CN102327241A - 一种聚乙二醇-集成干扰素变异体冻干制剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种聚乙二醇-集成干扰素变异体注射剂，所述注射剂包括每毫升50-500微克的聚乙二醇-集成干扰素变异体蛋白，以及包括保持pH在4.5-7.5的缓冲体系、稀释剂和稳定剂，本发明聚乙二醇-集成干扰素注射剂稳定，适合长期储存。

Description

一种聚乙二醇-集成干扰素变异体冻干制剂

技术领域

本发明涉及一种聚乙二醇-集成干扰素变异体冻干制剂，属于药物制剂领域。

背景技术

早在1957年，lssacs等人发现病毒感染的细胞产生一种因子，可抵抗病毒的感染，干扰病毒的复制，因而命名为干扰素（interferon,IFN）。干扰素是由灭活的或活的病毒作用于易感细胞后，由易感细胞基因组编码而产生的一组糖蛋白。其活性及抗原性皆取决于分子中的蛋白质，而与其糖基无关。根据其来源和结构，可将IFN分为IFN-α、IFN-β、IFN-γ，它们分别由白细胞、纤维母细胞和活化T细胞产生。IFN-α为多基因产物，有十余种不同亚型，但它们的生物活性基本相同。IFN除有抗病毒作用外，还有抗肿瘤、免疫调节、控制细胞增殖及引起发热等作用。目前临床上使用的干扰素大多是通过基因重组技术得到的。

IFN是慢性病毒性肝炎经临床验证有效的一线治疗药物。临床使用较多的是天然结构的IFNα-2a和IFNα-2b。二者均属于短效干扰素，半衰期短(4～16 h)，血清浓度在注射24 h后已经很低。其在体内的药代动力学过程影响了其抗病毒治疗的远期疗效。按照目前3~6MU/kg，每周3次的用药方法，在体内干扰素水平呈现出典型的“峰-谷曲线”。干扰素血清水平大幅度波动容易使病毒水平反跳，产生耐药性，降低治疗效果。同时，短效干扰素存在毒副反应大，人长期使用耐受性差，免疫原性强等不足。因此，对短效干扰素进行修饰，延长其在体内的半衰期，维持体内血药浓度的稳定，将有助于提高其治疗病毒性肝炎的有效性，并减轻毒副作用。

为提高天然干扰素的活性，美国Amgen公司首次合成了一种非天然的干扰素（Consensus interferon,集成干扰素，商品名为干复津）。干复津是一种经计算机优化组合的非天然的重组α-干扰素，其序列由20种天然α-干扰素亚型序列优化组合而成，其抗病毒活性比天然干扰素提高了5～10倍。1997年，FDA批准干复津应用于丙型肝炎的治疗，研究结果显示疗效明显优于普通干扰素。美国专利US4695623、US4897471、US5372808公开了复合干扰素具有广谱的干扰素活性，有较强的抗病毒和抗肿瘤以及激活NK细胞的活性。但是干复津和天然α干扰素相同，具有稳定性差、体内半衰期短、免疫原性强等缺点。同时N端第一位的半胱氨酸需与99位半胱氨酸形成二硫键，不能有效的进行N末端修饰。虽然Amgen公司的美国专利US005985265 A公开了和干复津蛋白的N端修饰的方法，但无论在修饰率和修饰后保留的生物活性均明显低于其它蛋白的N末端修饰（重组人粒细胞集落刺激因子G-CSF和重组人生长激素GH等）。

在干复津基础上，根据同源序列最高原则，发明人设计了全新的集成干扰素序列，命名为集成干扰素变异体（super antiviral interferon,简称IFN-SA），现根据干扰素的命名原则改为重组集成干扰素变异体（或称重组复合干扰素变异蛋白）。由171氨基酸组成，在N末端专门设计引入Gly Ser Gly Gly Gly五个氨基酸序列，可实现N末端的专一位点PEG修饰。该结构与干复津结构不同，同时体外抗病毒活性提高了50%。本新型结构及其重组制备和在抗病毒性疾病中的应用，已获中国发明专利授权，专利号：ZL01102915.3。

