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Daten der weitergeführten Anmeldung
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Diese Anmeldung basiert auf vorrausgehenden
Anmeldungen, U.S.S.N. 60/037,327 (Atty. Dock. Nr. CRP-111PR), eingereicht
am 7. Februar 1997, und U.S.S.N. 60/047,909 (Atty. Dock. Nr. CRP-147PR),
eingereicht am 29. Mai 1997.
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Gebiet der Erfindung
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Das Ziel der Erfindung ist in den
Ansprüchen
definiert. Die hier offenbarte Erfindung betrifft Stoffe und ihre
Verwendung für
die Herstellung eines Medikaments für die Reparatur von Knochendefekten
unter Verwendung von knochenbildenden Proteinen.
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Hintergrund
der Erfindung
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Eine Klasse von Proteinen wurde jetzt
identifiziert, die kompetent sind, als echte chondrogene Gewebemorphogene
zu wirken und allein in der Lage sind, die Proliferation und Differenzierung
von Vorläuferzellen in
funktionelles Knochen-, Knorpel-, Sehnen- und/oder ligamentales
Gewebe zu induzieren. Diese Proteine, die hier als "knochenbildende Proteine" oder "morphogene Proteine" oder "Morphogene" bezeichnet werden, umfassen
Mitglieder der Familie von morphogenen Proteinen des Knochens (BMPs),
die ursprünglich
durch ihre Fähigkeit
identifiziert wurden, die ectopische, endochondrale Knochenmorphogenese
zu induzieren. Die knochenbildenden Proteine werden im Stand der
Technik im allgemeinen als Untergruppe der TGF-β-Superfamilie von Wachstumsfaktoren
(Hogan (1996) Genes & Development
10: 1580–1594)
klassifiziert. Mitglieder der Familie der Proteine der Morphogene
umfassen das knochenbildende Protein-1 der Säuger (OP-1, auch bekannt als
BMP-7 und das Drosophila-Homologe 60A), das knochenbildende Protein-2
(OP-2, auch bekannt als BMP-8), das knochenbildende Protein-3 (OP-3),
BMP-2 (auch bekannt als BMP-2A
oder CBMP-2A, und das Drosophila-Homologe DPP), BMP-3, BMP-4 (auch
bekannt als BMP-2B oder CBMP-2B), BMP-5, BMP-6 und sein murines
Homologes Vgr-1, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-12, GDF3 (auch bekannt
als Vgr2), GDF8, GDF9, GDF10, GDF11, GDF12, BMP-13, BMP-14, BMP-15,
GDF-5 (auch bekannt als CDMP-1 oder MP52), GDF-6 (auch bekannt als
CDMP-2), GDF-7 (auch bekannt als CDMP-3), das Xenopus-Homologe Vgl und
NODAL, UNIVIN, SCREW, ADMP und NEURAL. Mitglieder dieser Familie
codieren sezernierte Polypeptidketten, die gemeinsame strukturelle
Eigenschaften haben, einschließlich
der Prozessierung von einer Vorläufer-"pro-Form", um eine reife Polypeptidkette
zu ergeben, die zur Dimerisierung in der Lage ist und die am Carboxy-Terminus eine aktive
Domäne
von etwa 97–106
Aminosäuren
hat. Alle Mitglieder haben ein konserviertes Muster von Cysteinen
in dieser Domäne
und die aktive Form dieser Proteine kann entweder eine Disulfid-verknüpftes Homodimeres
eines einzigen Mitglieds der Familie sein oder ein Heterodimeres
von zwei verschiedenen Mitgliedern (vgl. z. B. Massague (1990) Annu.
Rev. Cell. Biol. 6: 597; Sampath et al. (1990) J. Biol. Chem. 254:
13198). Vgl. auch U. S. 5,011,691; U. S. 5,266,683, Ozkaynak et
al., (1990) EMBO J. 9: 2085–2093,
Wharton et al., (1991) PNAS 88: 9214–9218), (Ozkaynak (1992) J.
Biol. Chem. 267: 25220–25227 und
U. S. 5,266,683); Celeste et al., (1991) PNAS 87: 9843–9847);
(Lyons et al., (1989) PNAS 86: 4554-4558). Die Offenbarungen beschreiben
die Aminosäure-
und DNA-Sequenzen ebenso wie die chemischen und physikalischen Charakteristika
dieser knochenbildenden Proteine. Vgl. auch Wozney et al. (1988)
Science 242: 1528–1534;
BMP 9 (WO93/00432, veröffentlicht
am 7. Januar 1993); DPP (Padgett et al. (1987) Nature 325: 81–84; und
Vg-1 (Weeks (1987) Cell 51: 861–867).
WO95/33502, FR-A-2564732 und EP-A-0321277 offenbaren knochenbildende
Zusammensetzungen, die eine Matrix umfassen.
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Somit wurden echte knochenbildende
Proteine nunmehr identifiziert, isoliert und cloniert, die in der Lage
sind, die vorstehend beschriebene Kaskade von morphogenen Ereignissen
zu induzieren, die in endochondraler Knochenbildung resultieren.
Ob natürlicherweise
vorkommend oder synthetisch hergestellt, von diesen knochenbildenden
Faktoren ist gezeigt worden, daß sie,
wenn sie in Verbindung mit einer herkömmlichen Matrix oder einem
herkömmlichen
Substrat, das die Anheftung, Proliferation und Differenzierung von
migratorischen Vorläuferzellen
erlaubt, in einen Säuger
implantiert werden, die Rekrutierung von zugänglichen Vorläuferzellen
induzieren und ihre Proliferation stimulieren und damit die Differenzierung
in Chondrocyten und Osteoblasten induzieren und weiterhin die Differenzierung
von intermediärem
Knorpel induzieren, die Vaskularisierung, die Knochenbildung, die
Remodellierung und letztlich die Markdifferenzierung. Darüber hinaus
haben zahlreiche Anwender die Fähigkeit
von diesen knochenbildenden Proteinen gezeigt, wenn sie entweder Matrixmaterial
von natürlichen
Quellen wie Kollagen oder synthetisch hergestellten polymerem Matrixmaterial zugemischt
werden, daß sie
die Knochenbildung induzieren, einschließlich der endochondralen Knochenbildung
unter Bedingungen, wo sonst kein echter Knochenersatz stattfinden
würde.
Wenn diese knochenbildenden Proteine zum Beispiel mit einem Matrixmaterial
kombiniert werden induzieren sie die Bildung von neuem Knochen bei:
großen
segmentalen Knochendefekten, Rückgratverschmelzen
und Brüchen.
Ohne Ausnahme beschreibt jede der vorstehend beschriebenen Offenbarungen
Implantieren oder Verabreichung der knochenbildenden Proteine an
der defekten Stelle durch Verpacken, Füllen und/oder Einwickeln der
defekten Stelle mit einem Gemisch aus knochenbildendem Protein und
Matrix, wobei das relative Volumen und die Oberfläche der
Matrix von Bedeutung sind. Im Falle von nicht einheitlichen Defekten,
die nicht spontan heilen war es bisher herkömmliche Praxis, Volumen von
Gemischen aus Matrix-knochenbildendem Protein an der defekten Stelle zu
implantieren, mit ausreichenden Volumen zur Füllung des Defekts, um eine
3-dimensionales Gerüst
für die anschließende Bildung
von neuem Knochen bereitzustellen. Während Standardknochenbrüche spontan
und ohne Behandlung heilen können,
hat es der Stand der Technik in Betracht gezogen, in dem Maße Brüche mit knochenbildenden
Proteinen zu behandeln und war es Praxis im Stand der Technik, knochenbildende
Proteine zusammen mit einer Matrix lokal an einer defekten Stelle
bereitzustellen, um die Heilung zu fördern.
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Während
das Implantieren eines Volumens an Matrix im herkömmlichen
Sinn, vor allem im Fall von nicht heilenden, nicht einheitlichen
Defekten, klug sein kann, können
sich bei gewissen Patienten als Resultat dieser Praxis klinische
Konsequenzen entwickeln. Zum Beispiel können Patienten, denen wiederholte
Konstruktionen oder Defektreparationen widerfahren, oder bei denen
das Matrixvolumen groß ist,
schädliche
immunologische Reaktionen gegen Matrizes entwickeln, die von Kollagen
abgeleitet sind. Kollagenmatitzes können gereinigt werden, aber
Reste von Verunreinigungen können
verbleiben, die für
gewisse Patienten stark allergen sind. In einer anderen Ausführungsform
kann entmineralisierte autogene, allogene oder xenogene Knochenmatrix
anstelle von Kollagen verwendet werden. Eine solche Matrix ist Kollagen
mechanisch überlegen
und kann in einigen Fällen
schädliche
Immunreaktionen verhinidern, aber die richtige Herstellung ist teuer, zeitaufwendig
und die Verfügbarkeit
von zuverlässigen
Quellen für
Knochen kann beschränkt
sein. Solche Matrizes aus natürlichen
Quellen können
durch inerte Materialien wie Plastik ersetzt werden, aber Plastik
ist kein geeigneter Ersatz, da es nicht resorbiert und auf Anwendungen
beschränkt
ist, die einfache geometrische Konfigurationen erfordern. Bis jetzt
wurden auch biologisch abbaubare Polymere und Copolymere als Matrizes
zur Reparatur nicht einheitlicher Defekte verwendet, denen knochenbildende
Proteine beigemischt waren. Während
solche Matrizes einige der vorstehenden Unzulänglichkeiten überwinden
können,
erfordert die Verwendung solcher Matrizes immer noch die Bestimmung
und Kontrolle von Eigenschaften wie der Polymerchemie, der Teilchengröße, der
biologischen Verträglichkeit
und anderer Besonderheiten, die für die Anwendbarkeit kritisch
sind.
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Zusätzlich würden Individuen, die wegen
eines erworbenen oder angeborenen Zustands eine verminderte Fähigkeit
haben, Knochenbrüche
oder andere Defekte zu heilen, die normalerweise eine spontane Reparatur
erfahren, aus Verfahren und injizierbaren Zusammensetzungen ihren
Nutzen ziehen, die die Reparatur von Knochen und/oder Sehnen verbessern,
ohne ein chirurgisches Verfahren zu erfordern. Letztlich stellt
eine injizierbare Formulierung auch Mittel zur Reparatur von osteochondralen
oder chondralen Defekten bereit, ohne ein chirurgisches Verfahren
zu erfordern.
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Es verbleibt Bedarf an Mitteln, Implantaten
und Verfahren zur Reparatur von Knochendefekten, die nicht auf einer
Matrixkomponente beruhen. Es verbleibt ein besonderer Bedarf an
Mitteln, Implantaten und Verfahren, die die Verabreichung von Knocheninduzierenden
Mengen an knochenbildenden Proteinen ohne gleichzeitige Verabreichung
von raumfüllenden
Matrixmaterialien erlaubt, die für
den Empfänger
von Nachteil sein können
oder biomechanisch und drehstabil nicht ideal sind. Es verbleibt
Bedarf an der Bereitstellung von Verfahren und Mitteln, insbesondere
injizierbaren Mitteln, die die Rate der Bildung von neuem Knochen
beschleunigen und die Qualität
verbessern.
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Dem gemäß ist es ein Ziel der vorliegenden
Erfindung, Mittel, Implantate und deren Verwendung für die Herstellung
eines Medikaments für
die Reparatur von Knochendefekten, Knorpeldefekten und/oder osteochondralen
Defekten bereitzustellen, die den Bedarf einer Zumischung von knochenbildenden
Proteinen zu einer Matrix umgehen. Die vorliegenden Erfindung stellt
matrixfreie knochenbildende Mittel, Implantate und deren Verwendung
für die
Herstellung von Medikamenten für
die Reparatur von nicht heilenden, nicht einheitlichen Defekten
bereit, ebenso wie für
die Förderung
einer verbesserten Knochenbildung bei der Rückgratverschmelzung und Knochenbrüchen, und
für die
Förderung
der artikulären
Knorpelreparatur bei chondralen oder osteochondralen Defekten. Diese
und andere Ziele, zusammen mit Vorteilen und Eigenschaften der hier
offenbarten Erfindung, werden durch die folgende Beschreibung, die
folgenden Figuren und die folgenden Ansprüchen anschaulich.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung basiert
auf der Entdeckung, daß ein
knochenbildendes oder für
den Knochen morphogenes Protein wie OP-1, allein oder in Zumischung
zu einem geeigneten Träger
und nicht einem herkömmlichen
Matrixmaterial, die endochondrale Knochenbildung induzieren kann,
die ausreichend ist, um segmentale Knochendefekte kritischer Größe zu reparieren.
Somit überwindet
diese Entdeckung die vorstehend beschriebenen Probleme, die mit
herkömmlichen
Materialien und Verfahren zur Reparatur von Knochendefekten einhergehen,
weil sie die Eliminierung von Matrixmaterial erlaubt. Weiterhin
ist diese Entdeckung angesichts der bestehenden orthopädischen
und rekonstruktiven Praxis unerwartet und widerspricht dem gegenwärtigen Verständnis des
Fachgebiets für
die Prozesse der Knochenreparatur/-bildung.
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Wie hier offenbart, wird nun anerkannt,
daß ein
knochenbildendes Protein einem Träger zugemischt werden kann,
wie er hier definiert wird, um ein matrixfreies Mittel zu bilden,
das, wenn es einem Säuger
verabreicht wird, bei der Verbesserung der Reparatur von nicht einheitlichen
Knochendefekten, Brüchen
und Verschmelzungen wirksam ist. Wie hier offenbart, werden Verfahren
und Mittel zur Induzierung der Bildung von neuem Knochen an einer
lokalen Defektstelle bereitgestellt, ohne den Bedarf der Bereitstellung
einer dreidimensionalen Strukturkomponente an der defekten Stelle.
Wie hier beabsichtigt, ist eine "matrixfreie" knochenbildende
Vorrichtung eine Vorrichtung, der zur Zeit der Verabreichung an
den Empfänger
ohne Matrix ist. Es ist zu verstehen, daß der Ausdruck "Matrix" eine Strukturkomponente
oder ein Substrat meint, die eine dreidimensionale Form hat und
an der gewisse zelluläre
Ereignisse, die in die Morphogenese des endochondalen Knochens involviert sind,
ablaufen; eine Matrix wirkt als eine zeitweise Gerüststruktur
für die
Infiltration von Zellen, die Zwischenräume für die Anheftung, die Proliferation
und Differenzierung solcher Zellen hat.
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Die Erfindung stellt in einem Aspekt
die Verwendung einer matrixfreien Zusammensetzung ohne Gerüststrvktur
für die
Herstellung eines Medikaments für
die Induktion von Knochenbildung in einem Säuger bereit, die ausreicht,
um einen Defekt zu reparieren. Eine Ausführungsform umfaßt den Schritt
der Bereitstellung einer matrixfreien knochenbildenden Vorrichtung
für einen
defekten Ort, der eine Hohlraum definiert. Die matrixfreie Vorrichtung
kann aus knochenbildendem Protein allein bestehen, oder sie kann
aus knochenbildendem Protein in Zumischung zu mit einem biologisch
verträglichen,
amorphen, nicht starren Träger
zusammengesetzt sein, der keine definierten Oberflächen hat.
Diese Zusammensetzung induziert die Bildung von neuem Knochen, welcher
den defekten Ort auffüllt
und dabei den Defekt repariert. Wie hier beabsichtigt, wird eine
matrixfreie knochenbildende Vorrichtung einem defekten Ort in einem
Volumen bereitgestellt, das nicht ausreichend ist, um die Hohlraum
an dem defekten Ort zu füllen.
In gewissen Ausführungsformen
umfaßt
die Hohlraum ein Volumen, das zu einer endogenen oder spontanen
Reparatur nicht in der Lage ist. Beispiele für Defekte, die für eine Reparatur
mit dem vorliegenden Verfahren geeignet sind, umfassen, sind aber
nicht beschränkt
auf, segmentale Defekte mit kritischer Größe und nicht einheitliche Brüche.
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In einer anderen Ausführungsform
stellt die Erfindung Zusammensetzungen und ihre Verwendung für die Herstellung
eines Medikaments für
die Verbesserung der Reparatur eines Bruchs bereit durch die Bereitstellung
von hier beschriebenen matrixfreien knochenbildenden Vorrichtungen
für eine
Bruchdefektstelle. Die Fähigkeit
der hier beschriebenen Vorrichtungen, die Bruchreparatur substantiell
zu verbessern, einschließlich der
Beschleunigung der Wachstumsrate und der Verbesserung der Qualität von neu
gebildetem Knochen, hat Implikationen auf die Verbesserung der Knochenheilung
bei betroffenen Individuen wie Diabetikern, Rauchern, fettleibigen
Individuen und anderen, die, wegen eines erworbenen oder angeborenen
Zustands, eine verminderte Fähigkeit
haben, Knochenbrüche
zu heilen, einschließlich
Individuen mit beeinträchtigtem
Blutfluß zu
ihren Extremitäten.
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In einem anderen Aspekt stellt die
Erfindung ein Implantat für
die Induzierung der Knochenbildung in einem Säuger bereit, das ausreicht,
um einen Defekt zu reparieren. Ein bevorzugtes Implantat umfaßt eine
matrixfreie knochenbildende Vorrichtung, die an einem defekten Ort
bereitgestellt wird, der eine Hohlraum definiert. Die Bereitstellung
einer knochenbildenden Vorrichtung ohne eine gerüstbildende Struktur an einen
Säuger
an einer defekten Stelle resultiert in einem Implantat, das in der
Lage ist, die Bildung von neuem Knochen zu induzieren, ausreichend,
um die Reparatur von nicht einheitlichen Knochendefekten, Brüchen und
Verschmelzungen zu fördern.
Bei Bereitstellung der knochenbildenden Vorrichtung an der defekten
Stelle hat das so gebildete Implantat ein zu Füllung der defekten Hohlraum
nicht ausreichendes Volumen.
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In noch einem anderen Aspekt stellt
die vorliegende Erfindung eine matrixfreie knochenbildende Vorrichtung
zur Induzierung der Knochenbildung in einem Säuger bereit. Wie hier beabsichtigt,
umfaßt
eine bevorzugte knochenbildende Vorrichtung ein bei der Knochenbildung
aktives Protein bereit, das in einem geeigneten Träger dispergiert
ist. Bevorzugte knochenbildende Proteine umfassen, sind aber nicht
beschränkt
auf, OP-1, OP-2, BMP-2, BMP-4, BMP-5 und BMP-6 (siehe nachstehend).
Wie hier offenbart, sind bevorzugte Träger biologisch verträglich, nicht
starr und amorph, ohne definierte Oberflächen oder dreidimensionale
Struktureigenschaften. Somit fehlt den Vorrichtungen der vorliegenden
Erfindung eine Gerüststruktur
und sie sind im Wesentlichen frei von Matrix, wenn sie einem Säuger bereitgestellt
werden. Beispiele für
bevorzugte Träger umfassen,
sind aber nicht beschränkt
auf, Pluronics und Alkylcellulosen. Wie vorstehend diskutiert, umfaßt das Verfahren
der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung einer solchen Vorrichtung
an einer defekten Stelle, so daß das
Volumen der Vorrichtung zur Füllung
des Leervolumens an der defekten Stelle nicht ausreichend ist.
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Die Implantate und Vorrichtungen
der Erfindung sind auch in der Lage, die Reparatur von chondralen oder
osteochondralen Defekten zu induzieren und fördern oder verbessern. Als
Resultat dieser Entdeckung sind jetzt Mittel zur Förderung
der Reparatur von Knochen und/oder Knorpel verfügbar, ohne das Erfordernis eines
chirurgischen Verfahrens. Insbesondere für die Verbesserung der Reparatur
eines Knochenbruchs ist in Betracht zu ziehen, daß eine geeignete
Formulierung an der Bruchstelle zur Zeit der Bildung des Bruchs injiziert
werden kann, um die Wachstumsrate von neu gebildetem Knochen zu
beschleunigen und die Qualität
von neu gebildetem Knochen zu verbessern.
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Die Vorrichtung der vorliegenden
Erfindung kann eine Vielzahl an Konfigurationen haben. Die Natur der
Vorrichtung wird von der Art des Trägers abhängen, in dem das knochenbildende
Protein dispergiert ist. Zum Beispiel kann eine bevorzugte Ausführungsform
eine Pasten-ähnliche
oder Kitt-ähnliche
Konfiguration haben; solch eine Konfiguration kann das Resultat
der Dispersion des knochenbildenden Proteins in einem Gel-ähnlichen
Träger
wie einem PluronicTM-Träger oder einer Alkylcellulose
wie Carboxymethylcellulose sein, die dann mit einem geeigneten Befeuchtungsmittel
wie zum Beispiel einer Salzlösung
befeuchtet wird. Eine andere bevorzugte Ausführungsform kann eine Konfiguration
des trockenen Pulvers haben; solch eine Vorrichtung folgt aus der
Dispersion des knochenbildenden Proteins in einem flüssigen Träger wie
Wasser mit oder ohne Excipient, gefolgt von Lyophilisierung. Eine
dritte Formulierung ist eine Lösung,
wie durch Kombination des Proteins mit einer sauren gepufferten
Lösung,
z. B. pH 4,0–4,5,
zum Beispiel einem Acetat- oder Citratpuffer. Noch eine andere Formulierung
ist eine Suspension, die durch Einbringung eines knochenbildenden
Proteins in eine physiologische gepufferte Lösung, wie phosphatgepufferte
Salzlösung
(PBS), gebildet wird. In Abhängigkeit
von der Konfiguration der Vorrichtung kann die Verabreichung an
der defekten Stelle durch eine Vielzahl von Verabreichungsverfahren
erreicht werden. Eine Paste kann zum Beispiel als ein Bett ausgedrückt werden,
das entlang der Oberfläche
der defekten Stelle liegt. In einer anderen Ausführungsform kann eine viskose
Flüssigkeit
entlang einer oder mehrere Oberflächen der defekten Stelle gebürstet oder
gepinselt werden oder durch eine weite Kalibriernadel injiziert
werden. Weniger viskose Flüssigkeiten
durch eine feine Kalibriernadel injiziert werden. Andere Konfigurationen
und Verabreichungswege sind in Betracht zu ziehen und werden nachstehend
detaillierter diskutiert.
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Im allgemeinen sind die Proteine
der Erfindung dimere Proteine, die die endochondrale Morphogenese
von Knochen induzieren. Knochenbildende Proteine umfassen ein Paar
von Polypeptiden, die, wenn sie gefaltet sind, eine Konfiguration
annehmen, die ausreichend ist, damit das resultierende dimere Protein
eine morphogenetische Wirkung ausübt. Das heißt, daß knochenbildende Proteine
im allgemeinen alle der folgenden biologischen Funktionen in einer
morphogenetisch sensitiven Umgebung induzieren: die Stimulierung
der Proliferation von Vorläuferzellen;
die Stimulierung der Differenzierung von Vorläuferzellen; die Stimulierung
der Proliferation von differenzierten Zellen; und die Unterstützung des
Wachstums und der Erhaltung von differenzierten Zellen. Vorläuferzellen
sind nicht bestimmte Zellen, die in der Lage sind, in einen oder
mehr spezifische Typen von differenzierten Zellen zu differenzieren,
in Abhängigkeit
von ihrem genetischen Repertoire und der Gewebespezifität der sensitiven
Umgebung, in der die Morphogenese induziert wird. In der vorliegenden
Erfindung können
knochenbildende Proteine die morphogenetische Kaskade induzieren,
die die endochondrale Knochenbildung typisiert.
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Wie hier verwendet umfaßt der Ausdruck "Morphogen", "Knochenmorphogen", "morphogenes Knochenprotein", "BMP", "knochenbildendes
Protein" und "knochenbildender
Faktor" die Klasse
an Proteinen, die durch das menschliche knochenbildende Protein
1 (hOP-1) typisiert
werden. die Nucleotid- und Aminosäuresequenzen für hOP-1
werden in den SEQ ID Nrs 1 und 2 bereitgestellt. Zur Erleichterung
der Beschreibung wird hOP-1 hier des weiteren als ein repräsentatives
knochenbildendes Protein bezeichnet. Es wird jedoch vom Durchschnittsfachmann
auf dem Fachgebiet erkannt, daß hOP-1
lediglich ein Repräsentant
der TGF-β-Unterklasse
der echten Gewebemorphogene ist und in der Lage ist, als knochenbildendes
Protein zu wirken, und es ist nicht beabsichtigt, die Erfindung
zu beschränken.
