JPH07500315A - 骨成長因子の標的送達 - Google Patents

骨成長因子の標的送達

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JPH07500315A
JPH07500315A JP5500099A JP50009993A JPH07500315A JP H07500315 A JPH07500315 A JP H07500315A JP 5500099 A JP5500099 A JP 5500099A JP 50009993 A JP50009993 A JP 50009993A JP H07500315 A JPH07500315 A JP H07500315A
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ベンツ，ヘイン
ローゼン，デイビッド
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セルトリックス　ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 骨生長因子の標的送達 技術分野 本発明は、タンパク質工学および医学療法の分野に関する。
さらに詳細には、本発明は、骨成長因子と標的する分子との複合体、および骨の 修復および増強などにおけるこれらの使用に関する。
発明の背景 「トランスフォーミング成長因子−βＪ　（ＴＧＦ−β）は、進化的に保存され 、広範囲の細胞型に影響するタンパク質のファミリーである。２つの形態、ＴＧ Ｆ−β１およびＴＧＦ−β２が、血小板放出物および骨で同定されている。両タ ンパク質とも、２６ｋＤのジスルフィド結合されたホモダイマーとして存在する 。
２つの形態の最初の３６アミノ酸残基中で、１４アミノ酸が異なるが、それらの 生物活性は同じである（　Ｃｈｅｉｆｅｔｚら、皿（１９８７）　４ｉ：４０９ −４１５；　Ｓ、５ｅｙｅｄｉｎら、ムー１０山、Ｃｈｅｗ、（１９８７）υ１ ２＝１９４６（９４９）。ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β２は、明らかに共通の 細胞表面レセプターに結合するが、アミノ酸配列の相同性は、約７０％のみであ る。ＴＧＦ−β３は、ＴＧＦ−β１と約７６駕相同であり、そして、ＴＧＦ−β ２とは約７９％相同である。
さらなるＴＧＦ−β類もまた、記載されている。米国特許第４゜８Ｊ１６．７４ ７号には、ＴＧＦ−β３の同定およびそのヌクレオチド配列、ならびに組換え細 胞培養からのＴＧＦ−β３の回収方法が、記載されている。Ｓ、　Ｂ、　Ｊａｋ ｏｖｌｅｖら、Ｍｏ１ｅｃ、　Ｅ　ｄｏｃｒ’ｎｏ　、　（１９８８）２：１１ ８６−１１９５には、ＴＧＦ−β４、およびｃＤＮＡの特徴づけにより同定され たそのヌクレオチド配列が記載されている。Ａ、　Ｂ、　Ｒ。
ｂｅｒｔｓら、Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒｓ　Ｖｏｌ、２　（１９９０）、ｐ ｐ、１３５−１４７には、Ｘｅｎｏｐｕｓ馴化培地からのＴＧＦ−β５の精製が 記載されている。
ＴＧＦ−βは、−次細胞培養の足場非依存成長をなし得る因子として同定された 。インビボにおいて、ＴＧＦ−βは、結合組織の蓄積を促進し、間葉起源の細胞 に対して細胞成長を誘導する。ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β２は、マクロファ ージ（Ｗａｌｌら、ヒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ 、（１９８７）　８４二５７８８）、ｐｒｅ−Ｂ細胞（Ｌｅｅら、Ｊ、　Ｅｘ　 、　Ｍｅｄ、　（１９８７）　１６６：１２９０）、造血幹細胞（Ｏｈｔａら、 Ｎａｔｕｒｅ　（１９８７）　３２９：５３９：　ｌ５ｈｉｂａｓｈｉら、阻ｏ ｏｄ　（１９８７）　６９：１７３７；　Ｋｅｌｌｅｒら、ムーカ１２Ｊ更Ｌ　 （１９８８）　ｉｎ　ｐｒｅｓｓ；　Ｓｆｎｇら、Ｂｆｏｏｄ　（１９８８）　 ｉｎ　ｐｒｅｓｓ）、およびＮＫ細胞（Ｒｏｏｋら、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　 （１９８６）　１３６：３９１６）を含む、免疫系の細胞の増殖および分化に影 響する。Ｂｅｎｔｚらの米国特許第４．８０６．５２３号には、ＴＧＦ−βはま た、免疫抑制を含む、炎症反応を抑制するために投与され得ることが開示された 。ＭｃＰｈｅｒｓｏｎらの米国特許第４．８１６．４４２号には、ＴＧＦ−βは また、過増殖、例えば、癌および白血病を抑制するために投与され得ることが開 示されている。
アクチピンは、インヒビン、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、および構造的にＴＧ Ｆ−β１に関連するタンパク質のファミリーを構成する他のタンパク質と、構造 的に類似するダイマータンパク質である。これらのタンパク質は、ＴＧＦ−β類 のクロマトグラフィー特性を示す。アミノ酸配列に関して相同性を有すると共に 、アクチビンは、ＴＧＦ−β類の特徴であるシスティン位置を有していることを 示す。アクチピンは、非還元条件の５ＤＳ−ＰＡＧＥでは２５　ｋＤの分子量を 示す（そして、還元条件下では、１４　ｋＤの分子量を示す）。アクチビンサブ ユニットには、２橿の既知形態が存在し、βＡあるいはβＢと呼ばれる。ホモダ イマー形態のβＡＡおよびβＢＢ、ならびにヘテロダイマー形態βＡＢが、文献 に記載されている。アクチビンサブユニットは、それらのアミノ酸配列に関して 、ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β２鎖に対シて約３０％の相同性を有する。イン ヒビンもまた、アクチビンに構造的に関連するポリペプチドである。インヒビン は、アクチビンβＡあるいはβＢサブユニットと、別のαサブユニットとのへテ ロダイマーである。インヒビンは、本質的にアクチピンとは逆の活性を示す。