然而，与其它蛋白质一样，使用集成干扰素变异体作为药物通常也会受到一些缺点的限制，包括免疫原性和半衰期短，其免疫原性导致中和抗体的形成以及临床治疗效果的损失，半衰期短则意味着需要对患者频繁给药以维持蛋白的有效治疗浓度。

聚乙二醇(polyetnylene glycol， PEG)是一种安全无毒、无活性的聚合物，常用于蛋白质药物修饰。修饰后的蛋白抗酶解、水溶性增加、半衰期延长、免疫原性和毒性降低（Inada,et al.,J.Bioact .And Compatible Polymers,5:343(1990). Delgalo,et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier systems,  9:249 (1992)    katre,Advanced Drug Delivery Systems,10:91(1993)）。

然而，尽管干扰素-聚合物缀合物在临床上有效，但是该类缀合物在临床实践中的广泛使用，需要能够在生产和分发给医疗机构期间的一段延长期内储存的制剂。干燥是保持物质不致腐败变质的方法之一，然而一些干燥方法是在0℃以上或更高的温度下进行。干燥后产品的理论和生物学性质会发生很大的变化，而冷冻干燥是发生在0℃以下，是指通过升华从冻结的物料中除水分或其它溶剂的过程。升华指的是溶剂，比如水，象干冰一样，不经过液态，从固态直接变为气态的过程，冷冻干燥得到的产物称作冻干物，该过程称作冻干。在冷冻干燥过程中样品的结构不会被破坏，因为固体成分被在其位置上的坚冰支持着，在冰升华是，它会留下孔隙在干燥的剩余物质里，这样就保留了产品的生物和化学结构及其活性的完整性。

目前，冷冻干燥法常用于许多生物活性材料（包括多肽、蛋白质等）的保存，但是，冻干法也有其自身的局限性，如在冷冻和除水过程中，蛋白过浓，可能会导致产物的不稳定。因此，除了在冻干状态以及液态都可以发生的脱酰胺作用以及氧化反应外，冻干法可能导致交联（生成共价寡聚物）以及非共价聚合物比例的升高，为了增强生物活性材料的稳定性，经常需要一些保护剂。

目前，大多数注射用蛋白类生物品的保护剂通常选用人血白蛋白，而人血白蛋白价格昂贵，致使该冻干产品成本高，另外人血白蛋白具有携带病毒的危险。为了解决这个问题，许多人正致力于蛋白类冻干制剂的研究，尝试以其它物质代替人血白蛋白作为冻干保护剂，如中国专利CN1260171A中选用右旋糖酐作为重组干扰素的冻干保护剂，也有用甘露醇作为冻干保护剂，在用甘露醇作为冻干保护剂时，往往会出现复溶性差、影响蛋白效应的问题，而单用右旋糖酐，对于有些蛋白，不利于其长时间保存，制剂稳定性相对较差。

已知在某些状态下氨基酸可以作为冻干蛋白产品的保护剂，据报道，谷氨酸钠和赖氨酸盐，对一种蛋白，乳酸脱氢酶的冷冻变性具有防冻作用（Seguro, et al. ,Cryobiology 27:70-79(1990)）等其它种类的分子，包括单糖和二糖，比如乳糖和海藻糖，以及聚合物比如PVP，也有报道作为冻干蛋白的保护剂，但对于这些二糖（乳糖和海藻糖），其价格昂贵，用其做低温保护剂时成本较高。但是，由于不同蛋白质本身理化性质的差异，对任一给定的蛋白产品，他们的效用是无法预测的。