Andere bekannte und nützliche
Proteine umfassen BMP-2, BMP-3, BMP-3b, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-8,
BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-12, BMP-13, BMP-15, GDF-1, GDF-2, GDF-3,
GDF-5, GDF-6, GDF-7, GDF-8, GDF-9, GDF-10, GDF-11, GDF-12, NODAL,
UNIVIN, SCREW, ADMP und NURAL und bei der Knochenbildung aktive
Aminosäurevarianten
davon. In einer bevorzugten Ausführungsform
umfassen die bei der Erfindung nützlichen
Proteine biologisch aktive Speziesvarianten von jedem dieser Proteine,
einschließlich
von konservativen Aminosäuresequenzvarianten,
von Proteinen, die von degenerierten Nucleotidsequenzvarianten codiert
werden, und von bei der Knochenbildung aktiven Proteinen, die das
konservierte Skelett von sieben Cysteinen gemeinsam haben, wie es hier
definiert wird, und die von einer DNA-Sequenz codiert werden, die
in der Lage ist, mit einer DNA-Sequenz zu hybridisieren, die ein
hier offenbartes knochenbildendes Protein codiert. In noch einer
anderen Ausführungsform
umfassen nützliche
knochenbildende Proteine diejenigen, die die konservierte Domäne von sieben Cysteinen
gemeinsam haben und mindestens 70% Aminosäuresequenzhomologie (Ähnlichkeit)
innerhalb der C-terminalen aktiven Domäne haben, wie hier definiert.
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In noch einer anderen Ausführungsform
können
die knochenbildenden Proteine der Erfindung als ostengen aktive
Proteine definiert werden, die eine der generischen Sequenzen haben,
wie sie hier definiert werden, einschließlich OPX und die Generischen
Sequenzen 7 und 8 oder die Generischen Sequenzen 9 und 10. OPX paßt die Homologien
zwischen den verschiedenen Arten der knochenbildenden Proteine OP1
und OP2 an und wird durch die Aminosäuresequenz beschrieben, die
nachstehend und in Seq. ID Nr. 3 beschrieben ist. Die Generische
Sequenz 9 ist eine Sequenz mit 96 Aminosäuren, die das Skelett mit sechs
Cysteinen enthält, das
durch hOP1 definiert ist (Reste 330–431 von Seq. ID Nr. 2), und
worin die restlichen Reste die Homologien zwischen OP1, OP2, OP3,
BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-8, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-15,
GDF-1, GDF-3, GDF-5, GDF-6,
GDF-7, GDF-8, GDF-9, GDF-10, GDF-11, UNIVIN, NODAL, DORSALIN, NURAL,
SCREW und ADMP anpassen. Das heißt, jeder der nicht-Cysteinreste
wird unabhängig
aus dem entsprechenden Rest in dieser zitierten Gruppe von Proteinen
ausgewählt.
Die Generische Sequenz 10 ist eine Sequenz mit 102 Aminosäuren, die
das Skelett mit sieben Cysteinen enthält, das durch hOP1 definiert ist
(335–431
Seq. ID Nr. 2) und worin die restlichen Reste die Homologien zwischen
der vorstehend zitierten Proteingruppe anpassen.
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Wie hier beabsichtigt, umfaßt diese
Familie an knochenbildenden Proteinen längere Formen eines vorgegebenen
Proteins ebenso wie phylogenetische, d. h. Arten- und allelische
Varianten und biosynthetische Mutanten, einschließlich C-terminale
Additions- und Deletionsmutanten und Varianten, so wie diejenigen,
die das konservierte C-terminale Cysteinskelett verändern können, unter
der Voraussetzung, daß die
Veränderung noch
die Bildung einer dimeren Art des Proteins zuläßt, die eine Konformation hat,
die in der Lage ist, die Knochenbildung in einem Säuger zu
induzieren, wenn sie in den Säuger
implantiert wird. Zusätzlich
können
die knochenbildenden Proteine, die bei dieser Erfindung von Nutzen
sind, Formen umfassen, die verschiedene Glycosilierungsmuster und
verschiedene N-Termini haben, natürlicherweise vorkommen können oder
biosynthetisch abgeleitet sein können,
und die durch Expression von rekombinanter DNA in prokaryontischen
oder eukaryontischen Wirtszellen produziert werden können. Die
Proteine sind als einzelne Art aktiv (d. h. Homodimer) oder kombiniert
als gemischte Arten, einschließlich
Heterodimeren.
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Die Implantate der Erfindung erfordern
keinen Träger
für das
knochenbildende Protein, um die Knochenbildung zu induzieren, die
ausreicht, um einen Knochendefekt kritischer Größe zu füllen oder die Reparatur eines
Bruchs in einem Tier zu verbessern. Wenn bei der Ausführung der
Erfindung das Protein in Verbindung mit einem Träger bereitgestellt wird, muß der Träger ohne
Gerüststruktur
sein, wie vorstehend festgestellt. Wenn ein bevorzugter Träger einem
knochenbildenden Protein zugemischt wird eine Vorrichtung gebildet,
die im wesentlichen frei von Matrix ist, wie hier definiert. "Im wesentlichen frei
von Matrix" ist
so zu verstehen, daß die
trägerlose
Vorrichtung, wie sie vor der Verabreichung formuliert wird, keine
Substratkomponente enthält,
die per se als Gerüst
dient. Das heißt,
daß die
Vorrichtung kein Substrat enthält,
das von einer exogenen Quelle eingeführt wurde und in der Lage ist,
als Gerüst
zu dienen. Anders ausgedrückt,
ist der Träger
anerkanntermaßen
vor der Verabreichung wegen seiner chemischen Natur nicht in der
Lage, zu der Vorrichtung eine Gerüststruktur beizutragen. Per
Definition sind bevorzugte Träger
biologisch verträglich,
nicht starr und amorph und haben keine definierten Oberflächen. Wie
hier verwendet, bedeutet "nicht
starr" eine Trägerformulierung,
die lose oder locker ist oder anders im wesentlichen nicht in der
Lage, eine dreidimensionale Struktur bereitzustellen oder zu bilden,
die eine oder mehr definierte Oberflächen hat. Wie hier verwendet,
bedeutet "amorph" das Fehlen einer
definierten dreidimensionale Form, oder einer spezifischen Gestalt,
das heißt
ohne besondere Gestalt oder Form oder mit einer undefinierten Gestalt
oder Form. Bevorzugte Träger
sind auch biologisch verträglich,
nicht partikulär,
adhärent
mit Knochen, Knorpel und/oder Muskel und inert. In gewissen Ausführungsform
sind wasserlösliche
Träger
bevorzugt. Zusätzlich
tragen bevorzugte Träger
kein signifikantes Volumen zu der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung
bei. Das heißt,
bevorzugte Träger
erlauben die Dispersion eines knochenbildenden Proteins so, daß das Endvolumen
der resultierenden Vorrichtung weniger ist als das Volumen des Hohlraums
an der defekten Stelle. Wie nachstehend diskutiert, kann ein bevorzugter
Träger
ein Gel sein, eine wäßrige Lösung, eine
Suspension oder eine viskose Flüssigkeit.
Zum Beispiel können besonders
bevorzugte Träger
ohne Einschränkung
Pluronics, Alkylcellulosen, Acetatpuffer, physiologische Salzlösungen,
Lactose, Mannitol und/oder andere Zucker umfassen. In einer anderen
Ausführungsform
könne knochenbildende
Proteine allein an einer defekten Stelle bereitgestellt werden.
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Zusammenfassend können die Implantate und Vorrichtungen
der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um die endochondrale
und intramembrane Knochenbildung zu induzieren, die ausreicht, Knochendefekte
zu reparieren, die nicht spontan heilen, ebenso wie die Wachstumsrate
und/oder Qualität
der Knochenneubildung zu erhöhen
und zu verbessern, insbesondere bei der Reparatur von Brüchen und
Verschmelzungen, einschließlich
Verschmelzungen des Rückgrats.
Die Verfahren, Implantate und Vorrichtungen sind auch in der Lage,
die Reparatur von osteochondralen und/oder subchondralen Defekten
zu induzieren. Das heißt, die
Implantate und Vorrichtungen sind in der Lage, die Bildung von neuem
Knochen und des darüberliegenden Oberflächenknorpels
zu induzieren. Die vorliegenden Erfindung ist insbesondere geeignet
für die
Verwendung bei Empfängern,
die allergisch gegen Kollagen oder Matrix sind. Sie ist auch besonders
geeignet für
die Verwendung bei Patienten, die wiederholte rekonstruktive Chirurgie
benötigen
ebenso wie für
Krebspatienten als eine Alternative für Rekonstruktionsverfahren
unter Verwendung von Metallgelenken. Die vorliegende Erfindung ist
auch für
Individuen von Nutzen, deren Fähigkeit
zur spontanen Knochenreparatur beeinträchtigt ist, wie Diabetiker,
Raucher, fettleibige Individuen, immundefiziente Individuen und
alle Individuen mit reduziertem Blutfloß zu ihren Extremitäten. Andere
Anwendungen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, prosthetische Reparatur,
Rückgratverschmelung,
Scoliose, Schädel-/Gesichtwiederherstellung
und massive Allograftreparatur.
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Ausführliche
Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen
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Um den Inhalt der beanspruchten Erfindung
klarer und genauer zu beschreiben, ist es beabsichtigt, daß die folgenden
Definitionen eine Anleitung bei der Bedeutung von spezifischen Ausdrücken sind,
die in der folgenden geschriebenen Beschreibung und den beigefügten Ansprüchen verwendet
werden.
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"Knochenbildung" bedeutet die Bildung
von endochondralem Knochen oder die Bildung von intramembranem Knochen.
Bei Menschen beginnt die Knochenbildung während der ersten 6–8 Wochen
der Entwicklung des Fötus.
Vorläuferstammzellen
von mesenchymalem Ursprung wandern zu vorbestimmten Stellen, wo sie
entweder: (a) kondensieren, proliferieren und in knochenbildende
Zellen (Osteoblasten) differenzieren, ein Prozeß, der im Schädel beobachtet
wird und als "intramembrane
Knochenbildung" bezeichnet
wird; oder (b) kondensieren, proliferieren und in knorpelbildende
Zellen (Chondroblasten) als Zwischenprodukt differenzieren, die
anschließend
von knochenbildenden Zellen ersetzt werden. Spezifischer differenzieren
mesenchymale Stammzellen in Chondrocyten. Die Chondrocyten werden
dann kalzifiziert, hypertrophieren und werden durch neugebildeten
Knochen ersetzt, der von differenzierten Osteoblasten gemacht wird,
die nun an der Stelle anwesend sind. Anschließend wird der mineralisierte
Knochen extensiv umgeformt und danach von einem Knöchelchen
verdrängt,
das mit funktionellen Knochenmarkselementen gefüllt ist. Dieser Prozeß wird bei
langen Knochen beobachtet und als "endochondrale Knochenbildung" bezeichnet. Im Leben
nach dem fötalen Zustand
hat der Knochen die Fähigkeit
zur Selbstreparatur bei Verletzung, indem er den zellulären Prozeß der embryonalen
endochondralen Knochenentwicklung nachahmt. Das heißt, daß mesenchymale
Vorläuferstammzellen
aus dem Knochenmark, Peristeum und Muskel induziert werden können, zu
der defekten Stelle zu wandern und die vorstehend beschriebene Kaskade
an Ereignissen beginnen. Dort akkumulieren sie, proliferieren und
differenzieren in Knorpel, der dann von neugebildetem Knochen ersetzt
wird.
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"Defekt" oder "defekte Stelle", wie hier beabsichtigt,
definiert einen Hohlraum, der eine Störung einer Knochenstruktur
ist, die eine Reparatur erfordert. Der Defekt kann weiterhin einen
osteochondralen Defekt definieren, der eine strukturelle Störung des
Knochens und des darüberliegenden
Knorpels umfaßt. "Hohlraum" ist so verstanden,
daß er
einen dreidimensionalen Defekt bedeutet, wie zum Beispiel eine Lücke, eine
Höhle, ein
Loch oder andere substantielle Unterbrechungen bei der strukturellen
Integrität
eines Knochens oder Gelenks. Ein Defekt kann das Resultat eines
Unfalls sein, einer Krankheit, eines chirurgischen Eingriffs und/oder von
prosthetischem Versagen. In gewissen Ausführungsformen ist die defekte
Stelle ein Hohlraum, der ein Volumen hat, das einer endogenen oder
spontanen Reparatur nicht zugänglich
ist. Solche Defekte werden auch als segmentale Defekte von kritischer
Größe bezeichnet.
Im Stand der Technik ist anerkannt, daß solche Defekte eine Lücke von
etwa 3–4
cm sind, mindestens aber größer als
2,5 cm, der spontanen Reparatur unzugänglich. In anderen Ausführungsformen
ist die defekte Stelle ein nicht kritischer segmentaler Defekt von
etwa mindestens 0,5 cm, aber nicht mehr als etwa 2,5 cm. Im allgemeinen
sind diese in der Lage einer gewissen spontanen Reparatur, obgleich
biomechanisch unterlegen derjenigen, die durch Anwendung der vorliegenden Erfindung
möglich
gemacht wird. In gewissen anderen Ausführungsformen ist der Defekt
ein osteochondraler Defekt wie ein osteochondraler Pfropf. Andere
Defekte, die unter Verwendung der vorliegenden Erfindung einer Reparatur
zugänglich
sind, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, nicht einheitliche
Brüche;
Hohlräume in
Knochen; Tumorresektionen; frische Brüche; Abnormalitäten des
Schädels/des
Gesichts; Rückgratverschmelzungen,
ebenso wie diejenigen, die von Krankheiten wie Krebs, Arthritis
einschließlich
Osteoarthritis und anderen degenerativen Knochenstörungen herrühren. "Reparatur" ist so gemeint,
daß sie
die Induktion einer Knochenneubildung bedeutet, die ausreichend
ist, den Hohlraum an der defekten Stelle zu füllen, "Reparatur" bedeutet aber nicht oder legt zwingend
ein Verfahren der vollständigen
Heilung nahe, oder eine Behandlung, das zu 100% wirksam bei der
Wiederherstellung eines Defekts zum physiologischen/strukturellen Zustand
vor dem Defekt ist.
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"Matrix" wird im Stand der
Technik so verstanden, daß sie
ein den Knochen leitendes Substrat bedeutet, das eine gerüstbildende
Struktur hat, an die infiltrierende Zellen anheften können, proliferieren
und an dem morphogenen Prozeß teilhaben,
der in Knochenbildung kulminiert. In gewissen Ausführungsformen
kann die Matrix partikulär
und porös
sein, wobei die Porosität
eine kritische Eigenschaft bei ihrer Wirksamkeit bei der Induktion
der Knochenbildung ist, insbesondere bei der endochondralen Knochenbildung.
Wie früher
beschrieben, ist eine Matrix so zu verstehen, daß sie der herkömmlichen
knochenbildenden Vorrichtung gewisse strukturelle Komponenten bereitstellt
(d. h. bis jetzt eine poröse
partikuläre
Matrixkomponente wie Kollagen, demineralisierten Knochen oder synthetische
Polymere umfassend), um dabei wie eine vorübergehende und resorbierbare
Gerüststruktur
für infiltrierende
Zellen zu wirken, die Zwischenräume
für Anheftung,
Proliferation und Differenzierung von solchen Zellen hat. Dem entsprechend
bedeutet der Ausdruck "matrixfreie
knochenbildende Vorrichtung" oder
knochenbildende Vorrichtung, die "im Wesentlichen frei von Matrix" ist eine Vorrichtung, der
zum Zeitpunkt der Verabreichung an den Empfänger eine im Fachgebiet anerkannte
Matrix fehlt. Darüber hinaus
ist im Wesentlichen frei von Matrix so zu verstehen, daß, wenn
eine Vorrichtung an der defekten Stelle bereitgestellt wird, kein
Substrat von exogener Quelle eingeführt wird, die per se als Gerüst dienen
kann. Matrixfrei oder im Wesentlichen frei von Matrix ist nicht
so gemeint, daß es
eine endogenen Matrix ausschließt, die
nach der Verabreichung der hier offenbarten Vorrichtungen und/oder
Implantate an der defekten Stelle induziert oder gebildet wird.
Somit betrifft die Erfindung weiterhin ein Verfahren zur Induzierung
der Bildung einer endogenen Matrix durch Bereitstellung der hier
offenbarten matrixfreien Vorrichtungen oder Implantate an der defekten
Stelle.
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"Knochenbildende
Vorrichtung" ist
so zu verstehen, daß sie
eine Zusammensetzung bedeutet, die ein knochenbildendes Protein
umfaßt,
das in einem biologisch verträglichen,
nicht starren, amorphen Träger
dispergiert ist, der keine definierten Oberflächen hat. Knochenbildende Vorrichtungen
der vorliegenden Erfindung sind in der Lage eine Knochenbildung
zu induzieren, die ausreichend ist, eine defekte Stelle zu füllen, die
einen Hohlraum definiert. Knochenbildende Vorrichtungen sind matrixfrei,
wenn sie der defekten Stelle bereitgestellt werden und werden der
defekten Stelle in einem Volumen verabreicht, das nicht ausreicht,
den Hohlraum zu füllen,
der durch die defekte Stelle definiert wird. Eine Vorrichtung kann
jede geeignete Konfiguration haben, wie eine Flüssigkeit, ein Pulver, eine
Paste, oder ein Gel, um nur einige zu nennen. Bevorzugte Eigenschafen für knochenbildende
Vorrichtungen, die für
die Verwendung bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung geeignet
sind, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf adhärent mit Knochen, Knorpel und/oder
Muskel; und wirksam dabei, zumindest eine lokale Quelle an knochenbildendem
Protein an der defekten Stelle bereitzustellen, selbst wenn vorübergehend.
Wie hier beabsichtigt, umfaßt
die Bereitstellung einer lokalen Quelle an Protein sowohl das Zurückhalten
von Protein an der defekten Stelle als auch die kontrollierte Freisetzung
von Protein an der defekten Stelle. Alles, was für vorliegende Erfindung erforderlich
ist, ist, daß knochenbildende
Vorrichtung wirksam ist bei der Bereitstellung des knochenbildenden
Proteins mit einer Konzentration, die ausreicht, die Knochenbildung
zu induzieren, die den dreidimensionalen Defekt füllt, die
den Hohlraum definiert, der einer Reparatur bedarf. Zusätzlich zu
knochenbildenden Proteinen können
auch verschiedene Wachstumsfaktoren, Hormone, Enzyme, therapeutische
Zusammensetzungen, Antibiotika oder andere biologisch aktive Mittel
innerhalb einer knochenbildenden Vorrichtung vorhanden sein: Somit
können
verschiedene bekannte Wachstumsfaktoren wie EGF, PDGF, IGF, FGF,
TGF-α und
TGF-β mit
einer knochenbildenden Vorrichtung kombiniert werden und können an
der defekten Stelle bereitgestellt werden. Eine knochenbildende
Vorrichtung kann auch verwendet werden, um chemotherapeutische Mittel,
Insulin, Enzyme, Enzyminhibitoren und/oder chemisch anlockende/chemotaktische
Faktoren bereitzustellen.
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"Knochenbildendes
Protein" oder morphogenes
Protein für
den Knochen wird im allgemeinen so verstanden, daß es ein
Protein bedeutet, das die volle Kaskade an morphogenen Ereignissen
induzieren kann, die in der endochondralen Knochenbildung kulminieren.
Wie an anderer Stelle hierin beschrieben, wird die Klasse an Proteinen
durch das menschliche knochenbildende Protein (hOP1) typisiert.
Andere knochenbildende Pioteine, die bei der Ausführung der
Erfindung von Nutzen sind, umfassen die bei der Knochenbildung aktiven
Formen von OP1, OP2, OP3, BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6, BMP9, DPP,
Vgl, Vgr, 60A Protein, GDF-1, GDF-3, GDF-5, 6, 7, BMP10, BMP11,
BMP13, BMP15, UNIVIN, NODAL, SCREW, ADMP und NURAL und Aminosäuresequenzvarianten
davon. In einer gegenwärtig
bevorzugten Ausführungsform
umfaßt
das knochenbildende Protein eines von: OP1, OP2, OP3, BMP2, BMP4,
BMP5, BMP6, BMP9 und Aminosäuresequenzvarianten
und Homologe davon, einschließlich
Arthomologen davon. Insbesondere bevorzugte knochenbildende Proteine
sind diejenigen, die eine Aminosäuresequenz
haben, die mindestens 70% Homologie mit den C-teminalen Aminosäuren 102–106 von
OP1, BMP2 und verwandten Proteinen hat, die die konservierte Domäne von 7
Cysteinen definieren. Gewisse bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden
Erfindung umfassen das knochenbildende Protein OP-1. Gewisse andere
bevorzugte Ausführungsformen
umfassen reifes OP-1 das in einer physiologischen Salzlösung solubilisiert
ist. Wie woanders hier weiter beschreiben, können die knochenbildenden Proteine,
die zur Verwendung bei der Erfindung der Anmelder geeignet sind,
mittels Routineexperimenten unter Verwendung des auf dem Fachgebiet
anerkannten und von Reddi und Sampath beschriebenen Biotests identifiziert.
werden. "Aminosäuresequenzhomologie" wird hier so verstanden,
daß sie
eine Aminosäuresequenzähnlichkeit
bedeutet. Homologe Sequenzen haben identische oder ähnliche
Aminosäurereste
gemeinsam, wobei ähnliche
Reste konservative Substitutionen oder erlaubte Punktmutationen
von entsprechenden Aminosäureresten
in einer ausgerichteten Referenzsequenz sind. Somit ist ein Polypeptidsequenzkandidat,
der 70% Aminosäurehomologie
mit einer Referenzsequenz teilt, einer, bei dem 70% der ausgerichteten
Reste entweder identisch sind oder konservative Substitutionen des
entsprechenden Rests in der Referenzsequenz. Beispiele für konservative
Variationen umfassen die Substitution eines hydrophoben Rests wie
Isoleucin, Valin, Leucin oder Methionin durch einen anderen, oder
die Substitution eines polaren Rests durch einen anderen, wie die
Substitution von Arginin durch Lysin, Glutaminsäure durch Asparaginsäure oder
Glutamin durch Asparagin und dergleichen. Der Ausdruck "konservative Variation" umfaßt auch die
Verwendung einer substituierten Aminosäure anstelle der nicht substituierten
Ausgangsaminosäure,
mit der Maßgabe,
daß ein
Antikörper,
der gegen das substituierte Polypeptid gebildet wird, auch mit dem
nicht substituierten Polypeptid immunologisch reagiert.
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Bei der Erfindung nützliche
Proteine umfassen eukaryontische Proteine, die als knochenbildende
Proteine identifiziert wurden (vgl. U. S. Patent 5,011,691, das
durch Bezugnahme eingeschlossen ist), wie die OP-1-, OP-2-, OP-3-
und CBMP-2-Proteine, so wie in der Aminosäuresequenz verwandte Proteine
wie DPP (aus Drosophila), Vgl (aus Xenopus), Vgr-1 (aus Maus), GDF-1
(aus Mensch, vgl. Lee (1991), PNAS 88: 4250–4254), 60A (aus Drosophila,
vgl. Wharton et al. (1991), PNAS 88: 9214–9218), Dorsalin-1 (aus Huhn, vgl.
Basler et al. (1993) Cell 73: 687–702 und GenBank-Zugangsnummer
L12032) und GDF-5 (aus Maus, vgl. Storm et al. (1994) Nature 368:
639–643).