アクチビンβＡホモダイマーおよびβＡＢヘテロダイマーを、ブタの卵胞液から 精製し、インビトロにおいて、ラット下垂体細胞からの卵胞刺激ホルモン（ＦＳ Ｈ）の放出を刺激することを示した（Ｗ、　ＶａＩｅら、■辿ｎ（１９８６）　 ３２１ニア７６−７９）。他の報告された活性には、神経分泌ニューロンがらの オキシトシン放出の刺激（Ｐ、　Ｅ、　Ｓａｖｃｈｅｍｋｏら、Ｎａｔｕｒｅ　 （１９１１８）　３３４：６１５−１７；　Ｗ、　Ｖａｌｅら、「ホルモンリサ ーチにおける最近の進歩」（１９８ｇ）　４４：１−３４）　；膵島からのイン スリン分泌の刺激（Ｙ、　Ｔｏｔｓｕｋａら、Ｂ’ｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏ　ｈ　 ｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｌ１１．　（１９８８）　ｌｊＪ：３３５−３９）　：およ び骨髄培養における赤血球細胞および多くの能力を有する始原細胞のコロニー形 成の刺激（Ｊ、　Ｙｕら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８７）　３３０ニア６５−６７； 　Ｈ，Ｅ、　Ｂｒｏｘ＋５ｅｙｅｒ　ら、Ｐ　ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ１ シ」工」ムＳ、Ａ、　（１９川８５：９０５２−５６）が含まれる。アクチピン βＡは、赤血球分化因子（ＥＤＦ）と明らかに同一である（Ｍ、　Ｍｕｒａｔａ ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｅａｄ、Ｓｅｔ、Ｕ、Ｓ、Ａ、（１９８８）　８５ ：２４３４−３８）。
アクチビンのアミノ酸配列がＴＧＦ−βと同じである事実以外に、アクチビンは 、線維芽細胞および上皮細胞上に存在するＴＧＦ−βレセプター１型、ＩＩ型、 あるいはＩＩＩ型への結合（二対して、ＴＧＦ−βと競合しない。しかし、アク チビンは、ＴＧＦ−β１のう、ト下垂体腫瘍細胞への結合に対しては競合するこ とが報告されている（Ｓ、　Ｃｈｅｉｆｅｔｚら、Ｊ、　Ｂ’ｏ１．　Ｃｈｅｎ ＋、（１９８８）　２６３：１７２２５−２８）。ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ− β２は、インビボにおける軟骨内性骨の形成を誘導することが報告されている（ Ｍ、　Ｅ、　Ｊ。
ｙｃｅら、Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、（１９９０）　１１０：２１９５−２２０ ７；　Ｈ，Ｂｅｎｔｚら、（１９８９）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２ ６４：２０８０５−１０）。
［骨の形態形成タンパク質Ｊ　（ＢＭＰ）は、Ｕｒｉｓｔに発せられた米国特許 第４．２９４．７５３号および第４．４５５．２５６号の開示に従って、尿素あ るいはグアニジン塩酸塩を用いて無機質脱落した骨から抽出し、沈澱することに より得られた。引続きＵｒｉｓｔｌｔ、この粗タンパク質混合物のイオン交換精 製で、ｐＨ４，８でのカルボキシメチルセルロース樹脂（ＣＭＣ）へは吸着され なかった活性が得られたことを報告した（Ｕｒｉｓｔ、　Ｍ、　Ｒ，、Ｃｌ１ｎ 、　０ｒｔｈ吐、力山−Ｒｅｓ、　（１９８２）　１６２：２１９）。５ｃｉｅ ｎｃｅ　（１９８３）　２２０：６８０−６８５およびＰ　ｏｃ、　Ｎａｔｌ、 　Ａｃａｄ、　、Ｓｃｉ、　Ｌｌ、Ｓ、Ａ、（１９８４）　ＬＬ：３７１−３７ ５（７）　Ｕｒｉｓｔの報告には、１７．５００ダルトンおよび１８．５００ダ ルトンの分子量を有するＢＭＰが記載されている。Ｕｒｉｓｔの特許公開である ＥＰＡ公開第０２１２４７４号には、ＢＭＰの限定タンパク質分解により得られ た４、０００から７．０００ダルトンのＢＭＰフラグメントが記載されている。
米国特許第４．６０８．１９９号には、３０．０００〜３２．０００ダルトンの 骨由来タンパク質が記載されている。このタンパク質は、水可溶性であり、コン カナバリンＡに対する親和性を有していないと、記載されている。
Ｎｏ　８８１００２０５には、骨形成活性を有するといわれている、ＢＭＰ−１ 、ＢＭＰ−２クラスＩ　（ｒＢＭＰ−２Ｊ　）、ＢＭＰ−３、およびＢＭＰ−２ クラスＩＩ　（ｒＢＭＰ−４Ｊ　）と呼ばれる４つのタンパク質が報告されてい る。これらのＢＭＰ類は、それ自身で骨形成活性を有するのか、あるいは他の因 子との組合せを必要とするのかは知られていない。
Ｊ、　Ｍ、　ＷｏｚｎｅｙのＧｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　 Ｖｏｌ、　１　（１９８９）、　ｐｐ、　２６７−２８０には、ＢＭＰ−５、Ｂ ＭＰ−６およびＢＭＰ−７Ｂと呼ばれる、ＢＭＰ−２に密接に関連するさらに３ つのＢＭＰタンパク質が記載されている。
Ｎｏ　８９７０９７８？およびＷｏ　８９１０９７８８ニは、今日ではＢＭＰ− ７であることが知られている、ｒＯＰ−ＩＪと呼ばれるタンパク質が記載されて いる。ＢＭＰ−７のクローニングは、Ｅ、　０ｚｋａｙｎａｋら、訣堕Ｊｏｕｒ ｎａｌ　（１９９０）　ｉ：２０８５−２０９３に記載されており、ＢＭＰ−７ の精製は、Ｔ、に、Ｓａｍｐａｔｈら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、（１９９０） 　ｌｊ、：１３１９８−１３２０５に記載されている。
