、HHV8的vMIP的衍生物在制备防治艾滋病或由趋化因子介导的炎性病变药物中的应用，其特征在于所述HHV8的vMIP的衍生物是指HHV8的vMIP-II’、vMIP-II”、vMIP-I’、以及序列分别为PTSPACPK、PACPKPGV和RQICADPS的人工化学合成的8残基肽；vMIP-II’是HHV8的K4基因去除第91-123位核苷酸即去除相应的11个氨基酸所得的肽，vMIP-II”是去除第91-156位核苷酸即去除相应的22个氨基酸所得的肽，vMIP-I’是HHV8的K6基因保留第94-240位核苷酸即保留相应的第32-80位氨基酸所得的肽。

2、根据权利要求1所述的HHV8的vMIP的衍生物在制备防治艾滋病或由趋化因子介导的炎性病变药物中的应用，其特征在于所述HHV8的vMIP的衍生物是指编码HHV8的vMIP-II’、vMIP-II”、vMIP-I’的肽的DNA分子。

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