目前，上市的聚乙二醇集成干扰素变异体制剂仍然没有，因此，需要提供一种稳定的、可供临床方便使用、并且适宜储存的制剂。

发明内容

本发明的目的在于提供一种稳定的并适合长期储存的聚乙二醇-集成干扰素变异体冻干制剂，本发明制剂复溶性好，性能更稳定，适于长期保存。

本发明所述聚乙二醇-集成干扰素变异体冻干制剂，包含每毫升50至500微克的聚乙二醇-集成干扰素变异体，以及包含保持pH在4.5-7.5的缓冲体系、一定量的低温保护剂，其中，所述的集成干扰素变异体是在N末端设计引入GlySerGlyGlyGly五个氨基酸序列，并在集成干扰素成熟氨基酸序列的Arg¹²¹突变为Lys¹²¹、Asp¹⁶⁶突变为Glu¹⁶⁶。

本发明中，所述的保持pH值在4.5-7.5的缓冲体系可以是醋酸盐缓冲体系、碳酸盐缓冲体系、枸橼酸盐缓冲体系或磷酸盐缓冲体系。

本发明中，优选的缓冲体系为磷酸盐缓冲体系，优选的pH值范围为6.5-7.5。

所述的低温保护剂，包括甘露醇、右旋糖酐或海藻糖中的任意一种或两种组合，优选为右旋糖酐与海藻糖的组合，右旋糖酐与海藻糖的比值为1~4。

本发明的研究人员发现，将右旋糖酐与海藻糖以一定比例混合后，作为冻干产品的低温保护剂，可以获得较单用右旋糖苷更为稳定的聚乙二醇干扰素变异体冻干制剂，保存时间更长。

本发明中，所述聚乙二醇集成干扰素变异体冻干制剂，还可进一步包括稳定剂，所述稳定剂可以是碱性氨基酸或聚山梨酯中的任意一种或多种，碱性氨基酸可以是，比如精氨酸或赖氨酸，或盐酸精氨酸或盐酸赖氨酸，碱性氨基酸的用量为25-40mg/ml；所述聚山梨酯为聚山梨酯80，用量为0.05-0.20mg/ml。在冻干制剂中，加入一定量的稳定剂后，制剂稳定性可相应地得到提高。

作为聚乙二醇-集成干扰素变异体缀合蛋白，所用的聚乙二醇，可以是直链聚乙二醇，也可以是支链聚乙二醇，优选为直链聚乙二醇，更为具体地，偶联本发明集成干扰素变异体的聚乙二醇为单甲氧基聚乙二醇（mPEG）醛，如可以是单甲氧基聚乙二醇乙醛、单甲氧基聚乙二醇丙醛、单甲氧基聚乙二醇丁醛，以实现对集成干扰素N末端的定点修饰，所用的mPEG的分子量范围可以选自是5000-50000，优选为10000-20000的范围，如可以是mPEG₁₂₀₀₀，mPEG₂₀₀₀₀。

本发明中，在作为一种冻干原液时，在用水配制后，它含有下列组分：

50至500微克的聚乙二醇-集成干扰素变异体，其中所述集成干扰素变异体是在N末端设计引入GlySerGlyGlyGly五个氨基酸序列，并在集成干扰素成熟氨基酸序列的Arg¹²¹突变为Lys¹²¹、Asp¹⁶⁶突变为Glu¹⁶⁶；

保持pH为6.5-7.5的NaH₂PO₄.2H₂O-Na₂HPO₄.12H₂O缓冲体系；

3%-6%的右旋糖酐(w/v)；

重量比为1%-4%的海藻糖(w/v)；

其中，右旋糖苷与海藻糖的重量比为1~3；

25-35mg/ml的盐酸赖氨酸，以及，

0.05-0.15mg/ml的聚山梨酯80；

注射用水。

注射液中，聚乙二醇-集成干扰素为在N末端GlySerGlyGlyGly上进行单一修饰的单甲氧基聚乙二醇-集成干扰素变异体。

修饰集成干扰素的聚乙二醇，为分子量为12kDa或20kDa的mPEG。

当将所得的稳定的冻干前液进行冻干后，可以得到更利于储存是冻干粉针型注射剂。

本发明的一个实施例中，研究了不同比例的右旋糖酐-海藻糖低温保护剂系统，在制成冻干制剂后所得产品的稳定性，结果表明，当海藻糖在低温保护系统中比例达到25%左右时，所得冻干产品的稳定性明显较不使用海藻糖的右旋糖酐强，但当达到50%左右时，其稳定性提高不明显。