BMP-3 wird auch bevorzugt. Zusätzliche
nützliche
Proteine umfassen biosynthetische morphogene Konstrukte, die in
U. S.-Pat. Nr. 5,011,691 offenbart sind, z. B. COP-1, 3–5, 7 und
16, ebenso wie andere Proteine, die im Stand der Technik bekannt
sind. Noch andere Proteine umfassen ostengen aktive Formen von BMP-3b (vgl. Takao et
al. (1996) Biochem. Biophys. Res. Comm. 219: 656–662), BMP-9 (vgl. W095/33830),
BMP-15 (vgl. WO96/35710), BMP-12 (vgl. WO95/16035), CDMP-1 (vgl. WO94/12814),
CDMP-2 (vgl. WO94/12814), BMP-10 (vgl. WO94/26893), GDF-1 (vgl.
WO92/00382, GDF-10 (vgl. WO95/10539), GDF-3 (vgl. WO94/15965) und
GDF-7 (vgl. WO95/01802).
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Noch andere nützliche Proteine umfassen Proteine,
die durch DNAs codiert werden, die in der Lage sind, mit einer DNA
zu hybridisieren, die ein hier beschriebenes knochenbildendes Protein
codiert, und verwandte Analoga, Homologe, Muteine und dergleichen
(vgl. nachstehend).
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Wie hier verwendet bedeutet "Träger" eine biologisch
verträgliches
nicht starres, amorphes Material, das keine definierten Oberflächen hat,
das geeignet ist für
die Vorrichtungen, Implantate und Verfahren der vorliegenden Erfindung.
Wie zuvor festgehalten bedeutet "nicht
starr" eine Trägerformulierung,
die lose oder locker ist oder anders im wesentlichen nicht in der
Lage, eine dreidimensionale Struktur bereitzustellen oder zu bilden,
die eine oder mehr definierte Oberflächen hat. Wie hier verwendet,
bedeutet "amorph" das Fehlen einer definierten
dreidimensionale Form, oder einer spezifischen Gestalt, das heißt ohne
besondere Gestalt oder Form oder mit einer undefinierten Gestalt
oder Form. Geeignete Träger
sind auch nicht partikulär
und nicht porös,
das heißt
porenlos. Trägern,
die für
die Verwendung bei der vorliegenden Erfindung geeignet sind, fehlt eine
dreidimensionale Gerüststruktur
und sind im wesentlichen matrixfrei. Somit ist "im wesentlichen frei von Matrix" auch so zu verstehen,
daß es
bedeutet, daß,
wenn eine einen Träger
enthaltende Vorrichtung an einer defekten Stelle bereitgestellt
wird, kein Substrat von einer exogenen Quelle einschließlich des
Trägers
eingeführt
wird, das per se als Gerüst
wirken kann. Vor der Verabreichung an und der Implantation in den
Empfänger wird
von dem Träger
wegen seiner chemischen Natur anerkannt, daß er nicht in der Lage ist,
zu der Vorrichtung eine dreidimensionale Gerüststruktur beizutragen. Bevorzugte
Träger
sind zumindest vorübergehend
adhärent
zu Geweben wie Knochen, Knorpel und/oder Muskel. Gewisse bevorzugte
Träger
sind wasserlöslich, viskos
und/oder inert. Zusätzlich
tragen bevorzugte Träger
kein signifikantes Volumen zu der Vorrichtung bei. Gegenwärtig bevorzugte
Träger
umfassen ohne Einschränkung
Alkylcellulosen, Pluronics, Gelatinen, Polyethylenglycole, Dextrine,
pflanzliche Öle
und Zucker. Insbesondere umfassen bevorzugte Träger gegenwärtig, sind aber nicht beschränkt auf,
Pluronic F 127, Carboxymethylcellulosen, Lactose, Mannitol und Sesamöl. Andere
bevorzugte Träger
umfassen Acetatpuffer, (20 mM, pH 4,5), physiologische Salzlösung (PBS)
und Citratpuffer. Im Falle von Vorrichtungen, die Träger wie
Acetat, Pluronics und PBS umfassen, kann die Verabreichung durch
Injektion in der Präzipitation
gewisser knochenbildender Proteine an der Verabreichungstelle resultieren.
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"Implantat", wie hierin beabsichtigt,
umfaßt
knochenbildendes Protein, das in einem biologisch verträglichen
nicht starren, amorphen Träger
dispergiert ist, der an einer defekten Stelle, die einen Hohlraum
definiert, keine definierten Oberflächen hat. Das heißt, daß das Implantat
der vorliegenden Erfindung hier so betrachtet wird, daß es die
defekte Stelle per se umfaßt,
an der die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung verabreicht/deponiert
wurde. Es wird weiterhin so beabsichtigt, daß zum Zeitpunkt der Verabreichung
einer Vorrichtung einem Implantat die Gerüststruktur fehlt und es im
Wesentlichen matrixfrei ist. Implantate, die von der Anwendung des
vorliegenden Verfahrens resultieren, sind in der Lage, die Knochenbildung
in einer defekten Stelle in einem Säuger zu induzieren, ausreichend,
den Defekt mit neugebildetem Knochen zu füllen und ohne das Erfordernis
des Einschlusses einer Matrix oder Gerüststruktur zur Zeit der Verabreichung
der Vorrichtung, und ausreichend, um den Hohlraum im Wesentlichen
zu füllen
und dabei strukturell die Größe und Form
des Defekts zu definieren.
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Die Mittel zur Herstellung und Verwendung
der Implantate der Vorrichtungen der Erfindung, ebenso wie andre
materielle Aspekte bezüglich
ihrer Natur und ihres Nutzens, einschließlich, wie der beanspruchte Gegenstand
der Erfindung herzustellen und zu verwenden ist, wird aus dem folgenden
weiter verstanden, welches die gegenwärtig als beste erachtete Ausführungsform
der Erfindung darstellt. Es versteht sich, daß die Erfindung nicht auf solche
beispielhafte Arbeit beschränkt
ist oder auf spezifische Details, wie sie in diesen Beispielen dargelegt
sind.
-
I. BETRACHTUNGEN ZUM PROTEIN
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A. Biochemische, strukturelle
und funktionelle Eigenschaften von morphogenen Proteinen des Knochens
-
Natürlicherweise vorkommende Proteine,
die hier als knochenbildende oder für Knochen morphogene Proteine
identifiziert und/oder anerkannt werden, bilden eine getrennte Subgruppe
innerhalb der losen evolutionären
Gruppierung von Sequenz-verwandten Proteinen, die als TGF-β-Superfamilie
oder -Supergenfamilie bekannt sind. Die natürlicherweise vorkommenden Morphogene
des Knochens haben eine substantielle Aminosäuresequenzhomologie in ihren
C-terminalen Regionen (Domänen).
Typischerweise werden die vorstehend erwähnten natürlicherweise vorkommenden knochenbildenden
Proteine als Vorläufer
translatiert, die eine N-terminale Signalpeptidsequenz haben, typischerweise
weniger als etwa 30 Reste, gefolgt von einer "pro"-Domäne, die
abgespalten wird, um die reife C-terminale Domäne zu ergeben. Das Signalpeptid
wird bei der Translation rasch abgespalten, an einer Spaltstelle,
die bei einer vorgegebenen Sequenz unter Verwendung des Verfahrens
von Von Heijne (1986) Nucleic Acids Research 14: 4683–4691 vorrausgesagt
werden kann. Die pro-Domäne
ist typischerweise etwa dreimal größer als die voll prozessierte
reife C-terminale Domäne.
Hier betrifft die "pro"-Form eines Morphogens
ein Morphogen, das ein gefaltetes Paar an Polypeptiden umfaßt, von
denen jedes die pro- und reife Form eines morphogenen Polypeptids
umfaßt.
Typischerweise ist unter physiologischen Bedingungen die pro-Form
eines Morphogens löslicher
als die reife Form. Die pro-Form scheint die primäre Form
zu sein, die von einer kultivierten Säugerzelle sezerniert wird.
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In bevorzugten Ausführungsformen
hat das Paar an morphogenen Polypeptiden Aminosäuresequenzen, von denen jede
ein Sequenz umfaßt,
die eine definierte Verwandtschaft mit einer Aminosäuresequenz
eines Referenzmorphogens hat. Hier haben die bevorzugten knochenbildenden
Proteine eine definierte Verwandtschaft mit einer Sequenz, die in
dem ostengen aktiven menschlichen OP-1, SEQ ID NR: 2 anwesend ist. Jede
oder mehrere der natürlicherweise
vorkommenden oder biosynthetischen Sequenzen, die hier offenbart sind,
könnten
jedoch in ähnlicher
Weise als Referenzsequenz verwendet werden. Bevorzugte knochenbildende
Polypeptide haben eine definierte Verwandtschaft mit mindestens
der Domäne
der sechs C-terminalen Cysteine von menschlichem OP-1, Reste 335–431 von
SEQ ID NR: 2. Vorzugsweise haben knochenbildende Proteine eine definierte
Verwandtschaft mit mindestens der Domäne der sieben C-terminalen
Cysteine von menschlichem OP-1, Reste 330–431 von SEQ ID NR: 2. Das
heißt,
daß jedes
bevorzugte Polypeptide in einem dimeren Protein mit morphogener
Aktivität
des Knochens eine Sequenz umfaßt,
die einer Referenzsequenz entspricht oder ein funktionelles Äquivalent
dazu ist.
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Funktionell äquivalente Sequenzen umfassen
funktionell äquivalente
Anordnungen von Cysteinresten, die innerhalb der Referenzsequenz
verteilt sind, einschließlich
Aminosäureinsertionen
oder -deletionen, die die lineare Anordnung dieser Cysteine ändern, ihre
Beziehung in der gefalteten Struktur des dimeren morphogenen Proteins
aber nicht materiell stören,
einschließlich
ihrer Fähigkeit
zur Bildung von solchen Disulfidbrücken innerhalb einer Kette
oder zwischen Ketten, wie sie für
die morphogene Aktivität
erforderlich sein können.
Funktionell äquivalente
Sequenzen umfassen weiterhin diejenigen, bei denen ein oder mehrere
Aminosäurereste
sich von dem entsprechenden Rest in der Referenzsequenzunterscheiden,
d. h. der Domäne
der sieben C-terminalen Cysteine (hier auch als Skelett der sieben
konsevierten Cysteine bezeichnet) von menschlichem OP-1, mit der
Maßgabe,
daß dieser
Unterschied nicht die morphogene Aktivität des Knochens zerstört. Entsprechend
sind konservative Susbstitutionen von entsprechenden Aminosäuren in
der Referenzsequenz bevorzugt. Aminosäurereste, die konservative
Susbstitutionen von entsprechenden Resten in der Referenzsequenz
sind, sind diejenigen, die physikalisch oder funktionell dem entsprechenden
Referenzrest ähnlich
sind, d. h. eine ähnliche
Größe, Form,
elektrische Ladung, chemische Eigenschaften einschließlich der
Fähigkeit
zur Bildung von kovalenten oder Wasserstoffbindungen oder dergleichen
haben. Insbesondere bevorzugte konservative Susbstitutionen sind
diejenigen, die die Kriterien erfüllen, die Dayhoff et al.
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(1978), 5 Atlas of Protein Sequence
and Structure, Suppl. 3, Kap: 22 (S. 354–352), Natl. Biomed. Res. Found.,
Washington, D. C. 20007, für
eine akzeptierte Punktmutation definiert hat, deren Lehren durch
Bezugnahme hier eingeschlossen werden.
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Knochenbildendes Protein aus natürlicher
Quelle in seiner reifen, nativen Form ist ein glycosyliertes Dimer,
das typischerweise ein offenbares Molekulargewicht von etwa 30–36 kDa
hat, wie mittels SDS-PAGE bestimmt. Wenn reduziert, ergibt das Protein
von 30 kDa zwei glycosylierte Peptiduntereinheiten, die ein apparentes
Molekulargewicht von etwa 16 kDa und 18 kDa haben. Im reduzierten
Zustand hat das Protein keine nachweisbare knochenbildende Aktivität. Das nicht
glycosylierte Protein, das auch knochenbildende Aktivität hat, hat
ein apparentes Molekulargewicht von etwa 27 kDa. Wenn reduziert,
ergibt das Protein von 27 kDa zwei nicht glycosylierte Polypeptide,
die ein apparentes Molekulargewicht von etwa 14 kDa bis 16 kDa haben
und in der Lage sind, in einem Säuger
die endochondrale Knochenbildung zu induzieren. Wie vorstehend beschrieben,
umfassen insbesondere nützliche
Sequenzen diejenigen, die die C-terminalen 102 Aminosäuresequenzen
von DPP (aus Drosophila) umfassen, Vgl (aus Xenopus), Vgr-1 (aus
Maus), die OP1- und OP2-Proteine, (vgl. U.S.-Pat. Nr. 5,011,691
und Oppermann et al., ebenso wie die Proteine, die als BMP2, BMP3,
BMP4 (vgl. WO88/00205, U.S.-Patent Nr. 5,013,649 und WO91/18098),
BMP5 und BMP6 (vgl. WO90/11366, PCT/US90/01630) und BMP8 und 9 bezeichnet
werden.
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In gewissen bevorzugten Ausführungsformen
umfassen hier nützliche
morphogene Proteine des Knochens diejenigen, bei denen die Aminosäuresequenzen
eine Sequenz umfassen, die eine mindestens 70%-ige Aminosäuresequenzhomologie
oder "Ähnlichkeit" oder vorzugsweise
eine 80%-ige Homologie oder Ähnlichkeit
mit einem morphogenen Referenzprotein hat, das ausgewählt ist
aus den vorstehenden natürlicherweise vorkommenden
Proteinen. Vorzugsweise ist das Referenzprotein menschliches OP-1
und die Referenzsequenz davon ist die C-terminale Domäne der sieben
Cysteine, die in ostengen aktiven Formen von menschlichem OP-1,
Reste 330–431
von SEQ ID NR: 2, anwesend ist. Morphogene Proteine des Knochens,
die hier von Nutzen sind, umfassen dem entsprechend allelische,
phylogenetische Gegenstücke
und andere Varianten der bevorzugten Referenzsequenz, natürlicherweise
vorkommend oder biosynthetisch produziert (d. h. einschließlich "Muteinen" oder "mutanten Proteinen"), ebenso wie neue
Mitglieder der allgemeinen morphogenen Familie von Proteinen, einschließlich der
vorstehend dargestellten und identifizierten. Gewisse insbesondere bevorzugte
morphogene Polypeptide haben mindestens eine 60%-ige Aminosäureidentität mit der
bevorzugten Referenzsequenz von menschlichem OP-1, noch mehr bevorzugt
mindestens eine 65%-ige Aminosäureidentität damit.
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In anderen bevorzugten Ausführungsformen
wird die Familie von morphogenen Polypeptiden des Knochens, die
bei der vorliegenden Erfindung von Nutzen ist, und Mitglieder davon,
durch die generische Aminosäuresequenz
definiert. Zum Beispiel erfüllen
die Generische Sequenz 7 (SEQ ID NR: 4) und die Generische Sequenz
8 (SEQ ID NR: 5), die nachstehend offenbart werden, die Homlogie,
die von den bisher identifizierten Mitgliedern der Proteinfamilie
geteilt wird, einschließlich
mindestens OP-1, OP-2, OP-3, CBMP-2A, CBMP-2B, BMP-3, 60A, DPP,
Vgl, BMP-5, BMP-6, Vgr-1 und GDF-1. Die Aminosäuresequenzen für diese
Proteine werden hier beschrieben und/oder im Fachgebiet, wie vorstehend
zusammengefaßt.
Die generischen Sequenzen umfassen sowohl die Aminosäureidentität, die von
diesen Sequenzen in der C-terminalen Domäne geteilt wird, definiert
durch die Skelette von sechs oder sieben Cysteinen, (Generische
Sequenzen 7 und 8), ebenso wie alternative Reste für die variablen
Positionen innerhalb der Sequenz. Die generischen Sequenzen stellen
ein geeignetes Skelette von Cysteinen bereit, wobei sich inter- oder intramolekulare
Disulfidbindungen bilden können,
und enthalten gewisse kritische Aminosäuren, die wahrscheinlich die
Tertiärstruktur
der gefalteten Proteine beeinflussen. Zusätzlich lassen die generischen
Sequenzen ein zusätzliches
Cystein an Position 41 (Generische Sequenz 7) oder an Position 46
(Generische Sequenz 4) zu, womit die morphogen aktiven Sequenzen
OP-2 und OP-3 umfaßt
werden.
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Generische
Sequenz 7
worin jedes Xaa unabhängig ausgewählt ist aus einer Gruppe von
einer oder mehreren spezifischen Aminosäuren, die wie folgt definiert
sind: "Res." bedeutet "Rest" und Xaa an Res.
2 = (Tyr oder Lys); Xaa an Res. 3 = (Val oder Ile); Xaa an Res.
4 = (Ser, Asp oder Glu); Xaa an Res. 6 = (Arg, Gln, Ser, Lys oder
Ala); Xaa an Res. 7 = (Asp oder Glu); Xaa an Res. 8 = (Leu, Val
oder Ile); Xaa an Res. 11 = (Gln, Leu, Asp, His, Asn oder Ser);
Xaa an Res. 12 = (Asp, Arg, Asn oder Glu); Xaa an Res. 13 = (Trp
oder Ser); Xaa an Res. 14 = (Ile oder Val); Xaa an Res. 15 = (Ile
oder Val); Xaa an Res. 16 = (Ala oder Ser); Xaa an Res. 18 = (Glu,
Gln, Leu, Lys, Pro oder Arg); Xaa an Res. 19 = (Gly oder Ser); Xaa
an Res. 20 = (Tyr oder Phe); Xaa an Res. 21 = (Ala, Ser, Asp, Met,
His, Gln, Leu oder Gly); Xaa an Res. 23 = (Tyr, Asn oder Phe); Xaa
an Res. 26 = (Glu, His, Tyr, Asp, Gln, Ala, oder Ser); Xaa an Res.
28 = (Glu, Lys, Asp, Gln oder Ala); Xaa an Res. 30 = (Ala, Ser,
Pro, Gln, Ile oder Asn); Xaa an Res. 31 = (Phe, Leu oder Tyr); Xaa
an Res. 33 = (Leu, Val oder Met); Xaa an Res. 34 = (Asn, Asp, Ala,
Thr oder Pro); Xaa an Res. 35 = (Ser, Asp, Glu, Leu, Ala oder Lys);
Xaa an Res. 36 = (Tyr, Cys, His, Ser oder Ile); Xaa an Res. 37 =
(Met, Phe, Gly oder Leu); Xaa an Res. 38 = (Asn, Ser oder Lys);
Xaa an Res. 39 = (Ala, Ser, Gly oder Pro); Xaa an Res. 40 = (Thr,
Leu oder Ser); Xaa an Res. 44 = (Ile, Val oder Thr); Xaa an Res.
45 = (Val, Leu, Met oder Ile); Xaa an Res. 46 = (Gln oder Arg);
Xaa an Res. 47 = (Thr, Ala oder Ser); Xaa an Res. 48 = (Leu oder
Ile); Xaa an Res. 49 = (Val oder Met); Xaa an Res. 50 = (His, Asn
oder Arg); Xaa an Res. 51 _ (Phe, Leu, Asn, Ser, Ala oder Val);
Xaa an Res. 52 = (Ile, Met, Asn, Ala, Val, Gly oder Leu); Xaa an
Res. 53 = (Asn, Lys, Ala, Glu, Gly oder Phe); Xaa an Res. 54 = (Pro,
Ser oder Val); Xaa an Res. 55 = (Glu, Asp, Asn, Gly, Val, Pro oder
Lys); Xaa an Res. 56 = (Thr, Ala, Val, Lys, Asp, Tyr, Ser, Gly,
Ile oder His); Xaa an Res. 57 = (Val, Ala oder Ile); Xaa an Res.
58 = (Pro oder Asp); Xaa an Res. 59 = (Lys, Leu oder Glu); Xaa an
Res. 60 = (Pro, Val oder Ala); Xaa an Res. 63 = (Ala oder Val);
Xaa an Res. 65 = (Thr, Ala oder Glu); Xaa an Res. 66 _ (Gln, Lys,
Arg oder Glu); Xaa an Res. 67 = (Leu, Met oder Val); Xaa an Res.
68 = (Asn, Ser, Asp oder Gly); Xaa an Res. 69 = (Ala, Pro oder Ser);
Xaa an Res. 70 = (Ile, Thr, Val oder Leu); Xaa an Res. 71 = (Ser,
Ala, oder Pro); Xaa an Res. 72 = (Val, Leu, Met oder Ile); Xaa an
Res. 74 = (Tyr oder Phe); Xaa an Res. 75 = (Phe, Tyr, Leu oder His);
Xaa an Res. 76 = (Asp, Asn oder Leu); Xaa an Res. 77 = (Asp, Glu,
Asn, Arg oder Ser); Xaa an Res. 78 = (Ser, Gln, Asn, Tyr oder Asp);
Xaa an Res. 79 = (Ser, Asn, Asp, Glu oder Lys); Xaa an Res. 80 =
(Asn, Thr oder Lys); Xaa an Res. 82 = (Ile, Val oder Asn); Xaa an
Res. 84 = (Lys oder Arg); Xaa an Res. 85 = (Lys, Asn, Gln, His,
Arg oder Val); Xaa an Res. 86 = (Tyr, Glu oder His); Xaa an Res.
87 = (Arg, Gln, Glu oder Pro); Xaa an Res. 88 = (Asn, Glu, Trp oder
Asp); Xaa an Res. 90 = (Val, Thr, Ala oder Ile); Xaa an Res. 92
= (Arg, Lys, Val, Asp, Gln oder Glu); Xaa an Res. 93 = (Ala, Gly,
Glu oder Ser); Xaa an Res. 95 = (Gly oder Ala) und Xaa an Res. 97
= (His oder Arg).
-
Die Generische Sequenz 8 (SEQ ID
NR: 5) umfaßt
die gesamte Generische Sequenz 7 und umfaßt zusätzlich die folgende Sequenz
(SEQ ID NR: 6) an ihrem N-Terminus:
-
-
Dem entsprechend ist beginnend mit
Rest 7 jede "Xaa" in der Generischen
Sequenz 8 eine spezifizierte Aminosäure, definiert wie bei der
Generischen Sequenz 7, mit dem Unterschied, daß jede Zahl für einen Rest
der Generischen Sequenz 7 in der Generischen Sequenz 8 um fünf verschoben
ist. Somit betrifft "Xaa
an Res. 2 = (Tyr oder Lys)" in
der Generischen Sequenz 7 Xaa an Res. 7 in der Generischen Sequenz
8. In der Generischen Sequenz 8, Xaa an Res. 2 = (Lys, Arg, Ala
oder Gln); Xaa an Res. 3 = (Lys, Arg, oder Met); Xaa an Res. 4 =
(His, Arg oder Gln); und Xaa an Res. 5 = (Glu, Ser, His, Gly, Arg,
Pro, Thr oder Tyr).
-
In einer anderen Ausführungsform
umfassen nützliche
knochenbildende Proteine diejenigen, die durch die Generischen Sequenzen
9 und 10 definiert sind, wie hier vorstehend beschrieben.
-
Wie vorstehend festgehalten, haben
gegenwärtig
bevorzugte morphogene Polypeptidsequenzen des Knochens, die bei
dieser Erfindung von Nutzen sind, mehr als 60% Identität, vorzugsweise
mehr als 65% Identität
mit der Aminosäuresequenz,
die die bevorzugte Referenzsequenz von hOP-1 definiert. Diese besonders bevorzugten
Sequenzen umfassen allelische und phylogenetische Gegenstückvarianten
der OP-1- und OP-2-Proteine, einschließlich des Proteins 60A von
Drosophila. Dem entsprechend umfassen in gewissen besonders bevorzugten
Ausführungsformen
nützliche
morphogene Proteine aktive Proteine, die Paare von Polypeptidketten
innerhalb der generischen Aminosäuresequenz
umfassen, die hier als "OPX" (SEQ ID NR: 3) bezeichnet,
welche das Skelett von sieben Cysteinen definiert und die Homologien
zwischen mehreren identifizierten Varianten von OP-1 und OP-2 beinhaltet.