５ｅｙｅｄｉｎおよびＴｈｏＩＩＩａｓに発せられた米国特許第４．４３４．０ ９４号では、カオトロピズム物質を用いた抽出、アニオンおよびカチオン交換カ ラムでの分画、およびｐＨ４，８でＣＭＣに吸着される画分からの活性の回収に よる、骨の形成を刺激する骨由来タフ１４り質の部分的な精製が報告された。こ の新規タンパク質の画分は、［骨形成因子Ｊ　（ＯＦ）と呼ばれ、約３０．００ ０ダルトンよりも低い分子量を有することに特徴がある。
タンパク質の可溶性、抗原性および生物学的クリアランスを変えるために、ポリ マーへ共有結合によって複合体化させて改変されたタンパク質に関する参考文献 が、当該分野にいくつか存在する。例えば、米国特許第４．２６１．９７３号は 、タンパク質の免疫原性を低減させるための、数種のアレルゲンのＰＥＧ（ポリ エチレングリコール）あるいはＰＰＧ　（プリプロピレングリコール）との複合 体化を開示した。米国特許第４．３０１．１４４号は、タンパク質の酸素保有能 を増大させるための、ヘモグロビンの、ＰＥＧおよび他のポリマーとの複合体化 を開示した。
欧州特許第９８．１１０号は、酵素あるいはインターフェロンの、ポリオキシエ チレン−ポリオキシプロピレン（ＰＯＥ−ＰＯＰ）ブロックポリマーに対する結 合が、血清中のタンパク質半減期を増大させることを開示した。米国特許第４． １７９．３３７号は、免疫原性を低減させるための、親水性酵素およびインスリ ンのＰＥＧあるいはＰＰＧへの複合体化を開示した。Ｄａｖｉｓら、Ｌａｎｃｅ ｔ　（１９８１）　ｉ：２８１−８３は、長い半減期および低免疫原性を有する 、血清中の尿酸代謝を提供する、ＰＥＧとの複合体化により改変された尿酸分解 酵素（ウリカーゼ）を開示した。Ｎ１５ｈｉｄａら、ＬＰｈａｒｍ、　Ｐｈａｒ ｍａｃｏｌ、（１９８４）　３６：３５４−５５は、ＰＥＧ−ウリカーゼ複合体 が、ニワトリに経口投与され、そのことにより、尿酸の血清レベルの減少が示さ れたことが開示した。Ｉｎａｄａら、■ｃｈｅｗ、　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、　Ｒｅｓ 、Ｃｏｍｍ、（１９８４）　１２２：８４５−５０は、リポタンパク質リパーゼ のＰＥＧとの複合体化が、それを有機溶媒に可溶にすることを開示した。Ｔａｋ ａｈａｓｈｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　＆　Ｂｉ。
ｈ　ｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍ、　（１９８４）　１２１：２６１−６５は、Ｐ ＥＧと複合体化されたＨＲＰが、酵素をベンゼンに可溶にすることを開示した。
Ａｂｕｃｈｏｖｓｋｉら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、（ １９８４）　ヱ：１７５−８６は、ＰＥＧと複合体化された、アスパラギナーゼ 、カタラーゼ、ウリカーゼ、アルギナーゼ、トリプシン、スーパーオキシドジス ムターゼ、アデノシンデアミナーゼ、フェニルアラニンアンモニアリアーゼなど の酵素が、血清中において半減期をより長くし、そして免疫原性を低減させるこ とを開示した。米国特許第４．８３０．８４７号および欧州特許出願第２０７， ５５７号は、ｔｅｃｈｎｉｕｍ−９９ｍにより標識され得るジホスホネート誘導 体化高分子を開示している。
抗体およびリポソームの両方が、薬剤を標的部位へ送達するために使用されてき た（例えば、ＴｙｌｅおよびＲｅｓ編、シＬ賎Ｌｅｄ　Ｔｈｅｒａ　ｅｕｔｉｃ 　Ｓ　ｓｔｅ＋ｎｓ、　Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　 １９９０を参照のこと）。
骨成長因子の標的送達は、これらの分子の有害あるいは望ましくない影響を減少 させ、相対的により高い投与量が目的とする部位に送達され得るので、低投与量 での使用が可能になり、そして目的とする部位での効果を引き延ばし得る。さら に、骨吸収および骨形成を含む、骨代謝に影響する標的する分子の使用は、付加 的あるいは相乗的な効果になり得る。
λ肌囚翌１ 本発明の目的は、骨成長因子と、目的とする組織に対する親和性を有する標的す る分子とを含有し、ここにおいて、該骨成長因子および標的する分子が、架橋物 質に化学的に複合体化されている、組成物の提供である。架橋物質は、好ましく は、合成親水性ポリマーである。骨成長因子は、好ましくは、ＴＧＦ−β、アク チピン、あるいは骨形態形酸タンパク質（ＢＭＰ）である。標的する分子は、好 ましくは、骨に対する親和性を有し、例えば、テトラサイクリン、カルセイン、 ビスホスホネート、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸、アミノホスホ糖類 、あるいはエストロゲンである。
本発明の別の目的は、被検体における骨形成を増進する方法の提供である。
本発明の別の目的は、被検体における骨喪失を治療する方法の提供である。
日を　るためのン Ａ、１１ 用語「骨成長因子」とは、骨の形成に影響するタンパク質のファミリーのことで ある。骨成長因子の例には、トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β） 、アクチピン、および骨形態形成因子（ＢＭＰ）が含まれる。