本发明的再一实施例中，给出了具体制备本发明所述聚乙二醇-集成干扰素变异体冻干制剂的处方组成，三个处方制成的聚乙二醇-集成干扰素变异体冻干制剂，在4℃条件下保存24个月，以水复溶后检测，聚乙二醇-集成干扰素变异体的活性保留率以及单聚乙二醇-集成干扰素变异体含量变化不大，所得制剂稳定。

本发明的还一实施例中，在给定的右旋糖酐-海藻糖体系中，加入一定比例的稳定剂碱性氨基酸，比如盐酸赖氨酸，得到的冻干制剂，稳定性有一定提高。

实施例

本发明通过下述实施例进一步阐明，但任何实施例或其组合不应当理解为对本发明的范围或实施方式的限制。本发明的范围由所附权利要求书限定，结合本说明书和本领域一般常识，本领域普通技术人员可以清楚地明白权利要求书所限定的范围。在不偏离本发明的精神和范围的前提下，本领域技术人员可以对本发明的技术方案进行任何修改或改变，这种修改和改变也包含在本发明的范围内。

实施例1  制备mPEG_20kDa-IFN-SA

IFN-SA溶液（3.5mg/ml）溶于磷酸钠浓度为100mM，pH6.0内含20mM NaCNBH₃的溶液中，4℃冷却后充分混匀，加入超出4倍摩尔量的甲氧基聚乙二醇醛（mPEG-丙醛，平均分子量为20kDa）。

在反应过程中蛋白质的修饰程度用反相HPLC来监测， 10小时后，反相HPLC分析结果表明，80%的N-末端具有未封闭的α氨基的蛋白质转变成mPEG-IFN-SA衍生物。

在10小时时间点，反应混合物用水稀释5倍，mPEG-IFN-SA衍生物的纯化用离子交换层析来完成，其所用的柱为Hiload 16/10 S Sepharose HP柱，以20mM的醋酸钠缓冲液pH5.5加以平衡，反应混合物以1ml/min的流速装入柱内，未反应的mPEG醛以3倍于柱体积的相同缓冲液加以洗脱，然后在4℃条件下进行蛋白质-聚合物连接分子的洗脱，以0%-75%的20mM醋酸钠缓冲液进行线性洗脱420min，缓冲液pH为5.5，含有1M NaCl，合并mPEG-IFN-SA衍生物的流份，经浓缩后再过滤。

实施例2  配置下列比例的冻干原液，并冻干成成品

Na₂HPO₄.12H₂O，2.58mg/ml，NaH₂PO₄.2H₂O，0.44mg/ml；

(1) 3.5%的右旋糖酐(w/v)+3.5%海藻糖(w/v)；

(2) 3.5%的右旋糖酐(w/v)+1.1%海藻糖(w/v)；

(3) 3.5%的右旋糖酐(w/v)+1.7%海藻糖(w/v)；

(4) 4%的右旋糖酐(w/v)+1%海藻糖(w/v)；

(5) 4%的右旋糖酐(w/v)+0.5%的海藻糖(w/v)；

(6) 5.2%的右旋糖酐。

按比例，取右旋糖酐、或不同比例的右旋糖酐-海藻糖，以pH为6.5-7.5的磷酸盐缓冲液配制，过滤除菌，制备含不同比例的右旋糖酐或右旋糖酐-海藻糖低温保护剂的mPEG20_kDa-IFN-SA溶液，每毫升溶液中含有mPEG_20kDa-IFN-SA  50-160μg/ml，充分混匀，分装为1ml/瓶，进行冷冻干燥，制备得到冻干制剂，保存。