Wie hier beschrieben, wird jedes Xaa an einer gegebenen Position
unabhängig
ausgewählt
aus den Resten, die an der entsprechenden Position in der C-terninalen
Sequenz von OP-1 oder OP-2 der Maus oder des Menschen vorkommt.
-
In noch einer anderen bevorzugten
Ausführungsform
haben nützliche,
bei der Knochenbildung aktive Proteine Polypeptidketten mit Aminosäuresequenz,
die eine Sequenz umfassen, die von einer Nucleinsäure codiert
wird, die unter Hybridisierungsbedingungen mit niedriger, mittlerer
oder hoher Stringenz mit DNA oder RNA hybridisieren, die morphogene
Referenzsequenzen codieren, d. h. C-terminale Sequenzen, die die
konservierten Domänen
von sieben Cysteinen von OP-1, OP-2, BMP2, 4, 5, 6, 60A, GDF3, GDF6,
GDF7 und dergleichen definieren. Wie hier verwendet, sind Hybridisierungsbedingungen
mit hoher Stringenz als Hybridisierung gemäß bekannter Verfahren definiert
in 40% Formamid, 5 X SSPE, 5 X Denhardt's Lösung
und 0.1% SDS bei 37°C übernacht
und Waschen mit 0,1 X SSPE, 0.1% SDS bei 50°C. Standardbedingungen für Stringenz sind
in kommerziell erhältlichen
Standardtexten der molekularen Clonierung gut charakterisiert.
-
Wie vorstehend festgehalten sind
bei der vorliegenden Erfindung nützliche
Proteine im allgemeinen dimere Proteine, die ein gefaltetes Paar
der vorstehenden Polypeptide umfassen. Solche morphogenen Proteine
sind inaktiv, wenn sie reduziert sind, sind aber aktiv als oxidierte
Homodimere und wenn sie in Kombination mit anderen der Erfindung
oxidiert werden, um Heterodimere zu ergeben. Somit können die
Mitglieder eines gefalteten Paares von morphogenen Polypeptiden
in einem morphogen aktiven Protein unabhängig von jedem der vorstehend
erwähnten
spezifischen Polypeptide ausgewählt
werden.
-
Die morphogenen Proteine des Knochens,
die bei den Materialien dieser Erfindung von Nutzen sind, umfassen
Proteine, die jede der vorstehend beschriebenen Polypeptidketten
umfassen, entweder isoliert aus natürlicherweise vorkommenden Quellen
oder hergestellt mittels rekombinanter DNA- oder anderer synthetischer
Verfahren und umfassen allelische und phylogenetische Gegenstückvarianten
dieser Proteine ebenso wie biosynthetische Varianten (Muteine) davon
und verschiedene verkürzte
und Fusionskonstrukte. Man stellt sich vor, daß auch Deletions- oder Additionsmutanten
aktiv sind, einschließlich
derer, die die konservierte C-terminale Domäne mit sechs oder sieben Cysteinen ändern können, mit
der Maßgabe,
daß die
Veränderung nicht
die Beziehung dieser Cysteine in der gefalteten Struktur funktionell
zerstören.
Dem entsprechend werden solche aktiven Formen als das Äquivalent
der hier offenbarten, spezifisch beschriebenen Konstrukte betrachtet.
Die Proteine können
Formen umfassen, die verschiedene Glycosylierungsmuster haben, verschiedene N-Termini,
eine Familie von verwandten Proteinen, die Regionen von Aminosäuresequenzhomologie
haben, und aktive verkürzte
oder mutierte Formen von nativen oder biosynthetischen Proteinen,
hergestellt durch Expression von rekombinanter DNA in Wirtszellen.
-
Die hier betrachteten morphogenen
Proteine des Knochens können
von intakter oder verkürzter
cDNA oder von synthetischen DNAs in prokaryontischen oder eukaryontischen
Wirtszellen exprimiert werden, und gereinigt, gespalten, wiedergefaltet
und dimerisiert werden, um morphogen aktive Zusammensetzungen zu
bilden. Gegenwärtig
bevorzugte Wirtszellen umfassen E. coli oder Säugerzellen, wie CHO-, COS-
oder BSC-Zellen. Ausführliche
Beschreibungen der bei der Ausführung
dieser Erfindung nützlichen
morphogenen Proteine des Knochens, einschließlich ihrer Herstellung, Verwendung
und Testung auf knochenbildende Aktivität sind in zahlreichen Veröffentlichungen
offenbart, einschließlich
US-Patent Nr. 5,266,683 und 5,011,691, deren Offenbarung hier durch
Bezugnahme eingeschlossen wird.
-
Somit können angesichts dieser Offenbarung
geübte
Gentechniker Gene von cDNA oder genomischen Bibliotheken zahlreicher
verschiedener biologischer Arten isolieren, die geeignete Aminosäuresequenzen
codieren, oder DNAs aus Oligonucleotiden konstruieren, und sie dann
in verschiedenen Arten von Wirtszellen exprimieren, einschließlich Prokaryonten
und Eukaryonten, um große
Mengen an aktiven Proteinen zu produzieren, die in der Lage sind,
die Morphogenese von endochondialem Knochen in einem Säuger zu
stimulieren.
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B. Die Gewinnung von morphogenem
Protein des Knochens, OP-1
-
1. Lyphilisiertes Protein
-
OP-1 kann aus 20 mM Acetatpuffer,
pH 4,5, mit 5% Mannitol, Lactose, Glycin oder anderen Zusatz- oder
Volumenmitteln unter Verwendung von Standardlyophilisierungsprotokollen
lyophilisiert werden. Von auf diese Weise wiederhergestelltem OP-1
ist beobachtet worden, daß es
bei Aufbewahrung bei 4°C
oder 30°C mindestens
sechs Monate biologisch aktiv ist.
-
OP-1 kann auch aus einem Succinat-
oder Citratpuffer (oder einem anderen nicht flüchtigen Puffer) für die Wiederherstellung
in Wasser lyophilisiert werden, oder von Wasser für die Wiederherstellung
in 20 mM Acetatpuffer, pH 4,5. Im allgemeinen sind Zusatzstoffe
wie Lactose, Sucrose, Glycin und Mannitol geeignet für die Verwendung
bei lyophilisierten matrixfreien knochenbildenden Vorrichtungen.
In gewissen Ausführungsformen
können
solche Vorrichtungen (0,5 mg/ml OP-1 und 5% Zusatz) vor der Lyophilisierung
in einer feuchten oder trockenen Konfiguration hergestellt werden.
-
Zum Beispiel sind flüssige Formulierungen
von OP-1 in 10 und 20 mM Acetatpuffer (pH 4, 4,5 und 5) mit und
ohne Mannitol (0%, 1% und 5%) für
mindestens sechs Monate stabil und ostengen aktiv.
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II. BETRACHTUNGEN ZUM
TRÄGER
-
Wie bereits erklärt, bedeutet "Träger", wie hier verwendet,
ein biologisch verträgliches,
nicht starres amorphes Material, das keine definierten Oberflächen hat
und für
die Verwendung bei den Vorrichtungen, Implantaten und Verfahren
der vorliegenden Erfindung geeignet ist. Geeignete Träger sind
nicht partikulär
und nicht porös,
das heißt
porenlos. Trägern,
die für
die Verwendung bei der vorliegenden Erfindung geeignet sind, fehlt
eine Gerüststruktur
und sind im wesentlichen matrixfrei. Somit ist "im wesentlichen frei von Matrix" auch so zu verstehen,
daß es
bedeutet, daß,
wenn eine einen Träger
enthaltende Vorrichtung an einer defekten Stelle bereitgestellt
wird, kein Substrat von einer exogenen Quelle einschließlich des
Trägers
eingeführt
wird, das per se als Gerüst
wirken kann. Vor der Verabreichung an und der Implantation in den
Empfänger
wird von dem Träger
wegen seiner chemischen Natur anerkannt, daß er im Wesentlichen nicht
in der Lage ist, zu der Vorrichtung eine dreidimensionale Gerüststruktur
beizutragen. Bevorzugte Träger
sind zumindest vorübergehend adhärent zu
Geweben wie Knochen, Knorpel und/oder Muskel. Gewisse bevorzugte
Träger
sind wasserlöslich, viskos
und/oder inert. Zusätzlich
tragen bevorzugte Träger
nicht ein signifikantes zum Volumen zu einer Vorrichtung bei. Gegenwärtig bevorzugte
Träger
werden ausgewählt
aus der Gruppe, die besteht aus: Alkylcellulosen, Pluronics, Gelatinen,
Polyethylenglycolen (PEG), Dextrinen, pflanzlichen Ölen und
Zuckern. Insbesondere bevorzugte Träger umfassen gegenwärtig, sind
aber nicht beschränkt
auf, Pluronics F127, Carboxymethylcellulosen (CMC), (d. h. CMC niedriger
Viskosität
von Aqualon), Lactose, PEG, Mannitol, Sesamöl und Hetastärke (Hespan,
Dupont) und Kombinationen davon. Andere bevorzugte Träger umfassen
ohne Einschränkung
Acetatpuffer, (20 mM, pH 4,5), physiologische Salzlösung und
Citratpuffer. Im Falle von Vorrichtungen, die Träger wie Acetat, Pluronics und
PBS enthalten, kann die Verabreichung mittels Injektion in einer
Ausfällung
gewisser knochenbildender Proteine an der Verabreichungsstelle resultieren.
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III. ÜBERLEGUNGEN ZUR FORMULIERUNG
UND ZUR VERABREICHUNG
-
Die Vorrichtungen der Erfindung können unter
Verwendung von Routineverfahren formuliert werden. Alles, was erforderlich
ist, ist die Bestimmung der gewünschten
Endkonzentration des knochenbildenden Proteins pro Volumeneinheit
an Träger,
wobei man im Gedächtnis
halten muß,
daß das
verabreichte Volumen an Vorrichtung weniger sein wird als das Volumen
des Hohlraums an der defekten Stelle. Die gewünschte Endkonzentration an
Protein wird von der spezifischen Aktivität des Proteins abhängen ebenso
wie von der Art, dem Volumen und/oder der anatomischen Lage des
Defekts. Zusätzlich
kann die gewünschte Endkonzentration
an Protein vom Alter, dem Geschlecht und/oder dem Gesundheitszustand
des Empfängers
abhängen.
Es wurde beobachtet, daß für segmentale
Defekte kritischer Größe von etwa
mindestens 2,5 cm Länge
typischerweise 0,05 ml (oder mg) einer Vorrichtung, die 0,5 bis
1,5 mg knochenbildendes Protein enthält, eine Knochenbildung induziert,
die ausreicht, um die Lücke
zu füllen.
Im Falle von frischen Brüchen
mit Defekten nicht kritischer Größe, wurde
beobachtet, daß etwa
0,1–0,5
mg Protein die Lücke
oder den Defekt reparieren. Die Optimierung der Dosen erfordert
nur Routineversuche und gehört
zum Können
eines Durchschnittsfachmanns auf dem Fachgebiet.
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Wie nachstehend beispielhaft dargestellt,
können
die Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung eine Vielzahl an Konfigurationen
annehmen. Zum Beispiel kann eine matrixfreie knochenbildende Vorrichtung
in Lösung
durch Solubilisierung gewisser Formen von OP-1 in Lösungen von
Acetat- (20 mM, pH 4,5) oder Citratpuffern oder phosphatgepufferter
Salzlösung
(PBS), pH 7,5, formuliert werden. In einigen Fällen kann das knochenbildende
Protein nicht vollständig
solubilisiert werden und/oder kann bei Verabreichung an der defekten Stelle
ausfallen. Suspensionen, Aggregatbildung und/oder in vivo-Präzipitation
beeinträchtigen
nicht die Wirksamkeit der matrixfreien knochenbildenden Vorrichtung,
wenn sie gemäß der hier
offenbarten Erfindung durchgeführt
wird. Matrixfreie Vorrichtungen in Lösung sind besonders geeignet
für die
Verabreichung durch Injektion, wie die Bereitstellung einer Vorrichtung
an einer Bruchstelle durch Injektion statt chirurgischer Mittel.
-
Allgemein gesagt unterscheidet sich
die Konfiguration von matrixfreien Vorrichtungen, die für die Verabreichung
durch Injektion geeignet ist, von denjenigen, die für die Verwendung
an einer offenen chirurgischen Stelle bevorzugt werden. Zum Beispiel
sind lyophilisierte Herstellungen von matrixfreien Vorrichtungen
eine gegenwärtig
bevorzugte Ausführungsform
für die
Reparatur dieser Art von Defekt. Die vorstehend beschriebenen matrixfreien
Vorrichtungen in Lösung
können
verwendet werden, um eine lyophilisierte Konfiguration herzustellen.
Wie zum Beispiel nachstehend beschrieben kann das knochenbildende
Protein OP-1 den vorstehend beschriebenen Puffern beigemischt und
dann lyophilisiert werden. OP-1 kann auch aus Mannitol-haltigem
Wasser lyophilisiert werden.
-
Wie nachstehend beispielhaft dargestellt,
können
lyophilisierte Konfigurationen von matrixfreien knochenbildenden
Vorrichtungen die Knochenbildung in segmentalen Defekten kritischer
und nicht kritischer Größe induzieren.
Zum Beispiel umfaßt
die Bereitstellung einer lyophilisierten Vorrichtung an einer segmentalen defekten
Stelle die Ablage von nicht zusammenhängenden Teilmengen der lyophilisierten
Vorrichtung entlang der Länge
des bloßgelegten
Muskels, der den segmentalen Defekt überspannt, so daß die Gesamtzahl
an Teilmengen eine Menge an knochenbildendem Protein bereitstellt,
die ausreicht, die Knochenbildung zu induzieren, die letztlich den
Hohlraum an der defekten Stelle füllt. Der Plazierung folgt der
Routineverschluß der
defekten Stelle, wobei die Schichten an Muskel und assoziiertem
Gewebe Schicht für
Schicht vernäht
werden, um die Teilmengen im Hohlraum an der defekten Stelle einzuschließen. Diese
Art von Verabreichung und chirurgischem Verschluß erfordern nur Routinekönnen und
-versuche. Ähnliche
Formulierungen und Verabreichungsverfahren können verwendet werden, um die
Knochenbildung für
die Reparatur von Lücken
zu induzieren, die durch fehlende Prosthetic, Knochentumorresektion,
Schädel-/Gesichtsrekonstruktion,
Rückgratverschmelzung
und massive Allograftdefekte verursacht sind. Alle Modifikationen
der vorstehend beschriebenen Verabreichungsverfahren, die für spezialisierte
Anwendungen von lyophilisierten matrixfreien Vorrichtungen erforderlich
sind, gehören
zum Können
des Durchschnittsfachmanns und erfordern lediglich Routineversuche.
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Noch eine andere Konfiguration von
matrixfreien Vorrichtungen ist nachstehend beispielhaft dargestellt.
Das knochenbildende Protein und ein Träger wie Carboxymethylcellulose
(niedrige Viskosität,
Aqualon, oder Pluronic F127 können
zusammengemischt werden, um eine Paste zu bilden. In einigen Ausführungsformen
wird ungefähr
Salzlösung
zu dem Träger
zugegeben, um eine Paste zu bilden; in der ein knochenbildendes
Protein wie OP-1 dispergiert werden kann. Eine Pastenkonfiguration
kann verwendet werden, um die Oberfläche eines Defektes, wie einem
Hohlraum, zu bestreichen. Pasten können verwendet werden, um Bruchdefekte
zu bestreichen, chondrale oder osteochondrale Defekte, ebenso wie
Knochendefekte an einer prothetischen Implantationsstelle. Eine
Paste kann auch injiziert werden oder ausgepreßt in einen oder entlang einer
der Oberfläche
eines Defekts, auf eine ähnliche
Weise wie das Ausdrücken
von Zahnpasta oder Dichtmasse aus einer Tube, so daß ein Bett
an matrixfreier Vorrichtung entlang der Länge der defekten Stelle verabreicht
wird. Typischerweise wird der Durchmesser des ausgepreßten Betts
von der Art des Defekts bestimmt, ebenso wie vom Volumen des Hohlraums
an der defekten Stelle.
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Es können auch Träger wie
Carboxymethylcellulose verwendet werden, um eine Vorrichtung mit
einer Konfiguration wie ein Kitt zu formulieren. Wie für den Durchschnittsfachmann
offensichtlich ist resultiert eine solche Konfiguration aus der
Anpassung des Anteil an Träger
im Verhältnis
zum Befeuchtungsmittel, wobei weniger Befeuchtungsmittel eine trockenere
Vorrichtung produziert und mehr eine feuchtere Vorrichtung produziert.
Die genaue Konfiguration der Vorrichtung, die geeignet ist, einen
Defekt zu reparieren, wird mindestens von der Art des Defekts und
von der Größe des Defekts
abhängen.
Der Durchschnittsfachmann wird diese Variablen kennen.
-
Noch eine andere Konfiguration, die
geeignet ist für
die Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung, ist ein Gel. Dies
wird nachstehend beispielhaft durch die Pluronic enthaltende matrixfreie
Vorrichtung dargestellt, die Knochenbildung in vivo induzieren kann.
Gele dieser Art wurden verwendet, um Brüche zu behandeln ebenso wie
Lückenreparaturen.
Eine nützliche
Eigenschaft dieser Konfiguration ist, daß die Viskosität des Gels durch
Anpassung der Menge an Träger
manipuliert werden kann, womit ein weiter Bereich an Anwendungen (z.
B. segmentale Defekte, Brüche
und Rekonstruktionen) und Verabreichungsarten (z. B. Injektionen,
Bestreichen, Auspressen und dergleichen) zugänglich ist. Somit kann diese
Form der Vorrichtung mindestens die Formen einer injizierbaren Flüssigkeit,
einer viskosen Flüssigkeit
und eines auspreßbaren
Gels annehmen, indem man einfach die Menge an Träger manipuliert, in der das
knochenbildende Protein dispergiert wird.
-
In noch anderen Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung können
Herstellungen der aktuellen knochenbildenden Vorrichtung unmittelbar
vor der Verabreichung an dem defekten Ort erfolgen. Zum Beispiel können CMC
enthaltende Vorrichtungen vor Ort hergestellt werden, geeignet für die Zumischung
unmittelbar vor der Chirurgie. In einer Ausführungsform wird das CMC mit
niedriger Viskosität
(Aqualon) getrennt vom knochenbildenden Protein OP-1 verpackt und
bestrahlt. Das OP-1-Protein wird dann dem CMC-Träger zugemischt und auf knochenbildende
Aktivität
getestet. Bei auf diese Weise hergestellten Vorrichtungen wurde
beobachtet, daß sie
so biologisch aktiv sind wie die herkömmliche Vorrichtung ohne CMC.
Wiederum ist nur die Bestimmung der wirksamen Menge an knochenbildendem
Protein erforderlich, die eine Knochenbildung induziert, die ausreicht,
die defekte Stelle zu füllen
und ein Vorrichtungsvolumen einhält,
das kleiner ist als das Volumen der defekten Stelle. Die genaue
Art, in der die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung formuliert
wird, und wann oder wie die Formulierung erfolgt, ist für die Ausführung nicht
kritisch.
-
Die Ausführung der Erfindung wird noch
vollständiger
durch die folgenden Beispiele verstanden, die hier nur zur Illustration
dargestellt sind und keinesfalls als Beschränkung der Erfindung verstanden
werden sollten.
-
N. BIOLOGISCHER TEST A. Biologischer
Test auf knochenbildende Aktivität:
endochondrale Knochenbildung und verwandte Eigenschaften Im folgenden
werden innerhalb des Umfangs der Erfindung des Anmelders liegende
Protokolle für
die Identifikation und Charakterisierung bona fide von knochenbildenden
Proteinen oder morphogenen Proteinen des Knochens ebenso wie knochenbildenden
Vorrichtungen dargestellt.
-
Der im Stand der Technik anerkannte
biologische Test für
die Knochenbildung, wie beschrieben von Sampath und Reddi (Proc.
Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80: 6591–6595) und in dem US-Pat. Nr.
4,968,590, deren Offenbarung durch Bezugnahme hier eingeschlossen
sind, wird verwendet, um die Wirksamkeit der Reinigungsprotokolle
zu belegen. Wie nachstehend gezeigt, besteht dieser Test in der
Aufbringung der Testproben auf subkutane Stellen bei allogenen Ratten
unter Ätherbetäubung. In
die Haut über
dem Bereich des Brustkorbs wird unter sterilen Bedingungen ein vertikaler
Einschnitt (1 cm) gemacht und mittels stumpfer Sektion eine Tasche
hergestellt. Unter gewissen Umständen
werden etwa 25 mg Testprobe tief in diese Tasche implantiert und
der Einschnitt mit einem Metallclip geschlossen. Die heterotrope
Stelle läßt die Untersuchung der
Induktion des Knochens zu ohne mögliche
Zweideutigkeiten, die bei Verwendung von orthotopen Stellen resultieren.
-
Die aufeinanderfolgenden zellulären Reaktionen,
die an der heterotropen Stelle auftreten, sind komplex. Die vielstufige
Kaskade der endochondralen Knochenbildung umfaßt: Bindung von Fibrin und
Fibronectin an die implantierte Matrix, Chemotaxis von Zellen, Proliferation
von Fibroblasten, Differenzierung in Chondroblasten, Knorpelbildung,
Einwachsen von Blutgefäßen, Knochenbildung,
Ummodellierung und Knochenmarkdifferenzierung.
-
Bei Ratten zeigt dieses biologische
Modell eine kontrollierte Progression durch die Stadien der Matrix-induzierten
endochondralen Knochenentwicklung einschließlich: (1) transiente Infiltration
durch polymorphonucleäre
Leukocyten am Tag eins; (2) die Wanderung und Proliferation von
mesenchymalen Zellen an den Tagen zwei und drei; (3) das Auftauchen
von Chondrocyten an den Tagen fünf
und sechs; (4) die Bildung von Knorpelmatrix am Tag acht; (5) Calcifizierung
des Knorpels am Tag acht (9) Einwachsen von Gefäßen, Erscheinen von Osteoblasten
und Bildung von neuem Knochen an den Tagen neun und zehn; (10) Erscheinen
der Ummodellierung von Osteaoblasten und Knochen an den Tagen zwölf bis achtzehn;
und (11) hämotopoetische Knochenmarksdifferenzierung
in dem Knöchelchen
am Tag einundzwanzig.
-
Histologische Sezierung und Anfärbung wird
vorgezogen, um das Ausmaß an
Knochenbildung in den Implantaten zu bestimmen. Anfärbung mit
Toluidinblau oder Hämotoxylin/Eosin
zeigt klar die letztliche Entwicklung von endochondralem Knochen:
Biologische Tests von zwölf
Tagen sind üblicherweise
ausreichend, um zu bestimmen, ob eine Knochen induzierende Wirkung
mit der Testprobe assoziiert ist.
-
Zusätzlich kann die Aktivität der alkalischen
Phosphatase als Marker für
die Knochenbildung verwendet werden. Die Enzymaktivität kann nach
Homogenisierung des ausgeschnittenen Testmaterials spektrophotometrisch
bestimmt werden. Die Aktivität
hat ihren Höhepunkt
an den Tagen 9–10
in vivo und nimmt danach langsam ab. Proben, die bei der Histologie
keine Knochenentwicklung zeigen, sollten bei diesen Testbedingungen
keine Aktivität
der alkalischen Phosphatase haben. Dieser Test ist von Nutzen bei
der Quantifizierung und um eine Abschätzung der Knochenbildung sehr
schnell nach der Entnahme der Testproben von der Ratte zu bekommen.
Es wurden zum Beispiel Proben, die knochenbildendes Protein mit
mehreren verschiedenen Reinheitsstufen enthielten, getestet, um
die wirksamste Dosis/den wirksamsten Reinheitsgrad zu bestimmen,
um eine Formulierung zu finden, die im Industriemaßstab produziert
werden könnte.
Die Resultate, wie sie als Niveau der Aktivität der alkalischen Phosphatase
und der histologischen Bewertung gemessen werden, können als "knochenbildende Einheiten" dargestellt werden.