用語ｒＴＧＦ−β」とは、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ −β４、ＴＧＦ−β５、ＴＧＦ−βポリペプチド鎖へテロダイマー（例えば、Ｔ ＧＦ−β１．２）およびそれらのフラグメント、合成ペプチド、おｐ、　１８１ −１９４．　Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ、　Ｉｎｃ、に記載のような、多くの周知 の任意のＴＧＦ−βアッセイによる実質的に等価の生物活性を有する相同タンパ ク質を含む、β型トランスフォーミング成長因子のことである。この特定のアッ セイで、軟寒天での細胞コロニーの形成を測定することにより、非新生物性の正 常ラット腎（ＮＲＫ）線維芽細胞の足場依存成長を誘導する能力を決定する。他 の周知のＴＧＦ−β活性アッセイには、限定はされないが、骨芽細胞増殖の刺激 、ケラチノサイト増殖の阻害、種々の細胞でのコラーゲン合成の刺激、マイトジ ェン刺激Ｔ細胞増殖の阻害、および走化性活性の刺激が含まれる。ＴＧＦ−β１ およびＴＧＦ−β２の調製は、米国特許第４．７７４．３２２号に記載されてお り、本明細書に参考として援用されている。他のＴＧＦ−β類もまた、記載され ている。米国特許第４，８８６．７４７号には、ＴＧＦ−β３の同定およびその ヌクレオチド配列が記載されており、そして組換え細胞培養からのＴＧＦ−βの 回収方法が記載されている。Ｓ、Ｂ、Ｊａｋｏｖｌｅｖら、Ｍｏ１ｅｃ、Ｅｎｄ ｏｃｒｉｎｏｌ、（１９８８）　２：１１８６−１１９５には、ＴＧＦ−β４、 およびｃ　ＤＮＡの特徴付けにより同定されたそのヌクレオチド配列が記載され ている。Ａ、　Ｂ、　Ｒｏｂｅｒｔ−馴化培地がらのＴＧＦ−β５の精製が記載 されている。
本明細書に使用されているように、用語ｒ　ＴＧＦ−β」は、１９９０年１１月 １６日に出願された同時係属の米国特許出願番号第６１４、３０６号に記載され ているー、テロダイマーＴＧＦ−β２．３もｔた、包含することを意図する。Ｔ ＧＦ−β２．３は、カラムクロマトグラフィーのピーク付近の画分をプールし、 これらの画分を逆相ＨＰＬＣ１，：かけ、５ＤＳ−ＰＡＧＥにょるＴＧＦ−β２ よりさらに遅（移動する画分を回収し、このより遅く移動する画分をＦＰＬＣに がけて、ｐＨ４，６カラ６、７ノクラシ工ント間で移動したものを回収シ、ｐＨ ４，６から６．７での溶出物を、逆相ＨＰＬＣあるいはゲル電気泳動にかけ、実 質的に純粋なＴＧＦ−β２．３を回収することにより、骨抽出物から調製され得 る。
本明細書に使用されているように、用語ｒ　ＴＧＦ−β」は、その作用機構がＴ ＧＦ−βレセプターあるいは別のメツセンジャー経路を介して媒介される、任意 の他の合成分子もまた含むことを意図する。
これらのタンパク質は、それらの活性が種特異的ではないので、競技用動物、愛 玩用動物、および酪農用動物、ならびにヒトを含む、一般的な治療被検体に使用 され得る。
本明細書に使用されているように、「骨形態形酸タンパク活性により測定される ような、骨形成を誘導し得る骨由来タンパク質のクラスのことである。ＢＭＰ類 には、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ −６、およびＢＭＰ−７、ならびに天然ＢＭＰの生物学的特性をとどめるそれら のフラグメント、欠失体、付加体、置換体、変異体、および改変体が含まれる。
ＢＭＰは、ヒト、ラン、あるいは他の種起源のものであり得る。
本明細書に使用されているように、用語「アクチビン」とは、アクチビンβＡＡ 、アクチビンβＡＢ、アクチビンβＢＢおよびそれらのフラグメント、合成ペプ チド、およびタンパク質がラット下垂体細胞からの卵胞刺激ホルモン（ＦＳ）［ ）の放出を刺激する標準的な細胞培養アッセイにおいて、同様の活性を有するタ ンパク質のことである（Ｖａｌｅら、Ｎａｔｕｒｅ　（１９８６）　３２ｉニア ７６）。簡単には、このアッセイでは、成体雄Ｓｐａｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ ラットの脳下垂体前葉を、コラゲナーゼで分解し、２４ウエルの組織培養皿に、 ウェルあたり０．３３　ｘ　１０６細胞の濃度でプレートする。細胞を、２％胎 児ウシ血清（ＦＢＳ）を含有する培地中に７２時間回収する。回収期間後、細胞 を、２％ＦＢＳ含有の新鮮培地で２回洗浄する。全ての処置をこの時期に行い、 細胞を７２時間インキュベートする。次に、培地を回収し、ＦＳＩ（レベルを、 Ｎａｔｉｏｎａｌ　ＨｏｒＩｌｌｏｎｅ　ａｎｄ　Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ　ｐｒｏ ｇｒａｍ　ｏｆ　ＮＩＡＤＤにによる、ラジオイムノアッセイキットを用いて測 定する。
本明細書に使用されているように、用語「標的する分子」とは、目的とする組織 に結合するか、あるいは目的とする組織の代謝に影響する分子のことである。従 って、例えば、骨を標的する分子（ｂｏｎｅ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ｍｏｌｅｃ ｕｌｅｓ）には、テトラサイクリン、カルセイン、ビスホスホネート、キレータ −、ホスフェート、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸、アミノホスホ糖類 、骨の無機質層と結合することが知られているペプチド（例えばオステオネクチ ン、骨シアロタンノイク質およびオステオボンチン）、骨無機質結合領域を有す るタンパク質などの、骨検索分子（ｂｏｎｅ−ｓｅｅｋｉｎｇ　ｍｏｌｅｃｕｌ ｅｓ）が含まれる。骨を標的する分子にはまた、ビスホスホネート、およびエス トロゲンおよび他のステロイドのような、骨吸収および骨形成速度に影響する分 子が含まれる。これらの骨を標的する分子は、骨に骨成長因子を運び得、および ／または、骨吸収あるいは骨形成に、相乗的あるいは付加的に影響し得る。
本明細書に使用されているように、用語「親水性ポリマー」とは、ポリマーを本 質的に水可溶性にする平均分子量および組成を有する、合成あるいは天然のポリ マーのことである。