将样品以水再溶解，同时测定mPEG20_kDa-IFN-SA生物活性(IU/ml)、单个mPEG20_kDa-IFN-SA的纯度，结果见表1，表1为不同保护剂对mPEG20_kDa-IFN-SA在4℃保存的稳定性。

在4℃条件下，放置24个月，测定其活性下降以及单聚乙二醇含量变化情况，结果见表1。

表1 加入不同冻干保护剂对mPEG-IFN-SA 在4℃放置稳定性比较

从上表结果可以看出，mPEG-IFN-SA在右旋糖酐-海藻糖低温保护剂中，4℃放置2年后，干扰素的活性保留率在起始活性的80%以上，单mPEG-IFN-SA也都在90%左右，而当仅用甘露醇时，4℃放置2年后，其活性保存率仅为起始活性的70%左右，下降明显比甘露醇-海藻糖低温保护系统要快，且其单mPEG-IFN-SA含量也仅为约82%，低于甘露醇-海藻糖约90%的纯度水平，在各不同比例的右旋糖糖-海藻糖低温保护剂中，其比例在4:1-1:1的范围内，活性保留率相差不大，升高海藻糖的比例，此时也不能明显提升mPEG-IFN-SA的稳定性。   

实施例3

     mPEG_20kDa-IFN-SA         160μg/ml

     Na₂HPO₄.12H₂O           2.58mg/ml

     NaH₂PO₄.2H₂O            0.44mg/ml

     右旋糖酐                 3.86mg/ml

     海藻糖                   1.24mg/ml

制备方法和过程：

按以下稀释液配方准确配制稀释液，配制后用于稀释原液，所用器皿需经过无热原处理，全过程无菌条件操作。稀释液配方：右旋糖酐3.86g，海藻糖1.24 g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.58 g ，NaH₂PO₄·2H₂O 0.44 g，注射用水准确定容至1 L，稀释液pH到7.2左右

取检定合格的聚乙二醇重组集成干扰素变异体原液，精密量其体积，用稀释液稀释至蛋白浓度为0.16mg/ml，无菌过滤，得半成品。

将2 ml西林瓶及胶塞进行无菌无热原处理，于半成品直接接触的分装机器的管道及分装针头等无菌无热原处理，无菌条件下分装半成品，每瓶装量1ml半成品溶液，冷冻干燥，得成品。

实施例4

     mPEG_20kDa-IFN-SA         160μg/ml

     Na₂HPO₄.12H₂O           2.58mg/ml

     NaH₂PO₄.2H₂O            0.44mg/ml

     右旋糖酐                 4.08mg/ml

     海藻糖                   1.36mg/ml

制备工艺同上，磷酸盐缓冲体系调节pH至6.8

实施例5

     mPEG_20kDa-IFN-SA         160μg/ml

     Na₂HPO₄.12H₂O           2.58mg/ml

     NaH₂PO₄.2H₂O            0.44mg/ml

     右旋糖酐                 4.47mg/ml

     海藻糖                   1.96mg/ml

制备工艺同上，磷酸盐缓冲体系调节pH至7.0

实施例6

     mPEG_20kDa-IFN-SA         160μg/ml

     Na₂HPO₄.12H₂O           2.58mg/ml

     NaH₂PO₄.2H₂O            0.44mg/ml

     右旋糖酐                 4.47mg/ml

     海藻糖                   1.96mg/ml

     盐酸赖氨酸               31.6mg/ml

    制备工艺同上，磷酸盐缓冲液调pH至7.2

分别检测三个制剂成品4℃存放24个月后的质量标准，见表2。

从上述标准中可以看出，三个实施例配方所制备得到的mPEG_20kDa-IFN-SA冻干制剂，在4℃存放24个月，其干扰素活性保留率高，mPEG_20kDa-IFN-SA含量降低不明显，加入一定比例的盐酸赖氨酸后，其稳定性相对也更佳，四个不同冷冻保护剂处方实施例均可获得稳定的冻干产品制剂。