Eine knochenbildende Einheit stellt die Menge an Protein dar, die
für die
halb-maximale knochenbildende Aktivität am Tag 12 erforderlich ist.
Zusätzlich
können
Dosiskurven für
die Knochen induzierende Aktivität
in vivo bei jedem Schritt eines Reinigungsschemas konstruiert werden,
indem man verschiedenen Konzentrationen an Protein tested. Dem entsprechend
kann der Durchschnittsfachmann repräsentative Dosiskurven unter
Verwendung von lediglich Routineversuchen konstruieren.
-
B. Knochenbildung nach der Implantierung
von knochenbildenden, matrixfreien OP-1-Vorrichtungen Knochenbildende Vorrichtungen
wurden mit 62,5 μg
lyophilisiertem OP-1 mit oder ohne 25 mg Kollagenmatrix hergestellt.
Diese Vorrichtungen wurden durch ihre Fähigkeit bewertet, die Knochenbildung
unter Verwendung des vorstehend beschriebenen ectopischen Knochenbildungstests
an der Ratte an sowohl intramuskulären als subkutanen Stellen
zu fördern.
Zusätzlich
wurde die Masse an gebildetem Knochen durch Messung der Calciumgehalte
und Gewichte der entfernten Vorrichtungen bewertet. Die geschaffenen
Daten sind in den nachstehenden Tabellen 1 und 2 zusammengestellt.
-
Wie aus der Histologie und dem Calciumgehalt
offensichtlich bildete sich Knochen als Antwort auf alle matrixfreien
OP-1-Proben. Diese Daten zeigen, daß die Implantierung einer matrixfreien
OP-1-Vorrichtung allein ausreichend ist, die endochondrale Knochenbildung
an ectopischen Stellen der Ratte zu induzieren.
-
Tabelle
1. Knochenbildung gg. Konzentrationen von OP-1
Intramuskuläre Stelle
-
-
Tabelle
2. Knochenbildung gg. Konzentrationen von OP-1
Subkutane Stelle
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C. Matrixfreie OP-1-Vorrichtungen,
die wasserlösliche
Träger
enthalten
-
Auch OP-1, das wasserlöslichen
Trägern
zugemischt war, fördert
die Knochenbildung. Bei dieser Untersuchung wurden Mannitol, Carboxymethylcellulose,
Dextrin, PEG3350, ein Pluronic-Gel und Kollagen durch Zugabe von
0,9%-iger steriler Salzlösung
zu einer Paste formuliert. Zehn μg
an in Wasser aufgelöstem
OP-1 wurden zu der Paste zugegeben, um eine matrixfreie Vorrichtung
herzustellen, und die Vorrichtung wurde unmittelbar intramuskulär in Ratten
injiziert. Nach 12 Tagen, wurden die implantierten Vorrichtungen
entfernt und mittels Calciumgehalt und Histologie auf Knochenbildung
bewertet. Diese Daten bestätigen
die vorstehend beschriebene Beobachtung, daß eine Kollagenmatrix für die Induktion
einer volumenfüllenden
Knochenbildung nicht essentiell ist. Von den bewerteten wasserlöslichen
Trägern
zeigt Mannitol insgesamt die besten Resultate, wobei die anderen
relativ vergleichbar erschienen.
-
-
D. Matrixfreie OP-1-Vorrichtungen
in Lösung
-
Von matrixfreien knochenbildenden
Vorrichtungen in Lösung
wurde auch gezeigt, daß sie
die Knochenbildung induzieren, wenn sie intramuskulär (IM) oder
intradermal (ID) verabreicht werden. In einem beispielhaften Experiment
wurden matrixfreie OP-1-Vorrichtungen
in 20 mM Acetatpuffer, pH 4,5, hergestellt. Die Vorrichtungen wurden
so hergestellt, daß die
gewünschte
Dosis (5–50
mg) an OP-1 in 100 μl
Injektionsvolumen verabreicht würde.
Beide Arten der Verabreichung induzierten die Knochenbildung, wie
mittels Calciumgehalt, Histologie und Explantgewicht gemessen.
-
E. Pluronic-Gel enthaltende
matrixfreie OP-1-Vorrichtung
-
Gegenwärtig bevorzugte Experimente
wurden mit einer Pluronic-Formulierung der matrixfreien OP-1-Vorrichtung
begonnen. In einer Ausführungsform
hat diese Vorrichtung die einzigartige Eigenschaft, bei Kühlschranktemperaturen
flüssig
zu sein, aber Gel-ähnlich,
wenn sie auf Raumtemperatur erwärmt
wird. Dies erlaubt, daß die
Vorrichtung in eine Spritze gezogen wird, wenn sie kalt ist und
nach einigen Minuten bei Raumtemperatur eine leichte Injektion zuläßt. Dies
war von Nutzen für
die Injektion solcher OP-1-Vorrichtungen in Bruchstellen, da das
Gel die Erhaltung von OP-1 an der Stelle der Verletzung zuläßt.
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Pluronic-Gel, das aus 0,5 g kommerziell
erhältlichem
Pluronic F127 hergestellt wurde, zu dem 1,35 ml Wasser zugegeben
wurden, ist bei Kühlschranktemperatur
eine visköse
Flüssigkeit
und bei Raumtemperatur ein halbfestes Gel. Nach 12 Tagen wurde als
Reaktion auf IM Verabreichung von matrixfreien OP-1-Pluronic-Gel-Vorrichtungen
die Knochenbildung beobachtet. Das Gel wurde nicht direkt in den
Muskel injiziert, sondern wurde ohne Verwendung einer Nadel in den
Muskellappen injiziert. Knochen bildete sich auch als Reaktion auf
SC Verabreichung derselben Pluronic-Gel-Vorrichtungen. Die OP-1-Dosis (5–25 mg)
war in 50 μg
Gel enthalten.
-
Die Wiedergewinnung von OP-1 aus
den Gel-Vorrichtungen wurde durch Extraktion mit 8 M Harnstoffpuffer
und Injektion des Extrakts in eine HPLC bestimmt. Es wurde eine
100%-ige Wiedergewinnung von OP-1 aus dem Gel erhalten. Außerdem waren
die Harnstoffextrakte von ausgewählten
Gelen so aktiv wie ein OP-1-Standard. Eines der Gele wurde zum Beispiel
nach 10 Tagen Lagerung bei Kühlschranktemperatur
in einer Spritze wieder extrahiert; es wurde eine 100%-ige Wiedergewinnung
von OP-1 erhalten und erneut war der Extrakt so aktiv wie ein OP-1-Standard.
-
Wie nachstehend beschrieben, kann
sterilgefiltertes OP-1 zu autoklaviertem oder bestrahltem Gel in aseptischer
Weise zugegeben werden, so daß eine
sterile Vorrichtung bereitgestellt werden kann.
-
OP-1 wurde autoklavierten Pluronic-Gelen
zugemischt. Das Gel wurde hergestellt, autoklaviert und dann gekühlt, so
daß es
sich vor der Zumischung von OP-1 verflüssigte. Das OP-1-Gel wurde
dann in Spritzen gefüllt,
die bei 5°C
aufbewahrt wurden. Es wurde beobachtet, daß die Proben mindestens 2 Wochen
bei 5°C stabil
waren. Ungefähr
mindestens 50–60%
des ursprünglichen
OP-1 verblieben nach 7 Wochen Lagerung bei 5°C. Gele wurden auch aus bestrahltem
Pluronic F127 hergestellt. Wiedergewinungen von 40–50% wurden nach
7 Wochen bei 5°C
beobachtet.
-
Ein zweiter Zeitverlauf wurde zum
Zweck der Bewertung der Knochenbildung als Reaktion auf matrixfreie
OP-1-Pluronic-Gel-Vorrichtungen durchgeführt. Volumen von 50 μl an Pluronic-Gel,
die 0 oder 10 μg
an OP-1 enthielten, wurden in einen Muskellappen injiziert. Implantate,
die am Tag 7, 12 und 21 entnommen wurden, wurden auf ihren Calciumgehalt
und die Aktivität
der alkalischen Phosphatase analysiert. Der Zeitverlauf der Knochenbildung
war ähnlich
dem, der mit der Standard-OP-1-Vorrichtung beobachtet wurde, die
Kollagen enthielt.
-
V. TIERSTUDIEN: VERFAHREN
DER VERWENDUNG VON MATRIXFREIEN OP-1-VORRICHTUNGEN UND -IMPLANTATEN
-
A. Heilung von segmentalen
Defekten kritischer Größe in Hunden
unter Verwendung von matrixfreien knochenbildenden Vorrichtungen
-
1. Experiment 1
-
Die folgenden Experimente zeigen
die Wirksamkeit von injizierbaren und gefriergetrockneten Formulierungen
von rhOP-1 für
die Heilung von segmentalen Defekten kritischer und unkritischer
Größe in einem
etablierten Ulna-Defektmodell des Hundes. Drei Formulierungen von
matrixfreien knochenbildenden Vorrichtungen, die alle OP-1 enthielten,
wurden in Defekten kritischer Größe (2,5
cm) und/oder Defekten unkritischer Größe (5 mm, 3 mm, 1,5 mm) bewertet.
Wie vorstehend beschrieben, sind Defekte kritischer Größe Defekte, die
nicht spontan heilen. Die . drei bewerteten Formulierungen waren
(1) 20 mM Acetatpufferlösung
(pH 4,5); (2) phosphatgepufferte Salzlösung (PBS, etwa pH 7,5); und
(3) lyophilisiertes (gefriergetrocknetes) Protein allein. Die Menge
an OP-1, die an den Defekten kritischer Größe bereitgestellt wurde, war
1,75 mg; 0,35 mg Protein wurde an den Defekten mit unkritischer
Größe bereitgestellt.
Unmittelbar vor dem Verschluß der
Wunde wurde OP-1 mit Acetat oder PBS zugemischt und dann mit insgesamt
1 ml an der defekten Stelle injiziert. Lyophilisierte Proben wurden
entlang der Länge
des Defekts in 5 separaten Teilmengen in diskreten, nicht zusammenhängenden
Orten entlang der Länge
des Defekts plaziert.
-
Unter Verwendung von chirurgischen
Standardverfahren wurden osteoperiosteale segmentale Defekte der
zuvor beschriebenen Größe bilateral
in der mittleren Region der Ulna von zwanzig erwachsenen, zu diesem
Zweck gezüchteten
Mischlingshunden geschaffen. Alle Tiere waren zwischen einem und
zwei Jahren alt, wogen 35 bis 50 Pfund und wurden von Lieferanten
mit USDA-Lizenz bereitgestellt. Eine spezielle Aufmerksamkeit wurde
darauf gerichtet, Tiere einheitlicher Größe und einheitlichen Gewichts
auszuwählen,
um Abweichungen bei der Knochengeometrie und -last zu beschränken. Die
Tiere wurden vor der Operation radiographisch durchmustert, um sich
der richtigen Größe und der
Reife des Skeletts zu versichern und daß keine offensichtlichen Abnormalitäten der
Knochen existierten. Die Tiere wurden auch klinisch überprüft, um akute
und chronische medizinische Zustände
während
einer Quarantänezeit
von zwei Wochen auszuschließen.
Ein vollständiges
Blutbild mit Zelldifferenzierung wurde vor der Chirurgie durchgeführt.
-
Der Bogen wurde wegen der mechanischen
Stabilität
beibehalten, aber es wurde keine interne oder externe Fixierung
verwendet. Die Stelle wurde mit Salzlösung gespült, um Knochensplitter und
ausgetretene Markzellen zu entfernen, dann getrocknet und vor der
Bereitstellung der Formulierung an der Stelle wurde Homöostase erreicht.
Die weichen Gewebe wurden vor der Injektion der Formulierungen 1
oder 2 (Acetat oder PBS) sorgfältig
in Schichten geschlossen. Die Formulierung der Vorrichtung 3 (lyophilisiertes
Protein allein) wurde vor der Schließung der Gewebeschichten entlang
dem Raum zwischen den Knochen plaziert, um das Implantat zu enthalten.
Das Verfahren wurde dann auf der contralateralen Seite wiederholt,
außer
daß vor
dem Wundverschluß keine
OP-1-Vorrichtung bereitgestellt wurde.
-
Den Tieren wurden nach der Chirurgie
intramuskulär
vier Tage lang Antibiotika verabreicht und unmittelbar nach dem
Eingriff wurden routinemäßig vorher-nachher-Radiogramme aufgenommen,
um sich einer einwandfreien Plazierung zu versichern. Die Tiere
wurden nach der Operation für
24 bis 72 Stunden in 3 × 4 Erholungskäfigen gehalten,
danach wurden sie in Geläufe
transferiert und ihnen die uneingeschränkte Bewegung erlaubt.
-
Es wurden zweiwöchige Radiogramme aufgenommen,
um den Fortschritt der Heilung zu untersuchen. Zusätzlich wurde
zweiwöchig
vor der Operation bis zur Tötung
Blut (Serum) entnommen, um die Antikörperbildung durch den Sponsor
zu untersuchen. Bei der Tötung
wurde alle Ulnae en bloc entnommen und diejenigen, die ausreichend
geheilt waren, wurden durch Torsion mechanisch getestet. Segmente
wurden mittels Histologie auf Gewebeantwort, Knochenarchitektur
und Ummodellierung, und Qualität
und Menge an neuer Knochenbildung und -heilung bewertet.
-
Die Tiere wurden 4, 6, 8 oder 12
Wochen nach der Operation getötet.
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1b(3). Radiogramme
-
Radiogramme der Vorderglieder wurden
zweiwöchig
bis acht Wochen nach der Operation aufgenommen und dann wiederum
bei der Tötung
an Woche zwölf
nach der Operation. Es wurden Standardaufnahmezeiten und -intensitäten verwendet,
und es wurden Sandsäcke
verwendet, um die Extremitäten
in konsistenter Weise zu positionieren. Die Radiogramme wurden bewertet
und mit früheren
Radiogrammen verglichen, um die Qualität und Geschwindigkeit der Defektheilung
einzuschätzen.
-
Mechanische
Testung
-
Unmittelbar nach der Sektion, wenn
die Heilung durch Befühlen
mit der Hand ausreichend erschien, wurden Proben auf Versagen bei
Verdrehung auf einer MTS hydraulischen Testmaschine mit geschlossenem Kreislauf
(Minneapolis, MN) getestet, die unter Hubkontrolle bei einer konstanten
Vorschubrate von 50 mm/Min. in einer zylindrischen Aluminiummuffe
und einzementiert mit Methylmethacrylat geführt wurde, unter Verwendung
des Protokolls des Herstellers. Ein Ende war starr fixiert und das
andere wurde gegen den Uhrzeigersinn gedreht. Da die Ulna des Hundes
eine leichte Krümmung
hat, wurden die Proben exzentrisch montiert, um die Drehung der
Proben coaxial mit der der Testvorrichtung zu halten. Die Torsionskraft
wurde mittels eines Hebelarms von sechs cm eines servohydraulischen
Materialtestsystems übertragen.
Es wurden gleichzeitig Aufzeichnungen von der Verdrehung des Implantats
vorgenommen, gemessen durch die Hubkontrolle der Maschine, während die
Last von der Belastungszelle aufgezeichnet wurde. Die Daten wurden
mittels eines Analog-Digital-Wandlers und eines PC und einer online
Aufnahmesoftware aufgezeichnet. Es wurden Kurven der Kraft-Winkel-Verdrehung
erzeugt, aus denen das Drehmoment und die Winkeldeformation bis
zum Versagen erhalten wurden, und die Energieaufnahme bis zum Versagen
als die Fläche
unter der Last-Verdrehungskurve berechnet wurde.
-
Ergebnisse
-
Die Knochenheilungscharakteristika,
mechanische Stärke
und Histologie von Ulna-Defekten
kritischer Größe, die
mit rhOP-1 ohne Trägermaterial
behandelt worden waren, waren ähnlich
denen von Defekten, die mit der Standard-OP-1-Vorrichtung behandelt
worden waren. In Kürze
waren die experimentellen Beobachtungen wie folgt: die radiographisch
beobachteten Knochenneubildung und Heilmuster bei Defekten, die
mit rhOP-1 ohne Marix behandelten wurden, waren ähnlich den Heilmustern, die
vorstehend mit der herkömmlichen,
Kollagen enthaltenden OP-1-Vorrichtung beobachtet wurden. Im allgemeinen
war die Knochenneubildung schon zwei Wochen nach der Operation offensichtlich.
Der neue Knochen fuhr bis zur Tötung
zwölf Wochen
nach der Operation fort, sich zu verdichten, zu konsolidieren und
sich umzugestalten. Diese Untersuchung zeigte, daß eine funktionelle
Knochenvereinigung mit menschlichen OP-1-Vorrichtungen ohne Matrix möglich ist.
Außerdem
waren das Erscheinungsbild und die Charakteristika der Histologie
nach zwölf
Wochen ähnlich
dem, wie sie mir der herkömmlichen,
Kollagen enthaltenden Matrix OP-1-Vorrichtung beobachtet wurden. Von den
sechs Defekten, die mit einer matrixfreien OP-1-Vorrichtung behandelt worden waren,
hatten vier zwölf
Wochen nach der Operation solide knochige Verbindungen. Die restlichen
beiden Defekte in demselben Tier zeigten radiographisch etwas frühe Knochenneubildung,
waren jedoch bei der Tötung
unvollständig überbrückt oder
gefüllt
mit neuem Knochen. Die mittlere Torsionslast bis zum Versagen des
geheilten Defekts war 40,05 N (Dies stellt das Äquivalent von etwa 79% von
zuvor getesteten segmentalen Defekten dar, die mit der herkömmlichen,
Kollagen enthaltenden OP-1-Vorrichtung
behandelt worden waren und 61% von zuvor getesteter intakter Kontroll-Ulna).
-
Radiographisch wurde bei allen drei
Formulierungen zwei Wochen nach der Operation eine extensive Knochenneubildung
beobachtet. Zwischen zwei bis 12 Wochen erhöhte der neue Knochen sein Volumen
und seine Radiodichtigkeit und füllte
und überbrückte die
Defekte. 12 Wochen nach der Operation (Tötung) hatte der radiodichte
neue Knochen die Defekte, die mit rhOP-1-Formulierungen behandelt
worden waren, signifikant gefüllt
und überbrückt. Alle
rhOP-1-Defekte bei der Tötung
nach 12 Wochen mechanisch stabil und mit neuem Knochen überbrückt. Bei
dem radiographischen Erscheinungsbild wurden zwischen den drei Formulierungen
keine signifikanten Unterschiede gefunden, obwohl die Formulierungen
1 und 2 zu allen Zeitpunkten leicht besser wirkten als Formulierung
3.
-
Histologisch war proliferierender
neuer Knochen innerhalb und in der Umgebung der Defekte vorhanden,
die mit rhOP-1 behandelt worden waren. Die Überbrückung der Defekte und knochige
Heilung waren im Wesentlichen 12 Wochen nach der Operation vollständig mit
Lücken
von Fibroknorpel zwischen Flächen
von neuem signifikanten Knochenwachstum. Anzeichen für frühe Cortexentwicklung
mit Verdichtung der Ränder von
neuem Knochen waren bei allen rhOP-1-Defekten vorhanden. Es gab
keine Unterschiede in der Bewertung der histologischen Reihenfolge,
basierend auf der Art der Formulierung, obwohl Formulierung 2 bei
der Qualität
der Verbindung besser abschnitt als die Formulierungen 3 und 1.
-
Die mittlere Belastung bis zum Versagen
der Defekte der Formulierung 1 war 47,64 N (94% der Defekte, die
mit der Standard-OP-1-Vorrichtung behandelt worden waren und 73%
der zuvor getesteten intakten Kontrollen). Die mittlere Belastung
bis zum Versagen der Defekte der Formulierung 2 war 51,96 N (102%
der Defekte, die mit der Standard-OP-1-Vorrichtung behandelt worden waren und
80% der zuvor getesteten intakten Kontrollen). Die mittlere Belastung
bis zum Versagen der Defekte der Formulierung 3 war 50,86 N (100% der
Defekte, die mit der Standard-OP-1-Vorrichtung behandelt worden
waren und 78% der zuvor getesteten intakten Kontrollen). Es wurden
keine signifikanten Unterschiede bei den mechanischen Testergebnissen
zwischen den Formulierungsarten festgestellt. Defekte der Formulierung
2 waren bei der maximalen Last beim Versagen etwas besser als Formulierungen
3 und 1.
-
Tabelle
4. Mechanische Testergebnisse für
Defekte mit kritischer und unkritischer Größe, die mit rhOP-1 behandelt
wurden, gegenüber
nicht behandelten Kontrollen. Mittel ± SD (Probengröße)
-
-
Es wurden auch Formulierungen getestet,
die 20 mM Acetatpuffer, pH 4,5 und 5% Mannitol verwendeten. Untersuchungen
unter Verwendung von unkritischen Defekten (5 mm Lücken) zeigten
eine klare Verbesserung bei der Heilungsrate, wenn OP-1 anwesend
war, im Vergleich mit Kontrollen. Spezifisch zeigten die Kontrollen
im Durchschnitt nach 8 Wochen 14% der Stärke von intakten Ulnae, während mit
OP-1 behandelte Defekte im Durchschnitt 79% zeigten. Radiographisch
war schon nach zwei Wochen nach der Operation neuer Knochen offensichtlich
und begann nach acht Wochen signifikant die Defekte zu füllen und
zu überbrücken, die
mit rhOP-1-Formulierungen behandelt worden waren. Keiner der sechs
unbehandelten Kontrolldefekte war am Ende des Untersuchungszeitraums
komplett geheilt. Einer der drei Defekte mit Formulierung 1 (Acetatpuffer)
und drei der drei Defekte, die mit Formulierung 2 (PBS) behandelt
worden waren, waren nach 8 Wochen vollständig mit neuem Knochen gefüllt und überbrückt. Alle
sechs Defekte, die OP-1 erhielten, hatten Knochenneubildung und
waren mechanisch stabil. Defekte mit Formulierung 2 waren signifikant
besser bei den Resultaten der radiographischen Bewertung, bei der
bis zum Versagen absorbierten Energie und bei der histologischen
Qualität
der Verbindung als mit Formulierung 1 behandelte Defekte. Andererseits
wurden zwischen den beiden Formulierungen keine Unterschiede bei
der mittleren Belastung beim Versagen, der Winkeldeformation und
dem histologischen Gesamterscheinung gefunden. Beide Formulierungen
waren bei allen Kategorien signifikant besser als Kontrolldefekte.
Histologisch war proliferierender neuer Knochen innerhalb und in
der Umgebung der Defekte vorhanden, die mit rhOP-1 behandelt worden
waren. Die Überbrückung der
Defekte und knochige Heilung waren 8 Wochen nach der Operation fast
vollständig
mit Lücken
von Fibroknorpel zwischen Flächen
von signifikantem neuem Knochenwachstum. Anzeichen für frühe Cortexentwicklung
und Knochenremodellierung waren bei einigen der rhOP-1-Defekte vorhanden.
Alle unbehandelten Kontrollen resultierten in unvollständigen Vereinigungen,
obwohl potentiell eine längerfristige
Heilung durch eine gewisse Knochenneubildung an den Wirtsknochenenden
und endostealen Regionen angezeigt wurde. Die mittlere Belastung bis
zum Versagen der Defekte der Formulierung 2 war 53,23 N (104,5%
der Defekte mit kritischer Größe, die mit
der Standard-OP-1-Vorrichtung behandelt worden waren und 81,6% der
zuvor getesteten intakten Kontrollen). Der Vergleich von Defekten
unkritischer Größe, die mit
0,35 mg OP-1 behandelt worden waren, mit zuvor getesteten Defekten
kritischer Größe, die
mit 1,5 mg OP-1 ohne Trägermaterial
behandelt worden waren (injizierbare Formulierungen) zeigten keinen
signifikanten Unterschied bei der mittleren Beladung beim Versagen.