はとんどの親水性ポリマーは、水溶液中で水素結合を形成し得る十分な数の酸素 （あるいは、しばしばではないが窒素）原子を取り込むことにより、この特性を 達成する。本明細書に使用されている親水性ポリマーは、一般的には、プロピレ ングリコール、ポリオキシエチレン、ポリエチレングリコール、ポリトリメチレ ングリコール、ポリ乳酸、あるいはそれらの誘導体である。他の適切なポリマー には、ポリオキシエチレン−ポリオ牛ンブロビレンブロノクポリマーおよびコポ リマーが含まれる。デンプン、へ、（リンなどの天然のポリマーもまた、本発明 の範囲内に含まれる。全ての適切なポリマーは、皮下投与されたときに非毒性か つ非炎症性であり、好ましくは、本質的には、数カ月の間インビボにおいて非分 解性である。まさに好ましい親水性ポリマーは、合成の、好ましくは、平均分子 量が約２００から約１０．　Ｇｏｏ、さらに好ましくは約６００から約８．００ ０、最も好ましくは約３４００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。
ＰＥＧは、好ましくは、二官能性であり、すなわち、骨成長因子と標的する分子 との間の架橋物質であり、これは、例えばＰＥ０６００ではジグリシジルエーテ ルのようなホモニ官能基、あるいはへテロ官能基からなる。分枝ポリ官能性ＰＥ Ｇ架橋物質もまた、使用され得る。架橋物質の官能基の特性は、複合体化される べき分子の反応性に依存する。
本明細書に使用されているように、用語「化学的に複合体化された」とは、共有 化学結合を介して接続されたことを意味する。本発明の実施において、親水性ポ リマーおよび骨成長因子は、結合ラジカルの使用により化学的に複合体化されえ 得、従って、ポリマーおよび骨成長因子は、それぞれラジカルに結合されるが、 直接には互いに結合されない。
当業者には、ポリエチレングリコールのようなポリマーは、実際的には、正確な 分子量を有して調製され得なＬ’ことが明白であるため、本明細書に使用されて いるように、用語「分子量」とは、当該分野で一般的に使用されているように、 任意に得られた試料の多くの分子の平均分子量のことである。
従って、ＰＥＧ　２０００の試料は、例えば、１．２００から２，５００ダルト ンまでの質量の範囲のポリマー分子を含有し得る。分子量範囲を明記することに より、平均分子量は、明記された制限間の任意の値であり得、そしてこれらの制 限外の分子を含み得ることが示される。従って、約８００から約２０．０００の 分子量範囲は、少なくとも約８００から約２０　ｋＤまでの範囲の平均分子量を 示す。
本明細書に使用されているように、用語「有効なりシン残基」とは、骨成長因子 あるいは標的する分子の外表面上に出ているり／ン側鎖のことであり、これは、 活性化ＰＥＧと反応し得る鎖の様式に位置する。一般的には、有効なりシン残基 の１０−１００％、より好ましくは、１０−５０％が使用され得る。有効なりシ ン残基の数は、２．４．６−　）リニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＴＮ ＢＳ）との反応により決定され得る。骨成長因子の遺伝子変異体が、分子中の特 定の部位のりシン残基を置換するために構築され得、従って、架橋効果を改変す る。実際には、このような置換は、成長因子のレセプター結合を妨害しないよう に保存され、成長因子の外領域あるいはより親水性の領域内に存在する。
本明細書に使用されているように、用語「治療する」あるいは「治療」とは、骨 の欠損、特に、骨喪失による骨の欠損の、修復、予防、あるいは緩和のことであ る。骨の欠損の治療には、喪失した骨の増大あるいは回復に加えて、代謝疾患、 慢性炎症プロセス（例えば、骨粗しよう症、変形性関節症、パリエツト病、骨軟 化症、骨石灰脱失症、多発性骨髄腫および癌の他の形態、および年齢関連の骨の 量の喪失）による、さらなる骨喪失の予防を含む。本発明の組成物は、治癒ある いは正常組織の再生のために、さらなる生物活性因子を含み得る。
本明細書に使用されているように、用語「目的とする組織」とは、治療あるいは 骨成長因子の配置のための、体内における所望の標的のことである。目的とする 組織には、骨、軟骨、あるいは骨成長因子が標的され得る他の組織または細胞型 が含まれ得る。
Ｂ、二肱五左方法 本発明の組成物は、標的する分子に化学的に複合体化された骨成長因子を含有す る。タンパク質への複合体化あるいはカップリングの化学の例が、当該分野にお いて要約されている（例えば、Ｐ、　ＴｙｌｅおよびＢ、　ＲａＪ！１ｉＳＴａ ｒ　ｅｔｅｄ　Ｔ　ｅｒａ　ｅｕｔｉＬ鐸）工、　Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ 、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９９０；およびＭｅａｎｓおよびＦｅｅｎｅｙ、ｒ タンパク質の化学的改変、歴史、および適用」肛匹坦ｎ■旦」仙ｍ、　１：２− １２　（１９９０）を参照のこと。これらは全体に、本発明書に参考として援用 されている）。
このような方法の１つには、骨成長因子の、選択された合成親水性ポリマーある いは複数のポリマーに対する化学的複合体化が包含され、次に、これらは標的す る分子に結合される。従って、例えば、骨成長因子上の反応基が架橋物質を介し て複合体化され得、そして標的する分子が第二の架橋物質を介して骨成長因子− ポリマーに複合体化され得る。ここにおいて、第二の架橋物質は、標的する分子 に含まれる反応基により、第一の架橋物質と同じか、あるいは、異なる種の架橋 物質であり得る。タンパク質上の反応基の例には、限定はされないが、Ｃ末端の カルボキシル基あるいはアスパラギン酸およびグルタミン酸のカルボキシル基； Ｎ末端およびリシン残基のアミノ基；ヒスチジンのイミダゾールおよびチロシン のフェノール性反応基；システィンのスルフヒドリル基；およびアルギニンのグ アニジン基が含まれる。