实施例7

mPEG_20kDa-IFN-SA         160μg/ml

 Na₂HPO₄.12H₂O           2.58mg/ml

 NaH₂PO₄.2H₂O            0.44mg/ml

 右旋糖酐                 4.47mg/ml

海藻糖                   1.96mg/ml

盐酸赖氨酸               31.6mg/ml

聚山梨酯80               0.1mg/ml。

按以下稀释液配方准确配制稀释液，配制后用于稀释原液，所用器皿需经过无热原处理，全过程无菌条件操作。稀释液配方：右旋糖酐4.47g，海藻糖1.96 g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.58 g ，NaH₂PO₄·2H₂O 0.44 g，盐酸赖氨酸31.6g，聚山梨酯0.1g，注射用水准确定容至1 L，稀释液pH到7.0左右。

取检定合格的聚乙二醇重组集成干扰素变异体原液，精密量其体积，用稀释液稀释至蛋白浓度为0.16mg/ml，无菌过滤，得半成品。

将2 ml西林瓶及胶塞进行无菌无热原处理，于半成品直接接触的分装机器的管道及分装针头等无菌无热原处理，无菌条件下分装半成品，每瓶装量1ml半成品溶液，冷冻干燥，得成品。

所得成品，于4℃存放24个月，用水溶解，测定聚乙二醇干扰素变异体效价及单聚乙二醇干扰素变异体含量，干扰素效价保留率可达到标示量的97%，单聚乙二醇干扰素变异体含量为标示量的97.95%。

Claims (9)

1.一种聚乙二醇集成干扰素变异体冻干制剂，包含每毫升50至500微克的聚乙二醇-集成干扰素变异体，以及包含保持pH在4.5-7.5的缓冲体系、冻干保护剂的混合物，其中所述集成干扰素变异体是在N末端设计引入GlySerGlyGlyGly五个氨基酸序列，并在集成干扰素成熟氨基酸序列的Arg¹²¹突变为Lys¹²¹、Asp¹⁶⁶突变为Glu¹⁶⁶。

2.根据权利要求1所述的冻干制剂，其中所述冻干保护剂为右旋糖酐-海藻糖混合体系，所述右旋糖酐-海藻糖的质量比为4:1-1:1。

3.权利要求1所述的冻干制剂，其中所述保持pH在4.5-7.5的缓冲体系为磷酸盐缓冲体系、醋酸盐缓冲体系或枸橼酸盐缓冲体系。

4.权利要求3所述的冻干制剂，其中所述缓冲体系的pH值为6.5-7.5。

5.根据权利要求1-4中任意一权利要求所述的冻干制剂，其中所述制剂还进一步包括稳定剂。

6.根据权利要求5所述的冻干制剂，其中所述稳定剂为碱性氨基酸或聚山梨酯中的任意一种或多种。

7.根据权利要求6所述的冻干制剂，其中所述碱性氨基酸为精氨酸或赖氨酸中的任意一种，所述碱性氨基酸的用量为25~40mg/ml。

8.根据权利要求6所述冻干制剂，其中所述聚山梨酯为聚山梨酯80，所述聚山梨酯80的用量为0.05-0.2mg/ml。

9.一种聚乙二醇集成干扰素冻干制剂，在用水配制成冻干前液时，它含有下列组分：

80至200微克的聚乙二醇-集成干扰素变异体，其中所述集成干扰素变异体是在N末端设计引入GlySerGlyGlyGly五个氨基酸序列，并在集成干扰素成熟氨基酸序列的Arg¹²¹突变为Lys¹²¹、Asp¹⁶⁶突变为Glu¹⁶⁶；

保持pH为6.5-7.5的NaH₂PO₄.2H₂O-Na₂HPO₄.12H₂O缓冲体系；

3%-6%的右旋糖酐(w/v)；

1%-4%的海藻糖(w/v);

25-35mg/ml的盐酸精氨酸；

0.05-0.15mg/ml的聚山梨酯80；

注射用水。