-
C. Heilung von Bruchdefekten
unter Verwendung von matrixfreien knochenbildenden Vorrichtungen
-
1. Bruchuntersuchung
am Kaninchen
-
Die Untersuchung eines Reparaturmodells
von Brüchen
bei Kaninchen (Mittelschaftbruch der Ulna) zeigt auch die Wirksamkeit
der Verfahren und Vorrichtungen der Erfindung. Diese Untersuchung
verglich die Wirkung der Verabreichung von matrixfreien OP-1-Vorrichtungen in
drei Konfigurationen: 1) Acetatpuffer pH 4,5 (lösliches OP-1), 2) PBS (Suspension
von OP-1) und 3) Pluronic-Gel. Vier Kaninchen wurden in jeder Gruppe
unmittelbar nach der Bildung des Bruchs behandelt; contralaterale
Kontrollen waren Arme ohne Defekt. Die Tiere wurden 3 Wochen nach
der Behandlung getötet.
Zusammenfassend zeigten Tiere, denen die Acetat oder Pluronic enthaltenden
OP-1-Vorrichtungen injiziert worden waren, einen signifikant größeren Bruchkallus
bei radiographischer, Tast- und histologischer Untersuchung. Die
mittlere Torsionsbelastung bis zum Versagen für alle Ulnae, die mit OP-1
behandelt worden waren, war 8,89 ± 2,99 N (Mittelwert f Standardabweichung)
(8 Proben). Während
die mittlere Torsionsbelastung bis zum Versagen für unbehandelte
Kontroll-Ulna 7,9 2,92 N war (9 Proben).
-
1a. Beschreibung des Testmaterials
-
Matrixfreie OP-1-Vorrichtungen in
Lösung
wurden verwendet. Die drei bewerteten Lösungskonfigurationen waren:
(1) rhOP, zugemischt einer phosphatgepufferten Salzlösung, 8,71
mg OP-1/ml. Die Vorrichtungen wurden in einzelne Röhrchen verpackt.
Der geschätzte
Bereich des verabreichten Vorrichtungsvolumens war zwischen 30 μl und 110 μl pro Stelle;
(2) rhOP, zugemischt 20 mM Acetatpuffer, pH 4,5, 0,99 mg OP-1/ml. Die
Vorrichtungen wurden in einzelne Röhrchen verpackt, die 130 μl enthielten.
Die Vorrichtung wurde in eine Spritze gezogen. In allen Fällen wurden
weniger als 100 μl
an jeder Stelle verabreicht. Der geschätzte Bereich von verabreichtem
Implantatvolumen war zwischen 60 μl
und 90 μl
pro Stelle; und (3) rhOP in Pluronic-Gel, 0,87 mg OP-1/ml. Die Vorrichtung
wurde in eine Spritze gepackt. Die Vorrichtung wurde bis zur Verabreichung an
der defekten Stelle gekühlt
aufbewahrt (verstrichene Zeit weniger als eine Minute). Jedes Dicke
Gel wurde in allen Fällen
unter Verwendung einer Nadel mit großer Kalibrierung (18) verabreicht.
-
In allen Fällen wurden die Dosierungen
kalibriert, um etwa 100 μg
rhOP-1 an jeder Bruchstelle zu verabreichen.
-
Insgesamt wurden zwölf erwachsene
männliche
While New Zealand-Kaninchen, die zu diesem Zweck gezüchtet worden
waren und die beim Beginn der Untersuchungen mindestens 9 Monate
alt waren, verwendet. Alle Tiere waren vom Skelett her reif und
wogen zwischen 2,4 und 3,0 kg und wurden von Lieferanten mit USDA-Lizenz
bereitgestellt. Die Tiere wurden untersucht, um akute oder chronische
medizinische Bedingungen während
einer Quarantäneperiode
auszuschließen
und wurden radiographisch untersucht, um sich einer geeigneten Größe, Reife
des Skeletts zu versichern und das keine offensichtlichert Anormalitäten im Knochenbau
existierten. Eine spezielle Aufmerksamkeit wurde darauf gerichtet,
Tiere von einheitlichem Geschlecht, einheitlicher Größe und einheitlichem
Gewichts auszuwählen,
um Abweichungen bei der Stärke
der geheilten Brüche
zu beschränken.
Expertimentelle traverse Brüche
wurden unter Verwendung chirurgischer Standardverfahren bilateral
in der zentralen Ulna von jedem Tier geschaffen. Die linke Ulna
diente bei jedem Tier als unbehandelte Kontrolle. In Kürze wurden
unter Verwendung von aseptischen Standardverfahren bilaterale Brüche induziert,
indem laterale Schnitte von etwa 2,0 cm Länge gemacht wurden und die
Freilegung der rechten Ulna wurde durch scharfe und stumpfe Sektion
erreicht. Eine transverse Osteotomy wurde in der Mitte der Ulna
unter Verwendung einer elektrischen chirurgischen Säge erzeugt.
Die Stelle wurde dann mit resorbierbarem Faden geschlossen. Eine
matrixfreie OP-1-Vorrichtung in Lösung wurde dann durch die weichen
Gewebe in die Bruchstelle injiziert. Das Verfahren wurde dann auf
der linken Seite wiederholt mit der Ausnahme, daß diesen Bruchstellen keine
OP-1-Vorrichtung bereitgestellt wurde.
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Den Tieren wurden intramuskulär vier Tage
lang nach der Chirurgie Antibiotika verabreicht. Die Tiere wurden
nach der Operation in Erholungskäfigen
gehalten, bis sie bei vollem Bewußtsein waren und ihr Gewicht trugen,
wonach sie in Standardkäfige
transferiert wurden und ihnen die uneingeschränkte Bewegung erlaubt wurde.
Die Glieder wurden nicht geformt.
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Wöchentliche
Radiogramme wurden aufgenommen, um das Fortschreiten der Heilung
zu beobachten. Alle Tiere wurden drei Wochen nach der Operation
getötet.
Alle Ulnae wurden en bloc gewonnen und mechanisch durch Torsion
getestet. Die Bruchheilung wurde weiterhin mittels Histologie auf
die Qualität
und Menge von Knochenneubildung und Heilung bewertet.
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Eine Woche nach der Operation war
bei allen Brüchen
die frühe
Knochenneubildung offensichtlich. Spuren von leicht radiodichtem
Material waren entlang den periostealen Grenzen anwesend. Die Menge
an Knochenneubildung war eine Woche nach der Operation bei den Brüchen mit
matrixfreien OP-1-Vorrichtungen signifikant größer als bei den (unbehandelten)
Brüchen.
Zwei Wochen nach der Operation war bei allen Brüchen, die mit der matrixfreien
OP-1-Vorrichtungen behandelt wurden, ein Fortschreiten der Knochenneubildung
offensichtlich. Nach drei Wochen war der Knochenkallus groß und die
Brüche
waren in der Gegenwart von OP-1 im Wesentlichen oder vollständig geheilt.
Auf der linken (unbehandelten) Stelle war die Bruchstelle nach drei
Wochen jedoch noch offensichtlich und die Menge an gebildetem Kallus
weniger.
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Die mittlere Torsionslast bis zum
Versagen für
alle Ulnae, die mit einer OP-1-Vorrichtung
behandelt worden waren, war 8,89 ± 2,99 N (8) (Mittelwert ± Standardabweichung
(Probengröße)). Die
mittlere Torsionslast bis zum Versagen für unbehandelte Kontrollulna
war 7,91 ± 2,92
N (9).
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Ein größeres Volumen an neuem Knochen
und eine vollständige Überbrückung der
Bruchstelle wurde bei allen rechten (mit OP-1-Vorrichtung behandelt)
Brüchen
im Vergleich mit links beobachtet. Die Proliferation von Kallus
wurde beobachtet, die sich in das weiche Gewebe der behandelten
Brüche
ausdehnte. Die linken (unbehandelten) Stellen zeigten einheitlich
Proliferation von neuem Knochen an den periostealen und endostealen
Grenzen und frühe
Knorpelbildung am Bruch, zeigten aber nicht konsistent vollständige knochige Überbrückung des
Bruchs.
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Konsistent mit den radiographischen
Resultaten, wurde ein größeres Volumen
von neuem Knochen bei den Stellen beobachtet, die mit OP-1-Vorrichtungen
behandelt worden waren.
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2. Bruchuntersuchung bei
der Ziege
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Noch ein anderes Tiermodell für die Bewertung
der verbesserten Bruchreparatur unter Verwendung von matrixfreien
OP-1-Vorrichtungen ist ein Ziegen-Modell (akuter Bruch des mittleren
Schafts der Tibia). Die Untersuchung vergleicht 0,5 mg OP-1 in Acetatpuffer
und 1 mg OP-1 in Acetatpuffer und 1 mg OP-1 präzipitiert in PBS, unmittelbar
nach der Schaffung des Bruchs unter Verwendung von chirurgischen
Standardverfahren injiziert. Die Tiere werden beobachtet und versorgt
wie bei den vorstehend beschriebenen Hunde- und Kaninchenuntersuchungen
und werden typischerweise 2, 4 und 6 Wochen nach der Behandlung
getötet.
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Es wird erwartet, daß durch
den Einschluß von
matrixfreien knochenbildenden Vorrichtungen bei diesen Tieren eine
verbesserte Knochenreparatur resultiert, wie bei den Kaninchenuntersuchungen
gezeigt.
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D. Reparatur von osteochondralen
Defekten unter Verwendung matrixfreier OP-1-Vorrichtungen
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1. Osteochondralen
Defekte in Kaninchen
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Die folgende Untersuchung zeigt,
daß matrixfreie
knochenbildenden Vorrichtungen sowohl die Reparatur des artikulären Knorpel,
der den Knochen überzieht,
als auch die Reparatur des darunter liegenden Knochens verbessern
kann. In dieser Untersuchung wurde ein osteochondrales Standarddefektmodell
des Kaninchens verwendet, um die verschiedenen injizierbaren Formen
von OP-1 bei der Heilung dieser Art von Defekt zu bewerten.
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Matrixfreie Vorrichtungen, die OP-1
enthalten, wurden in zwei verschiedenen injizierbaren Bereitstellungsformulierungen
und in einer gefriergetrockneten Formulierung hergestellt. Alle
Proben enthielten 125 μg OP-1.
Formulierung 1: 20 mM Acetatpuffer, pH 4,5, mit 5% Mannitol, Gesamtvolumen
50 μl; Formulierung
2: Suspension in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS); und Formulierung
3: gefriergetrocknet in Teilmengen von einer Probe.
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Insgesamt sechs erwachsene männliche
Kaninchen wurden verwendet. Osteochondrale Defekte mit einer vollen
Dicke von 4 mm im Durchmesser wurden bilateral in der Sulcus der
Kniescheibe von jedem Tier erzeugt, insgesamt 12 Defekte unter Verwendung
von chirurgischen Standardverfahren. Der linke Defekt erhielt eine
der drei OP-1-Formulierungen und die Defekte der rechten Seite dienten
als unbehandelte Kontrolle. Alle Tiere wurden zwölf Wochen nach der Operation
getötet
und die distalen Schienbeine en bloc entnommen. Die Defektstellen
wurden histologisch und durch Betasten bewertet, wie hier vorstehend
beschrieben.
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Bei allen Defekten außer einem
Defekt der PBS-Gruppe zeigt die OP-1-Seite eine signifikante Heilung mit
Regenerierung von Knochen und Knorpel. Obwohl auch bei den meisten
der Kontrolldefekte ohne OP-1 eine Heilung beobachtet werden kann,
ist die Reparatur unterlegen; üblicherweise
ist die Heilung des darunter liegenden Knochens unvollständig und
eine signifikante Unterproduktion von Glycosaminoglycanen (GAG)
im Knorpel (wie durch leichtes Anfärben mit Toluidin zu sehen
ist).
-
2. Schafmodell
-
Reparatur von osteochondralen und
chondralen Defekten kann auch in einem Standard-Ziegen- oder Schafmodell bewertet werden.
Zum Beispiel wird unter Verwendung von chirurgischen Standardverfahren
jedes Schaf in einer Untersuchung an beiden Gelenken des vorderen
Knies operiert und es werden zwei Defekte per Gelenk geschaffen
(einer auf dem medialen Kondylus und einer auf dem lateralen Kondylus).
Eines der Gelenke hat einen chondralen Defekt mit standärdisierter
partieller Dicke (5 mm im Durchmesser) auf jedem Kondylus, während das
andere Gelenk zwei ähnliche,
aber tiefere chondralen Defekt mit voller Dicke (etwa 1–2 mm im
subchondralen Knochen). Ein Gelenk des Tieres wird mit einer matrixfreien
knochenbildenden Vorrichtungsformulierung und das andere Gelenk
wird als unbehandelte Kontrolle gelassen. Jede Gruppe hat eine Untergruppe,
die früh
nach 8 Wochen getötet
wird und eine andere, die für
eine Langzeitbewertung 6–7
Monate gehalten wird. Es wird erwartet, daß die matrixfreien Vorrichtungen,
die jede der hier beschriebenen Formulierungen verwenden, die Geschwindigkeit
und die Qualität
der Reparatur sowohl des artikulären
Knorpel als auch des darunter liegenden Knochens erhöhen, in Übereinstimmung
mit den hier vorstehend beschriebenen Resultaten.
-
E. Heilung von segmentalen
Defekten unkritischer Größe in Hunden
unter Verwendung von matrixfreien knochenbildenden Vorrichtungen
-
1. Experiment 2
-
Wie bereits in Experiment 1 beispielhaft
dargestellt (vgl. Sektion V.A.1.) können injizierbare Formulierungen
von rhOP-1 verwendet werden, um Defekte unkritischer Größe (d. h.
5 mm, 3 mm, 1,5 mm) zu heilen. Das folgende Experiment ist eine
Erweiterung von Experiment 1 und konzentriert sich auf das Defektmodell von
3 mm. Wie nachstehend detaillierter beispielhaft dargestellt ist,
zeigten Defekte unkritischer Größe (3 mm), die
mit rhOP-1 behandelt werden, eine verbesserte Heilung und extensivere
Knochenneubildung. Wie nachstehend gezeigt, stellt ein Defekt von
3 mm ein konsistentes und reproduzierbares Modell für die Bewertung der
Beschleunigung von Prozessen der Bruchreparatur dar.
-
Dieses Experiment bewertet die Heilung
von Defekten unkritischer Größe, die
mit zwei OP-1-Formulierungen behandelt werden, rhOP-1 in Acetat/Lactosepuffer
(OP/Puffer) und rhOP-1 in einem Carboxymethylcellulose (CMC) (OP/CMC)-Gel
etwa vier Wochen nach der Operation. Die nachstehend zusammengefaßten Resultate
zeigen, daß Defekte
unkritischer Größe, die
mit injizierbarem rhOP-1 in CMC-Lösung und in Acetatpufferlösung behandelt
würden,
signifikant schneller handelten im Vergleich mit Kontrollen mit
CMC und Pufferträger
und unbehandelten Kontrollen. Radiographisch zeigten die Defekte
in beiden Gruppen mit OP-1-Behandlung (OP/CMC und OP/Puffer) eine
frühe radiodichte
Knochenbildung und Knochenüberbrückung 4
Wochen nach der Operation. Die mit OP/CMC behandelten Defekte waren
entlang der lateralen Ulna fast vollständig gefüllt und überspannt mit Knochen nicht
einheitlicher Dichte und unter Einbau der Ränder des Wirtsknochens. Proliferativer
neuer Knochen war bei den mit OP/Puffer behandelten Defekten vorhanden.
Keiner der Kontrolldefekte mit Träger (CMC und Puffer allein)
zeigte nach 4 Wochen Anzeichen von Knochendefektheilung. Das histologische
Aussehen von mit OP/CMC und OP/Puffer behandelten Defekten war ähnlich.
Bei den mit OP behandelten Defekten hatten sich an den Defekträndern und
entlang der Knochenhaut der Ulna, die sich über die defekte Stelle erstreckte,
signifikante Mengen an neuem Knochen gebildet. Die Überbrückung des
Knochendefekts war nach dem Zeitabschnitt von 4 Wochen nahezu vollständig. Mineralisierender
Knorpel und fibröses
Gewebe waren bei den mit OP behandelten Defekten vorhanden. Im Gegensatz
dazu waren die Defekte mit Trägerkontrolle
mit fibrösem
Gewebe gefüllt
und davon umgeben und hatten minimale Mengen von Knochenneubildung
an den Defekträndern.
Durchschnittlich hatten die mit OP/CMC behandelten Defekte nach 4
Wochen eine Torsionsstärke,
die 51% der Stärke
von intakten Ulna war im Vergleich von 14% bei den CMC-Trägerkontrollen.
Defekte, die mit der OP/Pufferlösung
behandelt wurden, hatten eine mittlere Torsionsstärke, die
44% der Stärke
von intakten Ulna, während
die Defekte mit Pufferkontrolle nur 9% der Torsionsstärke von
intakten Ulna erreichten. Die mit OP/CMC und OP/Puffer behandelten
Gruppen hatten nach 4 Wochen (9%) und 8 Wochen (27%) höhere mechanische
Stärken
als die unbehandelten Kontrollen.
-
Experimenteller Aufbau
-
Die Testproben bestanden aus rekombinantem
menschlichem knochenbildendem Protein-1 (rhOP-1) in einem injizierbaren
Verabreichungs-Matrixsystem. Die beiden rhOP-1-Formulierungen und die beiden Kontrollen
mit nur Träger
wurden bewertet und mit zuvor getesteten und berichteten unbehandelten
Kontrolldefekten verglichen. Nur über zwei dieser drei Formulierungen
wird hier berichtet. Eine Formulierung (OP/CMC) bestand aus 0,35
mg rhOP-1 in 100 μl
Carboxymethylcellulose (CMC)-Gel, und wurde in drei sterilen Spritzen bereitgestellt.
Eine zweite Formulierung (OP/Puffer) bestand aus 0,35 mg rhOP-1
in 100 μl
Acetatpuffer und wurde als OP-1-Lösung bereitgestellt. Die Kontrolle
aus nur Träger
bestand aus 100 μl
CMC-Gel (CMC-Kontrolle), die in drei sterilen Spritzen bereitgestellt
wurde und aus 100 μl
Acetatpuffer (Pufferkontrolle), die als Kontrolllösung bereitgestellt
wurde. Proben mit bekannten Mengen wurden und Inhalt wurden von
Creative BioMolecules, Inc. (Hopkinton, MA) hergestellt und geliefert.
-
Bilaterale segmentale Defekte der
Ulna, 3,0 mm lang, wurden in allen Tieren geschaffen. Die rechten Defekte
erhielten eine der beiden rhOP-1-Formulierungen, so daß drei Stellen
von jeder Formulierung untersucht wurden. Die linken Defekte erhielten
die Kontrolle mit nur Träger,
die kein rhOP-1 enthielt. Es wurden wöchentliche Radiogramme aufgenommen,
um den Fortschritt der Heilung zu untersuchen. Bei der Tötung wurden
alle Ulnae en bloc gewonnen und wurden, wenn ausreichend geheilt,
mechanisch durch Torsion getestet. Segmente wurden mittels Histologie
auf Gewebeantwort, Qualität
und Menge an Knochenneubildung und Ausmaß an Heilung bewertet. Erwachsene
männliche
Mischlingshunde, die für
diesen Zweck gezüchtet worden
waren, wurden wegen ihrer Verfügbarkeit,
der leichten Behandlung, der anatomischen Größe und wegen der bekannten
Charakteristika der Knochenreparatur und der Remodellierung bei
dieser Untersuchung verwendet. Alle Tiere waren vom Skelett her
reif, wogen zwischen 44 und 63 Pfund (im Mittel 54 1b) und wurden
von Mariin Creek Kennels, USDA Nummer 71-B-108 (Willowford, AK)
geliefert. Es wurde insbesondere darauf Wert gelegt, Tiere von einheitlicher
Größe und einheitlichem
Gewicht auszusuchen, um Unterschiede in der Knochengeometrie und
Belastung zu beschränken.
-
Chirurgie
-
Anästhesie wurde durch intravenöse Injektion
von Natriumpentothal mit der Dosis von 5,0 mg/lb Körpergewicht
erreicht. Nach der Induktion wurde ein endotrachealer Tubus plaziert
und die Anästhesie
mittels Inhalation von Isofluoran aufrechterhalten. Beide Vorderläufe wurden
auf sterile Weise vorbereitet und zurechtgelegt. Es wurde ein lateraler
Schnitt von etwa 2 Zentimeter Länge
vorgenommen und die Freilegung der Ulna wurde durch stumpfe und
scharfe Sektion erreicht. Der Defekt von 3,0 mm wurde in der mittleren
Ulna unter Verwendung einer Stichsäge erzeugt. Der Bogen wurde
wegen der mechanischen Untersuchung beibehalten und es wurde keine
interne oder externe Fixierung verwendet. Die Stelle wurde mit Salzlösung gespült, um Knochensplitter
und ausgetretene Markzellen zu entfernen. Die weichen Gewebe wurden
sorgfältig
in Schichten um den Defekt geschlossen. Die geeignete Probenformulierung
dann entsprechend dem Behandlungsschema in die defekte Stelle injiziert.
Die Prozedur wurde dann auf der contralateralen Seite mit der geeigneten Probe
wiederholt.
-
Radiogramme
-
Es wurden wöchentlich Radiogramme der Vorderläufe bis
vier Wochen nach der Operation erhalten. Es wurden Standardaufnahmezeiten
und -intensitäten
verwendet. Um die radiographischen Resultate zu quantifizieren wurde
jedem Radiogramm ein numerischer Wert zugeteilt, der auf der in
Tabelle 5 beschriebenen Bewertungsskala beruhte.
-
Tabelle
5
RADIOGRAPHISCHE BEWERTUNGSSKALA
| Grad: |
Keine
Veränderung
gegenüber
Aussehen unmittelbar nach der Operation | 0 |
Spur
von radiodichtem Material im Defekt | 1 |
Flockige
Radiodichte mit Flecken neuer Verkalkung | 2 |
Der
Defekt ist zumindest an einem Punkt mit Material nicht einheitlicher
Radiodichte überbrückt | 3 |
Der
Defekt ist auf der medialen und lateralen Seite des Defekts mit
Material nicht einheitlicher Radiodichte überbrückt, die Schnittenden des Randes
bleiben sichtbar | 4 |
Wie
Grad 3; mindestens einer von vier Rändern wird von neuem Knochen
verdeckt | 5 |
Der
Defekt wird von einheitlichem neuen Knochen überbrückt; die Schnittenden des Randes
sind nicht mehr sichtbar | 6 |
-
Tötung
-
Die Tiere wurden unter Verwendung
einer intravenösen Überdosis
an Barbiturat getötet.
Die Ulna und der Bogen wurden unmittelbar en bloc entnommen und
in mit Salzlösung
getränkten
Windeln plaziert. Beide Ulnae wurden einer Makrophotographie unterzogen
und Kontaktradiogramme aufgenommen. Weiche Gewebe wurden sorgfältig von
der defekten Stelle weggeschnitten. Eine wassergekühlte Säge wurde
verwendet, um die Ulna in Stücke
einheitlicher Länge
von 9 cm zu zersägen,
wobei die defekte Stelle in der Mitte der Testprobe gelegen ist.
-
Mechanische
Testung
-
Unmittelbar nach der Sektion, wenn
die Heilung durch Befühlen
mit der Hand ausreichend erschien, wurden Proben auf Versagen bei
Verdrehung auf einer MTS hydraulischen Testmaschine mit geschlossenem Kreislauf
(Minneapolis, MN) getestet, die unter Hubkontrolle bei einer konstanten
Vorschubrate von 50 mm/Min. geführt
wurde. Jedes Ende des Knochensegments war in eine zylindrischen
Aluminiummuffe montiert und mit Methylmethacrylat einzementiert.
Ein Ende war starr fixiert und das andere wurde gegen den Uhrzeigersinn
gedreht. Da die Ulna des Hundes eine leichte Krümmung hat, wurden die Proben
exzentrisch montiert, um die Drehung der Proben coaxial mit der
der Testvorrichtung zu halten. Die Torsionskraft wurde mittels eines Hebelarms
von sechs cm eines servohydraulischen Materialtestsystems übertragen.