例えば、ＴＧＦ−βは、合成の親水性ポリマーに結合するのに使用され得る、多 くの有効なアミノ基、カルボキシル基、およびヒドロキシ基を有する。ＴＧＦ− β中およびポリマー中に元来存在しているヒドロキシ基あるいはアミノ基は、結 合され得る前に、しばしば、活性化を要するので、ポリマーは、「結合基」を用 いて接続され得る。従って、ジカルボキシル無水物（例えば、無水グルタル酸あ るいは無水コノ＼り酸）のような化合物を使用して、ポリマー誘導体（例えば、 コ／％り酸エステル）を形成し得、次に、これらは、従来の脱離基、例えば、ト ヒドロキシスクシニミド、Ｎ、Ｎ’−ジスクシニミジルオキサレート、Ｎ、Ｎ’ −ジスクシニミジルカーボネートなどでのエステル化により、活性化され得る。
ポリマー−グルタレート組成物を形成するために使用され得る、まさに好ましく Ａジカルボキシル無水物には、無水グルタル酸、無水アジピン酸、無水１．８− ナフタレンジカルボン酸、および無水１．４．５．８．−ナフタレンテトラカル ボン酸が含まれる。従って、活性化されたポリマーを、次に、ＴＧＦ−βと反応 させ、ＴＧＦ−β−ポリマー複合体を形成する。
ＴＧＦ−βは、親水性ポリマーにカップリングさせるための適切なｐＨの溶液に 溶解するのが困難である。まさに好ましい方法は、ＴＧＦ−βを、担体タンパク 質の不在下で凍結乾燥させ、穏和な酸、好ましくは、約１０■Ｍ　ＨＣＩに溶解 することである。
溶液を、強塩基、好ましくは、緩衝生理食塩水中ＮａＯＨ（ＩＮ溶液）を加えて 中和し、溶解量のＤＭＳＯをさらに加える。最終溶液は、ＴＧＦ−βを溶解して 凝集を防ぐために、好ましくは、約５０％ＤＭＳＯ，あるいはＣＨ３ＣＮを含有 する。
１つの実施態様では、モノメチルポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）　（ｍｙ 　５，０００）を、無水グルタル酸と反応させてｍＰＥＧグルタレートを形成す る。次に、グルタレート誘導体を、Ｎ−ヒドロキシスクシニミドと反応させて、 スクシニミジルモノメチルポリエチレングリコールグルタレートを形成する。ス クシニミジルエステルは、次に、骨成長因子上に存在する遊離アミノ基（リシン 残基）と反応して、骨成長因子−ＰＥＧ複合体を形成し得、次に、この複合体が 、さらに標的する分子と複合体化され得る。上記のように、他のポリマーはｍＰ ＥＧと置き換えられ得る。同様に、カップリング反応は、タンパク質および合成 ポリマーを誘導体化する公知の任意の方法により実施され得る。
活性化ｍＰＥＧは、二官能性活性化ＰＥＧ　（すなわち、次に、各末端で活性化 される非メチル化ＰＥＧ）により全体あるいは一部が置換され得、架橋あるいは 一部架橋の骨成長因子組成物を提供する。組成物の特性は、プロセス中に含まれ る二官能性ＰＥＧの量を変化させて所望のように調整され得る。
得られた骨成長因子−標的する分子複合体は、標準的な方法、好ましくは、逆相 ）ＩＰＬＣ（ＲＰ−）ＩＰＬＣ）、サイズ排除ＨＰＬＣ（５ＥＣ−１ｐｔｃ；例 えば、テトラヒドロゲル−ＨＰＬＣ）　、あるいはイオン交換クロマトグラフィ ーにより、精製され得る。ＲＰ−ＨＰＬＣは、好ましくは、Ｂ溶媒として０．１ ％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いる９０％アセトニトリルあるいは９０％イ ンプロパツールによる０１８カラムで実施する。５ＥＣ−ＨＰＬＣについては、 好ましい操作緩衝液は、ｐ［１５，５の５ｍＭ酢酸ナトリウムであり得る。
ホモニ官能基あるいはへテロニ官能基のいずれかが、骨成長因子および標的する 分子の反応基の性質に依存して使用される。例えば、ホモニ官能試薬は、一般式 Ｒ−ＰＥＧ−Ｆｉを有し、ここにおいて、Ｒは、グリシジルエーテル（例えば、 ジグリシジル−ＰＥＧ　６００を形成するための）、スクシニミジルスクシネー ト、ρ−ニトロフェニルカーボネート（例えば、ビス（ρ−ニトロフェニルカー ボネー））　ＰＥ０３４００を形成するための）、イミダゾリルカルボニル（ｉ ｍｉｄａｚｏｙｌｃａｒｂｏｎｙｌ）などである。これらの物質および同様の架 橋物質が、Ｓｉｇ＋＋ａ、　Ｕｎｉｏｎ　ＣａｒｂｆｄｅおよびＰｏ１ｙｓｃｆ ｅｎｃｅから入手可能である。ＰＥＧ架橋部分を含有しない、カルボジイミドの ようなより短い架橋物質が、当該分野の化学に記載されており、市販されている （例えば、Ｐｉｅｒｃｅ）本発明の骨成長因子−標的組成物は、好ましくは、静 脈内注入、鼻腔内あるいは気管支エアロゾルなどの非経口経路により投与される 。持続放出装置が、皮下あるいは腹膜腔内に手術によりインブラントされ得る。
投与用の骨成長因子および標的する分子を含有する本発明の薬学処方剤は、一般 的に、薬学的に受容可能な賦形剤に加えて、骨の成長を促進するために、骨の形 成に有効な量の骨成長因子を含有する。適切な賦形剤には、水、生理食塩水、リ ンガ−溶液、バンク溶液、およびグルコース、ラクトース、デキストロース、エ タノール、グリセロール、アルブミンなどの溶液を含む、非経口投与に適したほ とんどの担体が含まれる。これらの組成物は、必要に応じて、安定剤、抗酸化剤 、抗菌剤、防腐剤、緩衝剤、界面活性剤、および他の付加添加剤を含有し得る。
骨成長因子−標的組成物はまた、適切な担体からの遅延放出形態で送達され得る 。
まさに好ましい賦形剤は、食塩加リン酸緩衝液（ＰＢＳ）あるいは等張クエン酸 緩衝液中に約Ｉ　Ｉ１ｇ／＋１の血清アルブミン（種特異的）を含有する。非経 口投与に適した賦形剤の十分な考察は、Ｅ、！、　Ｍａｒｔｉｎ、”Ｒｅｍｉｎ ｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅＳ”　（Ｍａｃ ｋ　Ｐｕｂ、　Ｃｏ、による最新版、賦形剤および処方に関する章：このような 開示の参考として本明細書に援用されている）に認められる。このような処方は 、当業者に周知であり、全身治療用に全身投与される。
有効な治療に必要とされる、骨成長因子−標的組成物の「有効量」は、成長因子 、治療されるべき症状の特性および重篤度、被検体の年齢および全般的な健康状 態、調製された組成物の特異活性、および当業者により決定され得る他の因子に 依存する。しかし、一般的な指針として、骨喪失あるいは欠損を治療するための 骨成長因子−標的する分子の複合体の有効量は、約０．１μｇ／ｋｇから約２５ μｇ／ｋｇの範囲である。
本発明の骨成長因子−標的組成物は、溶液あるいは懸濁液として処方され得るか 、または後に再構成するために凍結乾燥され得る。
ｃ、ｍ 以下に示す実施例は、当業者にさらなる指針として提供されており、いかなる方 法においても本発明を限定するためには構成されない。
爽立五」 （ＴＧＦ−β−ＰＥＧ−テトラサイクリン複合体の調製）テトラサイクリン（２ μｍｏｌ；　Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅ＋ｎ、　Ｃｏ、）を、１ｕ　ｍｏｌのビス −エポキシ−ＰＥＧ　（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｅｅ）に溶解し１、窒素雰囲気下で ２４時間、９０℃で、おだやかに攪拌しながら反応させる。次に、得られたテト ラサイクリン−ＰＥ０７３１合体を、０．０２Ｍホウ酸ナトリウム、０．０２％ ＳＤＳ、　５０％アセトニトリル、ｐｉ（９，０中に溶解した１００μｇのＴＧ Ｆ−β２を、５２μｌのテトラサイクリン−ＰＥＧ複合体に加えることにより、 ＴＧＦ−β２と反応させる。その混合物を３７℃で４８時間インキュベートする 。次に、得られたＴＧＦ−β−ＰＥＧ−テトラサイクリン複合体を、分子ふるい クロマトグラフィーおよびＣｌ８−ＲＰ−１（ＰＬＣにより精製する。
尖施１ （ビス−エポキシＰＥＧ　６００による、ＴＧＦ−β２の、３−アミノ−１−ヒ ドロキシプロピリデン−１，１−ビスホスホネート（ＡＤＰ）への複合体化） 凍結乾燥ＴＧＦ−βを、５０％水／アセトニトリルに溶解する（最終濃度２００ 〜５００μｇ／ｍｌ）。ｐ）Ｉを、リン酸緩衝液あるいはホウ酸緩衝液により、 ７〜８に調整する。１〜２０モル過剰のビス−エポキシ−ＰＥＧ　６００あるい はテトラ−エポキシＰＥ０１７００　（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ）を加え、混合 物を、４０℃、ｐＨ７，０〜８．０で、１５〜２０時間反応させる。Ａｍ１ｃｏ ｎ限外濾過を、結合していないＰＥＧを除去するために使用し得る。ｐＨを、ｐ Ｈ９，５の１％デオキシコール酸、０．０１　Ｎ　ＮａＯＨ，あるいは０．１Ｍ ホウ酸緩衝液で９．５に上昇させる。
３−アミノ−１−ヒドロキシプロピリデン−１，１−ビスホスホネート（ＡＰＤ 、　ＣＩＢＡ−ＧＥＩＧＹ）を、１％デオキシコール酸、ｐＨ９，５に２膳ｇ／ ｌａ　１に溶解する。次に、ビスホスホネートを５〜２００モル過剰に加え、４ ０°Ｃで一夜攪拌する。反応混合物を酸性化し、次に、クロマトグラフィーにか ける前に、０．４５μｍ低タンパク質結合シリンジフィルターを通して濾過する 。精製は、ゲル濾過、イオン交換（Ｍｏｎｏ−Ｓ）、および逆相ＨＰＬＣで行う 。
１皿五ユ■ （ＴＧＦ−βの、３−アミノ−１−ヒドロキシプロピリデン−１，１−ビスホス ホネート（ＡＰＤ）カルボジイミドへの複合体化）凍結乾燥ＴＧＦ−β（２００ μｇ）を、０．１　Ｍ　ＭＥＳ　（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸） 緩衝液、５０％アセトニトリルに、ｐＨ４，７で溶解する。スルホ−ＮＨＳ（Ｎ −ヒドロキシスルホスクシニミド、Ｐｉｅｒｃｅ）を、５０％アセトニトリル水 溶液に溶解し、２〜１０μモルを、ＴＧＦ−β溶液に加える。水溶性１−エチル −３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドＨＣＬ　（ＥＤＣ，Ｐｉ ｅｒｃｅ）を、０．１ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ４，７に溶解し、２〜５０モル加える 。最終的に、０．１　Ｎ　ＨＣＩに溶解したビスホスホネート（ＡＤＰ、　ＣＩ ＢＡ−ＧＥＩＧＹ）（５ｍｇ／１００μ＋）を、２〜５０μモル加える。ｐＨを 、０．０１　Ｎ　ＮａＯＨで４，７〜５．５に調整する。その混合物を室温で一 夜反応させる。
ＴＧＦ−β／ＡＰＤ複合体を、イオン交換（Ｍｏｎｏ−Ｓ）クロマトグラフィー および逆相ＨＰＬＣにより精製する。
尖施１−■ （ＴＧＦ−βのテトラサイクリンへの複合体化（Ｅｉｎｈｏｒｎ反応））メタノ ールに溶解したテトラサイクリンを、３８％ホルムアルデヒドと反応させる。水 ：メタノールの１：５溶液に溶解したＴＧＦ−βを滴下する。反応混合物を、室 温で２時間、おだやかに攪拌する。得られたＴＧＦ−β−Ｎ−リジンメチルテト ラサイタリンを、サイズ排除およびＲＰ−ＨＰＬＣにより、他の反応生成物から 分離し得る（　Ｂｅｒｎａｒｄｅｌ　Ｉｆら、Ｌｉｅｂｉ　ｓ　ｎｎ、　Ｃｈｅ ｍ、７０６：２４３−２４９　（１９６７））。
支胤五ユ （ＴＧＦ−βのテトラサイクリンへの複合体化）アルコキシアルキルテトラサイ クリンは、アルコール中で、アルデヒドとテトラサイクリンとを縮合して得られ る。例えば、テトラサイクリン、七ノーヒドロキシーメトキシＰＥＧ−２０００ （Ｍｅｎ−ＰＥＧ　２０００−ＯＨ）、およびホルマリンを当モルずつ、還流冷 却器を取り付けた丸底フラスコに加える。混合物を、約８０℃に加熱して、ｔ− ブチルアルコールに溶解する（油浴）。
温度を１１５℃に上げ、５０時間維持する。この反応は、窒素雰囲気下で行う。