Es wurden gleichzeitig Aufzeichnungen von der Verdrehung des Implantats
vorgenommen, gemessen durch die Hubkontrolle der Maschine, während die
Last von der Belastungszelle aufgezeichnet wurde. Die Daten wurden
mittels eines Analog-Digital-Wandlers und eines PC und einer online
Aufnahmesoftware aufgezeichnet. Es wurden Kurven der Kraft-Winkel-Verdrehung
erzeugt, aus denen das Drehmoment und die Winkeldeformation bis
zum Versagen erhalten wurden, und die Energieaufnahme bis zum Versagen
als die Fläche
unter der Last-Verdrehungskurve berechnet wurde.
-
Histologie
-
Getestete und nicht getestete Proben
wurden für
die histologische Bewertung vorbereitet. Die einzelnen Proben wurden
unmittelbar nach der mechanischen Testung oder bei nicht getesteten
Proben nach der Sektion durch Eintauchen in 10 %-ige gepufferte
Formalinlösung
fixiert. Auf einer wassergekühlten
Diamantensäge
wurden die Proben durch Durchschneiden der Proben entlang ihrer
langen Achse geteilt. Dieses Verfahren resultieret in zwei Portionen
von jeder Probe für
verschiedene histologische Präparationen,
einschließlich
nicht entkalkter Grundschnitte und nicht entkalkter Mikrotomschnitte.
-
Nach der Fixierung wurden die Proben,
die für
die nicht entkalkten Schnitte vorgesehen werden, in graduierten
Ethylalkohollösungen
von 70% bis 100% hydriert. Die Proben wurden dann in Methylmethacrylatmonomer
plaziert und die Polymerisation zugelassen. Die Grundschnitte wurden
durch Schneiden der Proben auf einer wassergekühlten Mark V CS600-A (East
Grandy, CT) Sektionssäge
hoher Geschwindigkeit in Schnitte von etwa 700 bis 1.000 Micron
Dicke erhalten. Diese Schnitte wurden auf einen Acrylobjektträger montiert
und unter Verwendung einer metallurgischen Schleifscheibe auf 100
Micron Dicke abgeschliffen und Mikroradiogramme wurden unter Verwendung
von Standardverfahren aufgenommen. Nach der Mikroradiographie wurden
die Schnitte weiter auf etwa 50 Micron abgeschliffen und mit basischem
Fuchsin und Toluidinblau für
die histologische Bewertung angefärbt, die die Qualität der Verbindung,
das Aussehen und die Qualität
des Knochenrands und des gitterförmigen
Knochens, die Anwesenheit von Knochenmarkselementen, die Remodellierung
des Knochens und die entzündliche
Reaktion bewertete (Tabelle 6).
-
TABELLE
6
HISTOLOGISCHE BEWERTUNGSSKALA
-
-
EXPERIMENTELLE ERGEBNISSE
-
Radiographische Bewertung
-
Eine Zusammenfassung der radiographischen
Grade für
jede Stelle wird in Tabelle 7 bereitgestellt. 4 Wochen nach der
Operation hatten die Defekte, die mit OP/CMC behandelt waren, einen
mittleren radiographischen Grad von 3 von 6 möglichen Punkten. Mit OP/Puffer
behandelte Defekte hatten einen mittleren radiographischen Grad
von 4. Defekte, die mit der CMC-Trägerkontrolle und nur mit Puffer
behandelt waren, hatten im Schnitt endgültige radiographische Grade
von 1,33 und 1,0. Bei beiden Gruppen, die mit OP-1 behandelt waren,
OP/CMC und OP/Puffer, gab es schon drei Wochen nach der Operation
Anzeichen von radiodichter Knochenneubildung in den Defekten und
entlang den lateralen Rändern
des Defekts. Nach vier Wochen hatten sich in den Defekten und in
dem umgebenden subkutanen Gewebe signifikante Mengen an neuem Knochen gebildet.
Die OP/CMC-Defekte waren fast vollständig gefüllt und mit Knochen uneinheitlicher
Dichte entlang der lateralen Grenze der Ulna überbrückt. Der neue Knochen wurde
signifikant mit den defekten Rändern
eingebaut. In zwei der drei mit OP/Puffer behandelten Defekte blieben
die Ränder
des Wirts sichtbar, obwohl proliferativer neuer Knochen anwesend
war. Im Gegensatz dazu war vier Wochen nach der Operation keiner
der OP/CMC- oder OP/Puffer-Defekte vollkommen überbrückt oder gefüllt. In
der CMC-Kontrollgruppe überlagerte nach
drei Wochen früher
neuer Knochen die Knochenränder
des Wirts und nahm weiterhin an Radiodichte zu. Erneut zeigten die
Pufferkontrolldefekte nach vier Wochen im Gegensatz dazu an den
Defekträndern
nur ein leichtes Anwachsen der Radiodichte. Keiner der Kontrolldefekte
in den Gruppen zeigte Anzeichen von knochiger Defektheilung.
-
TABELLE
7
RESULTATE DER RADIOGRAPHISCHEN BEWERTUNG
-
Eine Woche nach der Operation gab
es bei keinem der OP/CMC-Defekte Veränderungen beim radiogräphischen
Aussehen. Nach 2 Wochen waren Spüren
von radiodichten Gebieten an den abgeschnittenen Knochenenden vorhanden.
Nach 3 Wochen war ein Anwachsen von Radiodichte von neuem Knochen,
der sich in den Defekten und entlang den lateralen Defekträndern bildete.
Ein Defekt zeigte Anzeichen von früher knochiger Überbrückung. Nach
4 Wochen hatten die OP/CMC-Defekte eine signifikante Menge an radiodichtem
neuen Knochen in dem Defekt. Die Defekte waren entlang der lateralen
Grenze der Ulna fast vollständig mit
Knochen nicht einheitlicher Dichte gefüllt und überbrückt. Neuer Knochen wurde signifikant
mit den Defekträndern
eingebaut. Keiner der mit OP/CMC behandelten Defekte war 4 Wochen
nach der Operation vollständig
mit neuem Knochen gefüllt
oder solide davon überbrückt. Der
letztliche radiographische Grad für jeden Defekt war 3 von 6
möglichen
Punkten (Mittelwert 3,0 ± 0,0,
n = 3).
-
CMC-Kontrolle – 4 Wochen
-
Zwei Wochen nach der Operation gab
es keine signifikanten Veränderungen
beim radiographischen Aussehen der CMC-Kontrolldefekte. Nach 3 Wochen
begannen bei 2 von 3 Defekten die Ränder des Wirts mit neuem Knochen überlagert
zu werden. Nach 4 Wochen zeigten die CMC-Defekte ein gewisses Anzeichen
der Aktivität
für neuen
Knochen an den Defekträndern,
aber kein Anzeichen von knochiger Defektheilung. Die letztlichen
radiographischen Grade waren 1, 2 und 1 von 6 möglichen Punkten (Mittelwert
1,33 ± 0,58,
n = 3).
-
OP/Puffer – 4 Wochen
-
Eine Woche nach der Operation gab
es bei keinem der mit OP/Puffer behandelten Defekte Veränderungen
beim radiographischen Aussehen. Zwei Wochen nach der Operation waren
Spuren von radiodichten Gebieten in den OP/Puffer-Defekten und entlang
den Defektgrenzen anwesend. Eine signifikante Knochenneubildung
wurde auch in den subkutanen Geweben um die Defekte gesehen. Nach
3 Wochen erschienen Flocken an neuem Knochen in den Defekten und
in den darüberliegenden
weichen Geweben bildete sich neuer Knochen. Nach 4 Wochen gab es
ein signifikantes Anwachsen bei der Bildung von radiodichtem neuen
Knochen, der die mit OP-1 behandelten Defekte füllte und überbrückte. In zwei von drei Defekten
blieben die Ränder
sichtbar, obwohl proliferativer neuer Knochen die Defekte füllte und überbrückte. Keiner
der mit OP/Puffer behandelten Defekte war zum Zeitpunkt der Tötung nach
4 Wochen vollständig
gefüllt
mit neuem Knochen oder davon solide überbrückt. Die letztlichen radiographischen
Grade waren 3, 4 und 5 von 6 möglichen
Punkten (Mittelwert 4,0 ± 1,0,
n = 3).
-
Pufferkontrolle – 4 Wochen
-
3 Wochen nach der Operation gab es
bei keinem der nur mit der Pufferkontrolle behandelten Defekte signifikante
Veränderungen
beim radiographischen Aussehen. Nach 4 Wochen wurde eine Erhöhung bei
der Radiodichte an den Rändern
beobachtet, obwohl keine Anzeichen der Defektheilung evident waren.
Der letztliche radiographische Grad für jede Stelle war 1 von 6 möglichen
Punkten (Mittelwert 1,0 ± 0,0,
n = 3).
-
Grobe Beobachtungen
-
OP-1-Defekte: Alle mit OP/CMC und
OP/Puffer behandelten Defekte waren manuell stabil und hatten sichtbar
eine Masse von Knochenneubildung an der Defektstelle.
-
Trägerkontrolldefekte: Keiner
der CMC- und nur Pufferkontrolldefekte war nach 4 Wochen manuell
stabil, obwohl alle mechanisch getestet wurden.
-
Mechanische
Testung
-
Eine Zusammenfassung der mechanischen
Testresultate erscheint in Tabelle 8 OP/CMC 4 Wochen nach der Operation
war die mittlere Belastung bis zum Versagen von Defekten von 3 mm,
die mit OP/CMC behandelt waren, 33,08 ± 16,41 N (n = 3). Dies bedeutet
51% der Kraft von intakten Kontrollen, die zuvor getestet wurden.
Die mittlere Winkeldeformation war 31,13 ± 15,32 Grad. Die mittlere
Energie, die bis zum Versagen aufgenommen wurde, war 41,64 ± 30,52
Nm-Grad.
-
CMC-Kontrolle
-
4 Wochen nach der Operation war die
mittlere Belastung bis zum Versagen von Defekten von 3 mm, die mit
CMC-Kontrolle behandelt waren, 9,32 ± 16,41 N (n = 3). Dies bedeutete
14% der Kraft von intakten Kontrollen, die zuvor getestet wurden.
Die mittlere Winkeldeformation war 33,36 ± 25,95 Grad. Die mittlere
Energie, die bis zum Versagen aufgenommen wurde, war 10,53 ± 8,62
Nm-Grad.
-
OP/Puffer
-
4 Wochen nach der Operation war die
mittlere Belastung bis zum Versagen von Defekten von 3 mm, die mit
OP/Puffer behandelt waren, 29,03 ± 16,79 N (n = 3). Dies bedeutet
44% der Kraft von intakten Kontrollen, die zuvor getestet wurden.
Die mittlere Winkeldeformation war 36,14 ± 14,71 Grad. Die mittlere
Energie, die bis zum Versagen aufgenommen wurde, war 37,87 ± 27,73
Nm-Grad.
-
Pufferkontrolle
-
4 Wochen nach der Operation war die
mittlere Belastung bis zum Versagen von Defekten von 3 mm, die mit
Pufferkontrolle behandelt waren, 5,62 ± 1,65 N (n = 3). Dies bedeutet
9% der Kraft von intakten Kontrollen, die zuvor getestet wurden.
Die mittlere Winkeldeformation war 24,91 ± 12,03 Grad. Die mittlere
Energie, die bis zum Versagen aufgenommen wurde, war 3,94 ± 4,12
Nm-Grad.
-
TABELLE
8
MECHANISCHE TESTRESULTATE
-
Histologie
-
Eine Zusammenfassung der Resultate
der histologischen Bewertung ist in Tabelle 9 dargestellt. Von 12
Gesamtpunkten war der mittlere histologische Grad der Defekte, die
mit OP/CMC behandelt waren, 7,00 ± 0,87. Der mittlere histologische
Grad der CMC-Kontrolldefekte
war 4,50 ± 0,87.
Die mittleren histologischen Grade der OP/Pufferdefekte und der
Pufferkontrollen waren 6,08 f 0,14 und 4,0 ± 1,0.
-
OP/CMC
-
Die Behandlung resultierte nach vier
Wochen in einer frühen
osteochondralen Überbrückung mit
Gebieten an mineralisierendem Knorpel. In mit OP/CMC behandelten
Defekten wurde eine signifikante Knochenneubildung in den periostealen
und endostealen Bereichen der Ulna beobachtet, die sich über die
Grenzen des Defekts ausbreitete. Gebiete von mineralisierendem Knorpel
und etwas fibröses
Gewebe waren in den Defekten vorhanden. Die Überbrückung der Defekte war nach
vier Wochen nicht erreicht. Die Ränder des Wirts blieben sichtbar,
obwohl es Anzeichen des Einbaus von neuem Knochen und Remodellierung
gab.
-
CMC-Kontrolle
-
Nach vier Wochen wurde in den CMC-Kontrolldefekte
keine vollständige
knochige Heilung beobachtet. Die Kontrolldefekte resultierten in
fibrösen
Verbindungen mit keinen Anzeichen von knochiger Überbrückung. Es wurde beobachtet,
daß fibröses Gewebe
und mineralisierender Knorpel die Defekte füllten und umgaben. Sehr kleine
Mengen an neuem Knochen hatten sich entlang der Knochenhaut der
Ulna und am der endostealen Region der Ulna in der Nähe der Ränder des
Wirts gebildet. Es wurden Anzeichen an Resorption des Rands des
Wirts an den Enden des Defekts beobachtet.
-
OP/Puffer
-
Behandelte Defekte wurden mit mineralisierendem
Knorpel und fibrösem
Gewebe gefüllt.
In den endostealen und periostealen Regionen der Ulna in der Nähe der Grenzen
des Defekts bildete sich neuer Knochen und frühe Zeichen von Überbrückung mit
neuem Knochen waren evident, obwohl keiner der Defekte vollkommen überbrückt war.
Die Knochenränder
des Wirts zeigten Anzeichen von Einbau mit neuem Knochen, wurden
aber nach vier Wochen nicht völlig überdeckt.
Es wurde eine gewisse Remodellierung der Knochenränder des
Wirts und eine frühe
Verdichtung entlang der Grenzen des neuen Knochens beobachtet. Neuer Knochen
bildete sich auch in den subkutanen Gewebeschichten, die die defekte
Stelle überlagerten
und sich über
die Defektgrenzen erstreckten.
-
Pufferkontrolle
-
In keinem der Pufferkontrolldefekte
wurde vier Wochen nach der Operation vollständige knochige Heilung beobachtet.
Nicht behandelte Defekte zeigten fibröse Verbindungen mit keinen
Anzeichen von knochiger Verknüpfung;
es wurde fibröses
Gewebe beobachtet, das die Defekte füllte und sie umgab. Andere
nicht behandelte Defekte zeigten kein Anzeichen einer fibrösen oder
anderen Verbindung. Sehr wenig Knochenneubildung wurde bei den Pufferkontrolldefekten
beobachtet. Endostealer neuer Knochen erstreckte sich aus der Markhöhle der
Ulna und entlang den lateralen Defektgrenzen bildete sich periostealer
neuer Knochen. Die Knochenenden des Wirts waren sichtbar mit Anzeichen
von Randresorption.
-
TABELLE
9
RESULTATE DER HISTOLOGISCHEN BEWERTUNG
-
2. Experiment 3
-
Von rekombinantem menschlichem knochenbildendem
Protein-1 (rhOP-1), wenn implantiert in Kombination mit Knochenkollagenmatrix,
wurde gezeigt, daß es
diaphyseale segmentale Defekte kritischer Größe in Tieren durch die Bildung
von neuem Knochen heilt, der biologisch und biomechanisch funktionell
ist. Der Zweck dieser Untersuchung war die Bewertung der Wirksamkeit
von matrixfreien injizierbaren Formulierungen von rhOP-1 für die Beschleunigung
der Knochenheilung in einem Hundemodell für Defekte unkritischer Größe.
-
Bilaterale osteoperiosteale segmentale
Defekte von 3,0 mm Länge
wurden in der mittleren Ulna von 18 erwachsenen männlichen
Mischlingshunden erzeugt. Der Bogen wurde ohne zusätzliche
Fixierung wegen der mechanischen Stabilität erhalten. Weiche Gewebe wurden
vor der Injektion von rhOP-1 geschlossen. Neun Tiere erhielten rhOP-1-Formulierungen in
einen Defekt und die Trägerkontrollen
in den contralateralen Defekt und sie wurden 4 Wochen nach der Operation
getötet.
Neun unbehandelte Kontrolldefekte wurden in Zeiträumen von
4, 8 und 12 Wochen für
den Vergleich mit der rhOP-1-Behandlung bewertet. In regelmäßigen Abständen wurden
Radiogramme aufgenommen, um das Fortschreiten der Heilung zu untersuchen.
Bei der Tötung
wurden alle Ulnae durch Torsion mechanisch getestet, ob die Heilung
ausreichend war. Nicht entkalkte histologische Schnitte wurden für die Qualität und Menge
an Knochenneubildung und das Ausmaß an Heilung bewertet.
-
Radiographisch war die Knochenneubildung
schon zwei Wochen nach der Operation in mit rhOP-1 behandelten Defekten
evident und nach 4 Wochen überbrückte neuer
Knochen den Defekt. Im Gegensatz dazu zeigten Stellen mit Trägerkontrollen
4 Wochen nach der Operation wenig oder keine Knochenbildung. Darüber hinaus
waren die Torsionsstärken
von mit rhOP-1 behandelten Defekten nach 4 Wochen signifikant größer als mit
Träger
behandelte oder unbehandelte Kontrollen. Weiterhin waren die Torsionsstärken von
behandelten Defekten nach 4 Wochen praktisch gleich der Stärke von
nicht behandelten Kontrollen nach 12 Wochen. Eine eindeutige Beschleunigung
der Defektheilung und der Knochenbildung resultierte aus der Behandlung
mit rhOP-1. Die histologischen Befunde korrelierten mit den radiographischen
und mechanischen Testergebnissen.
-
Die Resultate dieser Untersuchung
bestätigen,
daß knochenbildende
Proteine, die in Defekte unkritischer Größe injiziert werden, die Defektheilung
beschleunigen können,
einschließlich
Kallusbildung am Bruch und Bildung von überbrückendem Knochen. Defekte, die
mit rhOP-1 behandelt wurden, bildeten neuen Knochen signifikant
schneller und stellten die Stärke
und Steifheit des Bruchs früher
wieder her als unbehandelte Kontrollen.
-
Zusammenfassend hat die Fähigkeit
der hier vorstehend beschriebenen matrixfreien Vorrichtungen, die
Defektreparatur zu verbessern, einschließlich der Beschleunigung der
Rate und der Verbesserung der Qualität von neu gebildetem Knochen,
Auswirkungen für
die Verbesserung der Knochenheilung bei betroffenen Individuen wie
Diabetikern, Rauchern, fettleibigen Individuen, alten Individuen,
von Osteoporose betroffenen Individuen, Benutzern von Steroiden
und anderen, die wegen eines erworbenen oder angeborenen Zustands
eine reduzierte Fähigkeit
haben, Knochenbrüche
zu heilen, einschließlich
Individuen mit gestörtem Blutfloß zu ihren
Extremitäten.
Solche Individuen erleben eine gestörte Heilung, was von einer
reduzierten Fähigkeit
resultiert, Vorläuferzellen
zu fördern,
und erleben Nekrose und/oder Sepsis.
-
Die hier offenbarten Verfahren und
Formulierungen stellen durch beschleunigte Knochenbildung eine verbesserte
Knochenbildung bereit. Spezifisch kann bei Befolgung der hier offenbarten
Verfahren und Protokolle die Rate der Knochenbildung, einschließlich Bildung
von Knochenkallus und Überbrückung, beschleunigt werden.
Wie hier beispielhaft dargestellt, erfolgt die Brückenbildung
schneller und in einem kürzeren
Zeitrahmen, was die stabilere Knochenbildung zuläßt, und dabei die biomechanische
Stärke
von sich neu bildendem Knochen verbessert.
-
Es ist auf dem Fachgebiet bekannt,
daß die
Kallusbildung eine Stufe in dem vielstufigen Heilungsprozeß ist, der
in der Knochenbildung kulminiert. Spezifisch umfaßt der Heilungsprozeß fünf Stufen:
Ereignis, Entzündung,
Bildung von weichem Kallus, Bildung von hartem Kallus und Remodellierung.
Das Ereignis beginnt mit der Einleitung des Bruchs und geht weiter,
bis die Energie völlig
verteilt ist. Das Entzündungsstadium
ist durch Hämatombildung
an der Bruchstelle charakterisiert, Kriochennekrose an den Enden
der Fragmente und einem Entzündungsinfiltrat.
Granulationsgewebe ersetzt nach und nach das Hämatom, Fibroblasten produzieren
Kollagen und Osteoclasten beginnen, nekrotischen Knochen zu entfernen.
Das Abflauen von Schmerz und Schwellung markiert den Beginn der
dritten Stufe des weichen Kallus. Diese. Stufe ist durch eine erhöhte Vaskularisierung
und reichliche Bildung von neuem Knorpel charakterisiert. Das Ende
der Stufe des weichen Kallus geht einher mit der Verbindung der
Fragmente durch fibröses
oder Knorpelgewebe. Während
der vierten Stufe oder der des harten Kallus wandelt sich der Kallus
in gewobenen Knochen um und erscheint klinisch geheilt. Die letzte
Stufe des Heilungsprozesses umfaßt die langsame Remodellierung
von gewobenem zu lamellarem Knochen und die Rekonstruktion des medullaren
Kanals (vgl. "Current
Diagnosis & Treatment
in Orthopedics," Hrsg.
H. B. Skinner (LANGE Medical Book Publ.)).
-
F. Reparatur von chondralen
Defekten mit matrixfreien knochenbildenden Vorrichtungen Schaaf)
-
1. Experiment 1
-
Unter Verwendung von ähnlichen
Verfahren und Materialien wie vorstehend beschrieben (vgl. die entsprechenden
Teile von D.2) wurde die folgende Untersuchung durchgeführt, um
weiter hin zu zeigen, daß das beispielhafte
knochenbildende Protein OP-1, wenn es in einer matrixfreien Vorrichtungen
verabreicht wird, die aktive Knorpelbildung und die Reparatur von
chondralen Defekten in gewichttragenden Gelenken induzieren kann.
-
Wie bereits vorstehend beschrieben
ist ein Defekt eine strukturelle Zerstörung des Knorpels und kann die
Konfiguration eines Hohlraums annehmen, eines dreidimensionalen
Defekts, wie zum Beispiel einer Lücke, einer Höhle, eines
Lochs oder einer anderen substantiellen Zerstörung der strukturellen Integrität. Defekte
im artikulären
Knorpel können
sich durch die gesamte Tiefe des artikulären Knorpel erstrecken und/oder
in den Knochen unter dem Knorpel (osteochondrale Defekte) oder die
Defekte können
oberflächlich
sein und beschränkt
auf das Knorpelgewebe selbst (chondrale oder subchondrale Defekte).
-
Am Anfang erfährt beschädigter Knorpelmatrix einen
Abbau durch Metalloproteinasen, die durch zelluläre Bestandteile in der Nähe freigesetzt
werden. Der proteolytische Abbau befreit von beschädigten Matrixkomponenten
und setzt dabei anabolische Cytokine frei, die in der Matrix eingeschlossen
sind. Wie es gegenwärtig
verstanden wird, stimulieren von der Matrix freigesetzte Cytokine
die Proliferation von Chondrocyten und, was wichtig ist, die Synthese
einer neuen makromolekularen Matrix. Die Anwesenheit von Zusammenlagerungen
von proliferierenden Chondrocyten, wie mikroskopisch bestimmt, ist
einer der ersten Indikatoren der Reparaturantwort des Knorpels.
Vermutlich wirkt diese Reparatur der katabolischen Wirkung der Proteasen entgegen
und stabilisiert das Gewebe durch erhöhte Matrixsynthese.