次に、この混合物を室温に冷却した後、この系を水吸引器に接続して、反応混合 物から水を除去する。エタノールを加えてｔ−ブチルアルコールを溶解し、混合 物を濾過する。残ったワインレッド色の沈澱を、アセトン抽出によりさらに精製 する。このようにして得た中間生成物を、イオン交換クロマトグラフィーおよび サイズ排除クロマトグラフィーにより、さらに精製し得る。活性化後、次に、テ トラサイクリン−ＰＥＧ複合体を、好ましくは、塩化メチレン、ジメチルホルム アミド、ＤＭＳＯなどの有機溶媒中で、ＴＧＦ−βにカップリングし得る。

Claims (46)

    【特許請求の範囲】
  1. １．骨成長因子と、目的とする組織に対する親和性を有する標的する分子とを含 有する組成物であって、骸骨成長因子および標的する分子が、架橋物質に化学的 に複合体化されている組成物。
  2. ２．前記骨成長因子が、ＴＧＦ−βである、請求項１に記載の組成物。
  3. ３．前記骨成長因子が、アクチピンである、請求項１に記載の組成物。
  4. ４．前記骨成長因子が、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）である、請求項１に記 載の組成物。
  5. ５．前記架橋物質が、合成親水性ポリマーである、請求項１に記載の組成物。
  6. ６．前記架橋物質が、多官能性である、請求項１に記載の組成物。
  7. ７．前記ポリマーが、ポリエチレングリコールである、請求項５に記載の組成物 。
  8. ８．前記ポリエチレングリコールが、約２００から約１０．０００の分子量を有 する、請求項７に記載の組成物。
  9. ９．前記合成親水性ポリマーが、前記骨成長因子上の有効なリシン残基に結合し ている、請求項５に記載の組成物。
  10. １０．前記骨成長因子が複数の有効なリシン残基を有しており、前記合成親水性 ポリマーが１０〜１００％の該有効なリシン残基に結合している、請求項５に記 載の組成物。
  11. １１．前記骨成長因子が多数の有効なリシン残基を有しており、前記合成親水性 ポリマーが１０〜５０％の該有効なリシン残基に結合している、請求項５に記載 の組成物。
  12. １２．前記標的する分子が、骨に対する親和性を有する、請求項１に記載の組成 物。
  13. １３．前記標的する分子が、タンパク質である、請求項１に記載の組成物。
  14. １４．前記標的する分子が、テトラサイクリンである、請求項１に記載の組成物 。
  15. １５．前記標的する分子が、カルセインである、請求項１に記載の組成物。
  16. １６．前記標的する分子が、ビスホスホネートである、請求項１に記載の組成物 。
  17. １７．前記標的する分子が、ポリアスパラギン酸である、請求項１に記載の組成 物。
  18. １８．前記標的する分子が、ポリグルタミン酸である、請求項１に記載の組成物 。
  19. １９．前記標的する分子が、アミノホスホ糖類である、請求項１に記載の組成物 。
  20. ２０．前記標的する分子が、ステロイドである、請求項１に記載の組成物。
  21. ２１．前記標的する分子が、エストロゲンである、請求項１に記載の組成物。
  22. ２２．薬学的に受容可能な担体中の有効量の請求項１に記載の組成物を投与する ことを包含する、成熟した骨の形成を増大させる方法。
  23. ２３．請求項１に記載の組成物を被検体に投与することを包含する、被検体の骨 喪失を治療する方法。
  24. ２４．前記骨成長因子が、ＴＧＦ−βである、請求項２３に記載の方法。
  25. ２５．前記骨成長因子が、アクチピンである、請求項２３に記載の方法。
  26. ２６．前記骨成長因子が、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）である、請求項２３ に記載の方法。
  27. ２７．前記標的する分子が、骨に対する親和性を有する、請求項２３に記載の方 法。
  28. ２８．前記標的する分子が、テトラサイクリンである、請求項２３に記載の方法 。
  29. ２９．前記標的する分子が、カルセリンである、請求項２３に記載の方法。
  30. ３０．前記標的する分子が、ビスホスホネートである、請求項２３に記載の方法 。
  31. ３１．前記標的する分子が、ポリアスパラギン酸である、請求項２３に記載の方 法。
  32. ３２．前記標的する分子が、ポリグルタミン酸である、請求項２３に記載の方法 。
  33. ３３．前記標的する分子が、アミノホスホ糖類である、請求項２３に記載の方法 。
  34. ３４．前記標的する分子が、エストロゲンである、請求項２３に記載の方法。
  35. ３５．前記被検体が、ヒトである、請求項２３に記載の方法。
  36. ３６．前記骨喪失が、骨粗しょう症関連である、請求項２３に記載の方法。
  37. ３７．前記骨喪失が、骨軟化症関連である、請求項２３に記載の方法。
  38. ３８．前記骨喪失が、骨石灰脱失症関連である、請求項２３に記載の方法。
  39. ３９．前記骨喪失が、年齢に関連する、請求項２３に記載の方法。
  40. ４０．前記骨喪失が、ステロイド療法に関連する、請求項２３に記載の方法。
  41. ４１．前記骨喪失が、変形性関節症関連である、請求項２３に記載の方法。
  42. ４２．前記骨喪失が、バジェット病に関連する、請求項２３に記載の方法。
  43. ４３．前記骨喪失が、癌に関連する、請求項２３に記載の方法。
  44. ４４．多発性骨髄腫における癌である、請求項４０に記載の方法。
  45. ４５．前記治療が、予防である、請求項２３に記載の方法。
  46. ４６．前記組成物が、持続放出性賦形剤を含有する、請求項２３に記載の方法。
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