-
Der artikuläre Knorpel und die Reparatur
des artikulären
Knorpel sind durch Standardverfahren der Histologie und Histochemie
leicht zu untersuchen. Diese Verfahren sind im Fachgebiet bekannt
und umfassen mikroskopische Untersuchungen von Schnitten von Knorpel,
die durch eines einer Zahl von histochemischen Färbemitteln gefärbt sind,
einschließlich,
aber nicht beschränkt
auf, Toluidinblau, Hämatoxylin
und Eosin, von Kossa, Safranin 0 und Masson's Trichromfarbe. Nach der Anwendung
von verschiedenen Farben kann der Durchschnittsfachmann die Reparaturantwort
des Knorpels durch die Identifikation von proliferierenden Chondrocyten
und die Bestimmung der Qualität
und Menge an Matrix wie Kollagen und Proteoglycanen bewerten, die
von den Chondrocyten synthetisiert werden.
-
Wie hier verwendet, betrifft artikulärer Knorpel
spezifisch Hyalin-Knorpel, eine nicht vaskuläres, nicht mineralisiertes
Gewebe, welches die artikulierenden Oberflächen der Teile von Knochen
in Gelenken bedeckt. Unter physiologischen Bedingungen liegt artikulärer Knorpel über stark
vaskulärem
mineralisiertem Knochen, der als subchondraler Knochen bezeichnet
wird. Artikulärer
Knorpel ist durch spezialisierte knorpelbildende Zellen charakterisiert,
Chondrocyten genannt, die eingebettet sind in eine extrazelluläre Matrix,
die Fasern von Kollagen (vorwiegend Typ ID Kollagen, ebenso wie
die seltenen Typen wie die Typen IX und XI) umfaßt, verschiedene Proteoglycane,
einschließlich
Glycosaminoglycane, andere Proteine und Wasser.
-
In dieser Untersuchung wurden Schafe
als ein Modell zur Bewertung der Reparatur von chondralen Defekten
von 1–2
mm Gesamttiefe × 7
mm Gesamtdurchmesser auf der gewichttragenden kondylären Oberfläche des
Knies verwendet. Die Defekte waren chondrale Defekte partieller
Tiefe und umfaßten
nicht den subchondralen Knochen, was durch das Fehlen einer Blutung
nach der Schaffung des Defekts evident war. Eine weitere Bestätigung wurde
durch die Histologie von dünnen
Schnitten zum Zeitpunkt der Tötung
erhalten; die Defekte erstreckten sich nicht in den subchondralen
Knochen.
-
Das experimentelle Protokoll wird
in Tabelle 10 bereitgestellt. Unter Verwendung von standardisierten Chirurgieverfahren
wurde ein Defekt 2 mm Gesamttiefe x 7 mm Gesamtdurchmesser auf der
gewichttragenden kondylären
Oberfläche
des rechten und linken Knies chirurgisch gemacht. Das rechte Knie
diente als Kontrollknie. Eine flüssige
matrixfreie OP-1-Vorrichtung (50 oder 250 μg OP-1) in 20 mM Natriumacetat,
pH 4,5, wurde entweder als ein einziger Bolus mittels Injektion
in das intraartikuläre
Gelenk verabreicht oder intermittierend mittels einer lokal implantierten
subkutanen Minipumpe (ALZET® 2002, ALZA Scientific
Products, Palo Alto, CA) verabreicht (0,5 μl pro Stunde für 2 Wochen
Dauer; insgesamt 200 μl).
Zahlreiche geeignete Minipumpen sind leicht verfügbar und werden vom Durchschnittsfachmann
routinemäßig für die Verabreichung
von pharmazeutischen und/oder therapeutischen Mitteln verwendet;
der Durchschnittsfachmann wird die bevorzugte Art und Rate der Verabreichung
unter den Umständen
einschätzen
können.
Die Heilung der chondralen Defekte wurde mit histologischen und
histochemischen Standardverfahren bewertet.
-
Tabelle
10 Reparatur von chondralem Defekt beim Schaf
-
Die bisher gesammelten Daten einer
3-monatigen Untersuchung mit Minipumpe (Gruppe III und N) offenbaren,
daß matrixfreie
OP-1-Vorrichtungen die Knorpelbildung und die anschließende Reparatur
von chondralen Defekten induzieren können. Nach zwölf Wochen
wurde bei den Kontrolldefekten nur wenig Hinweise für die chondrale
Defektreparatur beobachtet. Mittels der histologischen und histochemischen
Standardbewertung wurde jedoch in dem mit matrixfreiem OP-1 behandelten
Tier sowohl die Bildung von neuem Knorpel als auch die Fusion von
altem und neuem Knorpel beobachtet. Unter Verwendung von im Stand
der Technik anerkannten histologischen und histochemischen Indizes
als Maß für die chondrale
Reparatur, stimulierte OP-1 das Einwachsen von synovialen Zellen
in das defekte Gebiet. Diese Zellen differenzierten zu Proteoglycan-reichen
artikulären
Chondrocyten voller Dicke und davon resultierte die Reparatur des
chondralen Defekts.
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Die Heilung eines Knorpeldefekts
partieller Dicke ohne Beteiligung von subchondralem Knochen in einem
erwachsenen Tier ist ohne Präzedenzfall
und zeigt, daß die
aktive Knorpelbildung eine Eigenschaft des Reparaturprozesses ist,
der von einer matrixfreien knochenbildenden Vorrichtung induziert
wird. Aus diesen Untersuchungen wird geschlossen, daß eine matrixfreie
knochenbildende Vorrichtung verwendet werden kann, um chondrale
Defekte in vivo zu reparieren. Es ist insbesondere wichtig, daß eine solche
Reparatur an einem gewichttragenden Gelenk in einem großen Tiermodell
wie dem Schaf vorkommen kann.
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Andere Untersuchungen der Reparatur
von chondralen Defekten unter Verwendung von matrixfreien OP-1-Vorrichtungen
(zum Beispiel die Experimente, die vorstehend in Gruppe I und ID
dargestellt sind) sind gegenwärtig
noch in der Durchführung.
Es werden ähnliche
Ergebnisse erwartet wie die, die mit dem vorstehend beschriebenen
experimentellen Beispiel der Verabreichung mit einer Minipumpe erhalten
wurden, das heißt,
es wird erwartet, daß einziger
Bolus von injizierbarer matrixfreier Vorrichtung in das intraartikuläre Gelenk
einen chondralen Defekt in gewichttragenden Gelenken repariert.
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G. Alternative Verfahren
zur Heilung von segmentalen Defekten unkritischer Größe unter
Verwendung von matrixfreien knochenbildenden Vorrichtungen
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1. Experiment 1: Die Wirkungen
der verzögerten
Verabreichung von matrixfreier knochenbildender Vorrichtung auf
die Reparatur von Defekten unkritischer Größe (Hunde)
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Der Zweck dieser Untersuchung war
die Beurteilung der Heilung von Defekten unkritischer Größe, die zu
verschiedenen verzögenen
Verabreichungszeiten nach der Verletzung mit matrixfreien OP-1-Vorrichtungen behandelt
wurden. Die nachstehend beispielhaft dargestellte besondere Vorrichtung
ist eine injizierbare Formulierung der matrixfreien knochenbildenden
Vorrichtung. Es wird erwartet, daß andere Ausführungsformen der
Vorrichtung ähnliche
Resultate ergeben.
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In Kürze sind die experimentellen
Beobachtungen wie folgt: im allgemeinen heilten segmentale Defekte
unkritischer Größe, die
mit matrixfreien OP-1-Vorrichtungen behandelt wurden, 4 Wochen nach
der Verletzung in signifikant höherem
Maß im
Vergleich mit Kontrollen mit injizierbarem Träger. Von besondere Signifikanz
sind die unerwarteten Resultate, die anzeigen, daß mindestens
ein Indiz für
die Defektheilung, speziell die erhöhte mechanische Stärke der
Ulna, durch die Manipulation der Zeit nach der Verletzung, zu der
die matrixfreien OP-1-Vorrichtungen verabreicht werden, erhöht werden
kann.
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Zum Zwecke dieses Experiments und
wie hier verwendet, bedeutet Verletzung das zufällige Auftreten eines Defekts
(wie ein unerwarteter physischer Unfall, der im Auftreten von Defekten
unkritischer Größe resultiert),
das beabsichtigte Auftreten eines Defekts (wie die chirurgische
Manipulation, die im Auftreten von Defekten unkritischer Größe resultiert),
oder nicht traumatisch induzierte Defekte, die von einer oder von
mehreren der folgenden Krankheiten oder Störungen verursacht sein können: Sauerstoffmangel;
Ischämie;
primäre und
metastatische Tumorbildung; infektiöse Krankheiten; entzündliche
Krankheiten; sogenannte Kollagenerkrankungen (einschließlich Defekten
der Kollagensynthese, des Kollagenabbaus oder bei normaler Matrix); angeborene,
genetische oder Entwicklungskrankheiten; Ernährungskrankheiten; metabolische
Krankheiten; idiopathische Krankheiten; und Krankheiten in Zusammenhang
mit abnormer mineralischer Homöostase,
um nur einige zu nennen.
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Einige der hier beispielhaft dargestellten
Verfahren beinhalten den Schritt der Verabreichung einer matrixfreien
Vorrichtung an einer defekten Stelle nach dem Beginn des Heilungsprozesses;
die Stufen des Heilungsprozesses und die damit verbundenen physiologischen
Ereignisse wurden früher
beschrieben. Ein anderes der Verfahren umfaßt den Schritt der Verabreichung
einer matrixfreien Vorrichtung an einer defekten Stelle während der Reifung
der endogenen Matrix an der Stelle; die Ereignisse, die mit der
endogenen Matrixbildung während
der endochondralen Knochenbildung einhergehen, wurden auch früher beschrieben.
In einer gegenwärtig
bevorzugten Ausführungsform
stellt die vorliegenden Erfindung die Verwendung einer matrixfreien
Vorrichtung für
die Herstellung eines Medikaments für die Reparatur eines Knochendefekts,
eines chondralen Defekts oder eines osteochondralen Defekts bereit,
die den Schritt der Verabreichung einer matrixfreien Vorrichtung
zu Zeiten nach der Verletzung umfassen, die verzögert sind. Solche Verzögerungen
können
kurzfristig sein, mittel- oder langfristig, wie nachstehend beschrieben.
Das Ausmaß,
um das die Verabreichung verzögert ist,
hängt von
den Umständen
ab und der Durchschnittsfachmann wird leicht die Bedeutung davon
verstehen.
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Wie nachstehend gezeigt ist die verbesserte
Heilung und Defektreparatur das Ergebnis der Verabreichung einer
matrixfreien Vorrichtung an einer defekten Stelle zu vergangenen
Zeiten nach der Verletzung. Zum Beispiel kann die verzögerte Verabreichung
Zeiten von mindestens 0,5 Stunden bis zu mindestens 6 Stunden nach
der Verletzung umfassen; in einer anderen Ausführungsform können die
verzögerten
Verabreichungszeiten Zeiten von mindestens 6 Stunden bis zu 24 Stunden
umfassen, oder von mindestens 24 Stunden bis zu 48 Stunden nach
der Verletzung. In einer gegenwärtig
bevorzugten Ausführungsform
ist die Verzögerung
mindestens 6 Stunden. Andere Verabreichungzeiten nach der Verletzung
werden durch die vorliegenden Erfindung ebenfalls in Betracht gezogen.
In gewissen anderen gegenwärtig
bevorzugten Ausführungsformen
können
die verzögerten
Verabreichungszeiten von mindestens 48 Stunden bis zu mindestens
72 Stunden nach der Verletzung betragen. In noch anderen Ausführungsformen
können
die Verabreichungszeiten signifikant über 72 Stunden hinausreichen,
d. h. knochenbildende Vorrichtungen könne an der defekten Stelle
erst in der Stufe der Remodellierung der Knochenheilung verabreicht
werden. Es werden auch Verfahren in Betracht gezogen, bei denen
matrixfreie knochenbildende Vorrichtungen an der Stelle eines Defekts
unkritischer Größe zu vielen
Zeitpunkten nach der Verletzung verabreicht werden. Zum Beispiel
ist eine gegenwärtig
bevorzugte Vielzahl von 0,5 bis 6 Stunden und 7 Tage nach der Verletzung.
Eine Vielzahl von verzögerten
Verabreichungen kann mittels manueller Verabreichung an die defekte
Stelle oder mittels automatischer Verabreichungen unter Verwendung
einer früher
beschriebenen Minipumpe erreicht werden.
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Experimenteller
Aufbau
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Insgesamt 12 erwachsene Mischlingshunde
wurden verwendet. Wie früher
beschrieben wurden bilaterale segmentale Defekte der Ulna von 3
mm Länge
in allen Tieren erzeugt. Wie in dieser besonderen Untersuchung beispielhaft
dargestellt war die verwendete matrixfreie Formulierung von OP-1
3,5 mg OP-1/ml, die in 100 Mikroliter Lactose/Acetatpuffer verabreicht
wurde, wie vorstehend beschrieben. Zwölf Tieren wurden in den rechten
Defekt matrixfreie Vorrichtungen zu verschiedenen Zeitpunkten nach
der Verletzung verabreicht und Kontrollvorrichtungen wurden in den
linken Defekt zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Verletzung verabreicht.
Drei Tiere wurden bei der Schaffung des Defekts behandelt (0 Stunden),
drei 6 Stunden nach der Verletzung und drei 48 Stunden nach der
Verletzung. Alle Tiere wurden 4 Wochen nach der Chirurgie getötet. Es wurden
wöchentlich
Radiogramme aufgenommen, um den Fortschritt der Heilung zu untersuchen.
Bei der Tötung
wurden Knochensegmente mittels Histologie auf Gewebereaktion, Qualität und Menge
an Knochenneubildung und Ausmaß an
Heilung beurteilt. Alle Ulnae wurden en bloc gewonnen und in Torsion
mechanisch getestet.
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Wie früher beschrieben wurden die
Ulnae direkt nach der Sektion durch Torsion auf Versagen in einer MTS
hydraulischen Testmaschine mit geschlossenem Kreislauf unter Hubkontrolle
bei einer konstanten Vorschubrate von 50 mm/Min. geführt wurde.
Ein Ende war starr fixiert und das andere wurde gegen den Uhrzeigersinn
gedreht. Die Torsionskraft wurde mittels eines Hebelarms von sechs
cm eines servohydraulischen Materialtestsystems übertragen. Es wurden gleichzeitig
Aufzeichnungen von der Verdrehung des Implantats vorgenommen, gemessen
durch die Hubkontrolle der Maschine, während die Last von der Belastungszelle
aufgezeichnet wurde. Die Daten würden
mittels eines Analog-Digital-Wandlers
und eines PC und einer online Computeraufnahmesoftware aufgezeichnet.
Es wurden Kurven der Kraft-Winkel-Verdrehung erzeugt, aus denen
das Drehmoment und die Winkeldeformation bis zum Versagen erhalten
wurden und die Energieaufnahme bis zum Versagen als die Fläche unter
der Last-Verdrehungskurve berechnet wurde.
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Resultate
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Alle Proben wurden 4 Wochen nach
der Chirurgie mechanisch getestet. Mechanisch hatten die Defekte,
die die matrixfreie OP-1-Vorrichtung 6 Stunden nach der Verletzung erhielten,
die höchste
Torsionkraft; 73% von intakten Ulnae verglichen mit 64% nach 48
Stunden und 60% zur Stunde 0. Die Kontrolldefekte bei 0 Stunden,
6 Stunden und 48 Stunden nach der Verletzung hatten Kräfte von
23%, 28% und 24%.
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Diese Untersuchung zeigt das überraschende
Resultat, daß eine
verbesserte Heilung eines Defekts unkritischer Größe durch
eine verzögerte
Verabreichung einer matrixfreien knochenbildenden Vorrichtung an der
defekten Stelle nach der Verletzung erreicht werden kann. Dieses
unerwartete Resultat steht in Beziehung zum Stadium der Knochenheilung
oder der endogenen Matrixbildung an der defekten Stelle, einschließlich, aber
nicht beschränkt
auf, Ereignissen wie Klümpchenbildung,
Infiltration von Vorläuferzellen
und Kallusbildung, insbesondere weicher Kallus, um nur einige zu
nennen. Darüber
hinaus wird erwartet, daß andere
Defektreparaturprozesse unter Einschluß des Knochens, wie die Reparatur
von osteochondralen Defekten ähnlich
denen, wie sie hier beschrieben wurden, durch eine verzögerte Verabreichung
von matrixfreien knochenbildenden Vorrichtungen an der defekten
Stelle nach der Verletzung verbessert werden können.
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H. Weiter Untersuchungen
der Reparatur von chondralen Defekten unter Verwendung von matrixfreien
knochenbildenden Vorrichtungen (Schaf)
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1. Experiment 1: Glycosaminoglycane
und andere Polymere als Träger
für knochertbildendes
Protein
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Wie früher beschrieben sind gewisse
bevorzugte Kategorien von Verbindungen als Träger in den hier betrachteten
matrixfreien Vorrichtungen geeignet. Unter den gegenwärtig bevorzugten
Kategorien sind Verbindungen, die im Fachgebiet als Gleitmittel
anerkannt sind, speziell diejenigen, die natürlicherweise vorkommen und
natürlicherweise
physiologische Funktionen wie der Schutz und die Schmierung von
Zellen und die Erhaltung der Integrität von Gewebe erfüllen, um
nur einige zu nennen. Solche Verbindungen sind im allgemeinen auch
Befeuchtungsmittel und die Feuchtigkeit haltende Mittel. Eine Subkategorie
von gegenwärtig
bevorzugten Gleitmitteln umfaßt
die Biopolymere, die als Glycosaminoglycane bekannt sind. Glycosaminoglycane,
die bei der vorliegenden Erfindung in Betracht kommen, umfassen,
sind aber nicht beschränkt
auf, Hyaluronsäure, Chondroitin,
Dermatan und Keratan, um nur einige zu nennen. Es können sowohl
sulfonierte als nicht sulfonierte Formen in der vorliegenden Erfindung
verwendet werden. Andere Glycosaminoglycane sind für die Formulierung
von matrixfreien Vorrichtungen geeignet, und der Durchschnittsfachmann
wird andere geeignete Verbindungen entweder wissen oder in der Lage
sein, sich ihrer unter Verwendung von lediglich Routineexperimenten
zu versichern. Für
eine detaillierte Beschreibung von Glycosaminoglycanen vgl. Aspinall,
Polysaccharides, Pergamon Press, Oxford (1970).
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Ein insbesondere bevorzugtes Glycosaminoglycan
ist Hyaluronsäure
(HA). HA ist ein natürlicherweise vorkommendes
anionisches Polysaccharid oder komplexer Zucker. Sie wird in Knorpel
und synovialer Flüssigkeit
gefunden. HA ist im kosmetischen Grad und im medizinischen Grad
erhältlich;
zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung ist der medizinische
Grad im allgemeinen bevorzugt. HA kann beim Molekulargewicht von
niedrig bis hoch reichen. In gewissen Ausführungsformen der vorliegenden
Erfindung ist Material mit hohem Molekulargewicht vorzuziehen; nur
als Beispiel kann HA 190 (1,9 a 106 Da;
1% wird gegenwärtig
bevorzugt, es sind aber Konzentrationen geeignet, die von 0,5–2% reichen),
der Salzlösung
zugemischt wurde, zweimal wöchentlich
intraartikulär
verabreicht werden (0,1 ml/kg), um chondrale Defekte zu reparieren.
In anderen Ausführungsformen
kann HA mit niedrigem Molekulargewicht (wie HA80, 0,8 x 106 Da; 1% wird bevorzugt, es sind aber Konzentrationen
geeignet, die weniger als oder gleich 4% sind) verwendet werden.
Unter Verwendung der hier bereitgestellten Lehren kann der Durchschnittsfachmann
die Umstände
beurteilen, unter denen die HA mit hohem Molekulargewicht dem Material
mit niedrigem Molekulargewicht für
die Defektreparatur vorzuziehen ist, und umgekehrt. Darüber hinaus
wird dem Durchschnittsfachmann bewußt sein, daß HA in Lösung eine viskose Flüssigkeit
ist, und daß die
Viskosität
durch Einstellung des Molekulargewichts und des Gehalts an HA manipuliert
werden kann. Zum Beispiel ist es in einigen Ausführungsformen bevorzugt, sich
der Viskosität
der synovialen Flüssigkeit
im Gelenk anzugleichen. Unter Verwendung von Fachwissen und Routineexperimenten,
zusammen mit den hier bereitgestellten Lehren, kann der Durchschnittsfachmann
matrixfreie knochenbildende Vorrichtungen für die Reparatur von chondralen
Defekten formulieren, die HA als Träger verwenden; die Viskosität der Vorrichtung
ebenso wie der Proteingehalt können,
wie durch die Umstände
erforderlich und wie hier gelehrt, leicht angepaßt werden. HA ist kommerziell
von mehreren Quellen erhältlich,
einschließlich
Sigma Chemical Company (St. Louis, MO), Genzyme Pharmaceuticals
(Cambridge, MA) und Collaborative Laboratories (Esst Setauket, NY).
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Glycosaminoglycan und andere polymere
Träger
wie Hyaluronsäure,
die zur Verwendung mit den vorliegenden matrixfreien knochenbildenden
Vorrichtungen geeignet sind, können
in dem Schafmodell für
chondrale Defekte beurteilt werden, das vorstehend beschrieben ist.
Zum Beispiel werden mittels chirurgischer Standardverfahren in der
gewichttragenden Oberfläche
des medialen und lateralen Kondylus von beiden Kniegelenken in einem
Schaf Defekte von 2 x 7 mm gemacht. Ein Kniegelenk wird durch intraartikuläre Verabreichung
einer matrixfreien Vorrichtung mit OP-1/Hyaluronsäure behandelt
und das andere Gelenk wird mit Hyaluronsäure allein behandelt.
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Zwei Gruppen an Schafen werden untersucht:
Gruppe I wird nach 8 Wochen getötet
und Gruppe ID wird nach 6 Monaten getötet. Wie früher beschrieben kann die Heilung
von chondralen Defekten mittels Radiologie und histologischen und
histochemischen Standardverfahren beurteilt werden. Von jedem Knie
werden monatlich Radiogramme aufgenommen. Eine arthroskopische Untersuchung
wird unter Verwendung von Standardverfahren und Standardausrüstung unter
Anästhesie
genau vor der Tötung
vorgenommen. Unmittelbar nach der Tötung werden Proben des Kniegelenks
in 10 %-igem gepuffertem Formalin fixiert. Die Proben werden longitudinal
geteilt und ein Teil in graduierter Ethylalkohollösung von
70–100%
entkalkt und in Methylmethacrylat eingebettet, geschnitten und für die hostologische
Beurteilung angefärbt.
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Es wird erwartet, daß Hyaluronsäure enthaltende
matrixfreie Vorrichtungen die Rate der Reparatur von chondralen
Defekten erhöhen
und das erreichte Maß an
Reparatur verbessern. Die Reparatur kann in Tiermodellen durch Standardverfahren
der Knorpelcharakterisierung beurteilt werden, einschließlich der
histologischen Bewertung von gefärbten
und fixierten Gewebeschnitten, der Lokalisierung von knorpelspezifischen Makromolekülen (wie
Typ ID Kollagen und Aggrecan), der Bestimmung des Profils an Proteoglycan
und der mechanischen Testung. Alles Vorstehende kann durch einen
Durchschnittsfachmann unter Verwendung von Routineexperimenten und
dem Wissen auf dem Fachgebiet durchgeführt werden.
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Äquivalente
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Die Erfindung kann in andern spezifischen
Formen ausgeführt
werden, ohne die wesentlichen Merkmale davon zu verlassen. Die vorstehenden
Ausführungsformen
sind daher so zu verstehen, daß sie
unter allen Aspekten eher illustrativ als beschränkend für die hier beschrieben Erfindung
sind. Der Umfang der Erfindung wird daher eher durch die beigefügten Ansprüche als
durch die vorstehende Beschreibung festgelegt, und alle Abänderungen,
die innerhalb der Bedeutung und dem Bereich von Äquivalenz der Ansprüche liegen, sind
so zu betrachten, daß sie
umfaßt
werden.
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